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Ingegneria metabolica delle piante

Appunti di Ingegneria metabolica delle piante basati su appunti personali del publisher presi alle lezioni della prof. Bracale dell’università degli Studi Insubria Como Varese - Uninsubria, facoltà di Scienze matematiche fisiche e naturali - Varese. Scarica il file in formato PDF!

Esame di Biotecnologie vegetali docente Prof. M. Bracale

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ESTRATTO DOCUMENTO

un uptake di ferro questo viene chelato. La NA è ubiquitaria nelle piante

superiori, quindi si trova in tutte le cellule ed è una componente essenziale

dell’assimilazione del ferro e della sua omeostasi. Quindi si vede se si può

esprimere NA!

La NA è prodotta da un gene che è la nicotianamina sintasi, la via parte dalla

metionina -> la metionina tramite SAM sintasi viene trasformata in SAM (S-

adenosil-L-metionina) e da questa si ottiene NA tramite NAS. Si ha questa

reazione si terreni poveri di ferro proprio perché così aumenta il trasporto. In

realtà questo pathway è immerso in un pathway molto più complicato.

Overespressione del NA in riso

In questo caso sono stati individuati due geni OsNAS1 e OsNAS2 (Os sta per

riso), questi due geni sono inducibili quando si è in carenza di ferro nel terreno,

sono localizzati sullo stesso cromosoma nel riso (ridondanza funzionale). Ma c’è

anche un altro gene OsNAS3 che ha un comportamento diverso: quando manca

il ferro la sua espressione è indotta nelle radici, ma non nelle foglie (non si sa

ancora il perché). Quello che è stato fatto è che i geni sono stati messi

separatamente sotto un promotore costitutivo e terminatore, poi 35S + gene

per la selezione + promotore. 3 costrutti per i 3 geni, ogni gene viene messo

su un costrutto diverso. Si misura la quantità di ferro:

Wt semi di 3 piante: seme con tegumento 22 μg/g Fe, nel seme senza

 tegumento 4.5 μg/g

NAS1 30 piante: seme con tegumento 47 μg/g Fe, seme senza tegumento

 9.7 μg/g

NAS2 39 piante: seme con tegumento 64 μg/g Fe, seme senza tegumento

 19 μg/g

NAS3 24 piante: seme con tegumento 51 μg/g Fe, seme senza tegumento

 9.9 μg/g

Conclusione: anche lavorando invece che sullo storage sul suo trasporto mostra

un potenziale.

Esperimento sui dei topi messi a dieta di ferro per 2 settimane: durante queste

settimane sono stati fatti dei prelievi e si sono viste delle carenze di ferro. Il

gruppo anemico è stato alimentato con semi di riso wt e semi di riso

transgenici per 4 settimane -> durante questa 4 settimane si sono fatti 3

controlli. La quantità di ferro nei topi aumentava. Conclusioni: questi semi di

riso che contengono un maggior contenuto di fero sono efficienti per la

deficienza di ferro in topi. Sono stati fatti degli esperimenti sull’uomo con

risultati positivi, anche se non sono risultati così eccezionali. Non è detto però

22

che le condizioni ottimali che abbiamo in serra le abbiamo anche nel campo, la

pianta può essere sottoposta a stress in questo passaggio. Articolo: si mettono

assieme questi 2 approcci, da questo si dovrebbe ottenere un seme ricco di

ferro.

Costrutti con la possibilità di diversi promotori: pr1 e pr2 e pr3.

Il numero di piante e di eventi è molto grosso, per fare un’analisi bisogna fare

degli screening molto veloci. Bisogna porsi la domanda: di tutte queste

piante ce ne sono alcune in cui il contenuto di ferro è maggiore? È

possibile visualizzare velocemente il contenuto di ferro con uno substrato che si

chiama blu di Prussia che colora velocemente i tessuti contenenti ferro. Quando

ci sono tutti e due i geni ho la % più alta. Quanto è il contenuto di ferro?

