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• pH minimo è di 4,3 ; attività dell’acqua 0,92

• Tossinfezione : malattia emetica (prende il nome dal più importante sintomo che è il vomito)

riferita all’ingestione di tossine preformate e la sindrome diarroica riferita alla infezione

• Fa parte di un gruppo che prende il nome da questa specie che prevede un’alta omologia

genetica .

ECOLOGIA

• Il suolo è la fonte primaria di contaminazione degli alimenti, ma questo batterio è

ubiquitario. Il percorso di contaminazione per gli alimenti di origine vegetale è diretto,

mentre per quelli animale è indiretta perché è mediata da mangimi. Questi possono trovarsi

in biofilm su impianti e attrezzature per la produzione di alimenti. Per cui, oltre al percorso

di contaminazione da suolo esiste un percorso da contaminazione da biofilm, con il

passaggio delle spore dagli impianti agli alimenti(spore adesive). Ci sono diversi casi di

contaminazione di latte pastorizzato e latte in polvere imputati alla presenza di biofilm.

• I principali vettori sono il riso cotto e gli alimenti vegetali. In generale parliamo di alimenti

che vengono cotti in anticipo e che poi vengono raffreddati lentamente a temperature

maggiore a 4 °C.

FATTORI DI VIRULENZA  Provocata da tossina detta cereulide :

questa è una tossina dodecapeptide , resistente a calore e acidità, la cui produzione inizia

 nella tarda fase esponenziale per vedere il suo massimo nella fase stazionaria. 5

La densità cellulare minima per vedere la sintesi di cereulide negli alimenti è di 10 UFC/g.

 I ceppi emetici per produrre questa tossina hanno bisogna di una T compresa fra 10°C e 37

°C ed è necessaria anche la presenza di ossigeno.

Nello stomaco la cereulide si lega ai recettori HT3 scatenando l’intossicazione in un

 periodo di tempo compreso tra 0,5 e 6 ore (tempo per raggiungere lo stomaco).

Per quanto riguarda la sindrome diarroica sono note 3 tossine:

 • Enterotossina non emolitica;

• Emolisina BL

• Citotossina k

Queste 3 tossine sono caratterizzate dalla natura proteica e dal fatto di essere termolabili.

La densità cellulare minima espressa indifferentemente come cellule o come spore per la

sindrome diarroica è di 10 5 UFC/porzione. Il periodo d’incubazione è compreso fra le 8 e le

16 ore. Le cellule di B. cereus producono le enterotossine in loco, prodotte anche

all’interno dell’alimento, ma queste sono inattivate dalla cottura (se deve essere consumato

cotto) o, comunque, sono in genere inattivate da bassi valori di pH nello stomaco, dove

danneggiano la membrana dell’intestino tenue.

Per quanto riguarda il controllo :

4. Basse temperature  4°C per i ceppi non psicrotrofici.

5. Applicazione di un efficace sistema HACCP;

6. Riduzione Ph;

7. Riduzione a.w.

CLOSTRIDIUM PERFRINGENS

Letteralmente significa “spaccare tutto”

• Bacilli, Gram +, sporigeni, anaerobi(possono crescere anche a basse concentrazioni di

ossigeno)

• pH limite 5,5;

• Questo batterio causa una tossinfezione con un andamento bifasico:

a. infatti a poche ore dall’infezione si possono osservare i primi sintomi causati dalle

tossine preformate nell’alimento.

b. Successivamente dopo 16 ore si osserva una riesacerbazione (significa sintomi più

forti) dovuta alla moltiplicazione delle cellule vegetative nell’organismo e delle

enterotossine in loco.

I sintomi sono caratterizzati da dolori addominali, nausea e diarrea acuta.

• Ci sono 4 possibili tipi di enterotossina che nell’ambito della specie si distinguono in 5

gruppi dalla lettera A alle lettera E.

• Le tossine A,C,D causano diarrea acuta.

• Le tossine vengono prodotte nelle ultime fasi di sporulazione( Da stato vegetativo a

conservativo). Quando la cellula madre detta anche sporulante va incontro a lisi vi è il

rilascio di queste enterotossine.

• Per certi aspetti sono assimilabili a C. botulinum. È necessaria l’azione della tripsina che è

necessaria per attivare la tossina, la quale si lega alle membrane degli enterociti formando

canali attraverso i quali passano acqua e ioni.

ECOLOGIA

• Dal punto di vista ecologico è ubiquitario, frequentemente viene riscontrato nelle acque,

nel suolo, nei vegetali, ma anche nel tratto gastrointestinale di uomo e animali.

• In genere la contaminazione degli alimenti avviene in seguito al contatto con il suolo o con

materiale fecale.

• Una volta giunti sugli alimenti ( ricchi di proteine) possono crescere in essi purché la

temperatura sia compresa tra 12 e 50 °C.

• In questo tipo di alimenti come carne, sono in grado di raggiungere in poche ore cariche

superiori a 10 6 UFC/g(dose infettiva minima)ma la condizione perché si moltiplichi è

soprattutto la temperatura al di sotto di 4 gradi la moltiplicazione non avviene.

• Alimenti vettori sono carni e derivati quando sono preparati e consumati in momenti

distanti fra di loro e per i quali dopo la cottura non sia stata applicata una corretta

refrigerazione. Altri alimenti vettori sono alimenti crudi o non cotti adeguatamente.

• Un alimento che contiene spore di c. perfringers ingerito subito dopo la cottura nel

momento in cui arriva nell organismo le spore non germinano perché esse trovano delle

condizioni sfavorevoli, viceversa le cellule vegetative possono sporulare nell’intestino e

quindi produrre in loco le tossine. Un esempio è rappresentato dalla carne

Durante questo tempo si applica il raffreddamento della carne, quindi da 70 °C si va a temperature

che permettono la germinazione della spora e la moltiplicazione della cellula con ulteriore

produzione di spore nell’alimento stesso, tipo se l’alimento lasciato raffreddare lo mettiamo in frigo.

Quando c’è questa sporulazione ci ha la produzione di tossine.

MISURE DI CONTROLLO (sovrapponibili a quelle viste per C. Botulinum.)

• Innanzitutto essendo un ubiquitario è difficile impedire la contaminazione iniziale.

• Una modalità di controllo consiste nel ridurre la contaminazione di vegetali dal suolo, di

carne e latte con materiale fecale

• rispetto delle buone pratiche di processo e l’adozione di trattamenti termici che inattivano le

spore.

• Queste spore possono essere inattivate da un trattamento termico blando, tipo 60°C per

15 minuti.

• Un controllo importante consiste nell’attuare un raffreddamento rapido degli alimenti

pastorizzati a lunga conservabilità.

• Fondamentale è il controllo delle basse T;

• è possibile acidificare l’alimento in maniera biologica o chimica

• ridurre il valore di a.w. al di sotto di 0,93.

ALTRE INTOSSICAZIONI ALIMENTARI :

- AMMINE BIOGENE

- MICOTOSSINE: micotossicosi acute e croniche.

- TOSSINE ALGALI

AMMINE BIOGENE

Composti azotati organici che possono avere struttura aromatica eterociclica o alifatica

basso peso molecolare e con un carattere basico. Prodotti dai microrganismi in seguito a

decarbossilazione di determinati a.a. precursori. Questa operazione è catalizzata da

enzimi detti decarbossilasi. La produzione di ammine da parte dei microorganismi è uno

dei meccanismi di difesa dalle condizioni di acidità. Infatti nella decarbossilazione a livello

citoplasmatico vi è consumo di protoni . questo consente alla cellula di risparmiare energia

nell’esporto di protoni (ATPasi). Visto che queste ammine una volta prodotte nel

citoplasma vengono esportate , contribuiscono a non far abbassare eccessivamente il pH

extracellulare. Vi sono esempi di a.a. precursori e ammine come istamina prodotta da

istidina, tirammiana dalla tisossina, la triptamina.

DISTIBUZIONE, PREVALENZA E ADATTAMENTO AMBIENTALE DEI PRINCIPALI

MICROGANISMI PATOGENI VEICOLATI DEGLI ALIMENTI

L'istamina è una sostanza normalmente prodotta che funge da messaggero per molte

funzioni biologiche (processi immunitari, infiammatori e cardiaci). Questa molecola, però, è

il precursore di molte allergie. Abbiamo detto che molti microrganismi possiedono le

decarbossilasi, le quali riescono ad agire su diversi amminoacidi per portare alla

formazione delle ammine .

Qual è il significato biologico della produzione delle ammine?

La produzione di ammine è uno dei meccanismi di difesa dalle condizioni di acidità in

quanto comporta il consumo di H: la cellula veicola l'amminoacido al suo interno, consuma

protoni, e la espelle come ammina biogena .

Effetti acuti

Orticaria, arrossamenti localizzati, nausea, dispnea ( difficoltà respiratoria ), sudorazione

eccessiva, palpitazioni, mal di testa, effetti sulla pressione arteriosa (in aumento e in

decremento) .

Tra le ammine, la tiramina, la 2-feniletilammina e l'istamina sono quelle più

frequentemente riportate per quanto riguarda i sintomi sopra citati .

Possono causare intossicazioni severe, soprattutto su soggetti ipersensibili, o soggetti nei

quali gli enzimi naturalmente coinvolti nella detossificazione da ammine biogene (ammino-

ossidasi) sono inibiti.

L'inibizione di questi enzimi, può essere riscontrata in corrispondenza

o dell'assunzione di particolari farmaci che sono a base d’inibitori di mono ammino-

ossidasi.

Con l'assunzione di bevande alcoliche.

o Inoltre bisogna considerare che, l'azione delle ammino-ossidasi, può essere

o depotenziata dalla presenza di quantità rilevanti di DIAMMINE-ALIFATICHE come

ad putrescina e cadaverina (hanno un’alta soglia di percezione) .

Effetti cronici

1. Per quanto riguarda gli effetti a lungo termine delle ammine biogene, alcune di

essere sono precursori di sostanza cancerogene. Alcune ammine reagiscono con i

nitrati andando a formare le nitrosammine (pro-cancerogene) .

2. Un altro effetto a lungo termine è la stimolazione della crescita delle cellule

tumorali; questo sono spesso associate agli alimenti, in particolare prodotti ittici, sia

" freschi " che trasformati .

Ci sono ammine che vengono usate come indicatori di qualità, quindi rilevando la loro

concentrazione si riesce a risalire alla vita effettiva di un certo prodotto ittico. Per quanto

riguarda questi prodotti, è abbastanza famosa, l'intossicazione sgombroide tra i cui sintomi

ricordiamo orticaria e arrossamenti.

Altri alimenti in cui sono presenti le ammine biogene, sono in generale alimenti

fermentati , in primis i formaggi, infatti si fa riferimento a formaggi che hanno una

maturazione medio-lunga, i prodotti carnei fermentati , il vino , la birra e gli insilati.

Ovviamente in tutte queste sostanze per causare intossicazione, le ammine biogene

devono essere presenti in concentrazioni maggiori rispetto alla soglia che può variare da

individuo a individuo .

I limiti di queste sostanze negli alimenti, in realtà, se si va a vedere il regolamento UE del

2005, si rinvengono limiti solo per l'istamina e solo per quanto riguarda i prodotti ittici. Per i

prodotti ittici freschi il limite d’istamina è di 100 mg/KG, mentre per quanto riguarda i

prodotti ittici trasformati è tollerato un limite di 200 mg/Kg.

Fra i prodotti finali della proteolisi, sono proprio gli amminoacidi, e quindi a parità di

condizioni ci si aspetta che maggiore è la concentrazione di amminoacidi liberi in un

alimenti, maggiore sarà la concentrazione delle ammine biogene .

Dopo il pesce, i formaggi non freschi rappresentano la classe di alimenti più

frequentemente associati a intossicazione da ammine biogene. Il limite tossicologico è

abbastanza controverso, molti ricercatori concordano sul fatto che considerando la singola

ammina, la sua concentrazione non dovrebbe superare i 100 mg /Kg; tutto sommato c'è

un certo accordo sul fatto che la somma complessiva non supera il limite di 900 mg/Kg.

Uno studio riferito al pecorino abruzzese, prodotto da formaggio pastorizzato , e usando

batteri lattici starter, ha evidenziato un concentrazione di ammine biogene totali maggiore

di 900 mg/Kg. Un altro studio condotto su un formaggio chiamato ASINO, ha evidenziato

una concentrazione totale di ammine biogene, di circa 1600 mg/Kg, con la concentrazione

individuale d’istamina, tiramina, cadaverina e putrescina maggiore di 100 mg/Kg.

Un altro formaggio, la robiola di Roccaverano è caratterizzata da alte concentrazione di

tirannia e istamina.

Se consideriamo i formaggi, il livello quantitativo delle ammine biogene è variabile e

o influenzato da vari fattori: il tipo e la qualità del latte di partenza, la presenza o

l'assenza di un trattamento termico del latte, la sezione del formaggio, le condizioni

di maturazione (intese come durata e temperatura).

A Proposito della durata di maturazione il livello generalmente aumenta.

o Altro fattore è l'eventuale presenza di operazioni fatte al termine della maturazione;

o ci si può riferire a trattamenti come la grattugiatura, l'affettatura .

Altro fattore è la presenza di una confezione che custodisce il formaggio durante la

o sua "vita commerciale" e anche il tipo di materiale usato.

