Laboratorio di preparazione estrattiva e sintesi dei farmaci

LABORATORIO DI

PREPARAZIONE ESTRATTIVA

E SINTESI DEI FARMACI

3° Anno - a.a. 2020-2021

Prof. Annalida Bedini 1

SICUREZZA IN LABORATORI rischi infortunistico,

Le attività che si volgono nei laboratori chimici comportano una serie di che possono essere sia di tipo legato per

igienico-ambientale,

lo più ai rischi di lesioni traumatiche, sia di tipo legati all’esposizione ad agenti e/o fattori nocivi presenti

nell’ambiente di lavoro.

rischio

Il può essere de nito come la probabilità di avere un danno per esposizione ad un pericolo.

sicurezza

La consiste nella riduzione al minimo realizzabile del rischio.

Rischi di tipo infortunistico

➤

Esempi: lesioni per ferite da taglio, lesioni da ustioni termiche.

Rischi di tipo igienico-ambientale

➤

Esempi: agenti di tipo sico (esposizione prolungata a rumore, ultrasuoni, radiazioni ionizzanti), agenti di tipo chimico (inalazione,

contatto, ingestione di sostanze).

Valutazione della pericolosità di un composto:

→

Per agenti di tipo chimico si e ettua attraverso pittogrammi, indicazioni di pericolo

e consigli di prudenza, scheda di sicurezza (MSDS: Material Safety Data Sheet; fornita dalla ditta).

La singola persona è responsabile nel condurre un esperimento in maniera sicura senza essere pericolosa per sé stessa e per gli altri,

quindi è tenuta a conoscere ed osservare le regole di sicurezza di base essenziali di un laboratorio di chimica organica.

Prima di cominciare qualsiasi esperimento viene valutata la pericolosità dei reagenti che ci si appresta ad utilizzare.

GHS: Globally Harmonized System of Classi cation and Labelling of Chemicals

Entrato in vigore nel 2009.

Sistema mondiale armonizzato di classi cazione e di etichettatura delle sostanze chimiche che ha l’obiettivo di stabilire una base

comune e coerente per il pericolo chimico.

- Per facilitare il crescente commercio internazionale;

- Per proteggere la salute umana e l’ambiente;

- Per uniformare le regolamentazioni diverse fra i vari paesi;

- Per condividere uno standard internazionale di sicurezza.

Quasi tutti i paesi del mondo lo hanno adottato. Ci sono quindi degli standard mondiali di sicurezza.

PITTOGRAMMI

Simboli presenti nell’etichetta del prodotto che danno informazioni sommarie sulla pericolosità alla quale si va incontro maneggiando

quella determinata sostanza. Vecchi: prima del sistema GHS. Capita di incontrarli comunque, se si hanno

nel deposito sostanze vecchie.

INDICAZIONI DI PERICOLO E PRUDENZA lettera

Ad ogni sostanza è associata un’indicazione di pericolo e delle indicazioni di prudenza, date da una (P: prudenza, H: pericolo)

codice a 3 cifre.

seguita da un

Vecchia classi cazione: R: Rischio; S: Sicurezza.

Frasi supplementari per criteri solo UE e non GHS: EU + tre cifre (o + il numero della vecchia frase R)

Queste informazioni sono riportate nell’etichetta.

ESEMPIO: Dai pittogrammi capiamo che è una sostanza in ammabile e

corrosiva. 2

fi fi fi fi

O fi ff fi

Queste informazioni è bene averle prima di ricevere il prodotto, perché alcuni laboratori potrebbero non essere idonei alla

conservazione o al maneggiamento di determinate sostanze pericolose.

Le ditte forniscono già da subito una scheda di sicurezza della sostanza.

Esempio di ditta: Sigma-Aldrich

Ha in catalogo circa 300 mila sostanze.

La scheda di sicurezza fornisce informazioni esaustive di una sostanza o miscela per l’uso in luoghi di lavoro in 16 punti obbligatori:

1. Identi cazione della sostanza e della società produttrice

2. Indicazione dei pericoli

3. Composizione ed informazione ingredienti

4. Misure primo soccorso

5. Misure antincendio

6. Provvedimenti in caso di fuoriuscita accidentale

7. Manipolazione e stoccaggio

8. Controllo dell’esposizione e protezione individuale

9. Proprietà chimico- siche

10. Stabilità e reattività

11. Informazioni tossicologiche

12. Informazioni ecologiche

13. Considerazioni sullo smaltimento

14. Informazioni sul trasporto

15. Informazioni sulla regolamentazione

16. Altre informazioni punto di in ammabilità

Flash point di comuni solventi: il è la temperatura più bassa alla quale si formano vapori in una quantità tale

da determinare il fenomeno della combustione in presenza di ossigeno e di un innesco.

