Le radici del cancro

Le radici del cancro: una panoramica generale sugli attuali molteplici modelli a livello biologico-molecolare

Oncogeni

Innanzitutto parliamo di oncogeni, il cui termine viene coniato nel 1969 e serve a indicare geni normali (proto-oncogeni) necessari alla normale vita cellulare, ma che se sono mutati, diventano oncogeni e sono capaci di trasformare una cellula sana in cellula con fenotipo tumorale. La trasformazione causa l’acquisizione di caratteristiche tumorali. In realtà gli oncogeni, volendoli vedere in termini storici, sono stati scoperti per primi come geni facenti parte di retrovirus e il primo caratterizzato fu Src che era appunto in un retrovirus.

Detto che comunque esistono e hanno origine nei virus, in realtà noi in questa sezione parliamo di oncogeni e proto-oncogeni cellulari, che sono, nell’uomo, i più numerosi, e sono le versioni per altro umane di quelli che possiamo trovare a livello virale. A inizio anni ‘80 si definiva oncogene un proto-oncogene che muta e diventa quindi un gene capace di generare fenotipo malattia. Per dimostrare questa visione, la prima cosa era di dover trovare un gene capace di produrre qualcosa per trasformare il fenotipo da sano a malattia. Vennero quindi presi dei fibroblasti murini trasformati chimicamente, ovvero in cui erano state introdotte parecchie mutazioni mediante agenti chimici che trasformarono proto-oncogeni in oncogeni.

Venne poi recuperato il DNA mediante lisi o cristalli di calcio sonificazione, e venne fatto un tipo di transfezione in cui si usano cristalli arricchiti di DNA che entrano nella cellula trasformando quindi il nucleo di queste cellule. Fu osservato che una volta ogni tanto, se usati fibroblasti murini trasformati (ovvero cellule che crescono indefinitivamente) ci si accorgeva che fibroblasti murini normali (che non dovrebbero più replicarsi dopo un certo punto), transfettati con questi DNA, tornavano a proliferare. Questo ci dimostra che questi geni hanno una capacità trasformante.

Trasfezione e sequenze ALU

L’obiettivo successivo era poi vedere se queste cellule avessero le capacità di generare un tumore, andando a analizzare l’espressione del gene stesso in vivo. Si transfettò quindi DNA trasformato ma non partendo da una linea murina ma umana. Negli anni ‘80 questo passaggio uomo-topo non era chiaro se potesse funzionare, ma in realtà sono geni abbastanza simili e funziona. Venne quindi preso un tumore umano, preso il DNA di tale tumore umano, frammentato e transfettato. La domanda da porci ora è: come si fa a selezionare una parte di DNA umano? Ma in realtà la risposta è abbastanza semplice, perché il DNA umano è ricco di sequenze ALU, ovvero quei retrotrasposoni corti (anche detti SINE) di circa 300pb, il che rende il DNA umano enormemente (e naturalmente, cioè per via naturale) marcato.

Questo ci permette abbastanza facilmente di poter selezionare parti di DNA umano. Quindi il primo step è quello di frammentare il DNA umano, e trasformarlo, come abbiamo visto prima, in cellule murine (per esempio sempre fibroblasti) sane. Solo alcune di esse, evidentemente saranno poche, andranno incontro alla formazione di foci, il che ci deve far pensare che in quelle cellule è successo qualcosa, ovvero la trasformazione a carico del “frammento giusto” di DNA umano. Dopodiché lo step successivo si basa sulla necessità di riuscire a isolare il frammento più piccolo capace di dare trasformazione, ovvero il gene “in persona”.

Allora si pensò di prendere DNA a partire da quelle cellule di topo, per esempio fibroblasti, trasformate precedentemente e rifacendo una specie di secondo ciclo, ovvero da quei fibroblasti modificati si recupera ancora una volta il DNA, e ancora si va a trasformarlo in altre cellule di topo normali. E ancora una volta si isolano solo quelle che generano foci, e significa che hanno subito trasformazione con il frammento giusto che conterrà il gene, e si pensa ora sia un frammento “più pulito e nitido” di quello precedente.

