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ETelettrodo
Questo viene chiamata i , comunicazione dell'enzima con laETsuperficie.
Catalisi, i : Gli elettroni possono viaggiare in modo efficiente tra il sitocatcatalitico dell'enzima e il substrato che deve essere convertito in prodotto. Sipuò avere un buon Interfatial Eletton Trasfer ma la conformazione dell'enzimacambia e quindi la capacità di legare il substrato e di far avvenire la reazionecambia. È la corrente catalitica vera e propria e non deve essere limitata danessun fattore.
Abilità del substrato ad arrivare sull'enzima, i . Se l'enzima è messo in modoLevtale che il sito attivo non è accessibile oppure c'è un problema di diffusione delsubstrato per via del tempone.
Quello che è stato elaborato sono una serie di equazioni (nell'immagine). Questadefinizione di iET si può tralasciare in quanto si spera che la costante di trasferimentoelettronico è molto maggiore.
della costante catalitica. La kcat è una costante intrinseca dell'enzima, di quanto ci mette l'enzima a convertire un substrato in un prodotto. Se l'enzima funziona lentamente, ma gli elettroni viaggiano velocissimamente non ci si preoccupa per la iET in quanto il sistema misura la kcat. Quello che non si vuole è che l'enzima è capace di convertire velocissimamente substrato in prodotto ma non è capace di farlo in quanto gli elettroni viaggiano troppo lentamente da/verso l'elettrodo. La iLev che dipende dal trasporto di massa, che dipende dalla natura della soluzione la definisco dove si hanno una serie di valori tra cui omega. Omega è la rotazione dell'elettrodo, chiamato disc rotating electrode. L'elettrodo si trova su un motorino che ruota, ruotando mette in movimento la soluzione in cui è inserito, mescola la proteina e riduce il problema del trasporto di massa. Omega è la velocità angolare dirotazione. Quindi la diffusione non deve essere limitante e in quante condizioni l'equazione che viene fuori è un'equazione che risolve la corrente catalitica in termini di Mickaelis-Menten: viene fuori la KM e la concentrazione di substrato. Soprattutto si ottiene l'akcat, messa in relazione con la velocità massima (quando si ha la corrente massima).
In quanto modo si mette in relazione la cinetica classica di Mickaelis-Menten con un contesto elettrochimico. Il problema di applicarlo nella sensoristica è che si ha un elettrodo rotante che non è il massimo dal punto di vista della miniaturizzazione. Si fa un salto concettuale per applicarlo.
P450 BMP. Nella ciclovoltammetria si ha una risposta talmente scarsa da non ottenere i picchi anodico e catodico (primo grafico). Questo in quanto le specie redox sono molto schermate dall'esterno. Non si può utilizzare il ferrocene come mediatore in quanto viene metabolizzato dal p450. Si può utilizzare la
catena di trasporto degli elettroni e quindi la reduttasi. Si danno gli elettroni alla reduttasi dell’elettrone e questo poi li dà al p450. Si prende il dominio FMN, che reagisce con l’eme e si va a vedere se può interagire con l’elettrodo. La flavodossina è molto simile con il dominio FMN delle reduttasi e sappiamo che reagisce in modo molto spiccato con l’elettrodo. Si hanno 2 picchi in ossidazione (sotto) e riduzione (sopra) in quanto ha 2 stati redox (secondo grafico). La flavodossina interagisce particolarmente bene con gli elettrodi di carbonio quando si utilizza un promotore. L’elettrodo di carbonio vetroso ha le cariche esterne negative, l’FMN è carico negativamente mentre la neomicina, piccola molecola, è carica positivamente. Se facciamo un grafico con l’intensità del picco della corrente corretto per il background in positivo e in negativo (terzo grafico). Il background è dato dal fatto che la lineap450 e si aggiungono delle cisteine che silegano di rettamente all’elettrodo d’oro oppure a unospaziatore. La flavodossina prende elettronidall’elettrodo sul gruppo FMN e li passa all’eme delp450. Il p450 prenderà il substrato e libererà il prodotto.
Per la mutazione in cisteina la cosa più comoda èprendere delle serine (cambiamo un solo atomo).Le serine esposte sono 3: S64, S96, S35. Si fannodelle analisi del tunneling con il programmapathway per vedere quale delle serine ha il valorepiù positivo, maggiore velocità di trasferimentoelettronico verso l’FMN. Si va anche a vedere laquantità di superficie esposta. Non si ha unaserina migliore in tutto quindi si fanno i 3 mutanti.
