Laboratorio di biochimica applicata

Laboratorio di biochimica applicata

Strategie per la purificazione delle proteine

Perché le proteine vengono purificate?

• In clinica come agenti farmacologici
• Come campioni per lo studio della loro attività, regolazione o delle relazioni struttura-funzione
• Come detergenti, agenti emulsionanti o strumenti nei processi industriali
• Come reagenti per la ricerca

Nei processi di purificazione delle proteine è però necessario prendere in considerazione:

• La quantità di proteina purificata di cui si ha bisogno
• Se si rende necessario il recupero della proteina in forma attiva
• Quanto costa il processo
• Quanto tempo e lavoro saranno necessari

La purificazione di proteine

Si tratta di un processo a tappe che consiste nell’isolare la proteina di interesse da tutte le altre proteine che la contaminano; basti considerare che una cellula in media contiene dalle 10.000 alle 20.000 proteine diverse. Per poter purificare una proteina, questa deve dapprima essere estratta dalla sua matrice biologica, per poi essere allontanata selettivamente dalle altre proteine presenti.

La strategia adottata per il processo dipende da alcuni fattori:

• Caratteristiche chimico-fisiche della proteina di interesse
• Il tipo di studio guida e detta i limiti di purezza che è necessario ottenere
• In base alla resa necessaria verranno utilizzati protocolli diversi di estrazione
• Anche il costo del processo è da prendere in considerazione in quanto materiali costosi come resine di affinità o a scambio ionico possono rappresentare un fattore limitante

Un buon protocollo di purificazione deve essere riproducibile e permettere di ottenere la purezza desiderata mediante il minor numero possibile di passaggi per la purificazione. In genere nella prima parte della procedura si sfruttano tecniche ad alta capacità (ma bassa risoluzione) per poi passare a tecniche a bassa capacità (ma alta risoluzione), come ad esempio tecniche cromatografiche per ottenere elevata purezza/omogeneità. Spesso però ci si scontra con l’esigenza di ottenere un prodotto puro con una buona resa finale difficile in quanto in ogni passaggio si perde una certa quantità della proteina di interesse.

Inoltre:

• Non esiste una tecnica che permetta di amplificare le proteine
• Le proteine sono instabili (vedi sotto)
• Le proteine generalmente si uniscono a formare complessi
• Esiste un’ampia diversità chimica e strutturale delle proteine e delle loro attività, quindi si rendono necessari protocolli sperimentali particolari per la purificazione di ogni proteina

Molto spesso ad essere purificati sono gli enzimi cellulari, che altro non sono che proteine catalitiche relativamente instabili anche in condizioni ottimali. Tendono a denaturarsi e quindi inattivarsi; infatti, l’attività enzimatica (e quindi la funzione della proteina) è dettata dall’integrità della struttura tridimensionale della proteina (struttura che viene meno con la denaturazione) e che a sua volta dipende da legami che si instaurano all’interno della molecola stessa: legami H, idrofobici, ponti salini, disolfuro, interazioni elettrostatiche e legami covalenti.

La denaturazione proteica

Può verificarsi per cause fisiche (vedi calore) o per cause chimiche (vedi pH dell’ambiente):