Tutto questo funziona abbastanza facilmente, sebbene sia un passaggio da uomo a topo. L’unica domanda è allora come trovare, in quello che poi è un genoma murino, quel gene umano da cui sono partito con la prima transfezione che vedeva l’origine in un genoma umano? Ecco che ci tornano utili le sequenze ALU. Ci possono quindi aiutare proprio perché queste sequenze ALU (o dette anche SINE) sono di 300pb e ripetute circa 3 milioni di volte, quindi circa ripetute una ogni 3000pb. Per cui, in un primo momento per essere sicuri della presenza di genoma umano venne fatto un southern blot, ovvero la corsa di DNA post-taglio mediante enzimi e questo DNA, dopo la corsa elettroforetica si separa in base al peso molecolare, il che ci permette di usare sonde, cioè sonde ALU specifiche, per trovare determinati frammenti che contengano ALU umane, in un genoma murino. Questo non significa altro che un frammento con la presenza del nostro gene in analisi di origine umana.

Isolamento del proto-oncogene

Il passo successivo era l’isolazione del gene, il proto-oncogene. Quindi si prepara una library di frammenti genomici originanti dalla frammentazione del genoma umano mediante enzimi di restrizione. Si usano nuovamente sonde per sequenze ALU, nello specifico la zona che abbiamo riscontrato essere risultata “positiva” nell’elettroforesi. In questo modo saremo capaci di identificare dove si trova il mio gene che mi interessa perché sarà nelle vicinanze di quella sequenza ALU e quindi andremo a identificare il gene.

Una volta identificato, la teoria originale dice questo oncogene avesse subito una mutazione rispetto al proto-oncogene iniziale e quindi si può costruire delle sequenze miste, ibride, tra proto-oncogene e oncogene, per capire la parte trasformante. In questo modo, come si vede in figura qua sotto, si riconosce la mutazione minima, capace di trasformare il proto-oncogene in oncogene, definendola come mutazione causativa. Oggi in realtà molto più semplicemente facciamo un sequenziamento da subito, nelle cellule murine e senza fare neanche affidamento necessariamente alle sequenze ALU.

Proto-oncogeni e mutazioni

I proto-oncogeni sono abbiamo detto geni normali che hanno una fine regolazione e quando questa viene meno, possono essere causa di comparsa di fenotipo tumorale. La causa di questa de-regolazione può essere vasta. Infatti può essere mutazione, oppure anche per una forma di iper-espressione causata da amplificazione genica o anche causata da traslocazione cromosomica (vedi per esempio ABL-BCR in cui si ha associazione di un gene costitutivamente espresso a un gene che non lo è ma lo induce a essere espresso in modo enorme).

Vediamo ora alcuni proto-oncogeni, i più caratteristici:

