Relazione Laboratorio di biochimica

L L L

1 2 3

Cod. FISCALE: M R N

Assorbanza Misurata : 0. 2 7 3 2

Esercitazione n.1 : Determinazione della

1. concentrazione proteica mediante il saggio di

quantificazione Bradford

Costruire retta di calibrazione del contenuto proteico (espresso come mg/ml di BSA) dai dati

riportati in tabella Valori ABS

[BSA] (mg/ml) ABS

Std 0 0 0 0,0428

0,04 8

Std 1 50 L 1 0,064

Std 2 100 0,064

Std 3 200 0,117 0,117

0,16 7

Std 4 300 0,1627

L 1

Std 5 400 0,211 0,211

Std 6 500 0,265 0,265

0,30 1

Std 7 600 0,3021

L 1

Std 8 700 0,343 0,343

Std 9 800 0,401 0,401

0,46 1

Std 10 900 0,4621

L 1

Std 11 1000 0,503 0,503

Calcolare il contenuto proteico, dalla retta di calibrazione 3

Assorbanza Estratto proteico : 0. 2 7

Eq.ne retta calibrazione: [ABS]=m*[BSA] +q

Concentrazione Proteica: 5 2 0 mg/ml

Riportare grafico della retta di calibrazione, l’equazione ed il contenuto proteico dell’estratto .

y=0,0005x+0,013

0,273=0,0005x+0,013

X: ([BSA], mg/ml)=(0,273-0,013):0,0005=520 mg/ml

Esercitazione n.2 : SDS-PAGE

2. Preparazione dell’estratto proteico per l'elettroforesi.

a) Denaturazione del campione – Sample Buffer.

Calcolare la quantità di estratto proteico a concentrazione X mg/ml (VEDI IL

RISULTATO OTTENUTO DALL’ESERCITAZIONE 1) da prelevare per preparare 10 ml di

estratto proteico a concentrazione 4 mg/ml. –(Il protocollo analitico è ripotato nella

nota 1)

C1=Concentrazione proteica dell’estratto= 520 mg/ml (con assorbenza uguale a 0,273)

C2=4 mg/ml; V2= 10ml

Quindi usiamo la seguente formula per ricavare V1:

C1*V1=C2*V2

V1=(C2*V2)/C1= (4 mg/ml*10 ml)/ 520 mg/ml= 0,077 ml = 77µL

Volume da prelevare: 7 7 microL

Che pipetta viene utilizzata per il prelievo ? (indicare il range di impiego della pipetta)

Per prelevare 77 µL dell’estratto proteico utilizziamo una micro pipetta P200

perché ha un range d’impiego da 20 a 200 µL ed essa è compatibile con punte

sterili gialle. In assenza di essa possiamo utilizzare la micropipetta P100 che ha un

range d’impiego da 10 a 100 µL.

nota 1

PROTOCOLLO ANALITICO: Per la denaturazione del campione viene impiegato un buffer

concentrato 2 X, costituito da 2% SDS, 20% glicerolo, 20 mM Tris-Cl, pH 6,8, 2 mM di etilene

diammina tetraacetico (EDTA), 160 mM di ditiotreitolo (DTT) e 0,1 mg/ml di colorante blu bromfenolo.

Una buona denaturazione si ottiene miscelando una aliquota di campione a una concentrazione finale

di 4 mg/ml di proteina con 1 aliquota di sample buffer concentrato 2X (diluizione 1:1) . In modo da

ottenere una concentrazione proteica finale di 2 mg/ml di proteina con 1% SDS, 10% glicerolo, 10

mM Tris-Cl, pH 6,8, 1 mM di etilene diammina tetraacetico (EDTA), un agente riducente come

ditiotreitolo (DTT) o 2-mercaptoetanolo. E riscaldando per 5 minuti la miscela in un bagno d'acqua

impostato a 95°C

b) Rispondere alle seguenti domande



Supponendo di preparate 200 l dell’estratto proteico denaturato (a concentrazione di

2 mg/ml di proteina) . Quanto campione a concentrazione proteica di 4 mg/ml occorre

prelevare ?

