Istologia ed embriologia umana - esame istologico e citoanalisi

Prelievo: che può avvenire nei modi più disparati ma è bene ricordare la

• ovvero il prelievo diretto del campione di tessuto da esaminare;

biopsia,

fissazione;

• disidratazione;

• infiltrazione;

• inclusione;

• microtomia;

• reidratazione;

• colorazione.

•

Tra i coloranti ricordiamo il viola-ematossilina, che si lega al DNA rendendo di color

viola il nucleo, e il rosa-eosina che colora di rosa il citoplasma. Dopo aver aggiunto i

coloranti, il campione viene di nuovo disidratato e poi infiltrato con xilolo.

Alla fine la fetta si sul vetrino, cioè si incolla sul vetrino per evitare che vada

liuta

persa. Ora il preparato istologico è pronto per l’osservazione.

Mediamente tutto il processo di preparazione del campione dura 16 ore. In casi

estremi, in cui l’esito dell’esame deve essere repentino, il campione viene congelato

con azoto liquido e tagliato con un particolare microtomo, detto Le sezioni

criostato.

criostatate, piene di acqua, vengono colorate direttamente e possono essere subito

osservate al microscopio. Da notare che con questa tecnica il tessuto è vivo al

contrario della precedente, nella quale la fissazione segnava la morte di tutte le

cellule del tessuto.

1.2 Coloranti

Un passaggio fondamentale per permettere lo studio dei tessuti al microscopio è la

i tessuti animali, infatti, sono nella maggior parte dei casi incolori,

colorazione;

perché costituiti in gran parte di acqua e privi di pigmenti, e trasparenti, tanto da

risultare pressoché invisibili al microscopio ottico. Sono state perciò scoperte o

realizzate, fin dalla nascita dell'istologia, una serie di sostanze coloranti, capaci

appunto di colorare le cellule, o le diverse parti di una cellula, in modo da renderle

immediatamente visibili e distinguibili.

Al giorno d'oggi sono note moltissime sostanze di questo tipo, che possono essere

divise in due grandi gruppi in base ai meccanismi con cui si legano ai diversi

componenti cellulari, meccanismi che dipendono dal pH della sostanza da colorare:

i che si legano alle molecole con pH inferiore a 7 (acide),

coloranti basici,

• come il DNA;

i che si legano alle molecole con pH superiore a 7 (basiche),

coloranti acidi,

• come gran parte delle proteine citoplasmatiche.

Nelle analisi istologiche vengono normalmente utilizzate coppie di coloranti

basici/acidi, che colorano in modo diverso le diverse parti cellulari: un classico

esempio è la colorazione con una delle più comuni in

ematossilina/eosina,

laboratorio. L'ematossilina, basica, colora il nucleo in blu, l'eosina, acida, colora il

citoplasma in rosa (figura 1).

Figura 1: Classica immagine di un preparato di cute colorato con ematossilina/eosina. Con "p" si

indica il pelo, "fp" il follicolo pilifero.

Esistono comunque molti altri composti, in grado di colorare organelli cellulari anche

molto specifici.

Oltre ai coloranti tradizionali, negli ultimi anni hanno preso piede anche le tecniche

della immunochimica per individuare e distinguere i diversi componenti cellulari:

queste tecniche, che risultano molto utili per evidenziare singole classi di molecole

all'interno della cellula, prevedono l'uso di anticorpi opportunamente trattati, in grado

di legare e visualizzare specifiche proteine, lipidi o carboidrati.

Con opportune tecniche è anche possibile esaminare l’attività cellulare di una

determinata cellula. Gli enzimi risultano essere le molecole markers più utili. Siccome

ogni enzima è specifico per un determinato substrato, anche il prodotto sarà legato

alla presenza o meno dell’enzima. Quindi dalla presenza o assenza di un prodotto e

dalla sua quantità si può risalire all’attività di uno specifico enzima. Uno degli enzimi

più utilizzati in questo ambito è la la cui presenza massiva, a

5’-Nucleotidasi,

seguito di marcatura, spesso mette a nudo la natura cancerosa di una cellula.

Altre tecniche di osservazione istologica si basano sulla cioè la

metallizzazione,

superficie della cellula viene ricoperta da un particolare metallo e bombardata da un

fascio di elettroni. L’immagine riflessa viene catturata su una particolare superficie è

analizzata, ottenendo l’immagine reale della cellula. È possibile ottenere fette più

sottili utilizzando con una durezza pari a quella del vetro. Con

resina epossidica

questo metodo si ottengono strisce dello spessore di 200 Å. Utilizzando piombo e

acetato di uranile la cellula viene

colorata e bombardata da un fascio

di elettroni, ottenendo così

un’immagine della sezione.

Per quanto concerne i microscopi,

la risoluzione e qualità variano in

base al modello. I vari tipi di

microscopi sono:

ottico;

• a fluorescenza (figura 2);

• elettronico a scansione

•

(figura 3);

Figura 2: Spermatozoi osservati con microscopio a elettronico a trasmissione

•

fluorescenza. (figura 4).

Figura 3: Sestetto di archi: globuli rossi in microscopia elettronica a scansione.

Figura 4: Macrofago alveolare osservato in microscopia elettronica a trasmissione.

Come notato dalle immagini, la microscopia elettronica mostra maggiori dettagli, sia

di superficie (scansione) sia di componenti intracellulari (trasmissione).