Non è il punto di ebollizione! Ebollizione ≠ Combustione

Es: l’etanolo ha punto di ebollizione a 80°C, punto di in ammabilità a 12°C.

Dato che si usano sostanze in ammabili, si ha l’esigenza di non utilizzare amme libere!

Quando avremo bisogno di riscaldare non si userà mai il Bunsen, ma metodi alternativi.

Comuni operazioni condotte a pressione ridotta:

- Filtrazione a pressione ridotta

- Rotavapor (un distillatore, favorisce l’allontanamento dei solventi)

La vetreria deve essere integra e adatta a sostenere il vuoto che si produce.

Dispositivi di protezione individuale e collettiva:

- Occhiali;

- Guanti monouso;

- Camice;

- Cappe aspiranti.

Smaltimento dei ri uti: niente deve essere versato nel lavandino! (a meno che non venga espressamente suggerito).

Suddivisione dei ri uti in:

- Soluzioni acquose;

- Solventi alogenati (non li avremo);

- Solventi non alogenati.

CROMATOGRAFIA SU STRATO SOTTIL

TLC (Thin Layer Chromatography)

cromatogra ca di adsorbimento solido-liquido

È una tecnica semplice e veloce, che richiede solo minime quantità di campione

−9

10

(nell’ordine dei g). fase stazionaria fase mobile,

Si basa sulla diversa ripartizione di sostanze tra una ed una in funzione dell’a nità che ogni sostanza

ha per esse.

- Fase stazionaria (FS): materiale granulare omogeneo (es: gel di silice o allumina (sono entrambi polari, in fase diretta); RP-18 fase

stazionaria apolare, è in fase inversa).

Nella TLC la fase stazionaria è generalmente costituita da silice (più raramente allumina) addizionata di leganti (gesso, amido, ecc.) che

viene depositato, sotto forma di strato sottile, su un supporto piano solitamente di vetro o di alluminio.

- Fase mobile (FM): liquido che sale lo strato sottile di fase stazionaria per capillarità.

Diversi tipi di TLC:

- Preparativa: cromatogra a il cui obiettivo è quello di separare i componenti di

una miscela dal punto di vista quantitativo. Viene fatta con grandi quantità di

materiale. Lo strato sottile ha uno spessore maggiore ( no a 2 mm); la

dimensione della particella è maggiore.

- Analitica: obiettivo di analizzare la miscela, veri cando la sua composizione.

Si utilizza una minima quantità della miscela. 3

fi fi

fi

fi fi fi fi fi fi E fi fi fi ffi

HPTLC Performance TLC)

La (High si utilizza in casi particolari, miscele complicate da separare. Utilizza uno strato molto sottile e le

dimensioni delle particelle sono molto piccole.

(Noi in laboratorio utilizzeremo quella analitica)

La TLC viene principalmente impiegata per:

- Seguire l’andamento di una reazione: scomparsa dei reagenti e/o comparsa di prodotti;

- Controllare il grado di purezza di una sostanza;

- Riconoscere prodotti incogniti;

- Identi care l’eluente più adatto da impiegare per una separazione cromatogra ca su colonna;

- Seguire l’andamento di una separazione cromatogra ca su colonna.

Materiale impiegato:

- Lastre cromatogra che (comprate già preparate);

- Capillari per deposizione (per trasferire il campione sulla lastra);

- Eluente;

- Camera cromatogra ca (all’interno della quale si veri ca la separazione);

- Sistema di rivelazione.

PROCEDURE OPERATIV

Semina

1. diluite

Il campione, sciolto in opportuno solvente (soluzioni 1-2% nel solvente meno polare in cui la sostanza è solubile), viene posto

sulla lastrina come una macchia (spot) utilizzando opportuni capillari di vetro.

Si prende una punta di spatola del campione e si aggiunge circa 1ml di solvente e si assicura che il campione sia sciolto. Se non è

completamente sciolto si può ricorrere ad un breve riscaldamento.

capillari di vetro.

Trasferimento della soluzione nella lastrina tramite dei Si inserisce il capillare nella soluzione, che risalirà per

capillarità. Poi lo si poggia sulla lastrina.

Eventualmente si asciuga lo spot, per far evaporare il solvente.

La semina è realizzata lungo una linea parallela al bordo inferiore della lastrina, a circa 1 cm da esso; tracciata a matita.

Bisogna generare spots non troppo grandi.

Se la soluzione è diluita è possibile seminare più volte nello stesso punto.

Si depone il campione e si segnano i punti (con una matita).