Limitandoci alle piante dei vari gruppi che però hanno una performance di ferro

maggiore, mediante un’analisi non solo colorimetrica (stima qualitativa) serve

anche un’analisi quantitativa. Il ferro è un metallo e si può dosarlo con la

spettrometria di emissione. Il controllo nullo è una pianta che è stata

trasformata con un costrutto in cui manca solo il gene di interesse, è questo il

vero controllo, perché la wt non ha subito tutte le fasi di trasformazione al

contrario di una pianta trasformata, nella maggior parte dei casi inserisco

soltanto la resistenza. Nel wt il peso secco del ferro è di 2 microgrammi nel

seme brillato. Nel caso dei semi trasformati il contenuto di ferro aumenta di

circa 5/10 volte.

Nelle prime fasi della prova in campo si studia come si comporta la pianta, la

valutazione agronomica ha mostrato che non vi è alcun problema di resa da

parte del NAS FER274 mentre il NAS FER 234 ha mostrato una minor resa

quant’è

rispetto all’IR64 e al controllo nullo. Su queste piante, cresciute in terra

il contenuto di ferro? Il contenuto di ferro si mantiene sostanzialmente uguale,

queste piante si dimostrano migliori rispetto alle wt o al trasformato nullo.

Si va a vedere anche il contenuto di zinco; i trasportatori di metalli nelle piante

non sono specifici, quindi se aumento la concentrazione di un trasportatore e

aumenta la concentrazione del ferro mi posso aspettare che aumenti anche la

concentrazione di altri metalli. Lo zinco è un metallo essenziale, il contenuto di

zinco aumenta.

Questi due eventi (274 e 234) sono stati incrociati con varietà di riso che

vengono consumati nelle Filippine, in Indonesia e nel Bangladesh. Primo

incrocio: sono stati mescolati i due genomi, succede che il genoma di élite (C,

quello più consumato) si mescola a caso con il T e si ottiene il T1 che non ha le

Come

stesse qualità di C. io in realtà vorrei il genoma di C più il transgene.

faccio ad eliminare la parte del genoma che non mi interessa e tengo solo il

gene di interesse? Incrocio la T1 con il C e ottengo T2: hanno più genoma di C e

meno genoma di T. Continuando ad incrociare sempre con C e cercando di non

23

perdere il transgene si fa quella che si chiama pulitura del background

genetico. Il contenuto di ferro dei semi T2 è stato valutato con spettrometria,

per vedere la stabilità del tratto, perché negli incroci successivi questo tratto

potrebbe essere perso dato che viene inserito forzatamente. C’è un

abbassamento della quantità di ferro, ma è una leggera riduzione che era

prevista perché i grani polished che derivano dagli incroci sono grani derivati

Cosa vuol dire?

da parenti eterozigoti. Quando raccolgo i semi della T2 non ho

solo geni per il carattere transgenico, ho semi che possono portare anche

caratteri in eterozigosi. Quando ho un risultato soddisfacente vado a fare

l’autoimpollinazione e scelgo gli eterozigoti.

In questo riso, il contenuto di ferro è biodisponibile? Utilizzo le cellule

Caco-2, alle quali somministro il ferro e

se le estraggo noto un aumento di

ferritina, questo è un buon indice della

presenza di ferro e della sua

assimilazione. Si prendono le cellule, se

riescono ad assimilare il ferro che si dà nell’estratto allora si può dire che

questo ferro è biodisponibile e si vede un aumento di ferritina.

APPROCCIO 3

È basato sempre sul trasporto del ferro, il gene è OsYSL2, il mutante di questo

Perché?

gene ha delle strisce gialle. Perché è un gene coinvolto nell’uptake di

ferro e quando mutato l’uptake di ferro non è ottimale e quindi l’apparenza

della pianta mutata presenta delle strisce gialle, non c’è la clorofilla perché non

c’è abbastanza ferro. Il gene codifica per un trasportatore, ci sono 8 membri di

Arabidopsis)

questa famiglia (in e 14 in riso ed è una proteina della membrana

plasmatica. È un trasportatore, ma non un trasportatore come il gene NAS, è

un trasportatore della membrana, è all’interno della membrana plasmatica. Si

esprime principalmente nelle cellule del floema, ma anche nei semi in sviluppo.

È un gene inducibile, quando c’è carenza di ferro, quando la pianta non riesce

ad assorbire abbastanza ferro dal terreno il trasportatore viene sintetizzato dal

gene. L’overespressione può aumentare la concentrazione di ferro, nei grani

ripuliti, ed è richiesto un gene funzionale per produrre semi contenti ferro.

