Malattie del sangue

L'ERITROPOIESI

Li eritrociti sono degli elementi corpuscolati del sangue periferico privi del nucleo, presenti in concentrazione di 4.000.000-6.000.000/mm , dalla forma discoidale, con un diametro di 7.5 μm, con un'emivita di 120 giorni e contenenti emoglobina; nella colorazione May-Grunwald-Giemsa dello striscio di sangue appaiono formati da un alone centrale chiaro circondato da un anello più scuro.

Gli eritrociti si originano all'interno del midollo osseo a partire dalle cellule staminali ematopoietiche (HSC, Hemopoietic Stem Cell) che differenziano nel Common Myeloid Progenitor (CMP), che a sua volta dà origine al Colony Forming Unit-Granulocyte Erytrocyte Monocyte Megakaryocyte Progenitor (CFU-GEMM), il quale, opportunamente stimolato, è capace di originare quattro lineage cellulari diversi; nel caso dell'eritropoiesi, il CFU-GEMM si differenzia nel Megakaryocyte Erytroid Progenitor (MEP), poi nel Burst Forming Unit-Erythroyd (BFU-E) e nel

Colony Forming Unit-Erythroyd (CFU-E) che sono dei progenitori unidifferenziati che, se coltivati in vitro, sono capaci di generare esclusivamente dei precursori noti eritroblasti che maturano prima in reticolociti e poi in eritrociti. Il progenitore BFU-E (Burst Forming Unit-Erythroyd) è dotato di un potenziale replicativo molto elevato e produce vari foci di sviluppo, mentre il progenitore CFU-E (Colony Forming Unit-Erythroyd) è caratterizzato da un potenziale replicativo minore, da un maggiore stato di differenziamento e dalla produzione di un unico focus di sviluppo; tali cellule possono essere riconosciute all'interno delle piastre di crescita per la loro caratteristica morfologia e per il colore rosso dato dall'emoglobina grazie al microscopio ottico rovesciato (sono fatte crescere in un mezzo semisolido come la metilcellulosa in presenza di specifici fattori di crescita). Il progenitore CFU-E matura in precursori intermedi rappresentati dai proeritroblasti.

daglieritroblasti basofili, dagli eritroblasti policromatofili e dagli eritroblasti ortocromatici per poigiungere alla formazione dei reticolociti che sono liberati nel sangue periferico dovecompletano la loro amturazione ad eritrociti, in particolare il processo di maturazione edifferenziamento granulocirtario prevede una riduzione del diametro della cellula, unamodificazione della forma della cellula che da rotonda diventa discoidale e l’eliminazionedel nucleo nel passaggio dallo stadio di eritroblasto ortocromatofilo a reticolocita.

I reticolociti rappresentano la forma ancora immatura degli eritrociti, sono presenti sia alivello del sangue periferico (circa 0-2-0.5%) che del midollo osseo e presentano ancoradelle tracce importanti di mRNA; il loro numero può aumentare enormemente nellecondizioni patologiche caratterizzate da un’elevata capacità eritrosintetica.

N.B. Il termine “eritrone” indica l’intero comparto delle cellule

La regolazione trascrizionale dell'eritropoiesi prevede l'intervento del fattore EKLF il cui aumento induce il differenziamento del MEP in senso eritroide in associazione all'inibizione della trascrizione del fattore FLI-1 che è invece importante per il differenziamento in senso megacariocitario e favorisce la maturazione terminale delle cellule eritroidi; inoltre, altri fattori di trascrizione rilevanti nel processo maturativo dei progenitori eritroidi sono rappresentati da GATA-1 e da GATA-2.

Nell'eritropoiesi rivestono un ruolo importante lo Stem Cell Factor (SCF) che si lega al recettore c-Kit promuovendo il differenziamento dei progenitori eritroidi nelle fasi più precoci e l'eritropoietina (EPO) che promuove la proliferazione ed il differenziamento dei progenitori eritroidi e che è prodotta dal rene in condizioni di necessità quando l'ossigenazione tissutale scende sotto una determinata soglia (segnalazione a feedback).

