Malattie del sangue

Malattie del sangue: sistema emopoietico

Le cellule staminali

Le cellule staminali sono delle cellule pluripotenti o multipotenti caratterizzate da:

• Capacità di automantenimento o self-renewal, ovvero la capacità di effettuare molteplici e sequenziali divisioni cellulari simmetriche (dà origine a due cellule staminali) e divisioni cellulari asimmetriche (dà origine a una cellula staminale e a un progenitore), comportando una lunga persistenza nell'organismo; presentano quindi una capacità replicativa indefinita.
• Bassa attività proliferativa che permette di limitare la divisione cellulare come meccanismo di protezione dagli errori che si verificano durante la fase di replicazione del DNA (sono cellule quiescenti in fase G₀).
• Elevato grado di plasticità che è la capacità di acquisire l'abilità di differenziare in cellule di un tessuto differente da quello di partenza in particolari condizioni del microambiente.
• Differenziamento, ovvero la capacità secondo cui le cellule figlie possono differenziare in determinati tipi cellulari stabili e capaci di integrarsi funzionalmente nel tessuto a seconda dello stimolo ricevuto; questo processo prevede il silenziamento dei geni connessi alla staminalità e la contemporanea attivazione dei geni connessi al differenziamento.
• Rigenerazione dell'organo o del tessuto di origine in seguito al trapianto (questa caratteristica è molto studiata nei modelli murini di immunodeficienza).
• Entità morfologica.
• Mantenimento all'interno di nicchie staminali che sono sedi anatomiche privilegiate, lontane dagli insulti esterni, che permettono il mantenimento delle caratteristiche di staminalità delle cellule grazie alle caratteristiche topo-funzionali e architetturali del microambiente e alle interazioni con le componenti delle cellule stromali e della matrice.

All'interno del compartimento staminale sono presenti cellule con diversi gradi di staminalità, infatti sono presenti le cellule staminali vere e proprie, i progenitori che presentano delle caratteristiche di staminalità inferiori ma che possono andare incontro a un processo di dedifferenziazione, cioè la possibilità da parte dei progenitori di acquisire nuovamente le caratteristiche della staminalità, e le cellule differenziate.

N.B. Il mantenimento della staminalità è permesso dalla quiescenza, dal self-renewal e dalla differenziazione associati all'inattivazione dei meccanismi di senescenza, di apoptosi, di differenziazione, di necrosi e di anoikis.

Nei soggetti giovani, le cellule staminali funzionali presentano delle normali capacità di self-renewal e degli efficienti sistemi di riparazione del DNA (Non-Homologous End Joining e Homologous Recombination) che permettono un controllo dell'omeostasi tissutale grazie al mantenimento di un basso tasso di mutagenesi, di una buona riserva telomerica e di una normale replicazione; inoltre, le cellule staminali presentano un sistema gerarchico replicativo efficiente grazie alla presenza di segnali provenienti in maniera diretta dalla nicchia staminale grazie al contatto con la matrice extracellulare e le cellule della nicchia e in maniera indiretta grazie alla secrezione di ormoni e di fattori di crescita da parte delle cellule della nicchia.

Nei soggetti anziani, le cellule staminali tendono ad accumulare progressivamente delle alterazioni molecolari del DNA come le mutazioni passenger che possono determinare l'induzione di mutazioni driver, una disfunzione dei telomeri e un'alterazione della capacità replicativa che sono coinvolte nella comparsa delle cellule staminali danneggiate o dei precursori danneggiati che possono andare incontro a un'espansione clonale e alla formazione di un tumore oppure che possono determinare un'insufficienza dell'organo; inoltre, con l'invecchiamento, si verifica una diminuzione del numero delle cellule della nicchia staminale e un'alterazione della matrice extracellulare che contribuiscono alla perdita della senescenza e della capacità di self-renewal e all'acquisizione di un fenotipo differenziato.

L'emopoiesi

L'emopoiesi è il processo che permette la generazione delle cellule del sangue appartenenti a tutte le linee differenziative che comprendono gli eritrociti, i leucociti e le piastrine; tale processo gerarchico presenta al vertice la Long Term Hematopoietic Stem Cell (LT-HSC) che, sotto opportuni stimoli, dà origine alla Short Term Hematopoietic Stem Cell (ST-HSC) e poi a un progenitore noto come MultiPotent Progenitor (MPP) oppure Lymphoid-Myeloid MultiPotent Progenitor (LMPP).