Eluizione

2. fase mobile

La lastrina viene appoggiata verticalmente all’interno della camera di sviluppo contenente la (eluente) assicurandosi che il

livello dell’eluente sia al di sotto della macchia (se lo spot è immerso nell’eluente, viene dissolto).

L’eluente risale la lastrina per capillarità e viene fatto correre no a circa 1 cm dal bordo

superiore.

Durante lo sviluppo i vari componenti della miscela migrano e si separano a seconda della

diverse a nità nei confronti della FM e FS.

A sviluppo completato, si estrae la lastrina e si segna il livello raggiunto al fronte del solvente

(con la matita), si evapora l’eluente e si passa quindi alla fase di rivelazione.

Qualora alcune sostanze non siano state completamente separate (si trovano vicine), è

sviluppo

→

possibile ricorrere ad un ulteriore sviluppo (utilizzando la stessa lastrina)

multiplo.

Non bisogna muovere la camera di eluizione! (Si avrebbe una risalita non livellata).

camera di eluizione

La deve essere chiusa ermeticamente sia perché i solventi sono volatili, ma soprattutto perché la camera deve

essere satura. La saturazione della camera è fondamentale per la buona riuscita della separazione cromatogra ca.

Inoltre, in una camera satura la progressione della FM avviene più velocemente.

Rendendo la camera satura, si controbatte l’evaporazione del solvente dalla super cie piana della lastrina.

Per garantire la saturazione, nella camera (che sono in pratica dei barattoli) vengono inseriti dei fogli di carta da ltro che si imbevono

della fase mobile e quindi l’evaporazione del solvente che avviene dalla carta da ltro garantisce la saturazione della camera.

Le sostanze si spostano in funzione della loro polarità e di quella dell’eluente.

In presenza di una TLC in fase diretta (adsorbenti più polari rispetto alla FM) le sostanze più polari

avanzano più lentamente di quelle meno polari.

Se si utilizza una TLC in fase inversa (apolare), le componenti più trattenuti sono quelli polari e quelli che

migrano maggiormente sono quello polari.

gel di silice

Il è polare dal momento che in super cie il polimero di biossido di silicio espone sia gruppi silossanici (Si-O-Si) polarizzati,

sia dei silanoli (gruppi funzionali Si-OH).

Quando la fase mobile sale lungo la silice, i composti in essa disciolti sono in grado di interagire con i

gruppi polari della silice. Le interazioni in gioco sono principalmente dipolo-dipolo e legami a idrogeno,

e quindi quanto più polari sono i composti, tanto più verranno trattenuti dalla fase stazionaria. 4

fi ffi fi fi E fi fi

fi fi fi fi fi fi fi

Per esempio, se si ha una miscela di alcol benzoico, benzaldeide e un alchene generico:

- →

Alcol benzoico: dà interazioni sia come accettore che come donatore di ponte a idrogeno il più trattenuto

- Benzaldeide: accettore di ponti a idrogeno

- →

Alchene: non dà interazioni il più avanti

fase mobile capillarità

Nella TLC la è un liquido, o una miscela di liquidi, scelti per lo sviluppo e la sua migrazione avviene per

ascensionale.

La FM dovrà avere caratteristiche tali da competere opportunamente con il soluto per l’adsorbimento sulla fase stazionaria. Se la

competizione è e cace, il soluto passa più tempo nella fase liquida e scorre di più.

In alcuni casi è opportuno aggiungere un acido o una base organica (rispettivamente per eluire acidi e basi fortemente trattenuti).

Il potere di sviluppo è direttamente proporzionale alla polarità della

sostanza.

Alto potere di sviluppo: permettono una maggior risoluzione.

Es: Metanolo ha elevata a nità per il gel di silice, quindi si associa

fortemente ad esso e di conseguenza sposta gli analiti maggiormente nella

FM. (Maggiore migrazione)

Migrano troppo, tutti al fronte.

Invece utilizzando un solvente troppo poco polare, gli analiti non migrano.

ORDINE DI ELUIZIONE SU GEL DI SILICE

La di erente a nità che ciascuna sostanza organica ha nei confronti della FM e della FS è una caratteristica intrinseca di ciascun

composto organico, dipendente da: polarità, dimensione e volume delle molecole.

Pertanto alcune sostanze sono trascinate maggiormente ed altre in misura minore a parità di fase mobile, permettendo di e ettuare

una completa separazione dei composti costituenti la miscela.

Sostanze più polari, come gli acidi carbossilici, saranno quelli maggiormente trattenuti

(sono quindi quelle più adsorbite dal gel di silice).

Ciò però non signi ca che un acido carbossilico rimarrà sempre con nato alla base; se

io ho una sostanza polare e voglio farla migrare maggiormente devo utilizzare un

eluente più polare.

