Malattie infettive

Utilità dell'inquadramento microbiologico delle malattie infettive

12/10 prof.ssa Pietropaolo

Antibiogramma

La diagnosi microbiologica è una risposta a una domanda precisa: quanto è più precisa e ben formulata tanto più precisa e utile sarà la risposta. La ricerca del mo o di una sua parte (tossina, DNA). Il referto è lo strumento con cui il microbiologo trasferisce le informazioni emerse dall’esame microbiologico: deve essere formulato con estrema chiarezza in modo non equivoco ed essere esauriente. Difficoltà a causa della terminologia non univoca, dei continui aggiornamenti della nomenclatura batterica o della recente introduzione di refertazioni computerizzate.

TBcolor: misura la produzione di INf-γ da parte dell’organismo in seguito all’esposizione al batterio di TBC, poiché è un batterio a crescita lenta, viene fatta su coltura. La PCR ci dice in maniera più rapida se sono positivo o negativo a una certa infezione, sebbene ci possono ancora essere falsi positivi.

Diagnostica diretta

Dimostrazione del materiale patologico: agente patogeno e suoi costituenti

• Quesito preciso: un risultato negativo ha un risultato rilevante
• Quesito generico: il medico non è ben orientato. Indagini su campione possono non facilitare la diagnosi.

Valutazione del campione

• Qualità del campione, se io richiedo espettorato, non può essere sola saliva! Cioè mi devo assicurare in questo caso la cellularità che mi attesta che il campione espettorato è attendibile, o idoneo.
• Gli aspetti macroscopici, per es una meningite, di varia natura, richiede l’esame del liquor, la prima cosa che si vede è limpido o torbido, cosicché prima ancora di sapere la cellularità, comincio a escludere eventuali ipotesi diagnostiche. Dopodiché faccio il vetrino, e vedo il batterio, e magari trovo un diplococco, allora devo vedere se è un gram - (meningococco) o gram + (pneumococco), perché sarà diversa la terapia antibiotica da impostare immediatamente.
• La disponibilità di informazioni.

Conservazione del campione

• Refrigerazione: urine
• Temperatura ambiente
• Termostato

Trasporto del campione

Deve avvenire in tempi e condizioni che non alterino le caratteristiche microbiologiche del materiale patologico

• Terreni di trasporto non colturali
• Terreni di trasporto colturali
• Condizioni di refrigerazione atmosfera

Esame microscopico

• Presenza, forma e disposizione
• Percentuale di elementi differenti tintoriali o morfologici
• Elementi cellulari utili a giudicare l’idoneità del campione e valutare la risposta dell’ospite

L’esame microscopico è la base per impostare altre indagine e può essere condotto:

• A fresco: motilità, dimensioni, forma, capsula
• Previa colorazione: dimensioni, forma, disposizione, particolarità tintoriali, presenza/assenza strutture specifiche, gram +/-, spore o granuli metacromatici

Scarsa sensibilità: limite > 10⁵.

• Non consente un’identificazione di specie
• Colorazione speciali:
• Colorazione negativa: usata quando un organismo od una sua struttura non viene colorata facilmente (in presenza di capsula)
• Colorazione delle spore: richiede calore per facilitare la penetrazione del colorante
• Colorazione dei flagelli: flagelli richiede un mordenzante per ispessire la struttura flagellare

Esame colturale

Il batterio deve crescere su terreno, ciò ci assicura un’identificazione della specie e la determinazione della sensibilità ai farmaci. Importante la MIC (minima concentrazione inibente), e la resistenza ai farmaci che sta venendo fuori in questo periodo.