A seconda del diverso stimolo a cui è sottoposto, il progenitore ematopoietico può differenziare nella linea linfoide dando origine al Common Lymphoid Progenitor (CLP) che genera i linfociti T e B e le cellule Natural Killer oppure può differenziare nella linea mieloide dando origine al Common Myeloid Progenitor (CMP), il quale dà origine al Megakariocyte-Erytroid Progenitor (MEP) che genera le piastrine e gli eritrociti e al Granulocyte-Macrophage Progenitor (GMP) che genera i granulociti e i macrofagi. Al gradino inferiore della scala gerarchica sono presenti i precursori che sono delle cellule che presentano una ridotta capacità proliferativa e che si preparano a diventare delle cellule mature completamente differenziate.

N.B. In seguito ad alcuni esperimenti eseguiti sui modelli animali, sono stati scoperti dei percorsi alternativi di differenziamento, ad esempio, in condizioni di emergenza come un'emorragia grave, la Short Term Hematopoietic Stem Cell può differenziarsi direttamente in Megakariocyte-Erytroid Progenitor senza passare attraverso l'intermedio di Common Myeloid Progenitor; inoltre, l'ipotesi più recente dimostra la presenza di varie tipologie di cellule staminali ematopoietiche che potrebbe spiegare almeno in parte la possibilità di bypassare alcuni passaggi differenziativi in caso di necessità.

N.B. Nel corso del differenziamento da cellule staminali a cellule mature si verifica una riduzione della capacità di self-renewal e un aumento della capacità proliferativa.

La cellula staminale ematopoietica non è facilmente riconoscibile dal punto di vista morfologico in quanto, in seguito alla colorazione con May-Grunwald-Giemsa, è caratterizzata da un aspetto simile a un linfocita di medie dimensioni, da una rima citoplasmatica ridotta, dalla presenza di un nucleo molto grande e dall'assenza di specifiche granulazioni citoplasmatiche, ma risulta essere positiva per l'antigene CD34.

La cellula staminale ematopoietica non presenta un marcatore unico anche se il marcatore più comunemente utilizzato è il CD34 che è un antigene di superficie espresso in una piccola percentuale delle cellule del midollo osseo (cellule staminali ematopoietiche attive o in ciclo, cellule vascolari endoteliali ed alcuni fibroblasti) e sembra essere collegato ad alcuni meccanismi di adesione e di homing della cellula staminale ematopoietica (alcune cellule staminali ematopoietiche più primitive possono essere CD34^-); altri marcatori che possono essere presenti sono il CD38 che è una glicoproteina coinvolta nell'adesione cellulare e nella trasduzione del segnale (alcune cellule staminali ematopoietiche possono essere CD38^-), il CD133 (o prominina-1) che è una glicoproteina coinvolta nell'organizzazione della topologia della membrana cellulare e CD90 (o Thy-1) che è una glicoproteina coinvolta nell'interazione tra le cellule e con la matrice extracellulare legata ai processi di apoptosi, metastasi, infiammazione e fibrosi, nei processi di immunomodulazione e nel processo della tolleranza immunologica.

Inoltre, le cellule staminali ematopoietiche risultano essere negative per la presenza del HLA-DR e presentano una bassa espressione del CD117 (o c-Kit) che è il recettore per lo Stem Cell Factor (SCF).

N.B. La cellula staminale ematopoietica è caratterizzata da un'elevata espressione dei geni correlati alla staminalità e da una bassa espressione dei marcatori di differenziamento linea-specifici; inoltre, le cellule staminali CD34⁺ più indifferenziate che non presentano l'espressione dei marcatori di lineage possono revertare alla condizione di CD34⁺ quiescenti sotto determinati stimoli.
[L'antigene CD34 è comunemente utilizzato per la quantificazione, l'isolamento e la manipolazione delle cellule staminali ematopoietiche umane]

I progenitori ematopoietici più precoci sono positivi per la presenza di CD34, di CD38, di c-Kit e di HLA-DR, mentre i progenitori commissionati e le cellule mature sono negativi per la presenza del CD34 ma positivi per la presenza del CD38 e dei marcatori specifici di lineage.

