Relazione Laboratorio di Biochimica

Separazione dell'omogenato e dosaggio delle proteine

L'omogenato così ottenuto va incontro a separazione con formazione di 2 frazioni: la frazione superiore chiamata sovranatante che è una superficie liquida che deve essere analizzata (chiamata debris cellulare) e quella sottostante che viene chiamata pellet che rappresenta il deposito che non interessa analizzare e che consiste di residuo di membrane cellulari, diversi acidi nucleici e lipidi; inoltre per velocizzare il processo di separazione, si può procedere alla centrifugazione della soluzione in provetta.

Abbiamo inoltre parlato di dosaggio delle proteine che può avvenire attraverso la spettrofotometria. Questa tecnica trova applicazione grazie alla legge di Lambert e Beer che ci chiarisce come si possa stabilire la quantità di proteine presenti in una soluzione attraverso l'assorbanza luminosa peculiare di queste proteine opportunamente trattate con colorante comaschi nel metodo di Bradford che si lega a queste ed attraverso il risultato ottenuto.

su un detector in seguito irraggiamento luminoso monocromatico ad una data impressione le lunghezza d'onda restanti lunghezza d'onda e quindi non assorbite su un detector luminoso (I I ).1 0 Abbiamo successivamente parlato di una tecnica molto utilizzata che permette di identificare una determinata proteina in una miscela di proteine, mediante il riconoscimento da parte di anticorpi specifici: il Western Blotting. Questa metodologia ne permette il riconoscimento all'interno di una miscela di proteine che viene prima separata in base alle loro dimensioni (o peso molecolare) utilizzando un gel di acrilammide bisacrilammide (PAGE). Questa tecnica appena menzionata si pratica su dei campioni di proteine che vengono separate usando l'elettroforesi in gel SDS-PAGE. La separazione di proteine può avvenire per punto isoelettrico, peso molecolare, o una combinazione di questi fattori. (Abbiamo infatti parlato di elettroforesi 2D bidimensionale nella terza giornata).

SDS-PAGE è una tecnica che prevede l'utilizzo di un gel di acrilammide bis-acrilammide (neurotossici) con l'aggiunta di SDS (diodicildifosfato) fattore denaturante che rende la proteina lineare facendole perdere la sua natura terziaria (rottura dei ponti disolfuro [S-S]) e lasciando libera la carica negativa, in tal modo le proteine migrano spontaneamente verso l'anodo ed inizia la corsa elettroforetica (in modo planare); questo permette la separazione di proteine in base al loro peso molecolare: le proteine più piccole migrano più velocemente attraverso questa trama del gel rispetto a quelle di dimensioni maggiori. La concentrazione di acrilammide (nel resolving gel) ne determina la sua risoluzione, maggiore è la concentrazione, migliore sarà la risoluzione di proteine a basso peso molecolare che potrò identificare. Le proteine viaggiano solo in una dimensione lungo il gel per diversi lane (corsie). I campioni sono caricati in

wells (pozzetti) del gel. (da 1 a 10 solitamente) Una o due strisce (la prima el'ultima) vengono usualmente riservate per un marcatore o scala, una miscela commercialedi proteine con peso molecolare definito, tipicamente colorate così da formare bandecolorate visibili da prendere come riferimento graduato (con l'indicazione del pesomolecolare in Kda). Alcuni gel commerciali possono essere anche multi-gradiente dove in ununico gel abbiamo diverse concentrazioni crescenti (es. 4x - 8x - 12x) già preparati aborigine. trasferite su un appositoUna volta finita la corsa elettroforetica, le proteine devono esseresupporto (chiamato sandwich), che comunemente è composto da una membrana dinitrocellulosa e, specularmente da una spugna ed una piastra carica elettricamente con polo(+) e polo (-). Il trasferimento delle proteine avviene dal gel verso la membrana,precedentemente poste a contatto ed in soluzione di continuità, in direzione della piastracarica

positivamente (l'anodo) "Lo stampo" così ottenuto è una lamina metallica da cui vengono attratte. Sulla membrana viene successivamente incubato con un anticorpo specifico diretto contro la proteina di interesse (anticorpo primario) e il complesso proteina-anticorpo è evidenziato utilizzando un anticorpo secondario (cioè che riconosce il primo anticorpo) marcato, o in grado di conferire una colorazione specifica. Questo processo appena descritto è stato inoltre oggetto della prima simulazione eseguita su Labster. Abbiamo trattato inoltre l'argomento inerente gli Immuno-blotting: anticorpi primari che si ottengono dal siero di animali iniettando la proteina di interesse. Gli anticorpi del siero animale possono avere quindi reazioni con altre proteine (che condividono epitopi con la proteina di interesse); per una specificità maggiore si usano anticorpi monoclonali. Come anticorpo secondario si usa un siero di animale (di specie diversa da quella in cui si è prodotto l'anticorpo primario)è stato prodotto l'anticorpo primario), immunizzato con anticorpi della specie dell'anticorpo primario. L'anticorpo secondario è, quindi, un anticorpo diretto contro la parte costante di un anticorpo di specie diversa. Successivamente si effettuano i seguenti passaggi: 1. Bloccaggio antigenico: nel processo di trasferimento rimangono dei siti liberi sulla membrana, che vengono bloccati rivestendo la membrana con una miscela di proteine non specifiche. Questo evita il legame non specifico dell'anticorpo primario su tali siti. Si utilizza una miscela di sieroalbumine bovine (BSA). 2. Incubazione con anticorpo primario: la membrana viene immersa in una soluzione che contiene l'anticorpo primario. Poiché tutti i siti della membrana che legano proteine sono bloccati, l'anticorpo aderisce alla membrana solo se si lega con il suo antigene specifico. 3. Lavaggi: permettono di eliminare dalla membrana l'anticorpo in eccesso che non ha legato.