• Terreni di coltura
• Solidi: per lo studio morfologico
• Liquido: per liquidi biologici normalmente sterili (per es un campione bioptico di tessuto, lo faccio crescere lì, e poi lo metto in terreno solido)
• Selettivi
• Elettivi
• Differenziali: per esempio l’MSA: è un terreno a elevata concentrazione salina per lo stafilococco aureus nel cui terreno cresce bene e dà una colorazione dorata, da cui il nome, inoltre è coagulasi positivo e mi aiuta per la diagnosi
• Incubazione: temperatura, umidità e tensione di O₂

Talvolta sono cromogeni, cioè cambiano colore in presenza del mo, per esempio per Proteus Mirabilis; il terreno CHROM agar Orientation, per isolamento e simultanea differenziazione di patogeni urinari (E.coli – rosa; Klebsiella - blu metallico; Proteus – marrone); il verde malachite è un colorante usato in alcuni terreni di coltura che inibisce i batteri a crescita veloce, come i micobatteri.

Agar sangue

Identificazione

• Morfologia e caratteri tintoriali del mo
• Morfologia della colonia:
• Dimensioni: diametro
• Forma: puntiforme, circolare, filamentosa, irregolare, rizoide, fusiforme
• Rilievo: piatto, sopraelevato, convesso, cupoliforme, umbonato, ombelicato
• Margine: regolare, ondulato, lobato, eroso, filamentoso, arricciato
• Colore: bianco, giallo, nero, arancione, piombo
• Superficie: brillante, opaca, ecc.
• Trasparenza: non trasparente, translucido, trasparente
• Consistenza: burrosa, viscosa, membranosa, friabile
• Saggi biochimico - enzimatico:
• Catalasi: positivo (stafilococchi) o negativo (streptococchi)
• Emolisina su agar sangue
• Produzione di ossidasi
• Test della coagulasi: positivo (staphyl. aureus) o negativo (staphyl. coagulasi neg)
• Utilizzazione del citrato
• Produzione di indolo
• Produzione di decarbossilasi e deaminasi
• Idrolisi degli zuccheri
• Riduzione dei nitrati
• Valutazione delle caratteristiche antigeniche: si ricercano gli Ag, non risente degli antibiotici, ma non ci indica l’antibiotico giusto; agglutinazione al lattice; ELISA; la ricerca di Ag batterici presuppone comunque un sospetto diagnostico preciso:
• Vantaggi
• Rapidità
• Sono superati i problemi legati alla vitalità del microrganismo
• Non risente dell’influenza degli antibiotici: può rappresentare il solo mezzo diagnostico in pazienti trattati
• Svantaggi
• Non consente la valutazione della sensibilità agli antibiotici
• Potere patogeno
• Test per la motilità, che oggi si fa in maniera automatizzata
• Oggi esistono dei sistemi completamente automatizzati per l’emocoltura, detta a campana, ci sono poi delle resine costose, usate solo in ambito pediatrico, che legano l’antibiotico in coltura e permettono la crescita del batterio
• Tipizzazione dei mo
• Profilo biochimico
• Pattern di sensibilità a chemioantibiotici
• Tipo sierologico
• Antigeni gruppo specifici
• Antigeni tipo specifici
• Tipo fagico
• Profilo plasmidico

Protocolli interpretativi: risultati di tipo binario (esito positivo/negativo). Ogni codice identifica un certo patogeno.

Tecniche non colturali

• Ricerca di antigeni
• Evidenziazione di metaboliti batterici
• Ricerca di tossine
• Esotossine
• Agglutinazione al lattice
• Evidenziando l’effetto biologico
• Evidenziando i geni che le codificano
• Endotossine

Metodiche molecolari

• Particolarmente utili per microrganismi difficilmente coltivabili
• Possono fornire una identificazione dell’agente patogeno direttamente nel campione patologico
• Ricerca DNA, RNA ecc
• Utili per mo non coltivabili
• Condizioni di coinfezione virus-batterio
• Infezioni paucimicrobiche
• Infezioni croniche: tramite tecniche molecolari si può ricercare la clamidia, senza ricorrere al dolorose tampone uretrale maschile
• Infezioni latenti: uso tecniche molecolari per identificare infezione da PML, cioè infezione data da un poliomavirus oncogeno latente spesso sovrapposto a HIV (i farmaci biologici, o Ab monoclonali bloccano dei recettori specifici trattando il pz localmente, ma spesso questi farmaci possono favorire la crescita di virus PML latentizzanti