• RAS: GTPasi RAS è una GTPasi che fa parte di una via di signaling che arriva al nucleo, mediante le MAP chinasi, inducendo la proliferazione mediante attivazione finale di fattori trascrizionali proliferativi. RAS la troviamo in due forme, attiva e inattiva. GTP binding RAS è l’isoforma che è capace di attivare la cascata di segnalazione. Tuttavia è molto importante che, in condizioni sane, fisiologiche, venga anche disattivata, tanto che infatti esiste una proteina, detta GAP (GTPase Activating Protein), che attiva l’attività GTPasica intrinseca a RAS e permette così di idrolizzare la GTP legante RAS, convertendo quindi RAS in GTP binding RAS inattiva. È però necessario anche un fattore attivante, tanto che esiste la proteina GEF che sostituisce la GDP in GTP rendendo attiva nuovamente RAS. E sappiamo che se subisce una mutazione nel sito attivo della GTPasi, succede che nonostante l’intervento di GAP, RAS non idrolizza la GTP perché la sua attività enzimatica è disattivata dalla mutazione, quindi RAS rimane costitutivamente attivato e quindi è diventato definitivamente un fattore pro-oncogenico tumorale. Vediamo in cosa consiste questa mutazione. Da notare che fu il primo caso a essere caratterizzato a inizio degli anni ‘80. La prima mutazione trovata, la più comune, è il codone per la Glicina posizione 12 che viene mutato nel codone GGC Valina. Un’altra mutazione è invece nel codone successivo, il codone 13, sempre codificante per Glicina, e infine anche una terza possibile mutazione nel codone 61, codificante per una Glutammina. La mutazione più comune è di gran lunga quella in posizione 12, meno comune è la 13, e ancora meno comune è quella dell’amminoacido 61. In ogni caso, tutte queste mutazioni fanno venire meno l’attività GTPasica rendendo la proteina costitutivamente attivata. È perciò una mutazione Gain of function in cui RAS rimane poi sempre in forma attivata. Ci sono invece altre mutazioni che sono invece Loss of function che sono quelle NON nel sito attivo ma che al massimo non fanno che indurre mutazioni che allontanano dal fenotipo tumorale, mentre lo sono infatti solo le gain of function ma che si presentano solo se avvengono nel sito attivo GTPasico dell’enzima stesso.
• Recettori Tirosino-chinasici (TK): potremmo parlare nello specifico a un recettore, ovvero l’EGF-r prendendolo come modello di riferimento. Questo recettore ha un dominio intracitosolico abbastanza comune a molti altri tipi recettoriali, con in comune sempre la presenza del dominio tirosino-chinasico e il dominio transmembranario. Nello specifico nella parte del dominio citoplasmatico troviamo proprio quello che viene detto dominio di omologia, Src homology region o anche detto che fa parte del dominio proprio Tyr-k. Molto diversi invece sono in genere i domini extra-citosolici, ovvero quella parte del recettore che coinvolge ligandi specifici. Quando fu scoperto questo oncogene, fu scoperto in una forma virale da principio, ma che fu visto avere una mutazione simile anche nelle cellule, nell’oncogene cellulare ErbB-1 (detto Her-1), anche nome con cui indichiamo l’oncogene, quindi il gene vero e proprio, che codifica per la classe dei recettori EGF-r e nello specifico è un tipo di delezione tra esoni 2 e 7 nel dominio extracellulare. Nel virus oncogeno probabilmente si può dire che nel momento in cui il gene si integrò, alle origini della “nascita” di questo gene, probabilmente vi si integrò solo un pezzo, sinonimo quindi di una specie di delezione. Il recettore nella sua forma codificata dal gene WT è strutturato in modo tale da avere una caratteristica Porzione Oncogene deleta dimerizzare, ligando-specifica, ovvero di tendere a dimerizzare nello specifico in modo dipendente, ovvero con l’arrivo del segnale di crescita. Tuttavia con la delezione, e quindi la mutazione del gene, viene a formarsi una proteina tronca e mutata, che genera quindi una dimerizzazione ligando-indipendente. Molto simile a ErB-1 visto nora che corrisponde al fattore di crescita EGF, esiste anche ErB-2 (Her-2) (detto anche neu) che è responsabile, con altissima frequenza del tumore alla mammella. In realtà ci sono anche altri modi di dimerizzazione ligando-indipendente, per esempio a una over-espressione, con il tipico iper-affollamento in membrana con una dimerizzazione spontanea.
• Infine ci sono anche proto-oncogeni che traducono per dei fattori di crescita che vanno a indurre signaling in modo autocrino, su recettori collocati in membrana della cellula stessa che produce tali fattori. E si può verificare una loro over-espressione di questi fattori di crescita e che generano una iper-segnalazione. Quindi di fatto, nella categoria dei recettori simili a ErB1 e ErB2 (Her1 e Her2), possiamo proprio vedere queste due modalità di conversione del proto-oncogene a oncogene a tutti gli effetti, quindi si vede da una parte un evento del tipo delezione che comporta a eventi di attivazione ligando indipendenti per una modificazione morfologica della proteina, dall’altro lato invece vediamo l’esempio di una attivazione dell’oncogene causata da una iper-espressione del prodotto proteico e quindi una forma di iper-affollamento in membrana che causa proprio sempre la dimerizzazione spontanea del tipo ligando-indipendente.