N.B.

I topi knock-out per l'eritropoietina o per il suo recettore sviluppano una severa anemia che li conduce alla morte. La linfocitopoiesi: i linfociti si originano a partire dalle cellule staminali ematopoietiche (HSC) che differenziano in un progenitore noto come MultiPotent Progenitor (MPP) oppure Lymphoid-Myeloid MultiPotent Progenitor (LMPP), il quale a seconda del diverso stimolo a cui è sottoposto può differenziare nella linea linfoide dando origine al Common Lymphoid Progenitor (CLP) che genera i linfociti T e B e le cellule Natural Killer oppure può differenziare nella linea mieloide. A seconda della linea differenziativa, il Common Lymphoid Progenitor va incontro a un differenziamento peculiare: - Nella linfopoiesi B, il Common Lymphoid Progenitor (CLP) rimane a livello del midollo osseo dove subisce il commissionamento ed il riarrangiamento delle catene pesanti del B Cell Receptor (BCR) per poi spostarsi, come linfociti B naive, a livello dei linfonodi che sono.degli organi linfoidi secondari, le cellule B entrano in contatto con un antigene che induce lo switch isotipico e la proliferazione. A questo punto, la cellula B immatura può migrare nel sangue periferico per diventare una cellula della memoria, esprimendo delle immunoglobuline di membrana specifiche. Altrimenti, può migrare nuovamente nel midollo osseo, dove avviene la maturazione terminale a plasmacellula. Per quanto riguarda i marcatori di superficie, il CD19 ed il CD20 sono espressi lungo tutta la linea differenziativa, mentre il CD10 è espresso solo nella popolazione più immatura e il CD38 è espresso nelle plasmacellule. Nella linfopoiesi T, il Common Lymphoid Progenitor (CLP) migra a livello del timo, dove subisce il commissionamento ed il riarrangiamento del T Cell Receptor (TCR). Questo permette lo sviluppo delle varie sottopopolazioni di linfociti T, come i T helper (Th1, Th2 e Th17), i T citotossici, le cellule Natural Killer ed i T regolatori. Durante il processo differenziativo,

queste cellule è molto importante la stimolazione del sistema NOTCH che agisce in tutte le fasi di sviluppo in quanto regola la trascrizione dei fattori di trascrizione come GATA-3, TCF-1 e BCL11b che sono coinvolti nella sopravvivenza, nella proliferazione e nel differenziamento di queste cellule. [Il Common Lymphoid Progenitor CLP è identificato in vivo in quanto è in grado di dare origine a tutte le cellule del sistema linfoide]

La regolazione della linfopoiesi prevede l'intervento di numerosi microRNA che permettono l'indirizzamento dei precursori in al differenziamento in cellule mature e della cellula T naive al differenziamento delle diverse popolazioni.

LE CELLULE STAMINALI MESENCHIMALI STROMALI

Le cellule staminali mesenchimali stromali (MSC) sono un componente fondamentale della nicchia della cellula staminale emopoietica e rappresentano una popolazione eterogenea di cellule che proliferano in vitro formando delle colonie aderenti alla plastica, hanno

Una morfologia fibroblastoide con il nucleo in posizione centrale e possono differenziare in senso osseo, cartilagineo e adiposo. Tali cellule sono presenti nel liquido amniotico, nel sangue cordonale, nella placenta, nel tessuto adiposo, nell'atte materno, nella pelle, nella polpa dentale, nella membrana sinoviale e nel midollo osseo dove rappresentano lo 0.01-0.001% delle cellule nucleate (sono presenti sia a livello della nicchia osteoblastica che a livello della nicchia vascolare) e la loro presenza si riduce in maniera consistente con l'avanzare dell'età dell'individuo.

