Ingegneria proteica e disegno di farmaci - corso completo

Ingegneria proteica e disegno di farmaci

Struttura delle proteine

Dal punto di vista delle sequenze geniche abbiamo molta informazione. Le sequenze e i dati strutturali aumentano esponenzialmente di anno in anno. La genomica si occupa della completa sequenza del genoma di un organismo, incluso il genoma umano. La genomica strutturale è la soluzione di tutte le strutture proteiche in un organismo (immagini statiche). La proteomica studia come le componenti sono assemblate e come le attività sono interate (immagini dinamiche). Dal genoma segue il proteoma da cui segue la sequenza primaria delle proteine (aa). Quello che si vuole fare oggi è, partendo dalla proteomica (seq della proteina), riuscire non solo a determinare ma anche calcolare la struttura tridimensionale della proteina.

Da una sequenza lineare genica segue una sequenza lineare di aa che contiene le informazioni della proteina, ed è il ripiegamento della sequenza che determina la struttura e la funzione della proteina. Dal proteoma segue il metaboloma; la metabolomica è lo studio dell'interazione di pathways metabolici, e del ruolo di vari enzimi e molecole. Vi sono anche altri -omi: epigenomica, lipidomica, glicomica, transcrittomica, interattomica (interazione tra proteine per costruire sistemi più complessi) ecc. La struttura delle proteine è importante perché da questa deriva la funzione: dal ripiegamento 3D della proteina bisogna quindi capire la sua funzione nel metabolismo.

Quello che faremo è sfruttare la struttura della proteina e modificarla anche con mutagenesi per poterne derivare una certa funzione. La proteomica è una disciplina in evoluzione, soprattutto adesso in cui si parla di inquinamento e sostenibilità (vedi i chimici che usano tanti solventi inquinanti e per questo vogliono cominciare ad utilizzare degli enzimi).

Protein folding

Il folding della proteina è il suo ripiegamento nello spazio. Si parlerà quindi di protein folding. Il folding si propone di calcolare come una sequenza lineare dettata dagli aa si ripiega nello spazio: questo è interessante dal punto di vista applicativo ma anche medico perché alcune patologie sono derivate da un mis-folding delle proteine (vedi il Parkinson). Il problema del folding quindi non è solo tecnologico ma anche medico.

Nel grafico a sinistra si vede quante strutture proteiche vengono risolte in un anno, più strutture risolte con una nuova tecnica (CRIO-EM). Le due tecniche principali per la determinazione delle proteine sono:

• Cristallografia, Diffrazione raggi X
• Risonanza Magnetica Nucleare (NMR) che non richiede la cristallizzazione. Il difetto di questa tecnica è che ci dà info del nucleo di ogni atomo che compone la proteina: sono troppe informazioni per una proteina grande (>70-80KDa) per la quale non si riesce a risolvere la struttura (sovrapposizione di nuclei)
• Il CRIO-EM è la microscopia elettronica in condizioni di congelamento. È un microscopio elettronico ma con una potenza elevata, risoluzione più fine. Più grossa la proteina meglio è (si vede meglio). È la tecnica del futuro, costa molto (1 in Olanda, 1 a Londra, 2 in Italia).

A sinistra vediamo la doppia elica del DNA mentre a destra vediamo la struttura della proteina. Il codice genetico sappiamo essere ridondante: uno stesso aa può essere codificato da più triplette. Questo è importante perché per modificare una proteina con la mutagenesi si possono scegliere 4 codoni, di questi si sceglie quello che comporta meno cambiamenti per il test di mutagenesi. È anche importante considerare però che organismi diversi hanno una preferenza diversa di codoni: quando un gene viene tradotto in una proteina a livello dei ribosomi, qui si inserisce l’mRNA. L’mRNA funziona come stampo per il tRNA che porta con sé l’aminoacido. Organismi diversi hanno una concentrazione tRNA diversa. L’Ecoli ad esempio può avere pochi tRNA per un codone di un gene umano per cui quella proteina sarà poco prodotta. La ridondanza del codice genetico ci aiuta a scegliere il codone più abbondante in un determinato organismo.

Struttura primaria delle proteine

Gli alfa-aa (sono L-aa) sono chirali. Il Carbonio alfa ha 4 sostituenti diversi:

• Gruppo COOH (acido)
• Gruppo NH3 (basico)
• H
• R. Catena laterale che caratterizza l’aa.