Tempestività della risposta

• Primo giorno: prelievo campione, osservazione macroscopica, esame microscopico, ricerca Ag o sequenze geniche e allestimento colture → REFERTO PRELIMINARE
• Secondo giorno: esame delle colture: subcolture per identificazione, test di sensibilità agli antibiotici, test rapido
• Terzo giorno: identificazione e risultati dei test di sensibilità e interpretazione dei dati di laboratorio resistenza → REFERTO DEFINITIVO

Tabella riassuntiva

Tabella riassuntiva modalità

Antibiotico-resistenza

Uno stipite batterico è resistente quando è in grado di moltiplicarsi in presenza di concentrazioni di farmaco che risultano inibitorie per la massima parte degli stipiti della stessa specie. Il batterio si moltiplica in presenza di concentrazioni del farmaco pari a quelle massime raggiungibili nel corso dell’impiego terapeutico. Tanto più è bassa la MIC più il farmaco sarà meno tossico e quindi preferito dal medico. La resistenza è genetica!

Terminologia

• Agente antibatterico: composto in grado di interferire con la crescita e la moltiplicazione batterica; contrariamente al disinfettante, è attivo solo verso batteri metabolicamente attivi.
• Antibiotico: molecola naturale a basso P.M., prodotta dal metabolismo di un microrganismo: actinomiceti (Streptomyces), Miceti (Penicillium, Cephalosporium), in grado di inibire la crescita di altri microrganismi e/o causarne la distruzione.
• Chemioterapico: farmaco ad attività antibatterica prodotto per sintesi chimica (analogo strutturale di un antibiotico). La chemioterapia antibatterica si basa sul principio della tossicità selettiva: formulato per la prima volta da Paul Ehrlich, in base al quale una sostanza può essere utilizzata nella terapia di una malattia infettiva solo se è nociva per il microrganismo e relativamente innocua per le cellule dell’ospite.

La resistenza predice il possibile fallimento della terapia antibiotica, essa può essere:

• Naturale o intrinseca: insensibilità ad un farmaco che si estende a tutti gli stipiti di una data specie:
• Al mo può mancare la struttura su cui agisce l’antibiotico (es: Gram – vs penicilline; Clamidie e Micoplasmi sono privi della parete cellulare e quindi insensibili ai β-lattamici).
• La struttura della parete cellulare o la membrana citoplasmatica di un microrganismo possono essere impermeabili ad un antibiotico.
• Estrinseca o acquisita: generalmente selezionata da una precedente esposizione del patogeno all'antibiotico. Si attua secondo diversi meccanismi di cui i principali sono:
• Modifica del target batterico
• Produzione da parte del batterio di enzimi inattivanti l’antibiotico
• Ridotta permeabilità all'antibiotico
• Efflusso dell'antibiotico dalla cellula grazie ad un sistema di pompe attive (che richiedono E)

Se raggiungo a livello sierico delle concentrazioni di antibiotico il mo non ne risente e sopravvive, inoltre se ho un ceppo resistente la terapia antibiotica sarà inefficiente: streptococchi meticillino-resistenti, il 50% delle infezioni nosocomiali è resistente ad almeno 1 antibiotico. L’esito per il 90% dei pz con TBC multiresistente è infausto. Inoltre l’abuso ha aumentato l’incidenza e la selezione delle mutazioni inducenti la resistenza. L’esame batteriologico consente l’identificazione dell’ente etiologico, così permettendo la scelta del farmaco antibatterico adatto.

• Ogni antibiotico o chemioterapico possiede uno spettro d’azione antibatterico in base al quale è possibile prevedere in quali infezioni il suo impiego può essere efficace.
• Questa previsione, naturalmente, è possibile automaticamente solo nel caso di infezioni sostenute da batteri uniformemente e costantemente sensibili a determinati antibiotici (Haemophilus influenzae, Salmonella, spirochete…).

Se mette in evidenza stipidi diversamente sensibili, che danno luogo a mutanti è necessario completare il quadro con la ricerca di diversi Ab.