Altro fattore ancora, sono le condizioni del limite della shelf ife, ovvero condizioni di

o tempo e temperatura, in particolare ci si aspetta che il contenuto di queste sostanza

sia maggiore man mano che la shelf - life è più elevata, soprattutto il formaggio

viene tenuto ad una temperatura medio-elevata .

Altro fattore che influenza sia qualitativamente che quantitativamente, è il numero e

o il tipo di microrganismi che vengono coinvolti nella caseificazione . Infatti, essi sono

i principali fattori che causano la formazione delle ammine, d'altra parte però, ci

sono microrganismi, che sia durante la trasformazione che durante la shelf - life , o

addirittura a livello intestinale, possono trasformare le ammine biogene in aldeidi .

Com'è possibile controllare il livello di ammine nei formaggi ??

L'uso di basse temperature, si possono usare anche alte pressioni idrostatiche, radiazioni ,

atmosfera controllata, additivi, e colture amino ossidasi positive o negative .

Tutti questi interventi, in realtà effettuano un controllo indiretto sulla produzione di ammine

perché in realtà sono tutti mirati a tenere sotto controllo microrganismi potenziali

contaminanti, come enterobacteriacee e pseudomonadacee in grado di decarbossilare gli

amminoacidi.

Infine, il controllo più importante, consiste nella scelta di colture starter che non devono

possedere, decarbossilasi specifiche per amminoacidi come istidina, tirosina, Triptofano …

Un’altra caratteristica ricercata nei microrganismi utilizzati come starter. Nel gruppo dei

NOLAB, sono stati riscontrati anche batteri lattici in grado di ossidare le ammine, e quindi

un idea per tenere sotto controllo la formazione di queste sostanze potrebbe consistere

nell'aggiunta di batteri lattici non starter selezionati per l'assenza di decarbossilasi

specifiche e/o la presenza di ammino-ossidasi .

ALTERAZIONI DEGLI ALIMENTI

I latti fermentati sono caratterizzati da un ambiente con ph < 4.6, da un’alta densità

cellulare (>10 ) di batteri lattici vivi e vitali, e questi sono degli ostacoli alla proliferazioni di

8

microrganismi indesiderati .

La problematica è legata al fatto che sono dei prodotti che si conservano per 30-40 gg in

frigo (è una shelf ife lunga), ed è un alimento che si consuma senza cottura .

I potenziali patogeni che si ricercano nei latti fermentati sono: SALMONELLA (deve essere

assente in 25g di prodotto ), LISTERIA MONOCITOGENES (con una densità inferiore a

10^2 UFC/g) , STAFILOCCOCUS AUREUS (ASSENTE in un grammo di prodotto ) .

Questi limiti sono criteri di sicurezza alimentare.

Questi patogeni sono in realtà tutti asporigeni, e siccome i latti fermentati si

 producono da latte pastorizzato, per cui se la pastorizzazione non viene effettuata

correttamente ci può essere problema inerenti a questi patogeni .

Anche quando la pastorizzazione viene effettuata correttamente esiste una certa

 probabilità di ricontaminazione . Ad esempio, listeria monocitogenes può

contaminare il latte o anche il prodotto finito in seguito al contatto con utensili

colonizzati da biofilm. Stafiloccoccus aureus è un normale contaminante della pelle,

delle cavità nasali, dei capelli ecc …

Precisamente se consideriamo quei latti fermentati prodotti a livello artigianale,

 sebbene abbiano delle difese intrinseche rappresentate soprattutto dal gran numero

di batteri presenti, possono essere soggetti a contaminazioni, proprio ad opera

dell'operatore .

Un altra probabilità di ricontaminazione deriva dal contatto con frigoriferi sporchi ,

 chiaramente ci si riferisce a prodotti fatti in casa . Un prodotto può essere

rappresentato da quelli yogurt presenti in confezioni da mezzo litro, anche se questi

vengono forniti, oltre con il sigillo classico, anche con dischetti di plastica che si

devono mettere sopra per evitare ricontaminazioni .

Sicuramente è importante la giusta temperatura di refrigerazione; conservare questi

prodotti tra 0 e 4 gradi , per lo meno inibisce la crescita di salmonella e stafiloccucs aureus

, mentre non inibisce quella di listeria dato che è psicrotrofico .

Per quanto riguarda le alterazioni dello yogurt , possiamo considerare la scarsa o

eccessiva acidità , presenza di rigonfiamenti sul vasetto, la presenza dì odori o sapori

anomali, la sineresi ed ammuffimento

La scarsa acidità di uno yogurt , può essere causata o da un modesto sviluppo

o degli starter, oppure da un'eccessiva areazioni nel corso della fermentazione. Il

modesto sviluppo degli starter, a sua volta, può essere causato dalla presenza di

antimicrobici, ad esempio residui di antibiotici nel latte, lisozima presente in tutti i

latti, ma in concentrazione variabile a seconda del tipo di latte .

Il modesto accrescimento dei microrganismi può essere dovuto ad un trattamento

o effettuato in maniera non idonea .

Inoltre il modesto sviluppo degli starter, può essere indice di una infezioni in corso.

o L'eccessiva acidità dello yogurt può essere causata da un elevata densità cellulare

o iniziale degli starter, un tempo di fermentazione prolungato, ma anche da un

raffreddamento troppo lento al termine della fermentazione.

La presenza di gas nel vasetto è causata soprattutto da lieviti che si sono

o moltiplicati nel prodotto, lieviti provenienti da frutta non ben risanata o dalla stessa

preparazione starter, provenienti anche da attrezzature non ben sanificate.

I sapori e gli odori anomali, posso essere causati da starter contaminati, ad

o esempio nella preparazione starter ci può essere una minima densità cellulare di

lieviti, i quali, se si sviluppano, possono causare odori e sapori anomali. Un altra

usa di questi odori, può essere l'uso di starter in proporzione scorretta,

precisamente lactobacilli e streptococchi.

Infine l'altra causa di odori e sapori anomali, può essere l'applicazione di una

o fermentazione inadeguata, un esempio può essere l'utilizzo di una temperatura

scorretta.

La sineresi: il latte fermentato viene ottenuta, senza sottrazione di siero, però alcune volte

nei latti fermentati, si verifica l'espulsione di siero, e si rinviene sulla superficie del

prodotto. Questo fenomeno può avere una causa fisica o chimica, oppure biologica.

Ad esempio un residuo secco del latte, scarso, inferiore al 12%, può causare

questo fenomeno.

Può essere anche causato da un raffreddamento eccessivamente rapido, al

termine della fermentazione .

La causa biologica della sineresi consiste nella potenzialità di alcuni batteri del

genere BACILLUS di svilupparsi nel latte fermentato, perché sporigeno. Può

rilasciare spore, che una volte germinate, resistono al trattamento termico, ed

hanno attività proteolitica, ergo la fuoriuscita di siero dal coagulo.

In casi come questi si rende necessario il lavaggio e sterilizzazione di tutte le

apparecchiature utilizzate se si vuol evitare la ricontaminazione .

L'ammuffimento non è tanto frequente , però si verifica in quelle confezioni che vengono

aperte e poi conservate in frigo, viceversa non vi è contaminazione di muffe all'apertura

del prodotto .

Le muffe come i lieviti derivano da frutta contaminata, e per controllarle, si può aggiungere

acido sorbico o sorbato 2g/kg , solo in yogurt che contengono frutta; teniamo conto che

l'acido sorbico è attivo contro le cellule eucaristiche soprattutto , e precisamente usando

questo additivo, oltre che a tenere sotto controllo le muffe, si tengono sotto controllo i lieviti

.

Altre alterazioni microbiche dei latti fermentati, sono:

• una dovuta allo sviluppo di un batterio sporigeno che si chiama ALICICLO

BACILLUS ACIDIPHILUS, sporigeno, si sviluppa ad un pH di 2,9 e determina

alterazioni di gusto ed aroma .

• Si possono sviluppare anche batteri acetici, i quali sono tra i batteri più acidofili e

per altro riesco a metabolizzare anche l'acido lattico, il principale metabolita nella

fermentazione. La sviluppo di questi batteri è evidenziato da una restrizione della

confezioni.

Lezione n: 12 FORMAGGI

Esistono dei parametri dei formaggi che, in un certo senso, sono a noi favorevoli in quanto

sfavoriscono la crescita di microorganismi indesiderati. Quali sono questi parametri? Sali, eventuali

presenza di un microbiota competitivo (eventuale perché i formaggi si possono anche produrre

senza microorganismi starter) che può essere rappresentato da microorganismi starter, ma se

prendiamo formaggi con un certo periodo di maturazione possiamo considerare come microbioti

competitivi i batteri lattici non starter e altri microorganismi avventizi. Un altro ostacolo è l’attività

dell’acqua tenuto conto che il valore di questo parametro diminuisce man mano che il tempo di

maturazione aumenta. È ovvio che i formaggi freschi presenteranno dei valori di attività dell’acqua

compatibili con la crescita di molti e diversi microorganismi. In effetti , i formaggi freschi sono

quella categoria che presenta il maggiore rischio per il consumatore. D’altra parte, a contrapporsi a

questi ostacoli, ci sono degli aspetti negativi di questi prodotti come :

I formaggi sono consumati senza alcun trattamento termico, in particolare i problemi microbiologici

più importanti sono posti da formaggi con un contenuto di acqua piuttosto elevato e che si

conservano in condizioni refrigerate per più di 5 giorni. I più frequenti microorganismi patogeni

sono listeria monocitogenes, salmonella, strafilococcus aureus, clostridium e poi ci sono delle

sostanze prodotte da microorganismi come le aflatossine e le ammine biogene.

Per quanto riguarda i formaggi per controllare lo sviluppo dei patogeni è necessario un controllo

della qualità microbiologica del latte di partenza. Infatti, anche se si prevede di pastorizzare il latte,

bisogna fare comunque attenzione a tale parametro, perché se il latte è molto contaminato una

parte dei microorganismi indesiderati potrà resistere alla pastorizzazione.

Uno strumento importante per il controllo dei formaggi è la pastorizzazione. Essa è come se fosse

un’arma a doppio taglio, perché se non viene accompagnata da altre misure può aprire il campo a

patogeni come Listeria Monocitogenes che può arrivare a contaminare in una fase successiva alla

pastorizzazione e potrebbe contaminare il formaggio quando esso non può essere ancora

chiamato formaggio (pensiamo al problema dei biofilm nel semi – lavorato ). A parità di durata

della maturazione il formaggio ottenuto da latte crudo deve essere considerato come un alimento

che espone a un rischio maggiore rispetto a un formaggio analogo ottenuto a partire da latte

pastorizzato. Man mano che la maturazione va avanti le differenze quantitative tra i rischi

microbiologici tra queste 2 categorie di formaggi si vanno attenuando.

All’inizio della maturazione abbiamo formaggio ottenuto a partire da latte crudo e formaggio

ottenuto a partire da latte pastorizzato (puntino più in basso). Poi succede che man mano che

aumento il T.M. queste differenze diventano sempre più attenuate come dimostrano le due linee,

che si avvicinano tra di loro.

Importante è mantenere alti standard igienici durante la caseificazione o un altro mezzo è quello di

usare microorganismi starter ed eventualmente nell’uso dei cosiddetti starter

aggiunti(microorganismi che starter veri e proprio non sono, visto che gli starter acidificano e

portano enzimi importanti durante la caseificazione, mentre questi non hanno un ruolo nelle prime

fasi di caseificazione, ma dopo come fonte di enzimi e come microorganismi che competono con

quelli che portano a difetti nei formaggi o con i patogeni veri e propri). Accanto all’uso di questi

come mezzo di controllo sono state applicate con successo le colture protettive. Inoltre nella

caseificazione di diversi formaggi è consentito l’uso di antimicrobici come ad esempio lisozima,

nitrati, nitriti, la nisina e i sorbati. Di questi, i primi hanno un azione antibatterica, mentre i sorbati

non hanno azione rivolta verso i batteri ma è rivolta soprattutto nei confronti di eucarioti quindi

contro muffe e lieviti.

LISTERIA MONOCITOGENES è un microorganismi ubiquitario ed ha delle caratteristiche

ecofisiologiche che lo rendono in grado non solo di contaminare il formaggio, ma anche di potercisi

sviluppare, non a caso è anaerobio facoltativo, tollerante per le basse temperature e a valore di

attività dell’acqua (0,92), capace di formare biofilm.

Importante è mantenere la catena del freddo durante la sua produzione e durante la sua shelf life.

Quali sono i formaggi che agevolano la crescita di questo patogeno?

22) Formaggi a crosta lavata ad esempio il taleggio . Il lavaggio della crosta consiste nel lavare

la crosta con le mani o con altri utensili, con delle soluzioni contenenti sale. Pensando che

si tratta di un batterio ubiquitario è facile pensare che esso possa contaminare la soluzione

o gli attrezzi utilizzati per il lavaggio. Giunto sulla crosta, LISTERIA troverà delle condizioni

ambientali (aerobiosi, attività dell’acqua che presenta valori tali da creare un vantaggio

ecologico per listeria nei confronti di altri microorganismi contaminanti, inoltre ha negli

strati superficiali un ph vicino alla neutralità). Quindi queste condizioni consentono la

moltiplicazione di listeria.