Esistono 20 aa (naturali) ognuno dei quali avrà un R proprio, ad eccezione della Gly che ha R=H e per questo non è chirale. Il gruppo R conferisce all’aa diverso volume, carica, polarità, ionizzazione, abilità di ricevere o dare legami a H. La sequenza degli aa è la struttura primaria delle proteine. Una certa sequenza di aa detta come il legame peptidico si ripiega nello spazio (per limitare l’ingombro sterico), determinando la struttura secondaria che può essere:

• Alfa elica (la più comune)
• Filamento beta

La struttura secondaria è composta da regioni di sequenza con strutture regolari. Questa struttura a sua volta si ripiega grazie a dei loop per dare origine a una struttura compatta (generalmente globulare o fibrosa) ovvero la struttura terziaria, in cui appunto gli elementi della struttura secondaria formano delle unità chiamate domini. Alcune proteine sono fatte però in modo che diverse catene con una struttura terziaria interagiscano tra di loro per dare origine a una struttura quaternaria (vedi emoglobina che è formata da 4 catene, 2 alfa e 2 beta). La struttura quaternaria non vuol dire che ci sono 4 catene!

Il gruppo COOH (pKa=4.5) e NH2 (pKa=9) sono dissociati a pH=7 in cui si ha una carica globale =0 ma con carica – da una parte e una positiva dall’altra. In una catena proteica dove c’è sempre un primo aa (N-terminale carico +) e un C-Terminale (carica -), vi sono le varie catene laterali degli aa alcune delle quali non dissociano, altre delle quali possono cedere un H (aa acidi: E,D), altri invece ricevono il protone a pH neutro (aa basici: K, R. H ha un pKa=6 e per questo può sia cedere che donare un H). 2 aa quando siamo nel ribosoma, formano un legame chiamato peptidico: un legame covalente forte che può essere rotto a temperature elevate e a pH acidi.

Questo legame ha 2 caratteristiche fondamentali: è planare perché è parzialmente doppio e per il fatto che è planare non c’è una libera rotazione e quindi è di tipo trans. I 2 C-alfa infatti si trovano ai vertici opposti del piano. L’ingombro sterico in configurazione trans è molto ridotto.

Caratteristiche delle catene laterali

La catena laterale è quella che dà ingombro sterico: nell’immagine abbiamo una Gly e un Ala che per ingombro sterico vede il suo -CH3 spostato leggermente per ingombro sterico. Le catene laterali R vengono messe in posizioni alternate il più lontano possibile. A seconda della carica, volume e dimensioni della catena R, 2 legami peptidici ruotano leggermente uno rispetto all’altro (i piani dei legami peptidici ruotano uno rispetto all’altro utilizzando come perno il Calfa): gli angoli di rotazione sono phi e psi.

Questi angoli hanno valori diversi, e quindi alcuni aa, in base a questa rotazione, possono originare strutture ad elica o di filamenti beta. Ne consegue che dalla struttura primaria e segue quella secondaria. Se si vogliono fare delle mutazioni nella proteina, bisogna osservare quale tendenza ha quell’aa a fare delle eliche o dei foglietti. Quindi, ad esempio, se si vuole modificare un aa di un’alfa elica mettendo al suo posto un aa che tende a formare un foglietto beta, la proteina non si folderà. È importante anche andare ad osservare gli aa che sono coinvolti nei loop.

I filamenti beta possono essere isolati, ma molto più spesso i filamenti beta tendono ad associarsi formando i foglietti beta. Le eliche, invece, sono strutture completamente diverse rispetto ai filamenti beta: se guardiamo l’asse centrale sembrano essere quasi vuote (c’è una piccola cavità lungo l’asse). Quello che è molto importante nel ripiegamento e nella determinazione della struttura proteica, sono le interazioni deboli: tra un aa e l’altro si formano delle interazioni deboli (non covalenti). Un legame covalente per essere scisso necessita di un’energia che si avvicina a quella necessaria alla sua formazione, ovvero intorno ai 200kJ, mentre uno debole vuole un’energia di circa 20kJ.

Quando la proteina si ripiega, il numero elevato di interazioni deboli (elettrostatiche, idrofobiche, VdW, legami a H) fa sì che assuma una struttura stabile. Gli enzimi prodotti nella cellula, così come le proteine, non sono stabili al 100% perché vengono prodotte in momenti specifici, e, quando non sono più necessarie, è utile degradarle: con il turnover delle proteine si mantiene il bilancio tra degradazione e sintesi per assicurare l’efficacia dei diversi pathway in cui sono coinvolti e le funzioni vitali della cellula.