• La temperatura, e quindi il calore, è il maggior denaturante conosciuto. L’agitazione termica cui viene sottoposta una proteina è in grado di spezzare i legami H e in generale le interazioni deboli alla base della sua struttura tridimensionale (che ne determina la corretta funzione). Per minimizzare questo processo, le purificazioni di proteine sono condotte in freddo in camera fredda e in contenitori pieni di ghiaccio.
• La denaturazione può anche verificarsi congelando e scongelando una soluzione contenente la proteina di interesse (a causa della struttura cristallina del ghiaccio). Generalmente si ovvia al problema aggiungendo glicerolo o glicole etilenico che permettono di abbassare il punto di solidificazione della soluzione a -15-20°C; inoltre, quando la soluzione enzimatica è conservata in azoto liquido (potente refrigerante), l’utilizzo di questi reagenti permette alla soluzione di solidificarsi in forma amorfa e non cristallina.
• Anche il pH, e in particolare valori di pH estremi, possono portare alla denaturazione della proteina a causa dell’instaurarsi di cariche elettrostatiche sulla molecola; se la repulsione fra cariche uguali è eccessiva, la catena polipeptidica si svolge assumendo una configurazione “aperta”. Inoltre valori estremi di pH possono portare all’idrolisi (rottura) di vari legami covalenti sensibili. In generale si bypassa questo inconveniente mediante soluzioni tampone; la maggiore stabilità si ottiene mantenendo il pH vicino a quello ottimale dell’enzima o della proteina.
• Composti in grado di formare numerosi e forti legami H come urea, formaldeide ecc. sono in grado di spezzare la struttura secondaria e terziaria della proteina andando a competere con i residui degli amminoacidi e con il solvente nella formazione di legami H.
• Composti organici che possiedono sia gruppi idrofilici che idrofobici (es. detergenti) sono denaturanti molto forti. La parte idrofobica interagisce e si inserisce nel “core” idrofobico della proteina mentre la parte idrofilica rimane in contatto con il solvente acquoso (legami H). La proteina quindi si “rigonfia” (fenomeno di swelling) e si svolge (fenomeno di unfolding). Si ovvia generalmente evitando l’utilizzo di queste sostanze.
• Rottura per idrolisi dei legami peptidici ad opera di proteasi: generalmente gli omogenati possiedono elevata attività proteolitica in grado di denaturare le proteine. Si ovvia lavorando a 4°C e procedendo rapidamente nella purificazione. Inoltre vengono adoperati inibitori della proteasi (come il PMSF=fenilmetilsulfonilfluoruro).
• Inattivazione irreversibile di enzimi con ioni metallici come Fe³⁺, Zn²⁺. Si ovvia aggiungendo EDTA (etilendiamminotetraacetato) o EGTA che chelano gli ioni metallici formando legami di coordinazione e sottraendoli quindi alla soluzione.
• Ossidazione all’aria dei gruppi -SH (sulfidrilici). Per ovviare si lavora in presenza di piccoli composti sulfidrilici come cisteina, mercaptoetanolo ecc.

Proprietà di una soluzione fisiologica

La soluzione impiegata è fondamentale per preservare organuli e integrità metabolica, oltre che per prevenire l’azione di alcune attività enzimatiche potenzialmente dannose per il processo. Essa quindi deve mantenere le condizioni iso-osmotiche (per prevenire il rigonfiamento e l’esplosione degli organuli), un pH adeguato e livelli ottimali di ioni inorganici (ad esempio Mg²⁺ per preservare l’integrità di nucleo e ribosomi).

Localizzazione delle proteine

La localizzazione delle proteine da purificare influenza le metodiche che possono essere impiegate per ottenere un estratto grezzo di partenza:

• Per le proteine solubili extracellulari basta centrifugare e concentrare il liquido.
• Per le proteine solubili intracellulari occorre omogeneizzare le cellule (rottura delle membrane con rilascio dei componenti intracellulari) e rimuovere i componenti subcellulari non di nostro interesse mediante centrifugazione; nel caso di batteri si rende necessaria dopo la lisi cellulare una breve centrifugazione per rimuovere membrane e pareti.
• Le proteine solubili intracellulari ricombinanti espresse in microorganismi sono generalmente over-espresse e presenti quindi in elevate quantità entro le cellule.

La prima tappa nell’isolamento delle proteine prevede l’estrazione dalla cellula. Questo processo avviene mediante un’omogeneizzazione che distrugge il tessuto e rilascia in sospensione i componenti intracellulari. L’omogeneizzazione è anche fase preliminare negli studi sulla compartimentazione metabolica (che prevede la purificazione parziale degli organuli cellulari). L’omogeneizzazione per la purificazione delle proteine implica necessariamente una fase di distruzione cellulare per mezzi chimici, meccanici ed enzimatici. La scelta del metodo dipende dalla natura della parete/membrana del tipo di cellula da cui si intende effettuare l’estrazione.

Bisogna infatti considerare che a differenza delle cellule animali in cui la barriera principale è un “semplice” doppio strato fosfolipidico, cellule batteriche, vegetali e di funghi e lieviti possiedono un rivestimento estremamente rigido, ad esempio lo strato più o meno spesso di peptidoglicano che nei batteri “protegge” la membrana plasmatica (e che costituisce la parete batterica) o la spessa e rigida parete cellulare tipica delle cellule vegetali.