23) Formaggi al cui interno è consentita la crescita di muffe (formaggi erborinati ) in cui non è

da escludere una contaminazione ambientale da parte di questo batterio. C’è una

condizione ambientale che favorisce lo sviluppo di listeria ovvero il PH che proprio per la

presenza delle muffe può diventare anche alcalino (7/8). Il rischio è indipendente dal fatto

di avere pastorizzato il latte. Ammesso che ci sia stata la pastorizzazione nulla esclude che

il patogeno arrivi nelle fasi successive sul formaggio.

STAFILOCCOCCUS AUREUS è un naturale contaminante del latte, anche se pensandoci bene

questa affermazione è particolare, perché il latte è sterile ma esso è contatto con il derma degli

animali che ospita una serie di microorganismi come coagulasi positivi. Come caratteristiche eco-

fisiologiche che consentono la crescita :

24) Anaerobio facoltativo (che poi sono quelli che creano più problemi )

25) Aerotollerante

I formaggi maggiormente esposti :

26) Formaggi ottenuti da latte crudo in particolare l’acidificazione della cagliata è stata scarsa o

è avvenuta troppo lentamente

27) Formaggi che sono stati sottoposti ad un abuso termico (mancato rispetto per più ore della

catena del freddo)durante la distribuzione e conservazione

CLOSTRIDIUM è un microorganismo ubiquitario. Ha caratteristiche che permettono il suo sviluppo

anche in formaggi ottenuti da latte pastorizzato, perché si tratta di batteri sporigeni. Diciamo che i

formaggi che maggiormente sono esposti a tale rischio sono formaggi in cui prevalgono condizioni

di anaerobiosi. Ci sono due parametri che favoriscono il loro sviluppo :

28) pH >5,2 ;

29) attività dell’acqua maggiore di 0,95;

C’è un prodotto che un formaggio in realtà non è………. stiamo parlando del mascarpone. Si

ottiene per coagulazione acido-termica delle caseine contenute nella crema di latte, dopo questo

trattamento termico la crema di latte viene quasi sempre miscelata con latte concentrato che non

fa altro che aumentare il tenore proteico, cosi può essere consumato fresco. Nel 1916 ci fu una

intossicazione da clostriduim botulinum in seguito ai quali il nostro ministero della salute impose

delle pratiche :

30) Trattamento: Crema di latte a 121 ° per 20 minuti o trattamenti termici equivalenti

31) Abbassamento dei valori di pH o dei valori di attività dell’acqua e uso di antimicrobici come

la nisina o un antibatterico aspecifico che si chiama esametilentetrammina genera

formaldeide impiegata come antibatterico nel provolone ( antonio)

Ci sono specie del genere aspergillus che non hanno difficoltà ha svilupparsi sui cereali e quindi

anche nei mangimi a base di cereali, soprattutto se vengono messe in condizioni di stoccaggio di

alta umidità relativa ambientale e alta temperatura. Il momento in cui gli animali vengono nutriti con

mangimi conservati in cattive condizioni o con mangimi prodotti da cerali conservati in cattive

condizioni la aflatossine vengono assorbite dagli animali e quando si tratta di animali in lattazione,

queste sostanze si rinvengono anche nel latte. Negli animali si verifica una conversione delle

aflatossine, da G1 nei cerali che negli animali diventa M1. Le M1 e M2 sono solo parzialmente

inattivate dai trattamenti termici del latte, quindi per bloccare queste bisogna effettuare un analisi

sui mangimi, in particolare esiste una quantità massima giornaliera tollerata nei mangimi di 5

mg/kg sia per la B1 che per la B2. A queste corrisponde una concentrazione tollerata di 0,05 mg di

aflatossina per kg di latte.

Alterazioni dei formaggi

SAPORE AMARO

È una sensazione percepita dalle papille poste posteriormente da non confondere ne con

astringenza ne con acidità. Le cause di questi difetti nei formaggi sono diverse ma la principale

nell’accumulo di alcuni peptidi idrofobici delle caseine. Se consideriamo in particolare la Beta

Caseina si fa riferimento a peptidi che si generano nella regione carbossi - terminale. A sua volta

questo accumulo di peptidi idrofobici potrebbe essere causato da una spiccata e specifica attività

del caldo, quindi immaginiamo questi enzimi che agiscono su questa regione causando il rilascio di

peptidi idrofobici con tale odore caratteristico. Ci può essere il caso in cui tali peptidi possano

essere idrolizzati da parte delle peptidasi , il più delle volte sono insufficienti per rendere questo

difetto non percepibile. Altro aspetto fondamentale è la quantità di sale impiegata, formaggi in cui è

stato aggiunto poco sale sono formaggi che potrebbero presentare il difetto amaro, perché c’è una

bassa forza ionica che indebolisce le interazioni idrofobiche tra le caseine facilitando l’azione degli

enzimi del caglio sulle regioni idrofobiche delle caseine.

Il difetto è maggiormente evidente nei formaggi magri perché la presenza di grasso maschera l

amaro peptidi idrofobici, altre possibili cause può essere quella di un formaggio prodotto da latte

caratterizzato da elevata densità cellulare di batteri psicrotrofici contaminanti del latte crudo. È vero

che sono asporigeni, ma se la contaminazione iniziale è in genere nel latte la forma vitale di

PSEUDOMONAS potrebbe non esserci, ma potremmo ritrovare delle proteinasi prodotte da questo

batterio che non vengono inattivate nemmeno dalla pastorizzazione.

Altre cause meno frequenti: specificità dell’ attività proteinasiche e peptidasiche degli starter usati e

infine anche una erronea densità cellulare degli starter sia in una eccessiva densità che scarsa

densità iniziale. Cambiare i microrganismi starter usati scegliendo quelli che hanno elevate attività

peptidasiche o cambiare il fornitore.

RANCIDITA’ IDROLITICA O GUSTO PICCANTE: è un tipo di alterazione che si riscontra in

formaggi che per il loro carattere dovrebbero avere un carattere limitato in acidi grassi liberi come

CHEDDAR e GOUDA con un contenuto di acidi grassi liberi tra 400 e 4000 ppm. Quando questi

formaggi presentano un livello di acidi grassi più elevato si sviluppa tale difetto. Le possibili cause

sono l’uso di latte crudo (che contiene agenti lipolitici) o alta densità cellulare di microorganismi

pscicrotrofici. Ritorniamo sui batteri del genere Pseudomonas che producono anche lipasi

termostabili o maturazione che avviene a una temperatura più elevata del previsto in associazione

con o in alternativa a tempi di maturazione prolungati o starter che sono contaminati con

microorganismi lipolitici o scarsa purezza del caglio o microorganismi lipolitici nel corso della

maturazione (muffe e lieviti). La micro occhiatura è riferito a grana e formaggi da pasta filata

stagionati ed è causata da batteri lattici etero fermentanti.

La causa del gonfiore è fermentazione del lattosio o del galattosio da parte di coliformi, lieviti e

batteri lattici etero fermentanti. Questi generano gas vari come CO ,H molecolare che causa

2

rigonfiamenti che riguardano formaggi a breve maturazione o formaggi in cui non è proprio prevista

la maturazione. Non è un vero e proprio difetto.

Nelle ultime fasi di maturazione se non è avvenuta corretta acidificazione sia i coliformi che i batteri

lattici etero fermentanti competono con gli starter per il lattosio. I lieviti, inoltre, oltre a usare lattosio

e galattosio possono produrre CO2 anche a partire da acido lattico e quindi acido lattico prodotto

da altri microorganismi o aggiunto come acidificante.

GONFIORE TARDIVO

Dalla fermentazione dell’acido lattico da parte dei clostridi in particolare CLOSTRIDIUM

BUTIRRICUM che fermenta l’acido lattico producendo : butirrato,H2 e CO2. Questi sono dei gas,

ma l’H2 ha più bassa solubilità in acqua, cosi non riesce ad andare in fase acquosa e quindi è lui la

causa di questo gonfiore tardivo. Invece l’anidride carbonica può passare in fase acquosa andando

a formare acido carbonico. Considerando i formaggi grana, il gonfiore tardivo può essere causato

anche se raramente da propionibatteri . Esso si manifesta non solo con lo spacco della forma, ma

si manifesta anche con la comparsa di off flavours , dato dall’azione di clostridi che hanno operato

una fermentazione butirrica.

Le forme a volume maggiore sono le più esposte, perché il sale impiega molto tempo a

raggiungere il centro della forma. Ad una certa concentrazione di sale, i clostridi sono inibiti e non

possono essere metabolicamente attivi e quindi produrre gas che generano il gonfiore tardivo.

Inoltre lo sviluppo dei clostridi è favorito da bassa attività acidificante degli starter. Anche i proprioni

batteri possono essere coinvolti, anche se più raramente, in questo tipo . Anche per essi possiamo

dire che lo sviluppo è favorito in presenza di scarsa acidificazione della cagliata e quando ci sono

basse concentrazione di Sali.

I metodi di prevenzione di questa alterazione consistono :

15) nell’attenzione all’alimentazione degli animali e quanto più essa è ricca in insilati maggiore

sarà la probabilità che spore di Clostridium contaminino il latte.

16) Altra modalità di controllo consiste nell’uso di antimicrobici che hanno un’azione

abbastanza mirata nei confronti di Clostridium, in particolare nitrati e nitriti.

17) Il gonfiore tardivo può essere prevenuto anche attraverso l’uso di lisozima, nella quantità di

2 g/ hl di latte.

18) Un’altra modalità di prevenzione consiste nel trattare il latte mediante batto -

fugazione(latte viene centrifugato per favorire l’eliminazione delle strutture batteriche) o

mediante microfiltrazione.

19) Un’altra modalità di prevenzione, che deve essere vista in modo integrato con almeno una

di quelle precedentemente elencate, consiste nel controllo delle temperature di

maturazione, infatti le alte T favoriscono lo sviluppo dei Clostridi e anche dei propioni

batteri.

AMMUFFIMENTO

L’ammuffimento in genere è superficiale e consiste nella comparsa di miceli fungini. Si possono

creare fratture sulla crosta formaggio , le quali estendendosi possono poi andare a coinvolgere

una parte della pasta, cosi da avere il micelio fungino all’interno della forma, conferendo delle

colorazioni anomale (giallo-ocra). Anche grazie alla micro- occhiettatura può raggiungere il centro

della forma.

PELO DI GATTO

Consiste nella comparsa sulla crosta di un folto micelio grigio. In genere si tratta di muffe

appartenenti al genere Mucor (non tossigeno)che si insediano sulla crosta. Si rimedia con una

toelettatura prima del confezionamento, cioè di una eliminazione temporanea dei peli ,dato che

l’alterazione può ripresentarsi durante la conservazione casalinga. Il controllo si può effettuare in

diverse maniere :

20) inoculare la superficie con spore di un altro fungo Geotricum Candidum, perché questo

fungo esercita una competizione nei confronti del fungo responsabile di tale alterazione;

21) Il controllo si ottiene anche attraverso una oculata gestione di ambiente di produzione e

stagionatura, finalizzata a limitare la contaminazione da parte di questo fungo.

22) Infine, questo fungo, ma anche per tutti gli altri casi di ammuffimento, può essere tenuto

sotto controllo trattando superficialmente la crosta con prodotti chimici antifungini come i

sorbati e la pimaricina.

LE COLORAZIONI ANOMALE

Per quanto riguarda i formaggi senza crosta(crescenza) o con crosta fiorita bianca (Brié) la

colorazione anomala che si potrebbe presentare è una tonalità che va dal rosa all’arancione

dovuta da microrganismi cromogeni, in genere date da lieviti e anche da batteri del genere

Pseudomonas.

Per quanto riguarda i formaggi freschi a pasta filata la colorazione tende sul blu ed è causata da

batteri del genere Pseudomonas ( ubiquitario e psicrotofico ). Un esempio risale a 2 anni fa.

LA COLATURA

Consiste nel rammollimento eccessivo della pasta di formaggi molli, come la Crescenza, ed è un

rammollimento alla cui base c’è un danno subito dalle proteine della cagliata. Lo scalzo (visione

del formaggio frontale ) si abbassa, quindi si riduce lo spessore e si ha una destrutturazione dato

da un eccesso di attività proteolitica, come le proteasi presenti nel caglio o una dose eccessiva di

caglio.

LA GESSATTURA

È un difetto che possiamo descrivere con una pasta del formaggio finemente granulate, friabile e di

colore bianco. Considerato un difetto in quei formaggi la cui pasta è tipicamente elastica, viceversa

la gessatura è un aspetto desiderabile in formaggi come il QUARTIROLO LOMBARDO(??) che è

tipicamente bianco e al momento del taglio non si riesce ad avere la fetta intera, ma si spezzetta

data da una certa friabilità del formaggio. Poi ci sono alcuni formaggi come il QUAD (formaggi a

coagulazione acida)dove è desiderata una acidificazione spinta, ma questo difetto in tale

formaggio in realtà è mascherato dalla presenza di grasso che conferisce la cremosità alla pasta.

La gessatura è determinata da una acidificazione troppo spinta della cagliata che ha portato il pH a

valori inferiori a 5. Quando il pH si abbassa eccessivamente il calcio che è presente in forma

colloidale, perché legato alla caseina nel coagulo, passa in parte in soluzione e questo porta alla

perdita di elasticità della pasta.