• HSCs: CD34⁺, CD38^-, CD133⁺, CD90⁺, c-Kit^low, HLA-DR^-, Lin^-
• Progenitors: CD34⁺, CD38⁺, c-Kit⁺, HLA-DR⁺
• Precursors and Mature Cells: CD38⁺, Lin⁺

Secondo il vecchio modello, l'emopoiesi è un sistema gerarchico statico, ben determinato e basato sulla presenza di una popolazione ristretta di cellule staminali ematopoietiche caratterizzate dalla capacità di self-renewal, dal potenziale differenziativo multipotente e dalla capacità di attecchire e di ripristinare in vivo l'emopoiesi in ospiti irradiati in maniera letale, mentre secondo il nuovo modello la gerarchia emopoietica è dinamica in quanto le cellule staminali ematopoietiche possono cambiare il loro fenotipo perdendo o riacquistando le caratteristiche di staminalità in dipendenza del rimodellamento della cromatina, del ciclo cellulare e dell'espressione differenziale di alcuni recettori di superficie.

L'isolamento delle cellule staminali ematopoietiche prevede che sia eseguito un aspirato di sangue midollare in presenza dell'anticoagulante EDTA (un agente chelante del Ca²⁺) da un osso caratterizzato da un'elevata attività ematopoietica come la cresta iliaca posteriore del bacino o lo sterno (la sede preferenziale è rappresentata dalla cresta iliaca posteriore). Il sangue raccolto contiene una frazione delle cellule della nicchia, delle cellule staminali ematopoietiche, dei progenitori e dei precursori a diverso grado di maturazione e per isolare le cellule CD34⁺ è necessario eseguire una separazione su gradiente di Ficoll dopo che il sangue è stato diluito 1:2 oppure 1:3 con soluzione fisiologica; in questo modo il sangue diluito si stratifica lentamente sul gradiente di separazione, il quale presenta una densità maggiore rispetto al sangue in modo da non permettere la miscelazione delle due sostanze. Successivamente, il campione è centrifugato a 1500 rpm per 25 minuti in modo da ottenere diversi strati: nella parte inferiore della provetta sono presenti i globuli rossi e i granulociti neutrofili precipitati, circa a metà dell'altezza è presente un anello di colore bianco contenente le cellule mononucleate che comprendono le cellule staminali ematopoietiche, le cellule mesenchimali stromali, i progenitori endoteliali, i linfociti e i monociti.

A questo punto, è necessario attuare una selezione immunomagnetica sulle cellule mononucleate, le quali sono incubate per 30 minuti con degli anticorpi monoclonali diretti contro l'antigene CD34 e collegati a una biglia magnetica dalla parte della porzione del frammento Fc e poi sono lavate con una soluzione tampone per eliminare gli anticorpi che non si sono legati, centrifugate e poi risospese nello stesso tampone; in seguito, la sospensione cellulare è inserita in un sistema formato da un magnete nel quale è inserita una siringa contenente una resina particolare che permette al liquido di fluire in una provetta di raccolta mentre le cellule che presentano gli anticorpi legati sono trattenute all'interno della resina grazie all'azione del campo magnetico. Infine, è eseguito un ulteriore lavaggio con soluzione tampone e poi la siringa è svuotata mediante uno stantuffo in una provetta che potrà essere utilizzata per le successive analisi.

N.B. Il sistema di selezione immunomagnetico può essere impiegato per l'isolamento di numerose tipologie diverse di cellule variando la natura dell'anticorpo monoclonale utilizzato e deve essere eseguito sotto una cappa sterile.

La nicchia staminale emopoietica

La nicchia staminale emopoietica è un ambiente localizzato nel midollo osseo delle ossa lunghe capace di isolare le cellule staminali da stimoli di differenziamento, da stimoli apoptotici e da tutte quelle perturbazioni che ne potrebbero alterare lo stato di staminalità e che permette di proteggere l'organismo da un'eccessiva produzione di cellule staminali regolando l'equilibrio tra la quiescenza e l'attivazione cellulare; la nicchia è formata da cellule del microambiente che nutrono le cellule staminali e mantengono l'omeostasi tissutale, in particolare è possibile riconoscere la presenza di cellule endoteliali dei vasi, di cellule stromali, di fattori di crescita e di citochine prodotti sia dalle cellule della nicchia sia dalle cellule staminali e di cellule neuronali coinvolte nella regolazione della nicchia.

N.B. Il numero di cellule staminali ematopoietiche all'interno della nicchia staminale è altamente regolato grazie all'interazione con i diversi tipi cellulari e con la matrice extracellulare (azione diretta) e dalla produzione di fattori stimolatori ed inibitori (azione indiretta).