Volume da prelevare: 1 0 0 microL

Applicando la seguente formula possiamo ricavare il volume di campione (V2), a

concentrazione proteica di 4mg/ml (C2), da prelevare , per preparare 200 µL (V1)

dell’estratto proteico denaturato a concentrazione di 2 mg/ml(C1):

sapendo che 200 µL=0,2 ml(V1)

C1*V1=C2*V2

V2=(C1*V1)/C2= (2 mg/ml*0,2ml)/4 mg/ml =0,1 ml= 100 µL

Che pipetta viene utilizzata per il prelievo ? (indicare il range di impiego della pipetta)

Per prelevare 100 µL dell’estratto proteico utilizziamo una micro pipetta P200

perché ha un range d’impiego da 20 a 200 µL ed essa è compatibile con punte

sterili gialle, oppure possiamo utilizzare la micropipetta P100 che ha un range

d’impiego da 10 a 100 µL.

Quanto buffer concentrato 2 X occorre prelevare ?

Volume da prelevare: 1 0 0 microL

La diluizione è 1:1 (sample buffer concentrato 2X) per cui si prelevano 100 µL di

buffer concentrato 2x ed essi si miscelano ad un’aliquota di campione a una

concentrazione finale di 4 mg/ml di proteina.

1:1=200(µL):2X

2X=(200*1)/1

X=200 µL/2= 100 µL

Che pipetta viene utilizzata per il prelievo ? (indicare il range di impiego della pipetta)

Per prelevare 100 µL dell’estratto proteico utilizziamo una micro pipetta P100 che

ha un range d’impiego da 10 a 100 µL oppure possiamo utilizzare la micropipetta

P200 perché ha un range d’impiego da 20 a 200 µL ed essa è compatibile con

punte sterili gialle.

c) Importi da caricare nel Pozzetto 

Tenendo contro che in ogni pozzetto del gel occorre caricare 20 g di proteina, Quale

è il volume di campione che occorre prelevare e caricare nel pozzetto del gel di SDS?

C= m/V

m= 20µg

C=2 mg/ml= 2000µg/1000µL

QUINDI :

V= m/C = 20µg/(2000µg/1000µL)

V= 10µ

Volume da prelevare: 1 0 microL

Esercitazione n.3 : Analisi Western Blot

RISPONDERE ALLE SEGUENTI DOMANDE

Che informazioni si possono trarre dalle seguenti figure che riportano l’analisi Wester

Blot di una linea cellulare MV4-11 trattata con Quercetina 25 microM per tempi

differenti?

Nota:. Le cellule MV4-11 sono state trattate con quercetina per 24 ore, I livelli di espressione

delle proteine apoptotiche sono stati analizzati mediante western blotting.

FIGURA DOMANDE

Domanda 1: cosa è la linea cellulare MV4-11

Le cellule MV-4-11 sono macrofagi che

sono stati isolati dalle cellule blastiche di

un bambino di 10 anni affetto da leucemia

B-mielomonocitica bifenotipica e depositati

dal Wistar Institute. Queste cellule sono

utilizzate nella ricerca sul cancro e

sull'immunologia. In questo caso viene

utilizzata per studiare i meccanismi

molecolari degli effetti antitumorali che la

quercetina ha nella LMA.

Domanda 2: Che via di segnalazione si sta

studiando?

Si sta studiando la via di segnalazione

intrinseca che causa la disgregazione della

membrana dei mitocondri ed è innescata

dalla mancanza di fattori di crescita o come

risposta a danno di DNA, stress ossidativo,

ipossia, agenti chimici tossici (ad esempio i

chemioterapici).

Domanda 3: Che effetti ha la quecetina su

questa via si segnalazione?

La quercetina induce morte apoptodica-

caspasi-dipendente nelle cellule di

accompagnata da

leucemia mieloide acuta

espressioni alterate delle proteine della

famiglia Bcl-2 e depolarizzazione delle

membrane mitocondriali, che facilita il

rilascio del citocromo C e quindi

amplifica la cascata delle caspasi