1. Preparazione del campione: il campione contenente le proteine viene preparato e trattato in modo da renderlo adatto all'elettroforesi.

2. Elettroforesi su gel: il campione viene applicato su un gel di poliacrilammide e sottoposto a un campo elettrico. Le proteine si separano in base alla loro carica e massa molecolare.

3. Trasferimento su membrana: le proteine separate nel gel vengono trasferite su una membrana di nitrocellulosa o PVDF.

4. Incubazione con anticorpo secondario: la membrana viene immersa in una soluzione che contiene un anticorpo in grado di reagire con qualunque anticorpo della stessa fonte biologica del primario. Ad esempio: anticorpo primario di coniglio (rabbit), anticorpo secondario capra anti-coniglio (goat anti-rabbit).

5. Lavaggi: permettono di eliminare dalla membrana l'anticorpo in eccesso che non ha legato l'anticorpo primario.

6. Rilevazione della proteina: l'anticorpo secondario è legato a un enzima ed il tutto viene scannerizzato al computer per una più accurata visualizzazione delle bande mediante scala di grigi (RGB) che può arrivare a riconoscerne anche 256 (2^8) sfumature diverse.

Elettroforesi bidimensionale 2D o per isoelettrofocalizzazione: è un'ulteriore separazione delle proteine che avviene nel gel ma secondo lo specifico punto isoelettrico della proteina il cui numero è la somma dei punti isoelettrici degli

Amminoacidi che la compongono. "Housekeeping": Abbiamo parlato anche dell'espressione proteica.

Si definiscono geni housekeeping quei geni che codificano per proteine ed enzimi fondamentali per la vita della cellula, e che pertanto devono essere sempre presenti ed uguali nelle stesse linee cellulari.

Alcuni esempi che abbiamo fatto di geni costitutivi housekeeping sono, per esempio i geni che codificano la proteina actina, e GAPDH gliceraldeide-3-fosfato deidrogenasi (enzima coinvolto nella trasformazione per la via glicolitica in 1,3-bisfosfoglicerato).

Interessante sapere che in laboratorio, i geni costitutivi vengono utilizzati come standard comparativi per la reazione a catena della polimerasi quantitativa, in quanto si assume che la loro resa non dipenda dalle condizioni sperimentali.

Cosiddetto paradosso del valore C: Abbiamo anche fatto accenno del "noi come Homo Sapiens come mai abbiamo tante e tali proteine diverse rispetto al numero. Fondamentalmente manca una diretta.

Correlazione tra l'adi geni che possediamo?”...complessità genetica/morfologica di un organismo e le dimensioni del suo genoma. Nonesiste infatti una stretta correlazione tra il numero di basi e l’informazione genetica in essecontenuta DNA ripetitivo (satellite) geni discontinui; I genomi degli eucarioti hanno unadensità genica molto ridotta. In media, i geni codificanti per proteine occupano solo il 2-4%dell’intero genoma. La poca compattezza del genoma nucleare è dovuta alla strutturadiscontinua dei geni, con introni che nei mammiferi possono raggiungere dimensioni intornoa 20-30 kpb (ed oltre) e alla presenza di elementi ripetuti. La risposta è nello splicingalternativo: cioè il processo attraverso il quale, mediante un diverso arrangiamento degliesoni (regioni di RNA codificanti), da uno stesso gene possono derivare diverse mRNAalternativi e quindi proteine, dette isoforme.Neoangiogenesi: Ulteriore approfondimento è stato fatto,

nel corso della seconda giornata, sul fattore di crescita dell'endotelio vascolare VEGF posta in essere da particolari proteine dell'angiogenesi segnalazione, con riferimento causata da alcune cellule tumorali nei cosidetti "tumori solidi" che richiedono un'offerta di sangue aumentata e che possono così continuare a crescere e proliferare. I tumori che esprimono VEGF possono quindi svilupparsi e spargersi (riprodursi per metastasi) ad altri organi e regioni dell'organismo grazie ad altri siti di riconoscimento creati da cellule che esprimono recettori di membrana specifici. Quest'ultimo processo è stato oggetto della seconda simulazione effettuata su Labster. ESERCIZI SVOLTI (fogli di calcolo in allegato). Esercizio 1: dosaggio delle proteine con Bradford essay 1. Con questi valori ottenuti, realizzare un grafico cartesiano che riporti nell'asse delle ascisse

1. Nel grafico riportato sono rappresentati i valori di concentrazione sulle ascisse e i valori di assorbanza sulle ordinate.

2. Per individuare la posizione dei vari campioni, è necessario confrontare i valori di concentrazione riportati nella tabella 1 con i valori di assorbanza riportati nella tabella 2.

3. Tracciare una curva che unisca tutti i punti ottenuti nel grafico, tenendo presente che i punti potrebbero non essere disposti perfettamente in linea. I valori di assorbanza forniti sono valori reali di laboratorio ottenuti durante una simulazione e potrebbe essere necessario eseguire un "curve-fitting".

Sono stati preparati dei campioni a concentrazione proteica ignota per il dosaggio. Questi campioni sono stati aliquotati in un tubo da test e addizionati con Coomassie blue. Successivamente sono stati letti con lo spettrofotometro. Due campioni hanno restituito un valore di assorbanza entro il range ottimale: il campione 1 ha restituito un valore di assorbanza di 1,605, mentre il campione 2 ha restituito un valore...

di assorbanza di 0,825.4. Calc