STRACCHINATURA

Si verifica nei formaggi freschi a pasta filata e si può descrivere come la perdita della classica

struttura fibrosa di questi formaggi che assumono una consistenza eccessivamente morbida. La

causa si può ricondurre alle varie attività proteolitiche con enzimi di varia natura (plasmina, cioè

proteinasi endogena del latte) o enzimi del caglio che non sono stati inattivati dalla filatura o attività

proteolitiche dovute a microorganismi termoresistenti presenti nel latte crudo o anche legati a

starter. Nell’ambito di tali formaggi, la stracchinatura si presenta abbastanza accentuata , in

particolar modo nella mozzarella, perché essa viene obbligatoriamente confezionata, distribuita e

venduta nel liquido di governo e proprio per il contatto tra i due si assiste alla migrazione degli ioni

2+

Ca dalla pasta al liquido di governo.

SABBIOSITÀ

Può essere descritto come una sensazione avvertita dal palato di essere al contatto con della

sabbia, la causa è l’eccessiva presenza di cristalli di amminoacidi o di eccessiva presenza di

lattato di calcio in particolare si riferisce ai formaggi a pasta dura. Se prendiamo i formaggi a

coagulazione acida, la sabbiosità può essere causata da acidificazione carente. Nella maturazione

diversi batteri lattici non starter possono convertire l acido l-lattico in una miscela di acido d-lattico

ed l-lattico in particolare è la forma D dell acido lattico che realmente reagisce con il calcio

formando cristalli di lattato di calcio pentaidrato. Possono essere visibili come dei puntini bianchi

sulla pasta. SALUMI

I salumi presentano condizioni sfavorevoli alla crescita di microorganismi come un valore di attività

dell’acqua abbastanza basso (< 0,95). Teniamo conto che in funzione della tipologia di salume si

arriva a valori inferiori a 0,90. Altra caratteristica ecologica è il basso pH (ma non tutti lo hanno) o il

potenziale redox relativamente basso. Altra caratteristica che ci permette di difenderci da tali

microorganismi è l’uso di colture starter, inoltre dobbiamo sapere che certi prodotti subiscono una

affumicatura che è a tutti gli effetti un trattamento antimicrobico. Poi ci sono altri prodotti come la

mortadella o il prosciutto cotto che sono sottoposti ad un tipo di cottura pastorizzante, anche se

bisogna considerare che tali prodotti sono consumati crudi. Inoltre ci sono dei salumi che sono

ottenuti per fermentazione spontanea, quindi senza uso di colture starter e questo tipo di prodotti

potrebbe esporci a diversi rischi. Maggiori difficoltà dal punto di vista microbiologico e qualitativo

sono poste da quei prodotti venduti già affettati :Q___ perché questi tipi di prodotti sono

maggiormente suscettibili a contaminazioni microbiche secondarie che possono avvenire durante

l’affettatura, inoltre sono anche maggiormente suscettibili a fenomeni ossidativi.

I potenziali patogeni sono strafiloccocus areus , listeria monocitegenes, verocitossici(VITEC) e

batteri del genere salmonella e clostridium, mentre per quanto riguarda i prodotti dell’attività

microbica che causano intossicazione ricordiamo ammine biogene e micotossine. Per quanto

riguarda gli escherichia coli verocitotossisi possono esserci dei sierotipi come O 157: H 7 che

resistono a bassi valori di pH, ma resistono anche a concentrazioni di sale normalmente impiegate

per questi alimenti.

In generale i metodi di controllo di questi patogeni vedono sicuramente :

23) un controllo della qualità microbiologica della carne è molto difficile impedire la

contaminazione primaria della carne da parte di questi patogeni (staphilococchi o listeria

sulla carne) e quindi più che impedire, dobbiamo limitare quantitativamente la

contaminazione;

24) grande attenzione dovrà essere data durante la trasformazione e in particolar modo

durante le prime fasi della trasformazione quando la materia prima viene lavorata a

temperature vicine allo zero.

25) Nell’ambito della trasformazione è l’uso di starter microbici, nell’ambito di questi starter

rivestono un ruolo importante i batteri lattici perché determinano abbassamento del pH, che

nella carne avviene rapidamente subito dopo aver insaccato tutti gli ingredienti.be diciamo

che l’abbassamento del pH è un’ ostacolo per i patogeni, ma non per tutti ad esempio non

lo è per E.COLI 0157 H 7. Teniamo conto che ci sono diversi prodotti che richiedono che il

pH in realtà non venga abbassato al di sotto di 5.

26) Un altro metodo di controllo è l’uso di antimicrobici come i nitriti e i nitrati (anche azione su

colore e struttura del salume) e nisina

27) La nisina (batteriocina prodotta da lactococcus lactis) è usata in concentrazione di 50 ug/ g

cosi da impedire la crescita di Stafilococccus aureus (Questo batterio occupa la stessa

nicchia ecologica di stafilococchi coagulasi negativi, ad esempio stafiloccocus stilofus sono

considerati pro tecnologici)e poi ci sono quelli a livello di ricerca come gli antimicrobici di

origine vegetale.

28) Stesso concetto di lotta biologica o semplicemente competizione lo possiamo applicare per

quanto riguarda il controllo di muffe produttrici di micotossine, quindi per quei prodotti dove

ci sono miceli fungini all’ esterno, un altro componente è rappresentato dalla muffa

Penicillum Canneverdim(??) , queste muffe competono con i funghi tossigeni.

29) Si può controllare lo sviluppo di funghi tossigeni mantenendo durante la stagionatura

temperature medio basse e un’umidita relativa non eccessiva.

30) Infine altri mezzi di controllo consistono nell’applicazione di moderati trattamenti termici

(anche sui salami) tipo 53 ° mantenuta fino anche a due ore.

31) Alte pressioni idrostatiche.

Si tratta di un gruppo di alimenti che rappresentano un classico caso in cui trova dimostrazione

della teoria degli ostacoli, cioè la combinazione di iù ostacoli che porta alla fine al rispetto dei

criteri di sicurezza alimentare.

IRRANCIDIMENTO

È una delle cause per cui i salumi presentano una conservabilità massima di 12 mesi (anche se si

ritiene che 5-6 mesi è il tempo preferibile di consumo). Ci sono dei microorganismi che hanno una

tendenza a degradare i lipidi e quindi a predisporre il prodotto all’irrancidimento come il fungo

aspergillus o i batteri appartenenti al genere bacillus e al genere pseudomonas. La degradazione

in genere si riferisce ai triacil glirecoli i quali vengono idrolizzati a glicerolo e acidi grassi. Questi

ultimi vengono poi degradati per formare poi composti volatili a basso peso molecolare.

L’irrancidimento è un difetto che procede gradualmente partendo dalla periferia del prodotto.

Un primo indice di irrancidimento in corso è il colore sbiadito del budello che in fase avanzata

assume un colore gialliccio. Un salume irrancidito presenta caratteri sensoriali modificati, colore

giallastro o odore che è tipicamente piccante e penetrante, invece il sapore è amarognolo e

rancido.

LA MATURAZIONE MEFITICA

DESCRIZIONE :È raro sui prodotti freschi ed è più frequente sugli insaccati freschi. È un tipo di

alterazione che emana odore di acido solfidrico, colore verdastro ed è indice della presenza di

sulfomioglobina(a partire da a.a. solforati liberati dalle proteine della carne) e colore piccante.

CAUSA: sono gli enzimi endogeni

FATTORI : I fattori che favoriscono questa alterazione sono la conservazione del prodotto in

ambienti caldo umidi poco aerati, accatastamento del prodotto prima che esso abbia subito un

adeguato raffreddamento

PUTREFAZIONE

CAUSA: La putrefazione causata da batteri dei generi brochothrix clostridium, pseudomonas ,

serratia.

DESCRIZIONE :Il prodotto si presenta con un colore verdastro, con odore putrido e nauseante.

Negli insaccati stagionati più a lungo il fenomeno è concentrato in particolari punti chiamati nuclei

di putrefazione (che si distinguono dal resto del prodotto per il loro colore anomalo tendente al

grigio o al verde o al rosso mattone e si distingue anche perché si presenta più umido rispetto al

resto, può presentare muco jaaack presenta odore di stantio, consistenza diminuita). In generale

un salume che presenta questo tipo di alterazione ha una massa caratterizzata da una scarsa

consistenza che potrebbe presentare anche delle cavità dovute alla formazione di gas.

FATTORI: I fattori che influiscono sono: acidificazione limitata o assente; insufficiente

raffreddamento verso il termine della stagionatura ed essiccamento troppo rapido infatti può

favorire la formazione di una crosta superficiale che impedisce la perdita di umidità favorendo lo

sviluppo di batteri putridogeni :S

BRINATURA

DESCRIZIONE :La superficie del salume presenta un’efflorescenza di colore grigio biancastro e si

presenta untuosa.

CAUSA: È un difetto causato da sviluppo dei microrganismi sulla superficie in particolare di lieviti.

Es. salame con budello bianco.

FATTORI : I fattori che favoriscono questa alterazione sono legati alla conservazione quando

avviene in ambiente troppo umido e poco ventilato.

AMMUFFIMENTO

DESCRIZIONE : Per quelle categorie per i quali non è prevista la superficie presenta un micelio

ed è viscida ed untuosa. Un alcuni casi può interessare la parte interna del salume con comparsa

di sapori e odori anomali.

CAUSA : Le muffe appartengono al genere Mucor e Aspergiullus.

FATTORI: Essa è favorita dalla stagionatura o anche dalla conservazione in ambiente poco umidi

e poco ventilati a temperatura relativamente elevata.

COLORE ANOMALO

DESCRIZIONE: Colore anomalo assunto dai salumi, dal loro impasto che tende ad assumere

colorazione grigia.

CAUSA : C’è un fattore predisponente: quando il processo fermentativo avviene lentamente in un

certo senso il prodotto è predisposto per attacco di genere aspergillus, pseudococcus e

pseduomonas che sono autori di fenomeni enzimatici che causano tale colorazione anomala.

DIFETTO DI CONSISTENZA

Alterazione che consiste in una scarsa consistenza dell’impasto e può essere causata da enzimi

proteolitici di Bacillus e Pseudomonas o anche dalla mancata acidificazione biologica dell’impasto.

RIGONFIAMENTO

Consiste nella presenza di cavità. La causa principale è l’anidride carbonica, prodotto del

metabolismo di batteri eterofermentati obbligati o del metabolismo di lieviti.

TABLE OLIVES

Ke due palleeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeee >_<

Sono caratterizzate da un basso Ph, dalla presenza di sale, dalla presenza di un microbiota

competitivo che può risultare anche protecnologico. Inoltre la materia prima è ricca di composti

fenolici, molti dei quali con attività antimicrobica. Altro aspetto di questi prodotti che va a favore del

consumatore, è che a livello industriale alla fine della fermentazione si applica una pastorizzazione

o a volte una sterilizzazione. È chiaro che nel primo caso potrebbero germinare delle spore.

I rischi microbiologici derivano dal fatto che sono di pronto consumo e che non subiscono

trattamenti termici, ma trattamenti artigianali che avvengono in modo non controllato, per quanto

riguarda delle olive da mensa. Si tratta sempre di una fermentazione spontanea che viene

influenzata dalla stagionalità, dalla temperatura e da tanti altri parametri. In tal caso l’uso di starter

non è diffuso. I potenziali patogeni sono Strafilococcus Aureus, Listeria Monocitogenes ,

Escherichia Coli O157, clostridium Botulinum e Bacillus Cereus. Inoltre come un po’ tutti gli

alimenti fermentati che vanno incontro a un periodo di maturazione questi prodotti possono

contenere ammine biogene. Se volessimo individuare un CCP nel processo delle olive da tavola,

sicuramente potremmo dire che l’acidificazione è un punto critico, che viene operata dai batteri

lattici che sono normalmente presenti sulla drupa oppure mediante aggiunta di acido lattico o di

altri acidi come ciDrico e ascorbico. Queste sostanze possono essere aggiunte alla salamoia prima

del confezionamento. Un altro CCP può essere rappresentato dal trattamento termico. Qui ci si

riferisce alle produzione a livello industriale. Se si applica la pastorizzazione non si esclude la

germinazione di spore di Clostridi oppure di Bacilli a seconda se prevalgono rispettivamente

condizioni di anaerobiosi o di aerobiosi, ma il pH solitamente basso e la presenza di sale

rappresentano degli ostacoli per la germinazione di queste spore. I rischi microbiologici sono

anche legati a produzioni artigianali legate a fermentazione spontanea dove però alla fine del

processo non si applica alcun trattamento termico, ma il prodotto è ritenuto già consumabile. C’è

un organismo che si chiama INTERNATIONAL OLIVES COUNTRIES che ha stabilito i requisiti di

vendita per vari tipi di olive da mensa e tra i essi vi è proprio la specifica del valore massimo di pH

e del valore minimo di sale da rispettare. Un altro CCP è la conservazione che può essere fatta

anche non in salamoia e in tal caso è prevista l’applicazione di conservazione in atmosfera

modificata. C’è un punto della filiera che è molto difficile da controllare (impossibile per il

produttore) ed la vendita sfusa di tale prodotti da parte ad esempio di rivenditori ambulanti, aspetto

che espone il prodotto al rischio di ricontaminazione di microorganismi ubiquitari per la loro

esposizione all’aria.

