Istologia - Tessuto osseo

Tessuto osseo

Generalità

Il tessuto osseo fa parte, assieme alla cartilagine, dei tessuti connettivi specializzati per la funzione di sostegno. L’appartenenza del tessuto osseo ai tessuti connettivi è giustificata sia per la sua origine dal mesenchima, il tessuto embrionale che funge da matrice per tutti i tessuti connettivi, sia per la sua costituzione, essendo formato da cellule e da sostanza intercellulare composta da fibre collagene e sostanza fondamentale amorfa. La peculiarità del tessuto osseo è quella di essere mineralizzato: infatti, la sostanza intercellulare è per la maggior parte impregnata di cristalli minerali, in prevalenza fosfato di calcio. La presenza di minerali, come pure l'abbondanza e la particolare distribuzione delle componenti organiche della sostanza intercellulare, conferiscono a questo tessuto spiccate proprietà meccaniche di durezza e di resistenza alla pressione, alla trazione e alla torsione.

In virtù di queste proprietà, il tessuto osseo costituisce un materiale ideale per la formazione delle ossa dello scheletro, che costituiscono nel loro insieme l’impalcatura di sostegno dell’organismo. Inoltre, dato il notevole contenuto in sali di calcio, il tessuto osseo rappresenta il principale deposito di ione calcio per le necessità metaboliche dell’intero organismo. La deposizione del calcio nell’osso e la sua mobilizzazione, finemente controllate da meccanismi endocrini, contribuiscono in modo sostanziale alla regolazione dei livelli plasmatici di questo ione.

Da un punto di vista macroscopico, si distinguono due varietà di osso: l’osso spugnoso e l’osso compatto. L’osso spugnoso lo si ritrova principalmente a livello delle ossa brevi, delle ossa piatte e delle epifisi delle ossa lunghe: ha questo nome in quanto appare conformato come una spugna, con travate ossee, dette trabecole, variamente orientate e intersecate tra loro e delimitanti cavità, dette cavità midollari, che in vivo sono ripiene di midollo osseo ematopoietico. L’osso compatto lo si ritrova a formare la porzione più superficiale delle ossa brevi, delle ossa piatte e delle ossa lunghe, nonché a costituire la diafisi di queste ultime. Esso è privo di cavità macroscopicamente evidenti. Vedremo tuttavia come entrambe le varietà macroscopiche di osso si possano ricondurre, salvo rare eccezioni, ad un unico modello istologico di tessuto osseo.

Metodi morfologici di studio del tessuto osseo

Per lo studio istologico del tessuto osseo occorre tener conto del fatto che esso è un tessuto sui generis, essendo mineralizzato e quindi assai duro. Per allestire un preparato sottile di tessuto osseo per l’osservazione microscopica vengono generalmente impiegate delle varianti delle procedure tradizionali (le quali prevedono, subito dopo il prelievo, la fissazione, la disidratazione, l’inclusione in paraffina o in altro idoneo mezzo di inclusione e il sezionamento), che possono essere schematizzate come segue:

• I metodi di sezionamento di frammenti mineralizzati sono quelli teoricamente preferibili, preservando nella sezione di tessuto osseo sia la componente organica che quella minerale. Esigono però particolari accorgimenti e attrezzature che non li rendono attuabili in tutti i laboratori di istologia. Il tessuto, una volta fissato e disidratato, per poter essere ridotto in sezioni di spessore adeguato all’osservazione microscopica deve essere incluso in resine di durezza non molto dissimile da quella della matrice ossea mineralizzata (es. resine acriliche). I campioni vengono quindi sezionati mediante lame di durezza adeguata (es. lame al carburo di tungsteno, o lame di diamante). Le sezioni così ottenute possono essere montate ed esaminate come tali o colorate con apposite metodiche. Apposite varianti dei metodi suddetti sono utilizzate per l’esame di frammenti di osso al microscopio elettronico.
• I metodi per decalcificazione sono adeguati alla conservazione della componente organica, a scapito tuttavia della componente minerale che viene più o meno completamente rimossa. Il vantaggio di questi metodi rispetto ai precedenti è che sono di più facile esecuzione, non richiedendo strumentazione e abilità particolari. Il frammento di osso da esaminare viene fissato subito dopo il prelievo, al fine di preservare al meglio la morfologia delle cellule e l’integrità delle molecole organiche della sostanza intercellulare. Successivamente si procede alla rimozione della componente minerale, che viene dissolta chimicamente mediante il soggiorno del frammento in una soluzione acida. Caduti in disuso i metodi che si avvalevano di acidi inorganici forti (es. acido cloridrico, acido nitrico), in quanto deterioravano anche la componente organica creando considerevoli artefatti, sono attualmente in uso soluzioni di acidi organici (es. acido citrico, acido ascorbico), o di chelanti del calcio (es. acido etilendiamminotetraacetico o EDTA, acido etilenglicoltetraacetico o EGTA), che rimuovono la parte inorganica senza troppo danneggiare la parte organica. Una volta rimosso il minerale, il frammento osseo ha perso la sua durezza e può essere ulteriormente trattato come un qualsivoglia campione di tessuto molle, includendolo in paraffina e sezionandolo in sezioni sottili per mezzo di un comune microtomo. Le sezioni potranno essere successivamente colorate con metodi routinari o sottoposte a indagini istochimiche ed immunoistochimiche. I metodi per decalcificazione si prestano anche all’esame ultrastrutturale del tessuto osseo previa fissazione con i fissativi appositi per la microscopia elettronica (es. glutaraldeide) e successiva decalcificazione, osmizzazione, inclusione in resina epossidica o acrilica e sezionamento in sezioni ultrasottili.
• I metodi per usura sono metodi di microscopia ottica adeguati a preservare la componente minerale e la componente organica mineralizzata, rappresentata fondamentalmente dalle fibre collagene. Non consentono tuttavia la preservazione delle cellule e di gran parte delle molecole della sostanza fondamentale amorfa. Il frammento osseo da studiare viene prelevato ed immerso in acqua per un periodo di tempo sufficientemente lungo da consentire la macerazione dei componenti organici non mineralizzati. In seguito, dal frammento macerato viene tagliata manualmente una sezione piuttosto spessa che viene fatta asciugare e poi aderire ad un vetrino portaoggetto tramite una goccia di mezzo di montaggio (es. balsamo del Canada o balsami sintetici). Una volta che questo si è solidificato, la sezione di osso viene lavorata con carta abrasiva a grana decrescente, fino a ridurla per usura ad uno spessore sufficientemente sottile da renderla attraversabile dalla luce. Prima dell’osservazione, la sezione viene montata ponendole sopra una goccia di mezzo di montaggio ed infine un vetrino coprioggetto. Il mezzo, avendo una certa densità, non riesce a permeare le cavità microscopiche presenti nel tessuto osseo, che rimangono piene di aria. Pertanto, quando il preparato verrà osservato al microscopio ottico, l’aria contenuta nelle microcavità causerà la diffrazione dei raggi luminosi, che non verranno raccolti dall’obiettivo del microscopio. Pertanto tali cavità appariranno nere su uno sfondo chiaro, e quindi ben evidenti.

Sostanza intercellulare del tessuto osseo

Essendo un tessuto connettivo, il tessuto osseo contiene una quota rilevante di sostanza intercellulare organica, composta da fibre connettivali e da sostanza fondamentale amorfa. Alla componente organica si aggiunge inoltre la componente minerale.

• Le fibre connettivali sono rappresentate per la quasi totalità da fibre collagene, composte da collagene di tipo I come nella maggior parte dei tessuti connettivi. Rispetto a questi, il collagene dell’osso possiede un maggior numero di legami crociati che tengono unite le singole molecole di tropocollagene. L’abbondante contenuto in collagene è il principale responsabile della marcata acidofilia della sostanza intercellulare dell’osso, quale si può mettere in evidenza nei preparati demineralizzati allestiti per la microscopia ottica. Quando esaminate al microscopio elettronico nei preparati demineralizzati, le microfibrille collagene presentano la tipica striatura trasversale con periodo di 70 nm. Esse si aggregano a formare fibre collagene di spessore rilevante (5-10 µm) soltanto nel cosiddetto tessuto osseo fibroso, mentre nell’altra varietà di tessuto osseo, cosiddetto lamellare, le microfibrille collagene (spesse circa 60 nm) non tendono a riunirsi in fibrille ma formano un feltro omogeneo. Dallo strato di tessuto connettivo che avvolge esternamente l’osso, detto periostio, si dipartono spessi fasci di fibre collagene che penetrano all’interno del tessuto osseo corticale e si perdono nella sostanza intercellulare dell’osso: questi fasci costituiscono le fibre perforanti di Sharpey, che ancorano il periostio alla superficie dell’osso.
• Le fibre elastiche sono virtualmente assenti nel tessuto osseo, ad eccezione di una piccola quota di queste nelle fibre perforanti di Sharpey. Le fibre reticolari sono localizzate a livello della membrana basale che circonda i vasi sanguigni intraossei, ma non sono presenti nella sostanza intercellulare vera e propria dell’osso.
• La sostanza fondamentale amorfa ha una composizione peculiare e in buona misura diversa da quella degli altri tessuti connettivi. Di essa fanno parte varie classi di macromolecole.