Interazioni deboli e stabilità proteica

Ieri abbiamo visto le interazioni deboli che tengono stabile una proteina. Il legame peptidico è trans di tipo covalente e rigido. In questo piano si trovano i Calfa dei 2 aa adiacenti e instaurano un legame singolo e in quanto tali possono ruotare (al contrario del legame peptidico). La rotazione attorno ai legami singoli fa sì che piani adiacenti descritti da legami peptidici adiacenti possono ruotare uno rispetto all’altro. La rotazione è dettata dal gruppo R legato al Calfa. Gli angoli di rotazione sono phi e psi e hanno un’ampiezza dettata dall’ingombro sterico dipendente dalla catena R. P e G tendono a formare delle anse e quindi non rientrano nello schema dei filamenti beta e delle alfa eliche.

Il diagramma di Ramachandran

Dei chimici organici indiani tra cui Ramachandran hanno sviluppato un plot che è un grafico che porta sui suoi assi i valori degli angoli diedri (phi e psi). Questo diagramma è molto utile che viene oggi usato quando si parla di strutture di proteine in quanto basato sulla teoria secondo cui gli angoli phi e psi non possono essere casuali, ma possono avere solo determinati intervalli di valore. Quando si mette in relazione i due angoli, nel diagramma vediamo delle regioni con valori plausibili (che si trovano nelle proteine) e non plausibili.

Le aree bianche sono appunto le zone permessa (combinazioni di phi e psi che corrispondano a strutture di tipo alfa o beta) e si trovano tra +60 e +180 (filamenti beta di tipo anti-parallelo) e -60 e -180 (filamenti beta parallelo). Poi vi sono delle strutture particolari come il collagene (3 filamenti) che sebbene sembri elicoidale ha un andamento elicoidale e a zig zag e si trova nella zona permessa di +60 e +180. Le alfa eliche possono essere destrorse o sinistrorse e vi sono 2 zone a seconda dell’orientamento dell’elica. Quindi le strutture conosciute in qualche modo devono rientrare in queste zone permesse. Quando abbiamo una struttura cristallografica, NIM ecc., il primo passaggio da fare è quello di utilizzare un software che permette di costruire il grafico di Ramachandran in modo da vedere se gli angoli phi e psi rientrino o meno nelle zone permesse.

Conformazioni non permesse

A sinistra vediamo un esempio di conformazione non permessa. Vediamo 2 esempi reali: ribonucleasi A e BPTI in cui abbiamo dei valori sperimentali veri dove i punti, per la maggior parte, rientrano nelle zone permesse. Quando i punti sono fuori dalle zone permesse bisogna vedere a quale aa corrispondono cliccando sopra con il mouse in modo che il software riporti quale aa sia.

In questo modo si osserva poi la struttura tridimensionale della molecola per vedere dove si trovi l'aa. Vediamo il grafico a destra:

• In questo caso uno degli aa fuori dall’area permessa è la Gly indicata con + : questa ha R=H e quindi è molto flessibile.
• Abbiamo anche la P che è un’altra eccezione per ragioni inverse alla Gly, in quanto ha una catena laterale ciclizzata che lo rende molto rigido (lega il Calfa con il gruppo amminico). Questa rigidità impone dei valori phi e psi fuori dalle aree permesse.
• Nel grafico vediamo altri punti neri che non sono nè gly né pro e si clicca sui singoli punti. Se questi sono nel loop non ci sono problemi perché non è né un’alfa-elica né un foglietto-beta e quindi va bene che non si trovi nella regione permessa. In alternativa se si trova nelle strutture secondarie vi può essere un problema nella costruzione della molecola tridimensionale o meno. Quello che si va a fare è intervenire con modellizzazione molecolare per vedere se gli errori vengono corretti o meno.

Una volta che la struttura di una proteina sia stata risolta, bisogna depositare le coordinate nel PDB (the protein data bank) che saranno poi disponibili alla comunità scientifica che può così studiare la proteina. Se si vuole sapere se esiste la struttura di una certa proteina, si trova un codice con 3 lettere e un numero (in genere si prende quella con il numero più elevato, che corrisponde alla risoluzione più recente della proteina). Una volta scaricato il file, si può guardare con word e si vede una colonna di numeri che sono le coordinate x,y,z degli atomi che compongono la molecola. Se il file viene caricato su un software che serve per visualizzare le proteine, questo la fa vedere in 3D.