Antibiogramma

È il test impiegato per determinare l’efficacia antimicrobica di un farmaco nei confronti di specifici patogeni. Viene usato per identificare l’antibiotico efficace e la dose più opportuna. È uno dei test più importanti che viene comunemente eseguito nel laboratorio di microbiologia clinica a causa delle sue implicazioni terapeutiche immediate.

Nella pratica clinica questo tipo di test, essenziale per una corretta terapia, permette di:

1. Evidenziare quali siano i farmaci più efficaci nei confronti di un certo microrganismo patogeno
2. Fornire una stima della dose terapeutica più opportuna per la cura della malattia infettiva.

I test di antibiotico-sensibilità

• Vengono effettuati in vitro, e misurano la risposta (crescita) di un microrganismo isolato nei confronti di uno o più antibiotici.
• Sono eseguiti in condizioni standardizzate (la realizzazione tecnica deve rispondere a criteri perfettamente standardizzati, periodicamente aggiornati da diversi comitati Nazionali, CLSI ecc.) per garantirne la riproducibilità dei risultati.
• I risultati di questi tests debbono essere usati per guidare la scelta dell’antibiotico da adottare, alla quale contribuiscono anche le informazioni cliniche e l’esperienza professionale.
• Obiettivo dei tests per la determinazione della antibiotico-S è: predire il successo od il fallimento in vivo della terapia antibiotica.

I test si effettuano in vitro:

• Isolare il mo (la colonia deve essere pura, solo quel mo)
• Selezionare una batteria di antib da saggiare
• Sensibile a un trattamento standard: streptococchi: penicillina, non si fa l’antibiogramma!!
• Nell’urina da catetere vanno considerate patogene anche colonie piccole, e allora va fatto l’antibiogramma che non si fa.
• La MIC è importante perché posso curare il pz senza far venire tossicità al pz.

S=sensibili; I:intermedio; R: resistenza

Il laboratorio di microbiologia deve:

• Identificare il microrganismo responsabile dell’infezione a livello di specie
• Esprimere la sensibilità batterica
• Selezionare un’appropriata batteria di antibiotici da saggiare orientati alla terapia

Un antibiogramma è inutile:

• Quando il microrganismo isolato non può essere ragionevolmente considerato responsabile di una infezione nel sito in cui il campione è stato prelevato (flora commensale o contaminante: Streptococchi orali o H. parainfluenzae isolati da secrezioni bronchiali) o quando il numero di CFU/ml è inferiore alla soglia significativa (nelle urine o nelle secrezioni bronchiali).
• Quando il patogeno isolato appartiene ad una specie che è costantemente sensibile ad un trattamento standard, o per la quale non esiste una correlazione fra l’attività in vitro ed in vivo.
• In quelle infezioni cutanee dove è indicato un trattamento topico o chirurgico.

Un antibiogramma è utile:

• Emocoltura: l’antibiogramma deve essere eseguito tempestivamente nei campioni positivi
• Liquor
• Tratto respiratorio superiore ed inferiore: espettorato, lavaggio bronco-alveolare (BAL)
• Campioni da ossa o articolazioni, urina da catetere, fluidi da puntura: quando si sospetti un’eziologia batterica
• Infezioni ospedaliere accertate: anche per obiettivi epidemiologici

Misura della sensibilità batterica ad un antibiotico

Il metodo più corretto per determinare l’efficacia di un antibiotico nei confronti di un microrganismo consiste nello stabilire, per ogni farmaco antibatterico:

• La concentrazione minima inibente (MIC)
• La concentrazione minima battericida (MBC)

Questo metodo permette di stabilire una scala di attività dell’antibiotico per diverse specie batteriche. MIC: (Minimal Inhibitory Concentration): è una misura quantitativa dell’attività di un antibiotico verso un determinato batterio. Definita come la più bassa concentrazione di antibiotico in grado di inibire la crescita batterica visibile.

MBC: (Minimal Bactericidal Concentration): è...