Macromolecole della sostanza fondamentale

• Proteoglicani, composti da glicosaminoglicani acidi, solitamente solforati, uniti assieme da brevi catene proteiche. Quelli meglio conosciuti sono:
  • Proteoglicano di tipo I (PG-I), detto anche biglicano, in quanto costituito da due molecole di condroitinsolfato unite ad una estremità da un polipeptide ricco di leucina, lo si ritrova sia nella sostanza intercellulare mineralizzata che in quella non mineralizzata adiacente alle cellule ossee e ai loro prolungamenti, il cosiddetto tessuto osteoide.
  • Proteoglicano di tipo II (PG-II), detto anche decorina, in quanto tende ad associarsi alle microfibrille collagene come a decorarle. È formato da una parte proteica analoga a quella del PG-I unita ad una sola molecola di condroitinsolfato. Lo si ritrova nella sostanza intercellulare mineralizzata ma non nel tessuto osteoide, per cui si ipotizza che abbia un ruolo nell’orientare la deposizione dei cristalli minerali lungo le microfibrille collagene.
• Glicoproteine, di solito fosforilate o solfatate, includono molecole diverse alcune delle quali sono ritenute giocare un ruolo fondamentale nel controllo dei processi di mineralizzazione. Tra queste si annoverano:
  • Osteonectina, la glicoproteina più abbondante. È dotata di alta affinità per il calcio, sia come ione libero che associato in complessi di tipo cristallino. Si ritiene che essa agisca come elemento di nucleazione dei cristalli minerali, in quanto ritenuta capace di concentrare il calcio nelle sue adiacenze creando così le condizioni per avviare la precipitazione del fosfato di calcio.
  • Fosfatasi alcalina, un enzima capace di idrolizzare gruppi fosfato legati a substrati organici (quali ad es. il piridossal-5-fosfato) attivo in ambiente alcalino (pH 8-10). Alcuni studiosi ritengono che essa potrebbe giocare un ruolo nei processi di mineralizzazione, mettendo a disposizione gli ioni fosfato per la formazione dei cristalli minerali. Secondo altri, sarebbe invece coinvolta nella sintesi della matrice organica dell’osso.
  • Fibronectina, una molecola di adesione localizzata prevalentemente nella matrice pericellulare e caratterizzata da una porzione capace di legarsi al collagene. Si ritiene che la fibronectina sia coinvolta nei processi di migrazione, adesione alla matrice e organizzazione delle cellule dell’osso.
• Sialoproteine, o BSP (dall’acronimo inglese bone sialo-proteins, sialoproteine dell’osso), glicoproteine peculiari contenenti residui glicidici di acido sialico. Queste proteine posseggono una sequenza aminoacidica particolare Arg-Gly-Asp (sequenza RGD) che in esperimenti in vitro è stata vista mediare l’adesione al substrato di svariati tipi cellulari, incluse le cellule dell’osso. Si ritiene pertanto che le sialoproteine ossee abbiano la funzione fisiologica di consentire l’adesione delle cellule alla matrice ossea. Se ne conoscono più tipi: la osteopontina (o BSP-I), la BSP-II e la glicoproteina acida dell’osso (o BAG-75).
• Proteine contenenti l’acido gamma-carbossiglutammico (GLA), un aminoacido particolare derivato dall’acido glutammico con un ulteriore gruppo carbossilico legato al carbonio in gamma posizione. Il GLA incluso in una proteina possiede, nella porzione del residuo, due gruppi carbossilici liberi e ravvicinati che a pH fisiologico sono ionizzati e carichi negativamente, e pertanto capaci di agire come una sorta di chelanti per i cationi bivalenti quali lo ione calcio. Le proteine dell’osso contenenti il GLA sono di due tipi:
  • Osteocalcina, o proteina GLA dell’osso, una piccola proteina contenente 3-5 residui di GLA. È stato ipotizzato che essa possa giocare un ruolo di inibizione della mineralizzazione in quanto ritenuta capace di legarsi allo ione calcio e di renderlo indisponibile per la combinazione con lo ione fosfato, inibendo così l’accrescimento dimensionale dei cristalli minerali. Questa ipotesi è avvalorata dalla constatazione che l’osteocalcina abbonda nel tessuto osseo maturo ed è invece scarsa nel tessuto osseo in via di formazione, nonché dal reperto che questa proteina inibisce la crescita di cristalli di fosfato di calcio in vitro.
  • Proteina GLA della matrice, di peso molecolare maggiore della osteocalcina, è presente sia nell’osso maturo che in quello in via di formazione, nonché nella cartilagine destinata a essere sostituita da tessuto osseo, come la cartilagine di accrescimento. Il suo ruolo biologico non è chiarito.