• Esiste, sempre a proposito sempre di recettori, anche eventi abbastanza particolari, ovvero eventi in seguito a traslocazioni geniche in cui si ha scambi di frammenti genici. Si può infatti avere la formazione delle così dette proteine di fusione. Per esempio si può vedere il caso della proteina Ros che è un recettore di membrana normalmente in forma monomerica. Si ha una seconda proteina detta Fig, che è anch’essa un monomero, ma che tende a dimerizzare. Se, per traslocazione genica, si forma un ibrido genico tra Fig e Ros, si può generare un prodotto tale che all’N-terminale di Ros si esprima Fig e che spontaneamente dimerizza con un’altra proteina Fig-Ros frutto sempre della traduzione dell’ibrido genico. Questa dimerizzazione porta a far dimerizzare le due estremità Fig, ma di fatto fa dimerizzare anche il recettore Ros, attaccata proprio alle Fig che dimerizzano.
• Myc: è un fattore trascrizionale che di fatto è simile alla struttura HLH (Helic-loop-helic), ma anche al Leucine zipper. Ricordiamo che l’HLH è quel fattore di trascrizione che funzionano come dimero e ogni monomero ha una elica alfa di interazione con il DNA e un’elica per la dimerizzazione. In seguito alla dimerizzazione crea questa “pinza”, frutto dell’unione delle due eliche di contatto col DNA, una per monomero, che serve a agganciare gli acidi nucleici, e poi si ha l’unione dei due monomeri, sempre mediante due alfa eliche (con un totale, per ogni dimero, di 4 alfa eliche, 2 imputate al contatto con DNA, e 2 alla dimerizzazione). Myc è una struttura in cui il dominio di dimerizzazione funge sia perché si ha una HLH, sia perché si ha una porzione leucine zipper. Myc funziona sempre come eterodimero, con un’altra proteina del tipo HLH detta Max. Quindi possiamo dire che quando Myc si lega a Max, abbiamo la formazione del dimero con conseguente attivazione di Myc nella funzione proliferativa. Tuttavia, esiste una terza proteina, che compete con Max nel legame proprio con Myc, e che è molto simile a Max, e che si chiama Mad (o anche detta Mxd). In questo caso la funzione di Mad è quella di scalzare Myc, e legare quindi Max, con conseguente inattivazione dello stimolo proliferativo di Myc. Nello specifico possiamo dire che il dimero Myc-Max (ATTIVO) lega il DNA nei cosiddetti E-box (sequenze di nt del tipo CACGTG) dando segnali proliferativi. Nel momento in cui cambia la situazione della cellula, e Myc non deve essere più attivo, Myc vien espulso dal legame con Max da parte di Mad, che ne prende il posto, e quindi si forma un dimero Mad-Max che però non è attivo e quindi fa diminuire notevolmente la proliferazione, favorendo la differenziazione cellulare. Questa la rappresentazione della cellula “sana”. Tuttavia può succedere di trovare Myc over-espresso e quindi si ha una proliferazione costante e una inibizione invece del differenziamento cellulare. In questo caso infatti Myc over-espresso, e quindi nella sua isoforma di oncogene, è così abbondante che Mad non riesce più a scalzarlo e quindi succede che si ha una iper-proliferazione. Questo evento è proprio quello responsabile del Retinoblastoma. Per dimostrarlo venne fatto un esperimento in cui venne realizzata una proteina di fusione tra Myc e il recettore ER, il recettore degli estrogeni. Questa fusione fa sequestrare Myc a livello citosolico, infatti i recettori per i corticosteroidi in generale (che ricorda possono diffondere attraverso le membrane) sono proprio citosolici e il legame con il recettore ER fa rimanere l’ormone nella cellula facendo quindi attivare il signaling a livello nucleare. In questo modo formiamo nel citosol il dimero ER-Myc. Dopodiché si aggiunge estrogeni, o il tamoxifene, che mima gli estrogeni, per farlo legare con ER, facendolo dunque attivare, attivando il dimero ER-Myc facendolo migrare nel nucleo. Quindi una volta nel nucleo prende forza Myc, che lega Max, dimostrando come la sua attivazione genera proprio l’attivazione della proliferazione cellulare.

Amplificazione genica e traslocazioni

Quindi abbiamo detto che l’attivazione di Myc è dovuta all’amplificazione, ovvero esistono più copie di quel gene all’interno del genoma. L’evento di amplificazione genica si può verificare in due modalità:

• HRS (homogeneously region stain), il nome deriva dalla colorazione che ci permette di vedere questo tipo di amplificazione genica. Infatti è una colorazione che si fa nel cariotipo, in seguito all’analisi dei cromosomi di una cellula con il blocco della crescita cellulare in metafase. È una colorazione omogenea, come dice il nome, derivante dal fatto che questo tipo di amplificazione, marcabile proprio con questa tecnica, è frutto di un’amplificazione del tipo intercromosomica testa-testa.
• DM (Double minute chromosom) è invece un tipo di amplificazione genica del tipo extra-cromosomica, che porta alla formazione di frammenti genici che appunto non sono più dentro al cromosoma di origine, ma che continuano a avere capacità trascrizionali e traduzionali.

Tornando quindi a Myc, la traslocazione 8-14 è la più frequente che genera il linfoma di Burkitt.