Per quanto riguarda i principali difetti delle olive da mensa citiamo:

32) Fermentazione putrida causata dallo sviluppo di clostridi che è favorito da condizione di

anaerobiosi e dal pH elevato 4,5 ;

33) La fermentazione butirrica viene descritta dall’ odore di burro rancido e causata dallo

sviluppo di clostridium butirricum in salamoie con elevato pH e tenute a T alte e basso

contenuto di sale;

34) Alterazioni gassose. Appena sotto la superficie del frutto o addirittura nella polpa vi è la

comparsa di piccole sacche di gas che possono essere prodotte da entetobatteriace e altri

batteri gram negativi ma anche dai lieviti. Questi ultimi in effetti sono presenti sulle drupe e

hanno anche un certo ruolo protecnologico, ma se il sistema non è bilanciato da un punto

di vista microbico l’attività dei lieviti risulta critica. Essi possono utilizzare carboidrati residui

e addirittura ossidare anche gli acidi organici prodotti in seguito alla fermentazione lattica o

acidi organici aggiunti come agenti acidificanti chimici. Questo secondo tipo di metabolismo

è possibile solo in condizioni di aerobiosi. I lieviti oltre alla produzione della CO2 possono

causare anche intorbidimento della salamoia, generare composti dall’odore e sapore

sgradevole e di altre alterazioni come il rammollimento della polpa.

35) La polpa dell’oliva è consistente perché presenta pectina, ma la causa del suo

rammollimento è la presenza dell’enzima poligalatturonasi che idrolizza appunto la

pectina. Ci sono lieviti come Candida, Pichia, Rhodotorula che posseggono questo enzima,

questa poligalatturonasi. Inoltre anche alcuni batteri e alcune muffe possono avere questo

enzima.

36) Fermentazione proprionico-butirrica (zapatera) : ricercatori spagnoli sono stati i primi ad

esprimere questo difetto chiamandolo zapatera (scarpa), questa alterazione viene descritta

con odore e sapore di cuoio ammuffito. In condizioni di pH > 4.5 bassa concentrazione di

sale ed elevata T di stoccaggio si può avere uno sviluppo misto di clostridi e propioni

batteri. Questi batteri producono acido acetico, acido butirrico e propionico.

37) Spappolamento: in corrispondenza della formazione di un velo di Blastomiceti sulla

superficie della salamoia( efflorescenza) si può assistere allo spappolamento della polpa

causata da blastomiceti e da batteri cellulomonas flavigena e da lieviti come rhodotorula

minuta entrambi caratterizzati ad essere cellulosolitici(idrolizzano la cellulosa). In genere

questi batteri, lieviti cellulosoliciti si sviluppano in seguita ad un pH >4,5 o perché la

concentrazione di sale in salamoia è bassa ed anche favorita dalla presenza di aria e da un

elevata T di stoccaggio.

38) Salamoie filanti: ha una consistenza oleosa (come alterazione del vino) consistenza

oleosa perché c’è stato sviluppo di esopolisaccaridi prodotti da batteri lattici, difetto che si

può rimuovere facilmente scuotendo la salamoia o semplicemente sostituendola

PASTA FRESCA

Per la pasta fresca i prodotti che vengono confezionati è obbligatoria la pastorizzazione, inoltre

anche se non obbligatoria, ci può essere come mezzo che sfavorisce i batteri indesiderati la

conservazione in atmosfera modificata. Tale metodo accoppiato alle basse temperatura costituisce

un serio ostacolo per la maggior parte dei microorganismi indesiderati. In genere la composizione

dell’atmosfera è :

AZOTO = tra 60 e 80 % e CO2 tra 20 e 40 %.

La CO2 a tali concentrazioni contrasta la crescita di aerobi come le muffe o le pseudomonarace.

Inoltre a tali concentrazioni la CO2 rallenta lo sviluppo di batteri anaerobi facoltativi (ricordiamo che

la pasta fresca è consumata dopo cottura).

Questo prodotto è caratterizzato da valori di attività dell’acqua tra 0,92 e 0,97, in effetti proprio a

causa dei valori di a.w. relativamente elevati questa categoria di alimenti deve essere distribuita e

conservata a 4°C. Quest’obbligo vale sia per i prodotti confezionati che sfusi. Un altro aspetto

critico è posto dalla qualità microbiologica delle uova(pasta fresca all’uovo) e della farcitura (pasta

ripiena aaaaaaaaaaaah gnam) . Entrambe possono presentare problemi qualora le uova fresche

vengano a contatto con semilavorati o addirittura con il prodotto finito. Ad esempio le farciture se

non preparate in adeguate condizioni igieniche e/o non hanno subito un adeguato trattamento

termico possono essere veicolo di listeria. Oltre a listeria monocitogenes i potenziali patogeni

veicolati da pasta fresca sono strafilococchi coagulusi positivi, salmonella, bacillus cereus ,

clostridium perfrigens, botulinum e in più ci sono le micotossine sia per la pasta fresca che per la

pasta secca.

I CCP sono la pastorizzazione che avviene mediante l’utilizzo di vapore acqueo saturo o anche per

irraggiamento di microonde per binomi tempo temperatura che vanno da pochi secondi a pochi

minuti e per temperature comprese tra 82 e 100 gradi. Un altro punto critico di controllo consiste

nel raggiungimento del valore di a.w. desiderato. Un altro CCP è il mantenimento della catena

freddo e il controllo della composizione dell’atmosfera modificata quando applicata. Si controlla il

livello di ossigeno residuo.

PATOGENI DELLA PASTA FRESCA

Listeria monocytogenes : contaminazione a valle della pastorizzazione. È uno psicotrofico,

sviluppa anche in MAP. Si conserva 4°C. Nei confronti di Listeria l’ostacolo rappresentato dal MAP

può non essere sufficiente perché è un anaerobio facoltativo;

Strafilococcus aureus : produce tossine termostabili a partire da 10°C, per questo motivo è

fondamentale evitare gli abusi termici durante la distribuzione e la conservazione della pasta

fresca;

Salmonella : può svilupparsi nelle prime fasi di lavorazione. Per limitare la sua contaminazione è

fondamentale evitare le contaminazioni crociate. I rischi sono legati soprattutto alla pasta fresca

all’uovo, tanto è vero che una riduzione del rischio si può ottenere mediante l’uso di ovo- prodotti

pastorizzati al posto delle uova fresche;

Batteri sporigeni come BACILLUS CEREUS, CLOSTRIDIUM PERFRIGENES, CLOSTRIDIUM

BOTULINUM : rappresentano rischi microbiologici connessi al consumo di pasta fresca . Per

tenere sotto controllo la loro moltiplicazione è fondamentale mantenere la catena del freddo. Un

ostacolo ulteriore è rappresentato dall’uso di MAP, tenendo conto che i clostridi in atmosfera

modificata con solo azoto e anidride carbonica possono anche svilupparsi se messi in condizioni

idonee di temperatura. Possono essere controllati anche mediante uso di sostanze

antimicrobiche;

La cottura inattiva gli agenti batterici di infezione come listeria e salmonella, ma essa inattiva

anche la tossina botulinica. Per cui alla fine i rischi veri e propri per i consumatori sono limitati alle

tossine strafilococciche e alla tossina emetica prodotta da bacillus cereus. Nella pasta fresca

possiamo trovare anche l’ocratossina A e il DON. Per quanto riguarda le micotossine diremo che

sono resistenti alla cottura, per cui la strategia di difesa consiste unicamente nel controllare le

materie prime usate per la pasta. Si tratta di un controllo che riguarda proprio il controllo del

contenuto in micotossine. Questi metaboliti causano effetti negativi sulla salute a lungo termine,

per cui in tali casi è molto difficile risalire all’alimento che è stato vettore di queste sostanze.

Microorganismi deterioranti

Ammuffimento: rappresenta alterazione più frequente quando non si adottano sistemi di

confezione in MAP. Infatti alcune muffe psicrotrofiche appartenenti in particolare ai generi

Penicillium e Claudosporium possono svilupparsi sul prodotto. Il confezionamento in MAP

dovrebbe evitare queste alterazioni, ma comunque quando si adotta questo tipo di

confezionamento è fondamentale controllare il livello residuo di ossigeno che non dovrebbe

superare l’1.5 %, dato che quei funghi potrebbero sviluppare anche in presenza di basse pressioni

di ossigeno. Alla base di tutto c’è la scelta di un adeguato film plastico per il confezionamento, il

quale abbia bassa permeabilità all’ossigeno.

Controllo muffe : da attuare anche in combinazione con il confezionamento MAP è l’uso di

camere sterili per il confezionamento.

Rammollimento, colorazioni anomale, presenza di un muco superficiale (pensiamo alle

sostanze polisaccaridiche prodotte dai batteri all’esterno delle strutture), odori anomali:

imputate allo sviluppo di batteri GRAM + resistenti alla pastorizzazione, ad esempio i generi

BACILLUS, ENTEROCOCCUS, MICROCOCCUS. Quando diciamo “resistenti alla

pastorizzazione” intendiamo sia batteri sporigeni come BACILLUS ma anche al secondo genere

che appartiene ai batteri lattici, i quali non sono sporigeni, ma alcuni sono caratterizzati da una

maggiore resistenza alla pastorizzazione . questo non significa che se prima della pastorizzazione

5

vi era una densità pari a 10 UFC/g , alla fine della pastorizzazione saranno tutti eliminati, ma si

ha una riduzione della densità cellulare di questi asporigeni, ma a livelli che possono risultare non

sufficienti. Ci possono essere anche GRAM – come le ENTEROBATTERIACEE e le

PSEUDOMONARDACEAE che hanno contaminato il prodotto dopo la pastorizzazione. Teniamo

conto che questa serie di alterazioni, la cui causa è difficile da attribuire, è legata allo sviluppo di

5

batteri a livelli maggiori o uguali a 10 UFC/G. il metodo di controllo fondamentale per queste

alterazioni batteriche consiste nel mantenere la catena del freddo.

Ricerca di microorganismi patogeni e dei loro metaboliti negli alimenti

Classificazione in base ai metodi:

32) Coltura dipendenti: dipende dalla coltivazione. Si tratta di fare uso di terreni selettivi e

differenziali e spesso è necessario utilizzare questi terreni congiuntamente alla tecnica

dell’isolamento, perché poi l’ultima parte del metodo coltura dipendente è rappresentata

dalla cosiddetta conferma mediante saggi biochimici e per avere una conferma da essi ho

bisogno di una coltura pura(isolato). In alternativa ad essi esiste la conferma tramite metodi

genetici ed è necessario avere a disposizione il microorganismo isolato. La soluzione

ideale sarebbe quella di utilizzare entrambi i metodi. Con questi metodi coltura dipendente

non è sempre possibile coltivare e poi isolare i microorganismi, perché non sempre in

laboratorio si riescono a riprodurre le condizioni ideali per la crescita microbica o anche

perché alcune cellule presenti nell’alimento possono essere in uno stato vitale, ma non

coltivabile. Si parla proprio di resuscitare queste cellule e anche per questi due motivi sono

stati ideati i metodi coltura indipendenti.

33) Coltura indipendenti : prevedono un primo step di estrazione diretta degli acidi nucleici

dall’alimento, un secondo step che consiste in una amplificazione di determinati geni

potenzialmente presenti, anche se alcuni metodi non prevedono il secondo step. Poi

abbiamo un terzo step che consiste nella separazione degli acidi nucleici o dei prodotti

della reazione di amplificazione.

Schema che ricalca quello seguito nella PCR DGGE: ESEMPIO DI COLTURA INDIPENDENTE

Partite dall’ alimento e direttamente dall’ alimento viene estratto il DNA microbico, questo DNA

viene usato come stampo in una reazione di PCR (amplificazione). In questa reazione

generalmente si vanno ad amplificare (aumento del numero di copie) geni che codificano per l’RNA

ribosomiale 16s nel caso dei batteri, 18s nel caso dei lieviti. Al termine dell’amplificazione i prodotti

della reazione ovvero i geni di cui copie abbiamo aumentato di numero, vengono separati mediato

una particolare elettroforesi che si chiama DGGE. La caratteristica di efficienza di questa

separazione è che si riescono a separare sequenze amplificate anche se queste hanno una

lunghezza molto simile perché l’elettroforesi si fa usando un gel in cui è stato creato

appositamente un gradiente di agenti denaturanti (differenza di concentrazione tra inizio e fine). –

DGGE :

D denaturante

G gradiente

G gel

E elettroforesi

Gli agenti chimici denaturanti sono: urea e formalammide e si riescono ad ottenere bande che

sono ad altezze diverse, semplicemente perché le due o più sequenze nucleotidiche sono diverse

anche in un solo punto, ovviamente la diversità riguarda limitatamente la lunghezza , l’importante è

che siano diverse in un punto ovvero una base. In questo modo in corrispondenza di una banda si

ha una sola specie anche se può accadere che due ceppi della stessa specie diano un prodotto di

amplificazione che ha una diversa mobilità elettroforetica ad esempio le ultime due bande. È

possibile andare a tagliare queste bande e andare a determinare la sequenza nucleotidica di

quelle bande: sequenziamento. Una volta ottenuta la sequenza nucleotidica, questa sequenza

viene messa dentro un database dove ce ne sono tante altre per cui poi si arriva a determinare la

% di similarità tra la sequenza che abbiamo ottenuto e le varie sequenze presenti nella banca dati,

ovviamente si prende come risultato più attendibile la % di similarità più elevata.