Nell'organismo umano esistono due tipi di nicchie staminali ematopoietiche a livello del midollo osseo:

• Nicchia osteoblastica è localizzata in prossimità dei vasi di calibro maggiore e delle arteriole della porzione centrale dell'osso ed è coinvolta nel mantenimento della quiescenza. Questa nicchia è formata dagli osteoblasti, dagli osteoclasti, dai neuroni del sistema nervoso simpatico, dalle fibrille della matrice extracellulare, dalle cellule mature come i macrofagi e le cellule immunitarie, dalle cellule stromali perivascolari, dagli ioni Ca²⁺ e dalle cellule staminali ematopoietiche quiescenti. Il mantenimento della quiescenza è permesso grazie alla secrezione della citochina CXCL12 (riconosciuta dal recettore CXCR4 delle cellule staminali ematopoietiche) e dello Stem Cell Factor (riconosciuto dal recettore c-Kit) da parte delle cellule stromali perivascolari localizzate intorno alle arteriole che è favorita dalle innervazioni delle fibre del sistema nervoso simpatico e dalle cellule di Schwann; inoltre, hanno un ruolo importante anche i megacariociti che producono il TGF-β e la chemochina CXCL4 ed alcuni fattori come Frizzled che si lega al recettore Wnt e come DL1 che si lega al recettore Notch. Altri importanti sistemi di segnalazione per il mantenimento della quiescenza sono la molecola di adesione VCAM-1 presente sugli osteoblasti che si lega al recettore VLA-4 presente sulle cellule staminali ematopoietiche, le caderine, le osteopontine che si legano al recettore CD44 presente sulle cellule staminali ematopoietiche, l'acido ialuronico della matrice extracellulare che è riconosciuto dal recettore VLA-5 presente sulle cellule staminali ematopoietiche dalla fibronectina riconosciuta dalle integrine presenti sulle cellule staminali ematopoietiche.
• Nicchia vascolare è localizzata in prossimità dei vasi di calibro minore e dei sinusoidi del midollo osseo presenti nella periferia delle ossa ed è coinvolta nella proliferazione, nel differenziamento e nella mobilizzazione. Questa nicchia è formata dalle cellule endoteliali, dalle componenti adese alla parete vascolare, dalle fibrille della matrice extracellulare, dei macrofagi, dai megacariociti, dagli adipociti, dai linfociti T regolatori, dalle cellule del sistema nervoso simpatico legate alle cellule di Schwann non mielinizzate e dalle cellule staminali ematopoietiche più prone ad entrare nel ciclo cellulare. L'induzione della proliferazione, del differenziamento e della mobilizzazione sono permessi dagli stessi fattori coinvolti nel mantenimento della quiescenza (SCF e CXCL12) ma è presente una differenza nel microambiente in quanto i sinusoidi presentano una minore pressione parziale di ossigeno e delle fenestrature che permettono il passaggio di cellule mature del sangue che, con meccanismi al momento non conosciuti, possono contribuire alla generazione di cellule staminali ematopoietiche più attivate.

La regolazione dell'emopoiesi

La regolazione dell'emopoiesi è un processo altamente regolato sia intrinsecamente alle cellule sia a livello della nicchia staminale grazie a:

• Produzione di citochine e di fattori di crescita che possono agire con un meccanismo autocrino o paracrino a livello di diversi gradi gerarchici espletando funzioni diverse in quanto sia le cellule più indifferenziate che le cellule differenziate possono presentare lo specifico recettore, in particolare lo Stem Cell Factor (SCF) e la trombopoietina (TPO) sono molto importanti per il differenziamento in senso mieloide, l'IL-3 per il commissionamento in senso megacariocitario-eritroide, il Granulocyte-Macrophage Colony Stimulating Factor (GM-CSF) per il commissionamento in senso granulocito-monocitario, la trombopoietina (TPO) per il commissionamento megacariocitario, l'eritropoietina (EPO) per il commissionamento eritroide, il Monocyte Colony Stimulating Factor (M-CSF) per il commissionamento monocitario, il Granulocyte Colony Stimulating Factor (G-CSF) in associazione a IL-5 ed allo Stem Cell Factor (SCF) per il commissionamento granulocitario, l'IL-7 è importante per l'intero compartimento linfoide, l'IL-2 per il commissionamento.