Eliche delle proteine

Le eliche più studiate son le alfa-eliche. In realtà ve ne sono almeno 4 tipi:

• 2-ribbon che sembra più un nastro
• Eliche 3-10
• Alfa eliche
• Eliche pi-greco (un po’ meno comuni).

Queste diverse eliche avranno diverse tipi di combinazioni nel plot di Ramachandran. La differenza sta nel passo, ovvero nel quanto sia stretta o lassa l’elica e questo dipende dall’intervallo che c’è tra i legami a H. I gruppi C=O e N che si trovano nell’elica tendono ad interagire tra loro formando dei legami a H: quindi in un’elica tipo vi sono una serie di legami a H che sono orientati lungo l’asse dell’elica e sono intervallati da un certo numero di aa. Il grafico dove sono riportate le 4 eliche, ci fa vedere che:

• Per l’alfa-ribbon, si ha un intervallo di 1 aa tra l’O che attira l’H e l’N che lo dona per la formazione del legame a H (quello in mezzo è il numero 4) elica stretta e allungata
• Nel caso del 3-10, in mezzo abbiamo 2 Calfa, quindi il giro è un po’ più largo
• Nelle alfa eliche abbiamo 3 aa
• Nelle eliche pi-greco: 4 aa elica più larga e lassa

In questo caso il legame a H si forma con un intervallo tra i+3. Un residuo è correlato al successivo con una rotazione di circa 100° attorno all’asse dell’elica con una traslazione lungo l’asse di 1.5 Å. Vediamo un disegno con il legame a H che si trova lungo l’asse dell’elica. L’elica vista di sopra ha un andamento come in figura dove il centro sembra vuoto. La cosa da notare è che le catene laterali R sono proiettate verso l’esterno dell’elica, e diverse alfa-eliche presentano una distribuzione asimmetrica dei residui idrofobici/idrofilici.

Il grafico in basso a destra, dal punto di vista dell’ingegneria proteica ci fa vedere come funziona la convenzione per raffigurare le eliche: una serie di cerchi concentrici dove ogni cerchio rappresenta un giro dell’elica. Su questi cerchi concentrici vengono indicati gli aa che compongono l’elica.

È interessante vedere come, dal punto di vista ingegneristico, in media sono composte le eliche. Se si guardano tutte le proteine che conosciamo e si fa una media, si ottiene che le eliche sono lunghe in media 10 aa (se più lunga può essere destabilizzata, eliche di 40 aa sono rare). Il giro di un’elica è tale per cui su un giro ci sono 3.6 aa per giro, quindi ogni 7 aa, se parliamo delle catene laterali, queste puntano nella stessa direzione (non esattamente perché il valore esatto è 7.2). Questo ci interessa per l’ingombro sterico dato che puntano nella stessa direzione. 360/3.6 = 100° di rotazione per aa per giro.

Alcuni aa danno dei valori di phi e psi che stanno bene nelle alfa eliche, che sono: A, E, L, M, al contrario di P, G, Y, S che causano una distorsione dell’elica oppure questa non si forma proprio. Se vediamo inoltre l’orientamento dei legami a H, se il C=O è l’accettore dell’H (che va dall’N al C=O), tutti i legami a H nella proteina sono tutti orientati nella stessa direzione. Quindi le eliche hanno una direzionalità, il che comporta che esiste un momento di dipolo nelle eliche.

Il fenomeno del Capping

Questo dipolo comporta ad un fenomeno che si chiama:

• C-Capping: vuol dire che nella direzionalità dei legami H, si avrà una situazione in cui l’inizio dell’elica avrà una leggera carica – per via di come gli elettroni vengono spostati.
• N-Caping: leggera carica +.

Se si sceglie un aa da inserire, ad esempio E, questo ha una catena laterale che è -CH2, CH2-COO-, quindi ha una carica – a pH=7 che neutralizza la carica + nell’N-terminale e quindi funge da tappo (capping) per l’N-terminale, andando a stabilizzare l’elica. Nel caso di un aa non carico, questo né destabilizza né stabilizza l’N-terminale. Nel caso di un aa positivo questo destabilizza l’elica. Al contrario, al C-terminale, se si mette una K, si ha il fenomeno del C-capping, raggiunto quindi quando si scelgono aa con R=(+), al contrario del fenomeno del N-capping. Quindi la direzionalità dei legami a H è importante per la stabilità dell’elica. Un’altra cosa interessante se si fa uno studio statistico sulle eliche, è che possiamo avere una elica...