Questi metodi presentano delle criticità:

39) la prima consiste nel fatto che proprio l’estrazione degli acidi nucleici può essere difficile

perché le matrici alimentari il più delle volte sono complesse e potrebbero contenere anche

composti che inibiscono la reazione della PCR

40) L’altra criticità consiste nel fatto che DNA di specie diverse potrebbero essere più o meno

sensibili al metodo di estrazione usato.

41) Altra criticità è legata all’amplificazione preferenziale. Con questo termine intendiamo dire

che ci sono dei casi in cui viene amplificato il DNA di una specie ma non quello di un’altra;

42) un'altra consiste nei cosiddetti falsi positivi, cioè un alimento risulta con questo metodo

contenente un microorganismo, ma può essere successo che le cellule batteriche possono

anche non essere vitali. Questi andando ad estrarre il DNA, lo possono estrarre anche da

un cellula non più vitale. Succede che ci sono cellule vitali con DNA intatto e che viene

estratto e ci da un prodotto di amplificazione.

COLTURA DIPENDENTE PER RICERCA LISTERIA

OBIETTIVO : Dobbiamo arrivare a dire se contiene o no il microorganismo preso in questione

come LISTERIA(in questo caso). Viceversa ci sono diversi casi in cui non vogliamo avere anche

una indicazione qualitativa, oltre che quantitativa.

Si fa un arricchimento primario selettivo che consiste nel mettere le cellule contenute

nell’alimento in condizioni tali da moltiplicarsi per poter essere in seguito rilevate. A questo scopo

bisogna prendere una quantità nota dell’alimento e creare una sospensione tra alimento e una

soluzione che deve ovviamente contenere dei nutrienti. Se vediamo la descrizione del protocollo

diremo che consiste nell’omogenizzare 25 g di campione con 225 ml del terreno di arricchimento

che nel caso di questo protocollo si chiama HALF FRASER BROTH, il quale contiene Sali, fonti di

azoto organico, estratto di lievito e altre sostanze che in realtà non servono specificatamente per

far crescere il microorganismo, ma servono per attuare una selezione e una differenziazione. Nel

caso di questo protocollo si parla quindi di arricchimento primario selettivo). Quali sono agenti

selettivi? Acido nalidixico, citrato ferrico di ammonio, acriflavina HCL e poi ci sono delle sostanze

come lexulina che servono in una fase successiva per differenziare una colonia da un’altra. Poi

essa viene incubata a 30°C per 24 h, perché bisogna dare del tempo alle cellule di moltiplicarsi. La

conta in piastra si fa con una soluzione che contiene esclusivamente NaCl nel 99% dei casi.

Facciamo l’arricchimento quando con la normale conta in piastra non sono state rilevate colonie

nemmeno sulla diluizione più bassa. L’arricchimento si fa perché nel tempo di incubazione il

microorganismo deve avere il tempo di moltiplicarsi, per cui “patogeno deve essere presente o

assente in 25 g di prodotto”. Ma non mi posso fermare a questi risultati, ma devo garantire risultato

migliore. Perché sulla piastra 10 -1 non abbiamo rilevato colonie? Perché il patogeno non era

presente in 25 g di alimento oppure perché la densità cellulare del patogeno era molto bassa e

quindi non è stata rilevata.

Al fine di questo arricchimento si fa un arricchimento secondario selettivo : consiste nel trasferire

un aliquota della precedente sospensione incubata in un tubo contenente altro terreno di

arricchimento, nello specifico questa norma prevede di trasferire 0,1 ml in un tubo contenente 10

ml di FRASER BROTH. Perché prima il primario poi il secondario? Non è un caso che il primario si

faccia con HALF FRASER, che significa letteralmente metà, terreno molto simile al secondo, solo

che nel secondo vi è una concentrazione di acido nalidixico pari al doppio di quella presente nel

HALF FRASER BROTH. Non usiamo la stessa concentrazione, perché nel primario dobbiamo

favorire il recupero di cellule che sono anche in una condizione di stress. Viceversa, con

l’arricchimento secondario selettivo non vi sono questi problemi, perché le cellule sono state

incubate in un terreno contente nutrienti e sono state incubate in una condizione che se vogliamo,

le ha fatte adattare alla presenza di questo agente selettivo. Questo tipo di protocollo si applica a

numerosi patogeni. In realtà il protocollo continua e questo terreno colturale viene incubato a 37 °C

per 48 h . Alla fine si effettua uno striscio su un terreno selettivo per listeria come LISTERIA

SELECTIV AGAR BASE. In cosa consiste? Si prendono 100 microlitri di brodo di arricchimento

secondario, vi si striscia su questa piastra con terreno selettivo, dopo lo striscio abbiamo

l’incubazione a 37°c per 24 h. Alla fine si vanno a visualizzare le colonie, il cui aspetto dipenderà

dal tipo di terreno selettivo impiegato. Le colonie presentano colorazione grigiastra, una

dimensione di circa 1 mm e un alone nero , il quale è dato dal fatto che listeria (o altri patogeni)

idrolizza una sostanza organica presente nel terreno utilizzato detta esculina, che reagisce con ioni

ferro trivalenti e forma un composto di colore nero. Ci serve perché i test biochimici di conferma

successivi gli andrò a fare solo su colonie dove è presente effettivamente listeria. Quindi se ho

avuto una piastra con colonie grigie senza alone nero , non andrò a fare le fasi successive e potrò

dire che vi è assenza di listeria. Questi test consistono nell’utilizzo di carboidrati, nella conferma

dell’attività idrolitica sull’esculina e nella presenza di attività emolitica. Questi test si possono

effettuare più rapidamente utilizzando le gallerie biochimiche presenti in commercio e studiate

appositamente per il patogeno che stiamo ricercando (per listeria la galleria si chiama

MICROBACT 12 L). Queste gallerie funzionano più o meno allo stesso modo. Un altro saggio

biochimico di conferma che va abbinato ai saggi precedenti è il cosiddetto CAMP test, che va

abbinato ai precedenti test biochimici. Ha senso sottoporre ai successivi saggi biochimici di

conferma ovviamente quando le colonie presenti sul terreno presentano aspetto grigiastro, inoltre

ha senso sottoporre a tali test tutti gli isolati che hanno morfologia bacillare, in particolare si tratta

di bacilli corti che sono GRAM +, mobili a 25 °C, catalasi positivi, ossidavi negativi , positivi al test

di agglutinazione del lattice.

CARATTERI FENOTIPICI PER L’IDENTIFICAZIONE DEL GENERE

LISTERIA

Per quanto riguarda la capacità di muoversi, esiste il TEST DELLA MOBILITÀ mediante il

VETRINO A GOCCIA PENDENTE .

Il vetrino rallenta i movimenti delle molecole della soluzione disperdente. Succede che quando

osserviamo un preparato al microscopio, notiamo un velo di liquido tra il vetrino porta-oggetti e il

vetrino copri-oggetti e notiamo che le cellule sembrano dotate di un movimento, che in realtà è

“passivo”, in quanto in realtà sono le molecole di acqua che spostandosi fanno muovere anche le

cellule. Grazie alla concavità di questo vetrino i movimenti delle molecole di acqua sono rallentati e

questo consente più facilmente di osservare eventuali cellule dotate di moto autonomo. Come

prima cosa, attorno alla concavità del vetrino porta-oggetti si distribuisce un olio molto denso ,

invece sul vetrino copri-oggetti si deposita una ansata di sospensione cellulare. Dopo di che, si

poggia il vetrino porta-oggetti con la concavità rivolta verso il basso (che guarda verso il

pavimento)e poi viene spinto sul vetrino copri-oggetti. L’olio impedisce alla sospensione di uscire

della concavità. Alla fine i due vetrini vengono capovolti e il tutto è pronto per essere osservato al

microscopio.

Altro test fenotipico molto utilizzato

nella ricerca dei patogeni è il test

dell’OSSIDASI : ci riferiamo ad enzimi

coinvolti nel metabolismo aerobio, le

ossidasi, che trasportano gli elettroni

all’ossigeno, il quale si riduce ad acqua

o a perossido di idrogeno. Il protocollo

è semplice:

- l’isolato da saggiare è strisciato

su una piastra di TRIPTICASE

SOY AGAR, un terreno non molto selettivo che si usa per la coltivazione di diversi

microorganismi che sono chemo –organotrofi;

- Alla fine le piaste sono capovolte e incubate a 37°C per 48 h;

- Sullo striscio si aggiungono due gocce di un reagente che funge da donatore di elettroni

che si chiamo PARA – AMIDODIMETILANILINA, si attendono 10-30 secondi per l’eventuale

reazione;

- Se l’isolato che viene saggiato possiede una ossidasi, in presenza di ossigeno, la p-

AMIDODIMETIANILINA dona gli elettroni e cosi si ossida facendo apparire lo striscio di

colore viola;

- Visualizziamo il risultato.

Altro test fenotipico importante è il TEST DI AGGLUTINAZIONE DEL LATTICE : si fonda sulla

presenza di particelle di lattice rivestite di

antisiero o anticorpi che nel caso di Listeria

sono anticorpi che riconoscono le proteine

flagellari. Questo test viene anche usato nella

procedura di identificazione di

STAFILOCOCCUS AUREUS, in quel caso

l’anticorpo che riveste le particelle di lattice

sarà diverso in quanto andrà a riconoscere

una diversa proteina. Dopo di ciò viene

aggiunta la sostanza da testare, se quella

sostanza (sospensione cellulare)contiene

quel particolare antigene (nel caso di listeria

ripetiamo sono le proteine flagellari) si ha una

reazione classica di riconoscimento tipo antigene- anticorpo. Quindi si verifica una agglutinazione,

perché le particelle del lattice formano dei coaguli. Il protocollo prevede il versamento sulla striscia

reattiva di una goccia di reagente contenente il lattice, quindi una colonia è stemperata nel

reagente, si attende un minuto, dopo di che si potrà visualizzare il risultato.

SAGGI BIOCHIMICI

Per la conferma di Listeria nel campione ricordiamo che bisognava effettuare saggi biochimici che

consisteva nell’uso di una galleria biochimica e nell’uso di CAMP TEST. Ma ancor prima,

bisognava appunto verificare tutti i caratteri fenotipici (morfologia, colorazione di GRAM, presenza

di ossidasi)che sono stati identificati con i test nominati in precedenza. Una volta che tutti i test ci

danno indicazione che il microorganismo testato appartiene alla specie Listeria, ecco che

possiamo applicare questa galleria biochimica. Esistono diverse gallerie biochimiche. Abbiamo una

piastra con tanti piccoli pozzetti e in ciascuno di essi è presente un certo reagente, fonti di carbonio

diverse. Il protocollo consiste :

- nel diluire una colonia di 18- 24 h in un terreno appropriato;

- Ottenuto tale sospensione cellulare ciascuno dei pozzetti (sono 12 in tutto) presenti nella

piastra viene inoculato con 100 microlitri di sospensione cellulare;

- Dopo l’inoculo la sospensione corrisponde alla prima riga della figura, dove i pozzetti

hanno colorazione scura;

- Il tutto viene incubato per 18-24 h;

- Dopo si visualizza il risultato.

Quello che dobbiamo guardare ora(dopo le 24 h di incubazione) è la terza riga, dove abbiamo un

primo pozzetto nero, che era l’unico che nella prima riga aveva un colore chiaro. Il colore nero in

tal caso indica che l’isolato ha idrolizzato l’esculina. Viceversa se consideriamo gli altri pozzetti che

contengono fonti di carbonio, vedremo che se essi hanno un colore giallo significa che l’isolato che

stiamo saggiando è in grado di idrolizzare quel carboidrato. Infatti in ciascun pozzetto oltre ad una

certa fonte di carbonio vi è un indicatore di pH che si chiamo PORPORA DI BROMOCRESOLO.

Se la fonte di carbonio è stata utilizzata dall’isolato che stiamo saggiando ci sarà stata produzione

di acidi ed in seguito a ciò l’indicatore virerà al giallo. L’ultimo pozzetto serve per saggiare l’attività

emolitica; se il pozzetto utilizzato si presenta di colore marrone significa che l’isolato ha questo tipo

di attività, perché l’isolato possedeva un enzima che ha provocato l’idrolisi o meglio la lisi dei

globuli rossi. Ad esempio per la scelta di salmonella, il procedimento visto per Listeria è molto

simile, compreso l’uso di una galleria biochimica. Molto simile ad essa sarà anche il protocollo di

uso, il quale però conterrà saggi diversi naturalmente. Accanto a questa piastra viene fornita una

scheda da compilare dove indichiamo per quale specie c’è stata la colorazione del pozzetto VEDI

Su questa scheda troviamo dei numeri (4,2,1 …..) e sono raggruppati in triplette. Per ogni tripletta

si sommano i numeri in corrispondenza dei quali c’è il segno + (primo riquadro 4,2 con il + e 1 con

il -, quindi la somma sarà 4+2 = 6). Cosa viene fuori quando abbiamo fatto le somme? Un codice di

4 numeri, in tal caso 6 1 4 4. Tale codice è inserito in un apposito software di identificazione che ci

darà un report. In questo caso ha dato un valore di probabilità di avere LISTERIA

MONOCITOGENES al 96,32 % (questa galleria viene utilizzata anche per altre specie di

LISTERIA)

In alternativa all’uso di tale software si può confrontare il profilo delLlisolato saggiato(tipo positivo

all’esculina) con il registro dei profili. Questo porta via più tempo e porta a un maggior numero di

errori.