Metodi meccanici, enzimatici e chimico-fisici

Analisi quantitativa delle proteine

Quantificazione delle proteine totali

• Dosaggio spettrofotometrico diretto
• Metodi colorimetrici

Dosaggio spettrofotometrico diretto

La concentrazione di una proteina in soluzione può essere misurata mediante spettroscopia di assorbimento: l’assorbimento della luce da parte di un soluto è governata dalla legge di Lambert-Beer (A=εlc); poiché è noto ε (coefficiente di estinzione molare, caratteristico della sostanza), è possibile ottenere la concentrazione della proteina ottenendo il valore di assorbanza da un’analisi spettrofotometrica.

La lettura spettrofotometrica può essere condotta alla lunghezza d’onda di 260-280 nm (in quanto triptofano, tirosina e fenilalanina assorbono nell’UV intorno a quella lunghezza d’onda e tale caratteristica permette di dosare le proteine in base al contenuto di questi amminoacidi). Le soluzioni di proteine purificate però possono essere spesso contaminate da acidi nucleici che assorbono a 260 nm; si utilizza quindi la formula di Warburg e Christian che contiene i fattori di correzione per quantificare correttamente la proteina anche in presenza di acidi nucleici contaminanti.

Metodi colorimetrici

I metodi colorimetrici misurano l’assorbimento di un complesso colorato (cromoforo) che si forma per reazione specifica delle sostanze che si intende dosare. Si misura l’assorbimento del campione rispetto a quello di un bianco, contenuto in una cuvetta di riferimento, costituito da tutti i reagenti eccetto la sostanza che si intende dosare. Si costruisce quindi una retta di taratura riportando in grafico i valori di assorbanza (densità ottica OD) di quantità note della sostanza da misurare che hanno reagito con lo stesso reattivo per dare il complesso colorato (almeno 5 punti). Dalla retta di taratura si ricava la quantità della sostanza incognita.

Vantaggi: le proteine possono anche essere in forma non pura (anche in omogenato cellulare)

Svantaggi: il campione non può essere riutilizzato/recuperato

Le proteine presenti nella soluzione reagiscono con un reagente dando luogo ad un prodotto colorato la cui intensità si correla con la quantità di proteina presente.

Metodo del biureto

Si basa sulla capacità degli ioni Cu²⁺ di interagire, in ambiente basico, con le proteine formando complessi tetra-coordinati con l’azoto del legame peptidico. La formazione di tali complessi porta alla formazione di un colore blu misurabile a 540 nm. Il reattivo del biureto consiste in una soluzione basica di solfato di rame, tartrato di K e Na (che stabilizzano il complesso) e idrossido di sodio NaOH (crea l’ambiente alcalino). La reazione del biureto è data da tutti i composti che presentano almeno due gruppi peptidici.

Poiché la reazione richiede la presenza di almeno due gruppi -CONH₂, essa è negativa con gli amminoacidi e i dipeptidi, mentre è positiva con i polipeptidi a partire dai tripeptidi e naturalmente con le proteine. Nonostante il metodo sia facilmente riproducibile, la sensibilità è bassa e non consente di apprezzare concentrazioni proteiche <1 mg/ml.

Metodo di Lowry

Consiste in una sorta di “espansione” del metodo del biureto, facendo in sostanza seguire la reazione del reattivo del biureto dalla riduzione, in condizioni alcaline, del reagente di Foling-Ciocalteau (fosfomolibdato e fosfotungstato). Tale reattivo di Foling reagisce con la tirosina e il triptofano delle proteine dando un colore blu dovuto alla riduzione operata dal complesso rame-proteina (data dal biureto) che produce blu di tungsteno e di molibdeno. Il metodo è circa 50-100 volte più sensibile del biureto, tuttavia risente delle interferenze date da monosaccaridi, saccarosio, lipidi e fosfati.

Metodo di Bradford

Sfrutta un colorante specifico, il Coomassie Brilliant Blue G-250. Questo, legandosi alle proteine determina uno spostamento del picco di assorbimento del colorante da 465 nm (rosso) a 595 nm (blu) in soluzioni acide (al 50% in acido fosforico). La formazione di complessi non covalenti con le proteine avviene tramite interazioni elettrostatiche con amminoacidi basici (positivi) ed interazioni idrofobiche con amminoacidi aromatici. Il metodo è semplice ed ha elevata sensibilità (fino a 22 microgrammi di proteina/ml); lo svantaggio risiede nel fatto che i detergenti possono causare interferenza con il dosaggio.

