Laboratorio di preparazione estrattiva e sintesi dei farmaci

Laboratorio di preparazione estrattiva e sintesi dei farmaci

Norme di sicurezza in un laboratorio di sintesi organica

Registrazione dei dati sperimentali.

Progettazione ed esecuzione di sintesi organiche.

Fattori sperimentali che influenzano il decorso di una reazione.

Comuni attrezzature e strumentazioni di laboratorio, assemblaggio della vetreria.

Tecniche di agitazione ed impiego dei catalizzatori per trasferimento di fase; raffreddamento e riscaldamento di miscele di reazione.

Reazioni condotte in condizioni anidre ed in atmosfera inerte.

Tecniche di isolamento e purificazione di prodotti

• Filtrazione per gravità, a pressione ridotta, a caldo, metodi ed apparecchiature.
• Cristallizzazione: basi teoriche, scelta del solvente, uso del carbone decolorante, cristallizzazione semplice e frazionata, materiali e procedure; risoluzione ottica per cristallizzazione.
• Essiccamento di prodotti solidi.
• Estrazione: basi teoriche, estrazione continua e discontinua di soluzioni, apparecchiature usate.
• Anidrificazione di soluzioni e solventi organici: uso di agenti essiccanti.
• Tecniche di estrazione di prodotti naturali (macerazione, percolazione, infusione, decozione, digestione), estrazione con fluidi supercritici, con l’ausilio delle microonde e degli ultrasuoni, estrazione con liquidi pressurizzati, estrazione con Naviglio estrattore.

Evaporatore rotante e tecniche di distillazione

Impiego delle microonde e degli ultrasuoni nella sintesi organica.

Distillazione: distillazione semplice, frazionata, a pressione ridotta, azeotropica ed in corrente di vapore, modalità ed apparecchiature.

Cromatografia di adsorbimento e sublimazione

• Cromatografia di adsorbimento: TLC e cromatografia su colonna.
• Sublimazione: basi teoriche, sublimazione a pressione ambiente ed a pressione ridotta.

Determinazione delle costanti fisiche di composti organici

• Punto di fusione, punto di ebollizione, indice di rifrazione, potere rotatorio specifico.

Esercitazioni di laboratorio

Le esercitazioni di laboratorio prevedono l’ottenimento per sintesi o estrazione da matrici vegetali di semplici sostanze di interesse farmaceutico e la loro caratterizzazione attraverso la determinazione delle costanti chimico-fisiche e l'interpretazione di spettri (IR, NMR, Massa).

Obiettivi del corso

Il corso è finalizzato all’apprendimento delle conoscenze teorico-pratiche necessarie alla sintesi, purificazione e caratterizzazione di sostanze di interesse farmaceutico ed all’isolamento e caratterizzazione di principi attivi derivanti da matrici vegetali.

Chimica farmaceutica

La Chimica Farmaceutica è una disciplina chimica che coinvolge aspetti di scienze biologiche, mediche e farmaceutiche. Riguarda l’invenzione, la scoperta, la progettazione, l’identificazione e la preparazione di composti biologicamente attivi, lo studio del loro metabolismo, l’interpretazione dei loro meccanismi d’azione a livello molecolare e la costruzione del rapporto tra struttura e attività (SAR), la relazione tra la struttura chimica e l’azione farmacologica per una serie di composti.

Ruolo del chimico farmaceutico

Il Chimico Farmaceutico si occupa quindi: della progettazione e della sintesi di nuove molecole, di verificare come queste interagiscono con le macromolecole (es. proteine, acidi nucleici), di chiarire le relazioni fra la loro struttura chimica e l’attività biologica, di studiare l’assorbimento, la distribuzione corporea e la trasformazione metabolica di queste sostanze.

Stadi della sperimentazione

In qualsiasi esperienza di laboratorio possono essere individuate due fasi:

• Pianificazione dell’esperienza: programmazione del lavoro che si intende svolgere
• Svolgimento dell’esperienza: conoscenza e corretto uso degli apparati necessari alla realizzazione dell’esperienza stessa in sicurezza

Esempio pratico di sintesi

Ad esempio per la sintesi di un prodotto un ricercatore:

• Elabora uno schema di sintesi basandosi su un approccio di tipo retrosintetico.
• Ricerca in letteratura (SciFinder, Beilstein ecc.) tutte le informazioni utili che riguardano la sintesi e la caratterizzazione di molecole il più possibile simili a quella che intende sintetizzare.
• Progetta le apparecchiature necessarie per realizzare le condizioni di reazione che si intendono utilizzare.