Oltre all’uso della galleria biochimica, per i patogeni bisogna anche eseguire il CAMP TEST. Esso

prende il nome dai ricercatori ( CHRISTIE, ATKINS,MUNICH PETERSEN)che hanno notato per la

prima volta una cosa molto particolare: osservarono che esisteva una specie di sinergia nell’attività

emolitica (lisi per globuli rossi) tra gli STREPTOCOCCHI DEL GRUPPO B e gli

STAPHYLOCOCCUS AUEREUS. Nella figura abbiamo una piastra di agar sangue con uno striscio

al centro di una coltura di STAPHYLOCOCCUS AUREUS(che è la cosa particolare) tale

microorganismo ha attività emolitica. Dopo incubazione si osserva il cambiamento di colore in

corrispondenza dello striscio effettuato. Sulla sinistra si osserva uno striscio(perpendicolare) di un

isolato positivo al camp test, mentre sulla destra uno striscio di un isolato negativo al camp test.

Quindi si parla di attività sinergica perché entrambi gli isolati presentano attività emolitica e si

verifica il cambio di colore. Il classico aspetto di un isolato positivo al CAMP TEST è uno striscio

simile ad una freccia. In corrisponde dell’isolato vicino al centro si osserva un aumento dell’attività

emolitica. Le varie specie di listeria danno reazioni al camp test diverse nei confronti di due

microorganismi che sono S.A. e RODOCOCCUS EQUI e quindi in particolare per Listeria la

reazione al camp test è positiva in prossimità di S.A. mentre è negativa in corrispondenza di R.E

PROTOCOLLO :

- Su una piastra di agar sangue bisogna strisciare sia S.A.(in senso verticale) che R.E.

distanziati (parallelamente) fra di loro;

- l’isolato di listeria che dobbiamo testare deve essere strisciato perpendicolarmente agli

strisci dei due microorganismi citati in precedenza in modo da lasciare da queste linee di

striscio una distanza di 1-2 mm;

- Dopo aver effettuato questi strisci le piastre vengono incubate a 37°C per 24 h ;

- dopo ciò si visualizza il risultato.

In questo caso LISTERIA è positiva nei confronti di S.A. al test dell’attività emolitica e negativa nei

confronti di R.E.

RICERCA DI ENTEROBACTERIACEAE secondo norma ISO 21528-2

Per ricercare esse bisogna usare un terreno selettivo VIOLET RED BILE GLUOCOSE

AGAR(VRBA), che contiene come unico

carboidrato utilizzabile il glucosio, importante

perché tutte esse possono utilizzarlo. C’è un

terreno molto simile ad esso che contiene lattosio

e non glucosio, ma con esso non si riesce ad

avere idea della presenza di salmonella, perché

non fermenta lattosio. Contiene anche un

indicatore di pH che è il rosso neutro ed è selettivo

perché contiene i Sali biliari e il cristal violetto, i

quali impediscono la crescita di batter GRAM +. Il

campione viene messo nella piastre di VRBA per

inclusione. Dopo abbiamo l’incubazione delle

piastre a 37 °C per 24 h. Dopo le piastre vengono

controllate alla ricerca di colonie che possono

avere diversi colori, ma quelle che a noi

interessano hanno colore rosso, viola e rosa o

anche biancastro- grigio (le ultime però non sono considerate).

Le colonie nella loro crescita producono acidi che fanno scendere il pH e quando scende sotto di

4,5, l’indicatore vira al rosso- viola. Vi sono alcuni genere di Enterobatteriaceae che effettuano

una fermentazione acido- mista, ma vi anche altri generi come ENTEROBACTER, CLEBSIELLA,

SERRAZIA che producono composti che in realtà acidi non sono, si parla di fermentazione

butandiolica, in quanto il prodotto principale è il 2-3 butandiolo. Dopo di che 5 colonie sono

trasferite su un terreno detto NUTRIEN AGAR , il quale contiene peptone, estratto di carne e un pH

pari a 7. Le piastre vengono incubate a 37°C per 24h e dopo l’incubazione le colonie saranno

sottoposte al saggio dell’ossidasi

– negativo.

A lato c’è uno schema che

prevede una serie di test

biochimici e fisiologici , per

l’esecuzione dei quali è

necessario molto tempo. Per

risparmiare tempo e materiale si

fa riferimento a sistemi multi-test

a cui può essere combinato

l’utilizzo di sistemi

computerizzati, perché facilitano

l’interpretazione dei risultati e

quindi l’identificazione a livello di

genere. Uno di questi è BIOLOG

basato sulla capacità di

metabolizzare 95 fonti di

carbonio diverse per ottenere il

cosiddetto FINGER PRINT

METABOLICO di un certo

isolato. Ci sono diversi tipi di

micropiastre a seconda del tipo

di microorganismi che stiamo

ricercando. Nel caso delle ENTEROBATTERIACEAE ci sono delle micro-piastre dette GM2,

studiate in modo specifico per i GRAM – aerobi. Nelle piastre abbiamo 96 pozzetti con un

indicatore redox che è un sale di tetrazolio. In ciascun pozzetto, tranne uno che è quello in alto a

sinistra dove c’è solo acqua, vi è una diversa fonte di carbonio. Se l’isolato da identificare ossida

una certa fonte di C, l’indicatore si riduce trasformandosi in formazano (di colore viola). Per quanto

riguarda il protocollo:

- bisogna avere una coltura pura che va inoculata su un terreno detto BIOLOG UNIVERSAL

GROWTH supplementato da sangue defibrinato di montone;

- Dopo abbiamo l’incubazione a 37°C per 24 h ;

- poi vi è prelievo delle colonie con una specie di lunghi cotton – fiocchi , facendo ruotare il

cotone sulle colonie ;

- poi le metteremo in un tubo che contiene fondamentalmente soluzione fisiologica,

ruotando lo strumento per far staccare le colonie del tutto da esso. Per standardizzare le

colonie si usa alcol di dimetile : il fornitore da questi standard che sono diversi a seconda

dei gruppi microbici che stiamo studiando (nel nostro esempio standard di torbidità).

- Con lo spettofotometro devo vedere e misurare la trasmittanza e devo cercare di

avvicinarmi con la mia sospensione a quello standard di trasmittanza. Nel caso in cui sono

lontano devo aggiungere altre colonie in modo tale da abbassare il valore di trasmittanza. E

devo aggiungere anche soluzione fisiologica.

- Si aggiunge anche il tio-glicolato(presente in una capsulina) nel tubo dove ho inoculato le

cellule e ha la funzione di anti – capsula cosi evitare la formazione di interferenze.

- Bisogna avere una pipetta multicanale quando lavoriamo con le micro piastre, quindi verso

l’ inoculo in un contenitore sterile e poi lo prelevo con la pipetta per poi versarli con cautela

in ciascun pozzetto in maniera sequenziale , più o meno 150 microlitri.

- Le micropiastre poi vengono incubate sempre a 37°C per 24 h.

- Alla fine abbiamo la lettura delle piaste.

- Segue poi l’interpretazione dei risultati e si inseriscono in un database creato

appropriatamente per i GRAM - oppure un proprio database.

Questo metodo(FINGERPRINT METABOLICO) presenta una limitazione, perché esso può variare

a livello intraspecifico, cioè possiamo trovare più ceppi con differenze tra di loro. infatti per tale

motivo è bene non fare riferimento a database esistenti, ma man mano che si fa il sistema

costruire un proprio database. I SISTEMI MULTITEST

I sistemi MULTITEST comportano, rispetto ai sistemi tradizionali, un grande risparmio di tempo e

denaro. A livello di sicurezza degli alimenti NON è obbligatorio fare uso di metodi genetici, i quali

sono invece ritenuti dalla comunità scientifica nazionale INDISPENSABILI (non da soli, ma in un

approccio definito polifasico che quindi non esclude i caratteri fenotipici) per l’identificazione di un

certo isolato.

Domanda : VI SONO ALTRI METODI CHE, COME IL SISTEMA MULTITEST, CONSENTONO DI

RILEVARE CONTEMPORANEAMENTE DIVERSI PATOGENI PRESENTI IN UNO STESSO

ALIMENTO?

RISPOSTA : È chiaro che questo è un passo avanti, perché è molto vantaggioso. Certo che esiste,

esso sfrutta il metodo del DNA MACROARRAY, il quale consente anche di evitare la coltivazione

dei microorganismi su un terreno appropriato, per cui potremmo farlo rientrare tra i metodi

“COLTURA INDIPENDENTE”.

PRINCIPIO : Il principio su cui tale metodo si basa è quello di IBRIDAZIONE TRA SONDE DI

OLIGONUCLEOTIDI SPECIFICHE PER LE SPECIE RICERCATE. Il protocollo schematicamente

prevede:

- l’estrazione, anche diretta dall’alimento, del DNA;

- Il DNA estratto viene utilizzato per la PCR, ma se l’obiettivo è quello di cercare più patogeni

contemporaneamente, si parla di una MULTIPLEX PCR. Ricordiamo che nella tecnica PCR

abbiamo un DNA che funge da stampo, l’enzima DNA POLIMERASI che si concentra solo

sulle zone da amplificare e un certo numero di nucleotidi come ATP, GTP in quanto sono i

mattoncini utili per costruire il DNA. Altra cosa fondamentale per la tecnica PRC sono i

primer, i quali vanno ad appaiarsi sulle sequenze geniche che intendiamo amplificare.

Precisamente avremo più primer, copie, uno per ogni estremità. Nella MULTIPLEX PCR vi

è la co- presenza di 2 o più copie di primer specifica per un certo patogeno;

- Dopo si effettua una ibridazione su una lastra tra i prodotti della PCR e delle sonde già

presenti su questo supporto, sonde eventualmente marcate con FLUOROCROMO, un

composto chimico che genera fluorescenza. Il termine sonda è generico, ma in tal caso

faremo riferimento ad una sonda composta da nucleotidi e quindi la reazione di ibridazione

classica è resa possibile.

- Nel caso in cui le sonde usate non siano state marcate, il successivo step consiste

nell’aggiunta di sostanze cromogeniche come il NITROBLUTETRAZOILIOO, IL 5

BROMO 4 CLORO 3 INDOLIFOSFATO.

- In conclusione abbiamo una interpretazione dei risultati.

L’esempio riportato si riferisce ad un tipo di ibridazione messa in evidenza con l’adozione di

sostanze cromogene. Sono stati presi in considerazione 5- 6 patogeni tra cui

SALMONELLA,VIBRIO, ESCHERICHIA COLI 0 157 e sono state costruite sonde specifiche per

uno solo di questi patogeni. In ogni singolo riquadro vediamo dei puntini (più o meno alla stessa

altezza) che indicano dei controlli positivi e rappresentano il punto in cui si è verificata l’ibridazione,

quindi non sono da considerare per discriminare un patogeno da un altro, ma per tale scopo

dovremo prendere in considerazione altri punti della lastra, punti diversi per ogni singolo patogeno.

Questo ci dice che le sonde costruite sono buone, altamente specifiche.

Nella parte destra della figura vediamo la lastra di DNA MACROARRAY utilizzata per vedere la

presenza di patogeni in campioni di latte, inoculati deliberatamente da vari ceppi

contemporaneamente.

8. Teniamo conto che tra l’estrazione del DNA e il termine della metodica sono trascorse solo

18 ore.

9. L’altro aspetto positivo, oltre al fatto di sapere in quelle 18 ore quali patogeni sono presenti,

consiste nell’uso di sostanze cromogene che rendono visibile il risultato anche a occhio

nudo, senza cioè ricorrere a strumenti ottici costosi e sensibili alla fluorescenza.

10. Come tutti i metodi coltura indipendente c’è comunque sempre il rischio che il patogeno sia

estratto da una coltura non vitale.

METODI DI TIPIZZAZIONE

Con tale termine facciamo riferimento ad una ulteriore caratterizzazione/ distinzione di un

microorganismo già identificato a livello di specie o addirittura di sottospecie o di ceppo. Se

prendiamo SALMONELLA sub. Enterica abbiamo circa 2000 sierotipi, quindi risulta importante

individuare il sierotipo, al fine di capire la loro reale patogenicità. Infatti l’utilità della tipizzazione è

proprio quella di differenziare ceppi in base alla presenza di fattori di virulenza. È possibile

classificare tali metodi in 3 gruppi:

METODI TRADIZIONALI;

 METODI IMMUNOLOCIGI;

 METODI SU BASE MOLECOLARE;

Per quanto riguarda i primi diremo che sono basati su caratteri fenotipici (diversa sensibilità ai

batteriofagi o crescita a diverse temperature).

I secondi si basano su reazioni antigene – anticorpo, dove l’antigene è rappresentato dal fattore di

virulenza.

I metodi di tipizzazione su base molecolare, invece, sfruttano la diversità a livello di sequenza del

DNA che i microorganismi posseggono anche quando appartenenti ad una stessa specie. I

possibili metodi di tipizzazione sono :

Sequenziamento del DNA , dove abbiamo una tecnica detta MULTI LOCUS SEQUENCE TYPING;

DNA FINGERPRINTING, dove vedremo il metodo PFGE;

I tradizionali li saltiamo e passiamo ai metodi immunologici.

