Laboratorio di biochimica applicata

MODELLO DI MEMBRANA DEI LIPID RAFTS (ZATTERE LIPIDICHE) ELETTROFORESI

È una tecnica ormai collaudata che consiste nella migrazione differenziata in un campo elettrico di molecole elettricamente cariche. Molte molecole di interesse biologico come gli amminoacidi, i peptidi, le proteine e gli acidi nucleici possiedono gruppi ionizzabili e possono quindi esistere in soluzione come specie elettricamente cariche, sia come cationi che come anioni.

Principi generali:

• Una molecola con carica netta non nulla posta tra due elettrodi di segno opposto, migra verso l'elettrodo con segno opposto alla sua carica; questo perché tra gli elettrodi è applicata una differenza di potenziale (ddp) che genera il campo elettrico all'interno del quale la molecola si muove; la ddp è misurata in volt (V).
• La velocità di migrazione della molecola carica all'interno del campo è uguale a: E*qv = f

Dove:

• E = potenziale elettrico;
• f = coefficiente.

frizionale; esprime la resistenza che la molecola carica incontra durante il movimento e dipende quindi oltre che dalle dimensioni della particella, anche dalle dimensioni dei pori nel mezzo e dalla viscosità del tampone.

q= carica della molecola.

La velocità di migrazione è esprimibile come mobilità elettroforetica (μ): vμ= E

Positivo se le particelle si muovono verso il catodo

Negativo se migrano verso l'anodo.

La mobilità elettroforetica (μ) esprime quindi la velocità, espressa in cm/s di una particella dotata di carica che si muove in un campo elettrico unitario.

In presenza di una differenza di potenziale, molecole con carica diversa si separano in base alla diversa mobilità elettroforetica; diversamente molecole con carica uguale si separano in base alle diverse dimensioni.

FATTORI CHE INFLUENZANO LA VELOCITÀ DI MIGRAZIONE

Campione (dimensioni, carica e forma);

Tampone (forza ionica, concentrazione)

Il pH influisce sulla mobilità della molecola: a parità di pH, la mobilità diminuisce all'aumentare della forza ionica.

La mobilità può essere influenzata da diversi fattori:

• Supporto (adsorbimento, filtrazione molecolare)
• Effetto elettrosmotico
• Calore (effetto Joule)
• Dissipazione della potenza sviluppata

L'effetto Joule è regolato dalla legge di Joule, che stabilisce che in un sistema elettrico con una resistenza R e attraversato da una corrente I, si sviluppa una potenza termica pari a: W = I * R^2. La maggior parte di questa potenza viene dissipata sotto forma di calore.

Tuttavia, il calore generato dalla dissipazione della potenza sviluppata può avere effetti negativi:

• Diffusione dei campioni con minore definizione delle bande
• Correnti convettive che rimescolano i campioni
• Denaturazione delle molecole instabili
• Diminuzione della viscosità del mezzo e diminuzione della sua resistenza

Ricordando che per la prima legge di Ohm: VR = I * R

Nella soluzione tra gli elettrodi, la corrente viene trasportata principalmente dagli...

molecola di SDS si lega alle proteine con lo stesso rapporto: 1 SDS ogni 2 residui amminoacidici.

SDS + β-mercaptoetanolo = completa denaturazione delle proteine

L'elettroforesi in presenza di SDS separa proteine secondo la dimensione:

Le proteine si separano secondo l'effettivo raggio molecolare, approssimativamente uguale alla dimensione molecolare di ciascun polipeptide.

Il risultato è la separazione delle proteine per setacciamento attraverso i pori del gel di poliacrilammide:

Stacking gel (o gel di impaccamento): permette l'appiattimento dei campioni. Ciò avviene sia per la differenza del pH e della forza ionica tra lo stacking gel ed il tampone di corsa. Ha una bassa % di acrilammide che migliora l'impaccamento e rende possibile la libera migrazione di campioni.