Anche se esula dalla trattazione, è utile ricordare un’altra particolare metodica di

colorazione, ovvero quella di Gram. Evitando di entrare nei particolari, la colorazione

viene utilizzata per visualizzare le cellule batteriche e risulta essere il

di Gram

principale metodo di catalogazione delle singole specie batteriche, distinguendole in

Gram positive (ovvero si colorano) e Gram negative (ovvero non si colorano).

1.3 Citoanalisi: la forma e lo specchio della funzione

La citoanalisi è la corretta descrizione di una cellula, identificando quelle che sono le

sue principali strutture e caratteristiche morfologiche e da lì risalendo alla sua

funzione.

Per prima cosà si cerca di ricondurre la forma della cellula ad una particolare figura

geometrica. Possiamo identificare come probabile forma di una cellula quella sferica,

ovoidale, cubica, fusata, polimorfa.

Successivamente si passa all’osservazione della superficie della membrana

cellulare, rilevando opportune irregolarità (villi o blebs, prolungamenti citoplasmatici,

La membrana cellulare delle cellule differenziate, soprattutto delle cellule

figura 5).

epiteliali, non risulta essere una struttura uniforme, ma presenta delle porzioni

deputate a specifiche funzioni. Quando una cellula presenta porzioni della propria

membrana cellulare deputate ad una particolare funzione si dice che la membrana è

Un esempio è l’enterocita dei villi intestinali: la parte della membrana

polarizzata.

che sporge nel lume viene definita apicale e svolge funzioni di assorbimento mentre

la porzione di membrana posta agli antipodi svolge funzioni di ancoraggio alla

membrana basale ed è detta basale. Ricorda che la perdita di queste caratteristiche

è un indice di degenerazione cellulare, che può evolvere al cancro.

Figura 5: Il preparato mostra il caratteristico orletto a spazzola tipico degli epiteli respiratori.

Con l’indice si valuta la grandezza del nucleo rispetto al

nucleo/citoplasma

citoplasma cellulare. Una cellula con un rapporto alto molto probabilmente è una

cellula non attiva, quiescente, che non sintetizza proteine. Al contrario un indice

basso depone per una cellula altamente attiva, magari coinvolta nell’assorbimento,

escrezione, sintesi di proteine.

Fatto ciò si passa ad osservare il livello di compattamento del DNA all’interno del

nucleo della cellula. Se la cromatina prevalente è di tipo (chiara) vuol

eucromatico

dire che numerosi geni sono espressi e che la cellula è in una fase di intensa sintesi

proteica. In questo caso il DNA è meno compattato perché il grado di compattamento

della cromatina è in grado di influenzare l’espressione di specifici geni. Se invece il

tipo prevalente è quello (scuro), allora la maggior parte dei geni

eterocromatico

sono spenti e ciò vuol dire che la cellula è “a riposo”, con cromatina molto compatta e

densa.

Sempre nel nucleo, è possibile osservare delle particolari zone, i Il nucleolo

nucleoli.

è la fabbrica che produce i ribosomi, quindi la presenza del nucleolo è indice di

attività di sintesi proteica. Tuttavia la presenza eccessiva di nucleoli fa presagire che

il tipo di cellula che si sta analizzando sia una cellula tumorale.

Terminata l’osservazione del nucleo, si analizzano eventuali organelli cellulari. Un

forte presenza di REG, ovvero fa

reticolo endoplasmatico rugoso o granulare,

intuire che la cellula sia impegnata nella secrezione extra-cellulare attraverso

vescicole di trasporto, che dal REG, passando per il Golgi, arrivano sulla membrana

plasmatica e liberano all’esterno il loro contenuto. Dalla presenza o meno del REL,

si comprende come la cellula sia implicata nella

reticolo endoplasmatico liscio,

steroidosintesi (sintesi di ormoni steroidei).

La presenza massiva di nella cellula è indice di intensa attività “cinetica”,

mitocondri

cioè di intensa attività secretoria, o contrattile o di riassorbimento. I mitocondri sono

le fabbriche energetiche della cellula.

Nel citoplasma è possibile rintracciare la presenza di granuli di glicogeno, la riserva

di energia a breve termine. Da ciò si può intuire di come la cellula abbia un continuo

bisogno di energia per poter svolgere tranquillamente le sue funzioni e mantenere

l’omeostasi. Sempre nel citoplasma è possibile rinvenire delle strutture a forma di

virgola, i o polisomi. L’aspetto a virgola è dovuto al fatto che più

poliribosomi

ribosomi citoplasmatici sono interessati nel tradurre contemporaneamente lo stesso

mRNA. Si possono rinvenire anche goccioline lipidiche, altra fonte di energia per la

cellula e materia prima per la steroidosintesi.

I sono lo stomaco delle cellule. Col passare del tempo, nei lisosomi si

lisosomi

accumula materiale indigerito, creando dei caratteristici inclusi cellulari detti

La presenza delle lipofuscine è indice della senilità di una cellula. Infatti

lipofuscine.

le cellule giovani hanno la capacità di “evacuare” all’esterno tutto ciò che i lisosomi

non riescono a digerire. Ma col passare del tempo si perde tale capacità e si formano

le lipofuscine.

Altra struttura da analizzare è il che in alcune popolazioni cellulari ha

citoscheletro,

una importanza rileva