Svolgimento dell’esperienza

• Realizzazione dell’esperienza: sintesi o estrazione di uno specifico prodotto.
  • Assemblare l’attrezzatura necessaria
  • Misurare e trasferire le corrette quantità di materiali
  • Condurre l’esperienza a definite condizioni (temperatura, tempi, ecc.)
• Isolamento e purificazione (work-up) del prodotto: distillazione, estrazione, cromatografia, cristallizzazione, ecc.
• Caratterizzazione: verifica di identità e di purezza del prodotto ottenuto attraverso TLC, punto di fusione, punto di ebollizione, indice di rifrazione, potere rotatorio specifico, spettro di massa, IR, UV-vis, ecc. (interpretazione dei dati).

Sicurezza in laboratorio

Le attività che si svolgono nei laboratori chimici comportano una serie di rischi che possono essere sia di tipo infortunistico, legati per lo più ai rischi di lesioni traumatiche, sia di tipo igienico-ambientale, legati all'esposizione ad agenti e/o fattori nocivi presenti nell'ambiente di lavoro.

Il rischio può essere definito come la probabilità di avere un danno per esposizione ad un pericolo. La sicurezza consiste nella riduzione al minimo realizzabile del rischio.

Rischio di tipo igienico-ambientale

• Agenti di tipo fisico (esposizione prolungata a rumore, ultrasuoni, radiazioni ionizzanti)
• Agenti di tipo chimico (inalazione, contatto, ingestione di sostanze)

Valutazione della pericolosità di un composto

• Pittogrammi
• Indicazioni di pericolo e consigli di prudenza
• Scheda di sicurezza (MSDS: Material Safety Data Sheet)

Rischi di tipo infortunistico

• Lesioni per ferite da taglio
• Lesioni da ustioni termiche

Sistema mondiale armonizzato di classificazione e di etichettatura delle sostanze chimiche (GHS)

Pittogrammi, indicazioni di pericolo e consigli di prudenza.

Vecchia classificazione: frasi R (rischio) ed S (sicurezza). Nuova classificazione: frasi H e P.

• Indicazioni di pericolo (Hazard statements): Lettera H + codice a tre cifre
• Consigli di prudenza (Precautionary statements): Lettera P + codice a tre cifre
• Frasi supplementari per criteri solo UE e non GHS: EU + tre cifre (0 + il numero della vecchia frase R)

Scheda di sicurezza

Fornisce informazioni esaustive di una sostanza o miscela per l’uso in luoghi di lavoro in 16 punti obbligatori:

1. Identificazione della sostanza e della società produttrice
2. Indicazione dei pericoli
3. Composizione ed informazione ingredienti
4. Misure primo soccorso
5. Misure antincendio
6. Provvedimenti in caso di fuoriuscita accidentale
7. Manipolazione e stoccaggio
8. Controllo dell’esposizione e protezione individuale
9. Proprietà chimico-fisiche
10. Stabilità e reattività
11. Informazioni tossicologiche
12. Informazioni ecologiche
13. Considerazioni sullo smaltimento
14. Informazioni sul trasporto
15. Informazioni sulla regolamentazione
16. Altre informazioni

Molti solventi utilizzati in laboratorio sono infiammabili, motivo per cui non ci devono mai essere fiamme libere in laboratorio (bunsen). Il flash point è la temperatura a cui il solvente emette vapori infiammabili. Il punto di infiammabilità è la temperatura più bassa alla quale si formano vapori in una quantità tale da determinare il fenomeno della combustione in presenza di ossigeno e di un innesco.

Comuni operazioni condotte a pressione ridotta

Alcune operazioni vengono condotte a temperatura diversa da quella atmosferica.

• Filtrazione a pressione ridotta
• Rotavapor

È bene guardare prima dell’operazione se la vetreria presenta imperfezioni poiché, in tal caso, la vetreria non reggerebbe la pressione ridotta.

Cromatografia su strato sottile (TLC)

È una tecnica cromatografica di adsorbimento solido-liquido (modalità attraverso cui avviene la ripartizione) semplice e veloce (10 minuti al massimo), che richiede solo minime quantità di campione (nell’ordine dei 10 g). Si basa sulla diversa ripartizione di sostanze tra una fase stazionaria ed una fase mobile, in funzione dell'affinità che ogni sostanza ha per esse.

FASE STAZIONARIA: è un materiale granulare omogeneo, è fatta di vari tipi (gel di silice o allumina). Noi utilizziamo gel di silice.