Per dimostrare che un gene è necessario, come si può fare? Faccio delle piante

con il costrutto con RNAi, RNA interference.

Nel 1990 si è cercato di overespressione il gene della calcone sintasi (CHS), è

un gene del metabolismo secondario delle piante che però entra nella sintesi di

pigmenti colorati, vie di biosintesi che portano ad esempio alla colorazione del

fiore, scopo vessillifero. Il CHS è l’enzima che fa partire la via metabolica che

porta alle antocianine. C’era lo scopo di determinare l’aumento costitutivo di

CHS portava ad un aumento della pigmentazione, per vedere se questo enzima

24

è un enzima rate-limiting. Ci sono alcuni fiori transgenici più colorati, altri che

presentano delle aree ipopigmentate e in alcuni casi si sono ottenute piante

completamente ipopigmentate. FENOMENO DI CO-SOPPRESSIONE, elevate

quantità di RNAi. Nei fiori bianchi quello che salta all’occhio è che ho

pochissima quantità di transgene rispetto alla quantità riportata nella pianta

con fiori iperpigmentati e non si ha nessuna quantità di gene endogene -> in

alcune piante il transgene induce una soppressione del gene endogeno (RNA

endogeno) che dell’RNA transgenico.

Nel 1998 esce un altro lavoro che riesce a spiegare questo fenomeno.

C. elegans

Studiando si è visto che la mutazione del gene unc-22 comporta uno

scoordinamento dei movimenti. Si è visto che introducendo il gene unc-22 a

singolo filamento senso o anti-senso non portava ad alcun effetto, se invece

viene messo come doppio filamento (il controllo) si ha lo scoordinamento.

L’RNA a doppio filamento è più potente a dare un silenziamento del gene

endogeno rispetto alle 2 trasformazioni singole. Conclusioni: il silenziamento di

un gene è molto efficace quando un RNA doppio strand è iniettato, ma è debole

o addirittura inesistente se è iniettato un singolo filamento RNA, senso o anti-

senso.

RNAi: è un fenomeno fondamentale nella biologia, molto conservato, molto

potente, attraverso il quale doppi filamenti silenziano in modo molto specifico

l’espressione del gene omologo.

Se voglio arrivare a silenziare un gene endogeno per via biotecnologica cosa

devo fare? Devo ottenere un doppio strand di mRNA. Come si fa? La sequenza

di interesse (anche non tutta) viene messe in una direzione e dopo di che la

metto nella direzione opposta; separate da uno spaziatore, ad esempio un

introne, in modo da ottenere senso e anti-senso, l’introne serve per andare a

formare una sorta di forcina. Il tutto lo posso mettere sotto un promotore

costitutivo e serve un MS.

Tutto questo per dire che sono state prodotte delle piante OsYSL2i ->

silenziate! Sono state generate 7 linee transgeniche di riso e l’espressione del

gene endogeno è stato analizzato su foglie di piante T1, non le prime

trasformate ma la prima autoimpollinazione. Quello che si vede (nelle linee 3 e

5) è che il costrutto dà interferenza. Si è fatta crescere la pianta con questo

costrutto in vitro. La linea 5 è stato comparata con il wt (SLIDE)

Quando queste piante sono trasferite nel suolo (wt, 3 e 5), il contenuto di ferro

è più basso nella parte aerea sostenendo quindi che il ferro non è stato

trasportato. Il trasportatore all’interno della membrana resta bloccato nelle

radici, dove si ha un contenuto maggiore. Questo contenuto di ferro non è

traslocato nelle parti aeree e tanto meno nei semi. Se vado a silenziare questo

gene specifico produce delle piante che hanno un contenuto di ferro inferiore,

sembra essere un gene importante, essenziale nel trasferimento del ferro. 25

Si cerca di sovraesprimere OsYSL2, anche se si esprime costitutivamente si ha

una diminuzione del contenuto di ferro nelle radici e nella parte aerea.

Conclusioni: la sua overespressione non fa assolutamente niente. Posso

regolare sotto un controllo di un promotore spaziale/temporale, controllato

diversamente?