Trovare, a parità di FS, l’eluente più opportuno.

Rivelazione

3.

Se i componenti della miscela non sono direttamente visibili (assorbono nel visibile) bisogna utilizzare opportuni metodi di rivelazione,

lampade UV

come ad esempio l’irraggiamento della lastrina con che emettono a 254 e 366 nm.

→

- Sostanze uorescenti macchie luminose su fondo scuro.

→

- Sostanze non uorescenti (la maggior parte) la FS deve contenere una sostanza uorescente (silicato di zinco e magnesio attivato:

→

assorbe UV a 254 nm ed emette luce verde) macchie scure su fondo uorescente.

Questo metodo è utile per le sostanze che assorbono alla lunghezza d’onda di 254 nm.

Potrebbero però anche essere presenti molecole che non assorbono a questa lunghezza d’onda, e quindi con questo sistema di

rivelazione non si vedeno. agenti chimici.

Si utilizza quindi anche un altro tipo di rivelazione, con

Reattivi di uso generale:

- →

Iodio: utile per rivelare sostanze che contengono doppi legami e che formano complessi a trasferimento di carica con lo iodio

spots giallo-marroni.

- →

Acido solforico in etanolo, che viene spruzzato sulla lastra poi viene portata a calore, le sostanze vengono così carbonizzate

spots scuri su fondo bianco.

- Permanganato di potassio in soda: reattivo ossidante che porta alla formazione di macchie

→

scure (di permanganato) la lastrina appare viola e le macchie giallo-marroni.

- →

Sali di molibdeno e di cerio: reattivo ossidante macchie blu-viola su fondo giallo.

Spesso si porta anche a riscaldare, utilizzando una pistola termica (fonte di calore diretto e

preciso che arriva no a 600°C).

Permanganato più ossidante rispetto ai sali di molibdeno e cerio.

Reattivi speci ci (che noi non useremo) per gruppi funzionali:

- Ninidrina: per amminoacidi;

- 2,4-dinitrofenilidrazina: per aldeidi e chetoni 5

ff fl fi ffi fl ffi fi

fi ffi fi fl fl ff

fattore di ritenzione

4. Calcolare per ogni sostanza il (Rf):

Rappresenta la mobilità cromatogra ca.

Rapporto tra distanza percorsa dalla sostanza e quella percorsa dal solvente.

Il valore è compreso tra 0 (sostanza completamente trattenuta dall’adsorbente) e 1 (sostanza

non trattenuta che migra no al fronte) e viene espresso no alla seconda cifra decimale.

La capacità di separare una sostanza di interesse da altri componenti interferenti (selettività)

permettendone una identi cazione inequivocabile, in una TLC è legata alla mobilità cromatogra ca dei componenti della miscela, ed è

espressa dal fattore di ritenzione (o fattore di ritardo; Rf).

Fattori che in uenzano l’Rf:

- Uniformità delle particelle e spessore della FS;

- Temperatura che può in uenzare la composizione della FM;

- Grado di saturazione della camera di sviluppo;

- Quantità di miscela da separare seminata.

Quindi, non è semplice utilizzare questo parametro per poter identi care una sostanza in due TLC di erenti (poiché appunto l’Rf

dipende e varia a seconda di diversi fattori).

Per questa ragione, per e ettuare una analisi identi cativa di una sostanza tramite TLC è necessario seminare, sulla medesima lastrina

accanto alla miscela in esame, i componenti puri (standards) che ci si aspetta di trovare, e ettuando il riconoscimento per confronto

diretto tra gli Rf degli spot incogniti con quelli degli standards seminati (in questo modo sia la miscela in esame che gli standards

risentiranno delle stesse condizioni).

In questo modo, se otteniamo due Rf uguali, abbiamo alte probabilità che le due sostanze siano la medesima molecola.

Però in realtà diverse sostanze possono avere Rf uguali. Non è quindi una certezza (bisognerà ricorrere ad altri metodi analitici).

A volte si possono avere delle situazioni ambigue, in cui ad esempio due sostanze sono molto vicine ma non sono perfettamente

allineate: si tratta di due sostanze diverse o della medesima sostanza? (Vedi immagine a)

TLC in miscela

In questo caso, per identi care il composto può essere utile eseguire una (o

double spotting, o co-spotting) che richiede tre semine:

1. Il composto da identi care,

2. Il campione di riferimento,

3. Una miscela dei due.

In questo caso posso avere due risultati diversi:

b) nel punto di semina della miscela vedo che ci sono due macchie (separate di poco, ma

→

comunque sono due macchie) ho due sostanze diverse con Rf molto simili;

→

c) nel punto di semina della miscela vedo un unica macchia le due sostanze sono la medesima

(o