FASE MOBILE: è un liquido che sale lungo lo strato sottile di fase stazionaria per capillarità. Attraverso questa presenza contemporanea di fase mobile e stazionaria, le sostanze, data la natura diversa, corrono in maniera diversa e si separano nella TLC.

Fase stazionaria

Nella TLC, la fase stazionaria è generalmente costituita da silice (più raramente allumina) addizionata di leganti (gesso, amido ecc.) che viene fatta aderire sotto forma di strato sottile su di un supporto piano solitamente di vetro o di alluminio. La fase stazionaria deve rimanere aderente aggiungendo materiali inerti che facilitano la deposizione e fanno creare più facilmente lo strato.

Si parla di strato sottile dato che la fase stazionaria è proprio fatta da uno strato sottile che si deposita.

• Preparativa
• Analitica
• HPTLC (high performance TLC)

La distinzione è basata sullo spessore dello strato e sul diametro delle particelle. Quella che effettuiamo noi è quella analitica (TLC classica). Sia quella analitica che HPTLC sono considerate ‘analitiche’. La diversa dimensione della particella dà origine a uno spessore diverso. La HPTLC ha un numero maggiore di piatti teorici e quindi abbiamo migliori performance.

La cromatografia si distingue in:

• Preparativa: su tutta la massa faccio la separazione ottimale.
• Analitica: l’obiettivo è quello di avere informazioni sulla miscela (quanti composti ho, qual è quello principale, ecc.). La cromatografia analitica precede quella preparativa.

Impieghi della TLC

La TLC viene spesso impiegata per:

• Seguire l’andamento di una reazione: scomparsa dei reagenti e/o comparsa dei prodotti.
• Controllare il grado di purezza di una sostanza.
• Riconoscere prodotti incogniti.
• Identificare l’eluente più adatto da impiegare per una separazione cromatografica su colonna.
• Seguire l’andamento di una separazione cromatografica su colonna.

Materiale impiegato

• Lastre cromatografiche
• Capillari per deposizione
• Eluente
• Camera cromatografica
• Sistema di rivelazione

Procedure operative

Semina

Deposizione del campione (semina): il campione, sciolto in opportuno solvente, viene deposto sulla lastrina come MACCHIA (spot) utilizzando opportuni capillari di vetro. La semina è realizzata lungo una linea parallela al bordo inferiore della lastrina, a circa 1 cm (anche 1,5 cm) da esso. La linea è fatta sempre a matita. Cercare di non generare spots di diametro troppo elevato; se la soluzione è diluita è possibile seminare più volte nello stesso punto.

Quando si mette il capillare sulla TLC, questo forma uno spot e si diffonde dando origine a macchie molto grandi. Per generare macchie piccole, mentre si scarica il capillare bisogna soffiare: mentre soffiamo il solvente evapora e quindi non fa una macchia molto grande.

Molte sostanze assorbono all’UV. Prima di procedere alla eluizione, una volta seminata la sostanza, bisogna andare sotto la lampada e vedere se ci sono degli spot utili. Ad esempio se ci sono sostanze molto diluite, ci si accorge subito di ciò con la lampada UV. Con la lampada si guarda se le macchie vanno bene.

Eluizione

La lastrina viene appoggiata verticalmente all’interno della camera di sviluppo contenente la fase mobile assicurandosi che la zona di caricamento sia sempre al di sopra del livello dell’eluente. L’eluente risale la lastrina per capillarità e viene fatto correre fino a circa 1 cm dal bordo superiore. Durante lo sviluppo i vari componenti della miscela migrano e si separano a seconda della diversa affinità nei confronti della FM e FS. A sviluppo completato, si estrae la lastrina dalla camera di eluizione, si segna il livello raggiunto dal fronte del solvente, si evapora l’eluente e si passa quindi alla fase di rivelazione.

Qualora alcune sostanze non siano state completamente separate è possibile ricorrere ad un ulteriore sviluppo (SVILUPPO MULTIPLO). Ciò significa che una stessa TLC può essere riutilizzata una seconda volta: si asciuga la prima TLC e poi si mette nella stessa camera cromatografica della prima TLC. A questo punto abbiamo un’ulteriore risoluzione (anche con un eluente diverso, non necessariamente è lo stesso). L’eluente può essere un unico solvente oppure una miscela di solventi. Nella vasca in laboratorio abbiamo 10 ml di eluente.

