Relazione Laboratorio di Biochimica

Relazione laboratorio di biochimica 19-20-21 luglio 2020

In questo laboratorio, abbiamo assunto come principale oggetto di studio le proteine soffermandoci su una particolare tecnica d’analisi chiamata western blotting.

Introduzione al western blotting

In generale, il western blotting è una tecnica utilizzata per l’identificazione, con un anticorpo specifico, di un antigene (proteina) presente all’interno di una miscela di antigeni (o proteine) separate in un gel di poliacrilammide in base al peso molecolare e immobilizzate su una membrana. Questa tecnica permette di monitorare l’espressione proteica in una cellula e quindi di determinare la presenza, la quantità e il peso molecolare di uno specifico antigene attraverso tre passaggi:

• Estrazione e dosaggio delle proteine;
• Separazione delle proteine mediante elettroforesi su gel di poliacrilammide con sodio dodecil solfato (SDS-PAGE);
• Western blotting: trasferimento delle proteine separate dal gel su di una membrana di nitrocellulosa ed esposizione della membrana all’anticorpo diretto contro la proteina di interesse (anticorpo primario); esposizione della membrana ad un anticorpo diretto contro l’anticorpo utilizzato come primario (anticorpo secondario).

Prima giornata: estrazione delle proteine

Nella prima giornata, ne abbiamo analizzato il funzionamento concentrandoci dapprima sulle modalità di estrazione di proteine da cellule epatiche, epatociti derivanti da un tessuto molle, parenchimatoso che rende più agevole il processo rispetto ad esempio a cellule ossee. Inoltre, abbiamo chiarito l’importanza dell'espressione proteica di una cellula (proteoma) poiché ci permette di conoscere la sua attività biologica, ad esempio quando è sottoposta a condizioni di stress, di signaling, ecc. Infatti, variazioni nelle espressioni delle proteine possono modificare l’attività metabolica della cellula, portando a conseguenze biologiche importanti.

L’estrazione vera e propria delle proteine avviene meccanicamente tramite pestaggio di un quantitativo standard di epatociti, circa 1,5 mL, in una provetta a cui vengono aggiunti reagenti, detergenti zwitterionici che hanno la capacità di lisare (con tamponi salini che impediscono fluttuazioni di pH) le membrane cellulari e far così fuoriuscire il contenuto proteico della cellula.

L'estratto proteico può essere prelevato con micropipette che hanno diversi range di volume: le più utilizzate sono la p2, p10, p100, p1000, ecc. Ai campioni preparati con l'estratto proteico vengono addizionati inibitori della fosfatasi o inibitori delle proteasi che devono essere conservati a circa 4 gradi centigradi in un frigo per poter essere utilizzati nel tempo. L'aggiunta di questi inibitori, che hanno un proprio gradiente di concentrazione, deve essere diluita opportunamente per il campione di studio che vogliamo analizzare. Quindi, all'estratto proteico va aggiunto questo tampone ed il tutto deve essere omogeneizzato, portato ad alte temperature (bollitura per denaturare le proteine), fino a disgregare completamente la struttura cellulare.

L'omogenato così ottenuto va incontro a separazione con formazione di due frazioni: la frazione superiore chiamata sovranatante che è una superficie liquida da analizzare (chiamata debris cellulare) e quella sottostante che viene chiamata pellet, il quale rappresenta il deposito che non interessa analizzare e che consiste di residuo di membrane cellulari, diversi acidi nucleici e lipidi. Inoltre, per velocizzare il processo di separazione, si può procedere alla centrifugazione della soluzione in provetta.

Dosaggio delle proteine

Abbiamo inoltre parlato di dosaggio delle proteine che può avvenire attraverso la spettrofotometria. Questa tecnica trova applicazione grazie alla legge di Lambert e Beer, che ci chiarisce come si possa stabilire la quantità di proteine presenti in una soluzione attraverso l'assorbanza luminosa peculiare di queste proteine opportunamente trattate con colorante comaschi nel met.