Relazione laboratorio di Biochimica

RELAZIONE LABORATORIO DI BIOCHIMICA L-Z data: gg/mm/aaaa [Nome docente : D. Cautela] ______ LETT A ERA B C D E F G H I K L M N P O Q R S T U V Z WY N. 2 3 4 5 6 7 8 9 0 1 2 4 5 7 8 9 0 1 1 3 6 2 3 4 INSERISCI DI SEGUITO IL CONDICE NUMERICO CORRISPONDENTE ALLE PRIME 4 CIFRE DEL CODICE FISCALE COME ESPEMPLIFICATO DI SEGUITO ES: Cod. FISCALE: Assorbanza Misurata : 0. B B C 2 2 3 D ___________ 1. Esercitazione n.1 : Determinazione della concentrazione proteica mediante il saggio di quantificazione Bradford Costruire retta di calibrazione del contenuto proteico (espresso come mg/ml di BSA) dai dati riportati in tabella Std 0 Std 1 Std 2 Std 3 Std 4 Std 5 Std 6 Std 7 Std 8 Std 9 Std 10 Std 11 [BSA] (mg/ml) 0 50 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 1 ABS 0 0,048 0,064 0,117 0,167 0,211 0,265 0,301 0,343 0,401 0,461 0,503 [NICOTRA CARLO 004498791] Calcolare il contenuto proteico, dalla retta di calibrazione tenuto conto che il l’estratto proteico ha un valore di Assorbanza Misurata : 0. 3 3 9 Riportare grafico della retta di calibrazione, l’equazione ed il contenuto proteico dell’estratto . [BSA] (mg/ml) 0 50 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 ABS 0 0,048 0,064 0,117 0,167 0,211 0,265 0,301 0,343 0,401 0,461 0,503 Retta di calibrazione del contenuto proteico di BSA in mg/ml 0,6 y = 0,0005x + 0,0148 R² = 0,9978 0,5 0,4 ABS 0,3 0,2 0,1 0 0 200 400 600 2 800 1000 1200 LETTERA N. [NICOTRA CARLO 004498791] [BSA] (mg/ml) A 1 B 2 C 3 D 4 Cod. FISCALE: Assorbanza Misurata : E 5 F 6 G 7 N 3 0. H 8 C 3 I 9 T 9 K 0 C TROVIAMO LA CONCENTRAZIONE PROTEICA (mg/ml) ABS= 0,0005 [BSA] + 0,0148 [BSA]= (ABS 0,0148)/0,0005 [BSA]= (0,339 - 0,0148)/0,0005 = 648,4 mg/ml CONCENTRAZIONE PROTEICA: 648,4 mg/ml 2. Esercitazione n.2 : SDS-PAGE Preparazione dell’estratto proteico per l'elettroforesi. a) Denaturazione del campione – Sample Buffer. PROTOCOLLO ANALITICO: Per la denaturazione del campione viene impiegato un buffer concentrato 2 X, costituito da 2% SDS, 20% glicerolo, 20 mM Tris-Cl, pH 6,8, 2 mM di etilene diammina tetraacetico (EDTA), 160 mM di ditiotreitolo (DTT) e 0,1 mg/ml di colorante blu bromfenolo. 3 L 1 M 2 [NICOTRA CARLO 004498791] Una buona denaturazione si ottiene miscelando una aliquota di campione a una concentrazione finale di 4 mg/ml di proteina con 1 aliquota di sample buffer concentrato 2X (diluizione 1:1). In modo da ottenere una concentrazione proteica finale di 2 mg/ml di proteina con 1% SDS, 10% glicerolo, 10 mM Tris-Cl, pH 6,8, 1 mM di etilene diammina tetraacetico (EDTA), un agente riducente come ditiotreitolo (DTT) o 2-mercaptoetanolo. E riscaldando per 5 minuti la miscela in un bagno d'acqua impostato a 95°C Calcolare la quantità di estratto proteico a concentrazione X mg/ml (VEDI IL RISULTATO OTTENUTO DALL’ESERCITAZIONE 1) da prelevare per preparare 10 ml di estratti proteico a concentrazione 4 mg/ml. La concent