Lo sviluppo completato dipende dalla dimensione data. Sostanze diverse hanno corse diverse e così possono essere separate. La prima cosa da fare dopo aver tirato su la TLC è quella di segnare con la matita il livello a cui è giunta la corsa dell’eluente poiché poi il solvente evapora in qualche minuto. Il grado di saturazione della camera è fondamentale per la buona riuscita della separazione cromatografica. Nella nostra TLC c’è una evaporazione del solvente; se vogliamo che l’evaporazione sia ridotta al minimo, allora la camera deve essere satura. La camera si prepara 10 minuti prima (prima della semina).

Le sostanze si spostano in funzione della loro polarità e di quella dell’eluente, ed in presenza di una TLC in fase diretta (adsorbenti più polari rispetto alla fase mobile) le sostanze più polari avanzano più lentamente di quelle meno polari. Il gel di silice è una fase stazionaria polare, quindi trattiene sostanze affini, per cui trattiene le sostanze polari.

Ad esempio, si fa una TLC per verificare l’andamento di una reazione. Se il composto che stiamo sintetizzando è più o meno polare, allora questo di vedrà benissimo nella TLC. Se ho, per esempio, devo idrolizzare un estere, faccio la TLC e ho tante macchie. L’acido è più polare dell’estere, per cui sarà più polare e sarà rappresentato dalla macchia più in basso. Se ho macchie più in alto, significa che la reazione non ha preso la piega di nostro interesse dato che c’è una sostanza più polare.

Interazioni con una fase stazionaria polare

Il gel di silice è polare dal momento che in superficie il polimero di biossido di silicio [(SiO₂)_n] espone sia gruppi Si-O-Si (silossanici) polarizzati che dei gruppi funzionali Si-OH (silanoli). Quando la fase mobile sale lungo la silice, i composti in essa disciolti sono in grado di interagire con i gruppi polari della silice. Le interazioni in gioco sono principalmente dipolo-dipolo e legami ad idrogeno e dunque quanto più polari sono i composti, tanto più verranno trattenuti dalla fase stazionaria.

Fase mobile

Nella TLC, la fase mobile è un liquido o una miscela di liquidi scelti per lo sviluppo e la sua migrazione avviene per capillarità ascensionale. La fase mobile dovrà avere caratteristiche tali da competere opportunamente, con il soluto, per l’adsorbimento sulla fase stazionaria. Se la competizione è efficace, il soluto passa più tempo nella fase liquida e scorre di più.

Abbiamo una serie di equilibri tra tre ‘attori’: fase stazionaria, fase mobile e sostanza. Se aumenta la polarità, aumenta il potere di sviluppo. Con solventi molto polari, noi abbiamo una migrazione delle sostanze molto importante; questo poiché questi solventi scalzano la sostanza e questa è costretta ad andare in fase mobile. Più aumenta la polarità di fase mobile, più le sostanze saranno eluite.

Se faccio TLC con acetato di etile per eluirla, vedo che la sostanza è corsa pochissimo (si è sposta poco dal punto di semina). Voglio che lo scorrimento sia maggiore, allora cambio la fase mobile. Come posso modificare l’eluente? Basta fare una miscela con un altro eluente più polare. In questo modo ho una competizione maggiore con la fase stazionaria e quindi la sostanza migra maggiormente.

Non esistono TLC in cui l’ordine di eluizione si inverte. Utilizzando eluente in cui varia la polarità, posso avere migrazioni differenti ma non avrò mai la situazione in cui uno si inverte rispetto all’altro.

Ordine di eluizione su gel di silice

La differente affinità che ciascuna sostanza organica ha nei confronti della fase mobile e della fase stazionaria è una caratteristica intrinseca di ciascun composto organico, dipendente da polarità, dimensione e volume delle molecole, ecc. Pertanto alcune sostanze sono trascinate maggiormente ed altre in misura minore a parità di fase mobile, permettendo di effettuare una completa separazione dei composti costituenti la miscela. A fianco l’adsorbimento è crescente dall’alto al basso: servono eluenti più polari per eluire i prodotti. Ciò ha un valore relativo: se un acido carbossilico con R di dimensione elevata, allora questo potrebbe essere meno polare di un alcol.

Rivelazione con lampada UV

Se i componenti della miscela non sono direttamente visibili bisogna utilizzare opportuni metodi di rilevazione come ad esempio l’irraggiamento della lastrina con lampade UV che emettono a 254 e 366 nm. La maggior parte delle sostanze che utilizziamo sono incolori (apolari).

• Sostanze fluorescenti macchie luminose su fondo scuro

Questa tecnica è poco utilizzata.