Mappatura dei genomi, Biotecnologie Cellulari

Polimorfismi della lunghezza dei frammenti di restrizione (RFLP)

I siti di restrizione sono specifiche sequenze che vengono riconosciute da specifici enzimi (gli enzimi di

restrizione, endonucleasi) che tagliano il DNA in quel punto. Il DNA genomico possiede alcuni siti di

restrizione che sono polimorfici, cioè presenti nei due alleli in forma diversa, quindi quando il DNA

genomico verrà sottoposto a digestione con gli enzimi di restrizione i due frammenti produrranno un

polimorfismo di lunghezza (nel caso di mutazione uno dei due non sarà riconosciuto dall’endonucelasi

quindi non verrà tagliato). Sono quindi caratterizzati dalla perdita del sito di restrizione.

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Si presume che nel genoma umano siano presenti 10 RFLP.

Per identificare il RFLP si può usare:

• Southern hybridization con sonde che comprendono il sito di restrizione polimorfico

• PCR con la costruzione di specifici primer complementari ai due lati del sito polimorfico, e il RFLP

viene rivelato trattando il frammento con l’enzima di restrizione.

Polimorfismo della lunghezza di sequenze semplici (SSLP)

Gli SSLP sono sequenze polimorfiche caratterizzate dalla ripetizione, in numero variabile di volte, di

un pattern definito.

Esistono due tipi di SSLP:

• Minisatelliti o VNTR (ripetizioni in tandem a numero variabile) la cui lunghezza arriva fino a 25bp

• Microsatelliti o STR (ripetizioni in tandem semplici) la cui lunghezza arriva fino a 13bp

I microsatelliti sono più usati rispetto ai minisatelliti in quanto questi ultimi si trovano concentrati nei

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telomeri, nel genoma umano sono presenti circa 5x10 STR.

Il modo più semplice per trovare un polimorfismo di lunghezza è tramite amplificazione in PCR dello

specifico segmento legando fluorescenti ad uno o entrambi i primer. Il prodotto di PCR viene caricato su

un sistema capillare definito elettroforesi capillare dove viene letto da un rivelatore di fluorescenza

collegato ad un computer che ne calcola l’esatta lunghezza.

Polimorfismi di singoli nucleotidi (SNP)

I polimorfismi di singoli nucleotidi sono caratterizzati da una mutazione puntiforme che genera il

cambiamento di un nucleotide nel genoma. Sono presenti circa 4 milioni di SNP nel genoma ma solo

alcuni producono un RFLP. Un SNP è presente circa ogni 10kb di DNA.

Il metodo più semplice per la ricerca degli SNP è tramite l’analisi di ibridazione degli oligonucleotidi,

dove gli oligonucleotidi, opportunamente costruiti, misurano non più di 50bp e sono sensibili anche ad un

solo mismatch. Le tecniche che usano oligonucleotidi per discriminare SNP sono:

• Chip di DNA: utilizza wafer di vetro o silicone dove sono disposti ad alta densità molti

oligonucleotidi diversi, successivamente viene posto sul chip il DNA da esaminare marcato con

fluorocromi e si analizza al microscopio a fluorescenza. Il punto in cui viene emessa fluorescenza

indica quali oligonucleotidi hanno formato ibridi con il DNA. Un singolo esperimento può quindi

dunque esaminare più SNP.

• Tecniche di ibridazione in soluzione: utilizza una vaschetta da microtitolo dove in ogni pozzetto è

presente un oligonucleotide diverso, successivamente viene introdotto il DNA. Questa tecnica usa un

sistema di rivelazione in grado di discriminare tra il DNA a singolo filamento (non ibridato) e quello

a doppio filamento (ibridato con l’oligonucleotide) ad esempio tramite marcatura fluorescente e

silenziatore sul DNA con aumento di fluorescenza in caso di appaiamento.

MAPPE GENETICHE

Le mappe genetiche sono rappresentazioni ottenute determinando la distanza tra geni vicini mediante le

tecniche genetiche.

La caratterizzazione di mappe genetiche si basa sull’associazione genetica che ha le sue radici nelle

scoperte di Mendel e nei principi dell’ereditarietà:

• Primo principio: gli alleli segregano in modo casuale

• Secondo principio: coppie di alleli segregano in modi indipendente

Il secondo principio risulta essere veritiero solo per quei geni che si trovano su cromosomi diversi. Geni che

si trovano sullo stesso cromosoma tendono ad essere ereditati insieme, questo fenomeno è chiamato linkage.

Il fenomeno di linkage si verifica per geni molto vicini tra loro, se due geni risiedono sullo stesso

cromosoma ma sono molto lontani tra loro segregheranno come se si trovassero su cromosomi distinti. Il

grado di linkage riflette dunque la distanza fisica tra due geni ed il fenomeno è causato dal crossing-over.

La determinazione di mappe genetiche nell’uomo mediante calcolo delle frequenze di ricombinazione, è

ottenuta esaminando i genotipi di membri di generazioni successive di famiglie. Malattie a trasmissione

genetica vengono spesso utilizzate come marcatori genetici essendo spesso associate ad una specifica

locazione cromosomica. Tipicamente una famiglia oggetto di analisi è composta da almeno tre generazioni,

inoltre maggiore è il numero di figli, più affidabile sarà il risultato dell’analisi.