L'identificazione delle MSC prevede l'utilizzo di criteri morfologici e fenotipici e di approcci di tipo funzionale che sfruttano la loro capacità in vitro di dare origine a tessuto osseo, tessuto adiposo e tessuto cartilagineo, in particolare tali cellule devono:

1. Crescere in aderenza alla plastica quando messe in coltura.
2. Presentare come marcatori di superficie CD73

(glicoproteina ad attività nucleosidasica), CD90 (glicoproteina coinvolta nei processi di interazione cellulare, nell'immunomodulazione e nella tolleranza immunologica), CD105 (recettore del TGF-β), CD166 (glicoproteina coinvolta nel differenziamento osteogenico), CD29 (integrina coinvolta nell'adesione cellulare) e CD44 (recettore dell'acido ialuronico).

3) Non presentare i marcatori CD34 (espresso dalle HSC e dai progenitori emopoietici), CD45 (antigene panleucocitario), CD19 (espresso dai linfociti B), CD14 (recettore per il lipopolissacride espresso dalle cellule monocitarie), CD11b (marcatore granulocitario) e HLA-DR.

4) Produrre un differenziamento in senso osteogenico, condrogenico ed adipogenico. L'isolamento delle MSC è effettuato a partire da un aspirato di sangue del midollo osseo eseguito sulla cresta iliaca posteriore che subisce una separazione su gradiente di Ficoll per ottenere le cellule mononucleate, le quali sono poste in colture.

diffusa a 90° rispetto alla direzione del fascio di luce incidente). Inoltre, vengono utilizzatianticorpi specifici per marcare le MSC e permettere la loro identificazione e quantificazioneattraverso la fluorescenza. Questa tecnica permette di valutare anche l'espressione di specificimarcatori di superficie e di analizzare altre caratteristiche delle cellule, come ad esempio laproliferazione, l'apoptosi e la differenziazione.diffusa a 90°); in questo modo si ottengono dei grafici a dot plot in cui sono riportate in ascissa il Forward Scatter ed in ordinata il Side Scatter in modo da localizzare le cellule di dimensioni minori e con bassa granulosità nella zona in prossimità dell'origine degli assi cartesiani. Inoltre, è possibile discriminare le cellule in funzione della presenza di determinati antigeni mediante l'utilizzo di anticorpi monoclonali marcati con dei fluorofori quali la fluoresceina (FITC che emette luce verde) e la ficoeritrina (PE che emette luce rossa); in questo caso si ottengono dei grafici ad istogramma in cui sono riportate in ascissa la fluorescenza emessa ed in ordinata il numero di eventi registrati in modo da localizzare le cellule con minore espressione dell'antigene in esame in prossimità dell'asse verticale (nella medesima analisi è possibile utilizzare una popolazione di cellule come controllo). Per quanto riguarda ilgli altri tipi di cellule presenti nel corpo umano, come ad esempio le cellule ossee, le cellule muscolari, le cellule nervose e le cellule del sangue. Questa capacità di differenziarsi in diversi tipi di cellule è ciò che rende le MSC così promettenti per la medicina rigenerativa. Inoltre, le MSC sono in grado di modulare la risposta immunitaria del corpo, agendo come un "regolatore" del sistema immunitario. Possono sopprimere l'attività delle cellule del sistema immunitario che causano infiammazione e danni ai tessuti, favorendo invece la guarigione e la rigenerazione. Le MSC possono essere isolate da diversi tessuti del corpo, come il midollo osseo, il tessuto adiposo e il cordone ombelicale. Una volta isolate, possono essere coltivate in laboratorio e poi utilizzate per scopi terapeutici. In conclusione, le MSC sono cellule molto versatili e promettenti che hanno il potenziale di rivoluzionare la medicina rigenerativa. La loro capacità di differenziarsi in diversi tipi di cellule e di modulare la risposta immunitaria le rende un'opzione interessante per il trattamento di numerose patologie e lesioni.