Metodi di centrifugazione

Le tecniche di centrifugazione si possono suddividere in preparative e analitiche:

• Preparativa: permette di separare e purificare cellule intere, organelli subcellulari e macromolecole biologiche come acidi nucleici o proteine.
• Analitica: permette di studiare le caratteristiche di sedimentazione e della struttura di macromolecole e di determinarne il grado di purezza o la massa molecolare. Viene richiesta una quantità minima di materiale e vengono utilizzati rotori e sistemi di rilevamento più sensibili e molto costosi che consentono un controllo continuo del processo di sedimentazione del materiale.

Esistono più tipi di centrifughe:

• A bassa velocità (max 3000-6000 giri), si adoperano per raccogliere organelli di elevate dimensioni e precipitati grossolani.
• Micro-centrifughe (10.000 g), sono centrifughe da banco utilizzate per accelerazioni rapide.
• Centrifughe ad alta velocità (max 60.000 g) utili per il frazionamento cellulare.
• Ultracentrifughe (fino ad un max di 600.000 g), possiedono sistemi di vuoto e refrigerazione sofisticati e vengono adoperate per isolare piccoli organelli come ribosomi e vescicole di membrana.

Rotori

Contenitori presenti all’interno delle centrifughe, liberi di ruotare attorno ad un asse verticale grazie ad un motore elettrico; si distinguono essenzialmente due tipi di rotore:

1. Ad angolo fisso: nei rotori di questo tipo gli alloggiamenti per i tubi/provette sono disposti circolarmente attorno all’asse di rotazione ad un certo angolo prefissato (in genere variabile tra i 14° e i 40°) oppure disposti parallelamente ad esso. Sotto l’influenza del campo centrifugo (diretto verso l’esterno), le particelle si muovono in senso radiale contro le pareti delle provette scivolando poi verso il fondo con la formazione del pellet, un sedimento piccolo e compatto. La distanza delle particelle dall’asse di rotazione (e quindi l’accelerazione centrifuga cui sono sottoposte) varia a seconda della posizione all’interno del tubo, tra Rmin e Rmax. L’accelerazione centrifuga può variare tra cima e fondo del tubo e per convenzione il campo centrifugo relativo viene calcolato usando il raggio di rotazione medio Rav di un dato rotore.
2. A bracci oscillanti: nei rotori oscillanti a riposo, i porta-tubi rimangono paralleli all’asse di rotazione, ma quando il rotore inizia a girare, per effetto dell’accelerazione centrifuga i porta-tubi ruotano sui perni verso l’esterno, disponendosi perpendicolarmente all’asse di rotazione (quindi parallelamente al campo centrifugo). I rotori oscillanti permettono la formazione di bande di sedimento ben differenziate e pellet più uniformi in quanto le particelle non “strisciano” lungo la parete.

Cos'è la centrifugazione?

È un metodo di separazione che consente di separare una sostanza per mezzo della forza centrifuga. In una centrifuga le provette sono sottoposte a centrifugazione, cioè ad una rotazione ad altissima velocità. La centrifuga infatti è uno strumento progettato per produrre una forza centrifuga superiore alla forza di gravità terrestre.

La centrifugazione permette la separazione in un mezzo liquido, di materiali (solidi o liquidi), mediante l’applicazione di un opportuno campo centrifugo. La separazione è resa possibile dal fatto che materiali differenti tra loro per densità, dimensione o forma, sedimentano a velocità diverse se posti in un campo di forza centrifugo. Le particelle in soluzione, se lasciate in condizioni di quiete tenderanno a sedimentare per effetto della gravità. Per ogni particella la velocità alla quale sedimenta è proporzionale alla forza applicata; di conseguenza, macromolecole in soluzione sedimentano più velocemente quando la forza applicata è maggiore di quella di gravità esercitata dalla Terra.

Riassumendo: lo scopo delle tecniche di separazione per centrifugazione è quello di esercitare una forza maggiore del campo gravitazionale terrestre aumentando la velocità di sedimentazione delle macromolecole in modo da separarle in base alla diversa densità, forma e dimensione.