Nell’ immagine CV dx S35C, sx S64C. Questi sonoi risultati sono stati ottenuti in soluzione.Si osserva che la S35C si immobilizza meglio di quella S64C che dovrebbe avere lasuperficie esposta maggiore. La serina 64 ha una struttura
molto simile ma ha una variazione della posizione dell'anello dell'FMN, guardano la catena laterale della serina nel WT è rivolta verso l'esterno, quella della cisteina del mutante è verso l'interno. Questo porta ad una variazione della superficie esposta. La serina 35 ha una variazione del backbone che cambia il suo orientamento: passa da puntare verso l'esterno a puntare verso l'interno, questo porta a non avere una superficie esposta. Lo zolfo è più idrofobico dell'ossigeno e quindi tende ad andare verso ambienti idrofobici rispetto all'ossigeno.
Si vede quindi la CV del p450 con la flavodossina e si ottengono dei picchi e si guarda anche la quantità di prodotto che si forma sull'elettrodo. A parità di condizioni con il complesso si ha la produzione di 10x di prodotto.
Questo è stato ottenuto ingegnerizzando a due livelli:
- A livello della proteina: a livello del loop a cui si lega il gene
Della flavodossina con il gene del P450 e a livello dell'introduzione dicisteine sulla superficie della flavodossina.- A livello dell'elettrodo in quanto la cisteina è legata alla maleimide, che è legata ad uno spacer con un gruppo tiolo che lega l'elettrodo. Se si immobilizza la flavodossina direttamente non c'è risposta in quanto probabilmente si denatura. Nella proteina, nel caso del p450 umano è stato togliere la parte n-term che lega la proteina alla membrana e legarlo alla flavodossina. In questo modo si ottiene un complesso simile a quello visto prima (con p450 batterico). Si hanno 2 possibilità di complessi per il p450 umano: essere legato all'FMN oppure essere legato a tutto il BMR (tutta la reduttasi del p450 BMR). Quello che funziona meglio è il primo, p450+FMN, in quanto probabilmente l'aggiunta di un altro dominio invece di aiutare aumenta la complessità e rende più difficile il funzionamento.
sull'elettrodo. Ingegnerizzazione sull'elettrodo. Viene aggiunta per prima la cistamina che è un dimero con un legame S-S. Questo legame si rompe e il tiolo reagisce con l'oro dell'elettrodo e lascia scoperto un gruppo amminico. Questa reazione avviene nel giro di 15 minuti ed è spontanea. Successivamente si aggiunge la maleimide che da un lato reagisce con il gruppo ammidico e si lega covalentemente all'elettrodo con l'eliminazione di un gruppo ciclico. Quindi si ha un gruppo reattivo della maleimide capace di reagire con la cisteina della proteine. Si rompe il doppio legame e si forma un legame tra carbonio della maleimide e lo zolfo della cisteina della proteina. Si può fare un confronto sulla risposta del P450 umano legato a vari tipi di elettrodo. Si vede che sull'elettrodo di carbonio vetroso risponde sulla superficie ma non così bene, guardando non alla corrente ma alla concentrazione di prodotto, eritromicina, che.Siforma sull'elettrodo. Il p450-BMR da una risposta migliore sull'elettrodo d'oro. Ancorameglio si ha quando si utilizza una chimera tra il p450 umano (CYP3A4) e flavodossina. La flavodossina funziona meglio sia sul carbonio vetroso sia sull'oro.
Il passaggio successivo è stato passare ad un sistema più maneggiabile in modo che ci siano dei pozzetti sul fondo dei quali si abbia un elettrodo stampato, un controelettrodo e al centro il working electrod d'oro. In un sistema di questo tipo si hanno 8 celle elettrochimiche in parallelo dove si possono dare 8 esperimenti. Si ottengono quindi i risultati da questo chip in parallelo. Questo può essere anche esteso dagli 8 standard di un ELISA, ad un sistema con più pozzetti. Questo comporta anche una maggiore complessità del sistema che deve permettere tutti questi contatti.
Esperimenti. Si possono ottenere dei grafici di intensità di corrente in correlazione con concentrazioni di metaprololo.
substrato del CYP2D6. Da questo si può calcolare la KM elettrochimicamente. In letteratura la KM in soluzione è 40 microM mentre elettrochimicamente si ha 39.8 microM, quindi il range è quello giusto. Si può quindi vedere se un inibitore si lega portando via corrente catalitica alla reazione enzima+substrato portando ad un abbattimento della corrente. In questo modo si dovrebbe poter misurare l'IC50. Quando con un substrato a concentrazioni maggiori si aspetta un aumento della corrente, nel caso di un inibitore la corrente varia su un valore di base intorno a zero, sostanzialmente non c'è risposta. Se si aggiunge inibitore in presenza del substrato, quinidina (I) con il metaprololo (S), si vede che aumentando la concentrazione di quinidina si abbatte la corrente dovuta al substrato. Con una conc
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