Mappatura dei genomi, Biotecnologie Cellulari

Mappatura dei genomi

Anche con le tecnologie più sofisticate non è possibile sequenziare una sequenza di oltre 750bp, ciò vuol dire che se bisogna analizzare una sequenza molto ampia bisognerà frammentarla, analizzarla frammento per frammento e ricomporla. Questo metodo è chiamato shotgun ed è la metodologia standard per il sequenziamento di piccoli genomi di procarioti, ma il discorso si complica quando aumenta la grandezza del genoma in quanto saranno presenti molti più frammenti (per n frammenti il numero di possibili sovrapposizioni è 2ⁿ - 2ⁿ) ed inoltre genomi più complessi contengono sequenze ripetute ed è molto facile tralasciare sequenze molto simili tra loro o dividerne due che in realtà sono unite.

Quindi per procedere al sequenziamento di genomi eucariotici si deve prima costruire una mappa del genoma che mostri la posizione di geni ed altre caratteristiche particolari. Una volta ottenuta la mappa si può procedere con:

• Shotgun esteso all'intero genoma che sfrutta caratteristiche particolari della mappa del genoma
• Usando contig di cloni ossia dividendo il genoma in segmenti di poche centinaia di Kb o poche Mb e successivamente vengono sequenziati procedendo con lo shotgun

La mappa del genoma indica quindi linee guida per procedere al sequenziamento.

La mappatura del genoma

La mappatura del genoma può essere divisa in due categorie:

• Mappatura genica che usa tecniche di genetica ed evidenzia la posizione nel genoma di geni e sequenze caratteristiche
• Mappatura fisica usa tecniche di biologia molecolare per evidenziare tratti distintivi della sequenza inclusi i geni

Una mappa genomica consiste in un elenco di marcatori per i quali è nota la posizione nel genoma, le mappe possono essere utilizzate per assegnare regioni genomiche a specifiche aree del genoma completo.

Marcatori genomici

Si può definire marcatore genomico qualunque elemento strutturale che possa essere facilmente identificabile e a cui si possa attribuire una specifica posizione lungo il genoma. Un marcatore di DNA per essere utile deve essere presente in almeno due forme alleliche. I geni possono essere usati come marcatori di DNA ma una mappa basata sui soli geni non è molto dettagliata in quanto anche se venissero mappati tutti i geni, soprattutto negli eucarioti, i geni disterebbero troppo tra loro.

Inizialmente venivano usati i caratteri fenotipici per determinare mappe di geni più o meno vicini, successivamente fu chiaro che dovevano essere utilizzati altri parametri in quanto talvolta più di un gene controlla un solo fenotipo, quindi vennero usati fenotipi biochimici.

Tre tipi di sequenze di DNA possono soddisfare i requisiti del facilmente identificabile, presenza in due forme alleliche e con una specifica locazione, questi sono:

• RFLP (polimorfismi della lunghezza dei frammenti di restrizione)
• SSLP (polimorfismi della lunghezza di sequenze semplici)
• SNP (polimorfismi a singolo nucleotide)

Polimorfismi della lunghezza dei frammenti di restrizione (RFLP)

I siti di restrizione sono specifiche sequenze che vengono riconosciute da specifici enzimi (gli enzimi di restrizione, endonucleasi) che tagliano il DNA in quel punto. Il DNA genomico possiede alcuni siti di restrizione che sono polimorfici, cioè presenti nei due alleli in forma diversa, quindi quando il DNA genomico verrà sottoposto a digestione con gli enzimi di restrizione i due frammenti produrranno un polimorfismo di lunghezza (nel caso di mutazione uno dei due non sarà riconosciuto dall’endonucleasi quindi non verrà tagliato). Sono quindi caratterizzati dalla perdita del sito di restrizione.

Si presume che nel genoma umano siano presenti 10 RFLP. Per identificare il RFLP si può usare:

• Southern hybridization con sonde che comprendono il sito di restrizione polimorfico
• PCR con la costruzione di specifici primer complementari ai due lati del sito polimorfico, e il RFLP viene rivelato trattando il frammento con l’enzima di restrizione.

Polimorfismo della lunghezza di sequenze semplici (SSLP)

Gli SSLP sono sequenze polimorfiche caratterizzate dalla ripetizione, in numero variabile di volte, di un pattern definito. Esistono due tipi di SSLP:

• Minisatelliti o VNTR (ripetizioni in tandem a numero