TIPIZZAZIONE CON METODI IMMUNOLOGICI

PRINCIPIO : uso di siero contente anticorpi in grado di riconoscere diversi antigeni, i quali

 possono essere di varia natura, proteici, polisaccaridici o addirittura gli antigeni possono

essere degli acidi nucleici. Ricordiamo che per l’ESCHERICHIA COLI si prende l’antigene

O(lettera), di natura polisaccaridica, oppure l’antigene H, di natura proteica.

Come facciamo ad attribuire ad un certo sierotipo? Proprio in base alla presenza

 dell’antigene che viene evidenziata da una reazione di AGGLUTINAZIONE.

Negli ultimi anni sono stati sviluppati dei test rapidi di tipizzazione, i quali funzionano

 semplicemente caricando il campione contenente l’individuo da tipizzare in un pozzetto.

Nella parte sinistra

 vediamo il pozzetto grigio,

ma abbiamo anche un

esempio di tipizzazione

per

ENTEROMONARACEAE.

Poi siccome questa

scheda (o card) è su un

supporto di carta di

cellulosa, succede che

per capillarità il campione

migrerà e nel momento in

cui incontra un anticorpo

fissato nel kit (se l’anticorpo riconosce quel antigene) la reazione enzimatica collegata a

tale riconoscimento sarà indicata dalla comparsa di una banda colorata sulla scheda.

Quindi notiamo le due situazioni: nella prima dove il batterio non ha un certo antigene

 (quindi sarà un test negativo perché l’unica banda di controllo presente non si è colorata),

nella seconda il batterio è stato sierotipizzato e dove l’antigene è stato riconosciuto

dall’anticorpo, si presentano due bande colorare e quindi il test è positivo.

ESEMPO: TIPIZZAZIONE (SU BASE MOLECOLARE) DI SALMONELLA MEDIANTE MULTI

LOCUS SEQUENCE TYPING con geni di virulenza (MLST – v dove v sta per virulenza). Si chiama

MULTILOCUS perché appunto prendiamo in considerazione diversi geni.

PROTOCOLLO :

Il protocollo consiste nella scelta di geni cosiddetti “HOUSEKEEPING” e di geni codificanti per

fattori di virulenza. Cosa sono i geni HOUSEKEEPING ? sono geni fondamentali per la normale

vitalità cellulare come alpD e gyrB, filB e filC dove queste ultime sono delle proteine flagellari. In

base a cosa si sceglie un gene piuttosto che un altro? Si fa un’ analisi preliminare delle sequenze

di vari geni, scegliendo poi quei geni per i quali si osserva un maggior numero di differenze. Ad

esempio, se prendiamo il genere Salmonella e prendiamo il gene RDNA 16s, vedremo che non

mostra alcuna variabilità per cui sarebbe inutile considerarlo al fine di una tipizzazione, al contrario

di questi geni(quelli citati prima) che sono stati scelti che presentano una certa variabilità.

Una volta estratto il DNA dal batterio da tipizzare, si mette il DNA in una PCR, che in realtà non è

una sola ma è un numero uguale a quello dei geni scelti (ad esempio se abbiamo 4 geni , di cui 2

HOUSEKEEPING e 2 geni di fattori di virulenza, le PCR saranno 4);

Una volta effettuata la PCR, si effettua il sequenziamento dei prodotti dell’amplificazione cioè della

PCR, per cui per ogni individuo da tipizzare si ottiene una sequenza per ognuno dei geni

considerati;

A questo punto si va a fare un allineamento multiplo. Immaginiamo di avere 10 individui del genere

SALMONELLA e per ognuno di essi 4 sequenze, quindi andiamo a prendere un gene per volta e

andiamo a vedere le differenze tra le sequenze del gene nei 10 individui che stiamo studiando.

L’allineamento, fatto appunto gene per gene, quindi avremo 4 allineamenti, ci metterà in evidenzia

anche le più piccole e minime differenze tra le sequenze;

Infine si vanno a combinare le differenze fra le sequenze dei geni scelti per individuare i sierotipi.

Un modo comodo per esprimere il grado di similarità o di differenza è la rappresentazione a

dendogramma(che letteralmente significa “rappresentazione ad albero”) come qui.

Se prendiamo individui presenti sulla destra, vicini fra loro, possiamo notare un grado di

similarità alto;

Una volta fatto ciò, vado ad individuare i sierotipi.

TIPIZZAZIONE MEDIANTE PULSED FIELD GEL ELECTROPHORESIS (PFGE)

Tecnica che non si basa come la precedente sul sequenziamento del DNA, ma sull’ ottenimento di

un DNA FINGERPRINT. Questo metodo a differenza di altri basati sempre sul FINGERPRINT,

come l’RFPLP o anche il metodo noto come RAPD, non richiede l’esecuzione di una PCR, a

differenza dei precedenti che invece non possono prescindere dall’esecuzione della PCR.

PRINCIPIO: ottenimento di un DNAFINGERPRINT (o un profilo di frammenti di DNA

FINGERPRINT) e un confronto di quello ottenuto con i FINGERPRINT contenuti in un database.

PROTOCOLLO :

Il protocollo è schematizzato in figura, dove il DNA viene estratto e su di esso vengono fatti

agire degli enzimi di restrizione

(famiglia di enzimi che viene anche

detta “endo -nucleasi”) che

idrolizzano l’acido nucleico su punti

interni. Cosa viene fuori? Frammenti

di DNA più o meno lunghi, i quali poi

vengono separati mediante

elettroforesi sotto l’azione di un

campo elettrico che cambia

direzione seguendo un angolo di

120 °, il quale fa aumentare

l’efficienza della separazione.

Alla fine si ha un profilo dove abbiamo vari frammenti di DNA appunti generati in seguito

all’azione degli enzimi di restrizione. Si nota che questo metodo è caratterizzato da una

elevata ripetibilità

anche in diversi

laboratori, purché le

condizioni siano le

stesse.

Grazie a tale aspetto

è stato creato un

database detto

PULSENET da parte

di uno statunitense,

database che è

valido a livello

internazionale,

all’interno del quale si trovano profili PFGE di ESCHERICHIA COLI O157 H7,

SALMONELLA , SHIGELLA, LISTERIA, CAMPILOBACTER.

METODI DI DETECTION TOSSINE BOTULINICHE

Il metodo standard consiste :

34) nell’uso di uno standard detto MOUSE ASSAY

35) di metodi immunologici grazie ai quali le tossine sono riconosciute da anticorpi specifici;

36) Oltre ai metodi immunologici ci sono i saggi biochimici che sfruttano l’attività proteasica

delle tossine.

MOUSE ASSAY: metodo molto sensibile, infatti il cosiddetto LOD (LIMIT OF DETECTION) è

nell’ordine di pico- grammi/ml, molto sensibile, ma semplice in quanto un estratto di alimento, per il

quale si vuole saggiare la presenza di tossine botuliniche, viene iniettato nelle cavie. Uno

svantaggio di questo metodo, però, consiste nel fatto che non è possibile fare

contemporaneamente la “sierotipizzazione”, ricordano che abbiamo tante tossine botuliniche, cioè

dire quale delle tossine è implicata. Uno dei vantaggi è il poco tempe necessario (circa 48h)per la

comparsa dei sintomi.

METODI IMMUNOLOGICI : uno di questi è il famoso TEST ELISA

Ecco le fasi di questo test:

L’anticorpo viene fissato su un supporto(può essere anche una MICROARRAY);

poi viene aggiunto il campione che potenzialmente contiene la tossina;

Incubazione;

avviene riconoscimento tra antigene e anticorpo;

successivamente viene aggiunto l’anticorpo secondario, simile al primo per struttura, ma

in più si presenta legato ad un enzima;

fase finale consiste nel mettere nella reazione un substrato su cui agisce proprio quell’enzima;

se l’enzima ha agito il test darà risultato positivo

Il TEST ELISA può essere utilizzato anche per la DETECTION delle tossine, ad esempio tutte le

tossine botuliniche , ma anche quelle stafilococciche, a patto che le tossine da individuare siano di

natura peptidica o proteica. Esso ha il vantaggio di essere molto sensibile, ma anche rapido.

METODO IMMUNOLOGICI : un altro importante è un metodo che fa uso del “LATERAL FLOW

DEVICE” Anche qui abbiamo un protocollo

specifico :

un pozzetto dove viene depositato il

campione ;

interazione tossina – anticorpo;

succede che tossina- anticorpo hanno

formato un complesso che migra in base alle

leggi della cromatografia. La freccia in figura

è il senso di migrazione della sostanza;

Man mano che si va avanti si trovano altri

anticorpi, per cui si può avere il

riconoscimento del complesso tossina-

anticorpo da parte degli anticorpi presenti e fissati nel supporto di nitro – cellulosa;

Interpretazione dei risultati : il kit conterrà una linea di controllo positivo e avremo una per

riconoscimento di tossina A e una per la tossina B

Un metodo che non richiede un saper fare alto, una competenza elevata, però allo stato attuale

presenta un limite di DETECTION ancora troppo elevato, compreso tra 25 e 500 nano grammo/

ml.

SAGGI BIOCHIMICI : fatti perché le tossine sono in grado di idrolizzare una certa proteina. Quindi

bisogna evidenziare la presenza della tossina, in modo indiretto, andando a vedere se c’è stata

l’attività enzimatica. Uno dei saggi biochimici possibili si basa sul principio noto come FRET

(FORESTER RESONANCE ENERGY TRANSFER) con il quale si ha un trasferimento di energia

Cosa succede?

Trasferimento molecola, una

molecola che abbia attività

enzimatica della tossina botulinica.

Tale molecola è fissata

all’estremità ad un gruppo

fluoroforo(gruppo che genere

fluorescenza);

Succede che normalmente il primo

fluoroforo, riceve energia in forma di

variazione, ma non si tiene l’energia, ma la trasmette secondo il principio FRET, al secondo gruppo

fluoroforo (legato alla seconda estremità);

Se la molecola interna è intatta, si avranno due segnali di fluorescenza emessa. Se la molecola

viene degradata per azione della tossina succede che uno dei 2 segnali di fluorescenza continua

ad essere emesso, mentre l’altro segnale è ridotto

Ma cosa prevede schematicamente il protocollo ?

• Coltivazione di una linea cellulare che contiene la proteina sensibile alla tossina legata a

due fluorofori;

• Incubazione in presenza del campione potenzialmente contaminato dalla tossina;

• Lettura fluorescenza

Per quanto riguarda la sensibilità diremo che è pari a quella del TEST ELISA. Quindi sono richieste

attrezzature con discreto livello di tecnologia e un personale qualificato.

METODI DI DETECTION AMMINE BIOGENE

I principali metodi sono :

Elettroforesi capillare ;

 Cromatografia su strato sottile;

 Gascromatografia ;

 HPLC

Le ammine biogene, nella maggior parte dei casi, sono rilevate tramite HPLC in fase

inversa. In particolare vediamo l’applicazione per ammine biogene presenti nei formaggi.

Il protocollo prevede :

Estrazione acida: il campione di formaggio viene omogenizzato con una soluzione di acido

 cloridrico, sospensione che viene poi centrifugata. Le fasi successive saranno effettuate sul

surnatante;

Su questo estratto, il quale conterrà ammine e tante altra sostanze, viene effettuata una

 operazione di derivatizzazione, una reazione chimica che consente alle ammine presenti

nell’estratto di essere rilevate mediante DETECTOR UTRAVIOLETTO impostato ad una

lunghezza d’onda di 254 nm. L’agente utilizzato può essere diverso, in tal caso è il DANSIL

CLORURO. Alla fine di tale reazione si ha un’ammina DANSILATA. In pratica il DANSIL

CLORURO sostituisce l’H del gruppo NH2;

Estrazione ammine con etere dietilico: le ammine sono separate da altri composti organici

 presenti nel campione;

Ottenuto l’estratto etereo, esso viene portato a secco mediante, ad esempio, uso di un

 evaporatore centrifugo sotto vuoto;

Prima dell’analisi HPLC, l’estratto etereo è solubilizzato nella fase mobile e quindi caricato

 in colonna. La fase inversa è chiamata tale perché abbiam la fase stazionaria è costituita

da una molecola con catena idrocarburica più o meno a 18 atomi di carbonio. Quindi si

tratta di una molecola meno polare rispetto alla fase mobile, di conseguenza le molecole

più polari come gli amminoacidi eluiscono prima, poi via via eluiranno quelle sempre meno

polari. In figura abbiamo i primi picchi sono gli amminoacidi più polari, poi via via abbiamo

altri picchi che rappresentano le ammine.


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lidiaspa

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DETTAGLI
Corso di laurea: Corso di laurea in scienze e tecnologie alimentari
SSD:
Università: Bari - Uniba
A.A.: 2014-2015

I contenuti di questa pagina costituiscono rielaborazioni personali del Publisher lidiaspa di informazioni apprese con la frequenza delle lezioni di Salubrità degli alimenti e studio autonomo di eventuali libri di riferimento in preparazione dell'esame finale o della tesi. Non devono intendersi come materiale ufficiale dell'università Bari - Uniba o del prof Minervini Fabio.

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