Il pH dello stacking gel è inferiore di 2 unità circa rispetto a quello del tampone di corsa. In particolare nel gel di impaccamento il pH è 6.8 e la

glicina(acido debole) è presente per il 95% in forma zwitterionica (puntoisoelettrico), e solo per il 5% in forma di anione glicinato. Quando viene applicata corrente…

Gli ioni di glicina nel tampone di corsa si muovono allontanandosi dall'elettrodo negativo (catodo), dirigendosi quindi verso il campione e lo stacking gel: qui il pH è vicino al pI, per cui gli ioni glicinato perdono la propria carica rallentando il proprio movimento; in questo modo la glicina non potrà trasportare efficacemente la corrente e saranno le stesse proteine a portarla migrando verso l'anodo.

Allo stesso tempo nello stacking gel e nel campione:

• Gli ioni Cl (cloruro), altamente mobili, si muovono per allontanarsi dal catodo (elettrodo negativo)

Questo crea una zona ristretta nella parte superiore dello stacking gel in cui la conduttanza è molto bassa (a causa dell'elevata resistenza);

Come risultato si avrà una concentrazione degli anioni

ecrescente riduzione dei pori fino ad essere totalmente interrotta laddovela dimensione dei pori stessi risulta minore del diametro delle proteine si formeranno bande molto strette e altamente risolte.

Visualizzazione delle proteine nel gel:

• Colorazione con Coomassie Brilliant:
• il blu Coomassie lega preferenzialmente residui aromatici e basici(tirosina, arginina ecc..), e si lega alle proteine mediante legami ionici trai gruppi sulfonici del colorante e i gruppi amminici delle proteine oltreche attraverso forze di Van der Waals.
• Colorazione con l'argento "silver staining" (permette di visualizzare circa 1 ng di proteina per banda):
• si fissano le proteine con metanolo e si aggiunge nitrato di argento che si lega alle proteine. Si aggiunge quindi formaldeide per ridurre l'Ag ad argento metallico. La reazione viene interrotta con acido acetico. Procedimento analogo a quello dello sviluppo fotografico.

Elettroforesi in condizioni native - ZIMOGRAFIA

Una metodica che permette la separazione elettroforetica di attività proteolitiche e l'identificazione del loro PM mediante l'uso di un gel di poliacrilammide in SDS co-polimerizzato con un substrato adatto per l'enzima di interesse. Per l'identificazione delle gelatinasi viene utilizzato come substrato la gelatina; la scelta della gelatina è basata sulla capacità di questa proteina, ad alto PM, di formare polimeri e di co-polimerizzare omogeneamente con la poliacrilammide:

Come si nota in figura, la tecnica si basa sull'osservazione dell'attività proteolitica dell'enzima di interesse grazie alla presenza di zone nel gel che sono state degradate dalla proteina (metalloproteinasi della matrice)

ISOELETTROFOCALIZZAZIONE

Permette la separazione delle proteine in base alla composizione amminoacidica (aa acidi e basici) e quindi in base alle cariche delle proteine; in sostanza in base al loro punto isoelettrico

I. Tecnica dotata di un elevatissimo potere risolutivo ed è impiegata per la separazione di composti anfoteri (che possono cioè comportarsi da acidi o da basi in base alla sostanza con cui reagiscono) come amminoacidi, proteine ed in particolare isoenzimi (enzimi che catalizzano la medesima reazione ma caratterizzati da differenze strutturali e di natura chimico-fisica).

Amminoacidi e peptidi sono separati in un campo elettrico lungo cui esiste un gradiente sia di potenziale sia di pH.

Ciascuna molecola anfotera ha un suo pI e se sottoposte all'azione di un campo elettrico (E), esse migrano a seconda della propria carica netta (soluzione acida anodo (+); soluzione basica catodo (-);)

La regione anodica ha un pH più basso di quella catodica e il gradiente di pH è mantenuto stabile attraverso l'impiego di miscele di anfoliti (sostanze anfotere a basso PM che contengono un numero variabile di gruppi carbossilici e amminici) aventi pI