Mappatura genetica nei batteri

La difficoltà principale nella mappatura di un genoma batterico è che questo è aploide quindi non passano

attraverso la meiosi. La soluzione è quindi di usare uno dei tre metodi esistenti per trasferire DNA da un

batterio all’altro:

• Coniugazione: quando due batteri entrano in contatto fisico tra loro e uno trasferisce materiale

genetico all’altro

• Trasduzione: quando c’è il passaggio di piccoli frammenti di DNA tramite batteriofago

• Trasformazione: quando un batterio assorbe dall’ambiente un frammento di DNA

Il trasferimento genico viene di solito effettuato tra un ceppo selvatico ed un ricevente con determinati alleli

recessivi e si verifica l’avvenuto trasferimento nel ceppo ricevente con l’acquisizione delle funzioni

biochimiche specificate dai geni in studio.

Limiti di una mappa genica

La risoluzione di una mappa genetica indica il numero di marker e il grado di precisione con cui è possibile

determinarne la posizione sul cromosoma. Essa dipende dal numero di crossing-over che è possibile

studiare. Nel caso di organismi di laboratorio, che si riproducono con facilità, è possibile studiare molti

incroci ottenendo una mappa genetica anche abbastanza dettagliata. Se però si studiano mammiferi, il

numero di meiosi è limitato dal tempo di riproduzione e dalle dimensioni della progenie. Inoltre la

probabilità di crossing-over non è uniformemente distribuita lungo il cromosoma.

Hotspot

La frequenza di ricombinazione è una misura della distanza tra due geni, determinando la frequenza di

ricombinazione di diverse coppie di geni si può costruire una mappa delle loro posizioni relative sul

cromosoma.

La corrispondenza tra una mappa genica e la reale distribuzione dei marker sul cromosoma dipende dalla

probabilità di crossing-over che dovrebbe essere pressappoco simile in ogni zona del cromosoma, invece si è

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notato che ci sono dei punti in cui il fenomeno del crossing-over è più frequente che in altri, questi punti

sono detti hotspot. Una frequenza di crossing-over più elevata porta ad una sovrastima della distanza,

viceversa con quelle ridotte.

MAPPE FISICHE

Le mappe genetiche si basano quindi su quelli che sono i geni e le loro distanze, questo tipo di mappe va

bene per i procarioti dove si possono studiare molti crossing-over e permettono la costruzione di una mappa

genetica molto dettagliata grazie anche alla grossa quantità di progenie disponibile, con gli eucarioti è invece

impreciso fermarsi alle sole mappe genetiche in quanto risulterebbero imprecise, si ricorre quindi anche alle

mappe fisiche. Le mappe fisiche vengono sviluppate a partire da:

• Mappe dei siti di restrizione che localizzano la posizione di siti di taglio all’interno della molecola

di DNA da analizzare

• Ibridazione fluorescente in-situ (FISH) dove si ibrida con sonde marcate

• Mappatura mediante STS

Mappe di restrizione

Il modo più semplice per costruire una mappa di restrizione è confrontare le dimensioni dei frammenti

ottenuti tramite digestione del DNA con due endonucleasi specifiche per due sequenze distinte. Il

procedimento consiste nel digerire la molecola di DNA con un enzima di restrizione e successivamente far

correre i frammenti ottenuti mediante elettroforesi su gel di agar, viene ripetuto lo stesso procedimento

anche per il secondo enzima. In questo modo sarà quindi possibile sapere quanti siti di restrizione sono

presenti sulla molecola di DNA ma non la loro posizione relativa. Viene quindi eseguita una doppia

digestione, ossia viene digerita la molecola di DNA con entrambi gli enzimi di restrizione

contemporaneamente e successivamente tramite digestione parziale che fornisce informazioni necessarie

per una mappa completa, ma solo se non sono presenti numerosi frammenti, talvolta in presenza di molti

frammenti si tende a marcare ciascuna estremità di DNA prima di eseguire la digestione parziale e le

dimensioni dei frammenti di digestione parziale visibili permettono di posizionare i siti non mappati relativi

all’estremità della sequenza.

Con la presenza di genomi di grosse dimensioni che hanno molte sequenze di restrizione spesso si preferisce

usare enzimi di restrizione per sequenze più lunghe di 6bp (esempi di enzimi che riconoscono sequenze di

6bp sono EcoRI e BamHI) come ad esempio sequenze di 7 o 8bp che sono più rare usando enzimi come

SapI e SgfI anche se sono noti pochi enzimi che riescono a riconoscere queste sequenze.

Un altro metodo per costruire mappe di restrizione è avvalersi di enzimi di restrizione che riconoscano un

sito 5’-GC-3’ in quanto questo tipo di sito è molto raro nelle cellule dei vertebrati in quanto possiedono

un enzima che aggiunge un gruppo metilico al C del 5’ formando un nucleotide non stabile che viene

sostituito con la T. Vengono quindi usati enzimi di restrizione come SmaI (1 taglio ogni 78kb) e BssHII (1

taglio ogni 390kb). Quando viene eseguita una digestione con enzimi di restrizione più rari si genereranno

frammenti più lunghi che dovranno comunque essere analizzati in elettroforesi su gel di agar, però la

normale elettroforesi non discriminerebbe tra molecole grandi ma con piccole variazioni tra di loro, quindi

viene applicato un capo elettrico particolare dove la carica elettrica si alterna tra due coppie di

elettrodi posti a 45° rispetto alla lunghezza del gel. Questo tipo di elettroforesi si chiama elettroforesi su

gel in campo alternato ortogonale (OFAGE).

Mappatura ottica

Oltre alla tecnica di digestione del DNA tramite endonucleasi ed elettroforesi esiste anche la mappatura

ottica. Con la mappatura ottica si sfruttano sempre quelli che sono i siti di restrizione che però verranno

localizzati direttamente osservando il taglio direttamente dalle molecole di DNA co