Componente minerale

La componente minerale è rappresentata da cristalli di sali di calcio, prevalentemente fosfato di calcio, a cui si aggiungono quantità minori di carbonato di calcio e tracce di altri sali (fluoruro di calcio, fosfato di magnesio). Il fosfato di calcio è presente sotto forma di cristalli di apatite, la cui cella elementare ha la forma di un prisma esagonale appiattito e formula chimica Ca₁₀(PO₄)₆; le due cariche positive sono di norma neutralizzate dal legame con due ioni ossidrile (OH^-), formando così la idrossiapatite, ma si possono ritrovare anche altri anioni (ione carbonato nella carbonatoapatite; ione fluoruro nella fluoroapatite). Il cristallo si origina dall’impilamento delle singole celle elementari ed ha la forma di un ago lungo e sottile, spesso circa 2 nm e lungo 20-40 nm.

I cristalli di apatite sono ben riconoscibili nei preparati di tessuto osseo allestiti per la microscopia elettronica in quanto fortemente elettrondensi; essi tendono a disporsi parallelamente tra sé e alle microfibrille collagene, di cui ricoprono la superficie e permeano le porosità. Osservazioni condotte durante il processo di mineralizzazione dell’osso hanno consentito di precisare che il fosfato di calcio precipita inizialmente sotto forma di minutissimi aggregati amorfi. Questi nuclei iniziali di concrezione minerale vengono rapidamente rimpiazzati da sottilissimi cristalli aghiformi disposti parallelamente a molecole filamentose della sostanza fondamentale detti filamenti assili (o crystal ghosts), verosimilmente costituiti da decorina, in rapporto col periodo delle microfibrille collagene. Tali cristalli crescono assumendo l’aspetto tipico dei cristalli di apatite, occupando progressivamente gran parte dello spazio interposto tra le microfibrille collagene e permeando le microfibrille stesse. Una volta formatisi i cristalli di apatite, la deposizione di nuovo minerale può avvenire sia per formazione di nuovi cristalli che per apposizione sui cristalli preesistenti. Tale fenomeno è finemente regolato dalle cellule ossee tramite la produzione di specifiche molecole della matrice ossea, come già accennato in precedenza.

Cellule del tessuto osseo

Le cellule proprie del tessuto osseo sono morfologicamente distinguibili in 4 varietà: le cellule osteoprogenitrici (dette anche preosteoblasti), gli osteoblasti, gli osteociti e gli osteoclasti. Di queste, cellule osteoprogenitrici, osteoblasti e osteociti sono in realtà fasi funzionali consecutive dello stesso tipo cellulare, a sua volta derivato dalla differenziazione in senso osteogenico della cellula mesenchimale pluripotente dei tessuti connettivi; sono pertanto considerabili come cellule autoctone dell’osso. Gli osteoclasti, per contro, derivano da precursori immigrati nel tessuto osseo dal sangue, i cosiddetti preosteoclasti, i quali a loro volta si differenziano da cellule staminali del midollo osseo ematopoietico.

• Le cellule osteoprogenitrici, o preosteoblasti, hanno forma fusata o ovalare, con citoplasma scarso e basofilo e nucleo eucromatico con grande nucleolo. Al microscopio elettronico, la basofilia citoplasmatica si dimostra dovuta a un gran numero di poliribosomi liberi. Gli altri organuli sono poco rappresentati.
• Le cellule osteoprogenitrici si collocano sulle superfici libere delle ossa: le si riconoscono a livello dello strato più interno del periostio apposto all’osso, il cosiddetto strato osteogenico di Ollier, riccamente vascolarizzato. Tali cellule sono altresì localizzate a livello del tessuto connettivo lasso che riveste le cavità interne dell’osso, il cosiddetto endostio, in vicinanza dei capillari sanguigni. Le cellule osteoprogenitrici sono dotate di capacità proliferativa, che si manifesta in modo particolare durante l’accrescimento corporeo ma che può esplicarsi anche durante la vita adulta. Esse sono in grado di produrre e secernere le bone morphogenetic proteins (BMP).