Si è pensato di sostituito il promotore costitutivo con un promotore inducibile

seme-specifico. Il gene OsYL2 è stato posto sotto il controllo del promotore

OsSUT1, fondamentale per il trasporto del sucrosio dal floema ai semi. Si va a

vedere la concentrazione del ferro nei semi di riso brillati, piante omozigoti per

il transgene cresciuti in terra. La linea 1 ha una quantità di ferro inferiore alla

linea 18, chiaramente questo dipende da dove si è andato ad inserire il

transgene. Comunque le linee transgeniche hanno una concentrazione

maggiore di ferro rispetto alle wt.

Conclusione è che effettivamente la strategia di utilizzare di volta in volta, a

seconda delle necessità, dei promotori non costitutivi può essere più vincente

rispetto a quella di utilizzare dei promotori costituivi.

Articolo del 2012: idea di utilizzare più geni, sono stati combinati 3 approcci,

Produzione di piante transgeniche per la ferritina

 Per la nicotianamina

 OsYSL2 sotto il controllo di un promotore endosperma-specifico

L’idea è quella di potenziare il trasporto e l’uptake in seme. Il costrutto è

piuttosto grande: gene per la nopalina sintasi (gene marcatore) + gene OsYS2

(trasportatore, sotto un promotore per il trasporto del saccarosio) + ferritina

sotto promotore specifico per il seme + OsYSL2 sotto promotore seme-specifico

+ gene per nicotianamina sintasi sotto promotore forte (promotore costitutivo)

+ gene per ferritina + altre cose.

Anche in questo caso, le piante trasformate con 3 costrutti rispetto alle wt

mostrano una concentrazione di ferro nei semi brillati nella generazione T2

molto maggiore, quindi l’introduzione di geni multipli è molto efficace. Analisi

fatta su semi di piante cresciute in serra. Cosa succede nelle piante

cresciute nel campo? Anche in questo caso c’è un aumento rispetto alla

quantità di ferro del wt, in alcuni casi si raggiunge il quadruplo della quantità,

più o meno lo stesso rapporto che si osserva in serra. La qualità del seme è

simile? Sì è simile a quella delle piante wt. La produzione di piante

transgeniche con geni multipli, sebbene sia più complicato a monte, a valle dà

un buon risultato. 26

APPROCCIO 4

Vorrei avere delle piante che assorbono più ferro in quanto nel terreno ce n’è

molto, perché è un costituente del suolo, rappresenta in peso il 5% del suolo,

ma c’è una poco percentuale di ferro libero, la maggior parte è ferro non

solubile, soprattutto vero nei suoli basici, calcarei. Questi rappresentano la

maggior parte dei suoli coltivabili, arabili, circa il 30% del suolo nel mondo. Il

ferro libero ha una concentrazione molto inferiore rispetto alla quantità

necessaria per le piante per vivere. Il problema per la pianta è quello di

assorbire il ferro libero e di avere accesso al ferro non solubile. Le piante hanno

sviluppato due strategie.

Strategia 1

È tipica delle dicotiledoni e di alcune monocotiledoni tranne i cereali. Il ferro è

legato soprattutto in terreni basici, quindi l’idea è quella di acidificare. La

rizosfera = parte del terreno intorno alla radice. Dalla cellula si ha estrusione di

protoni nella rizosfera per acidificarla, si ha questa estrusione grazie all’attività

di un’ATPasi legata alla membrana. Da ferro 2 si passa a ferro 3, ma questo non

può entrare direttamente, la membrana non è permeabile al ferro 3, per questo

è legato e viene reso solubile attraverso molecole che lo chelano. A questo

punto riesce ad entrare nella parete e nella membrana, una volta entrato viene

ridotto a ferro 2 che entra nel citoplasma e la molecola chelante esce nella

rizosfera. La riduzione all’interno della parete è fatta ad opera di una riduttasi,

FRO2, e l’entrata del ferro 2 è permessa attraverso un trasportatore specifico

IRT. Acidificazione + solubilizzazione + chelasi + riduzione + trasporto.

Strategia 2

Tipica delle monocotiledoni graminacee, l’idea è la sintesi dei cosiddetti

fitosiderofori, piccole molecole (TOM1) che vengono estruse, che hanno peso

molecolare intorno ai 300 kDa e hanno dei gruppi funzionali che chelano il

ferro. Ci sono dei trasportatori specifici, all’interno il ferro 3 viene trasformato in

ferro 2 all’interno del citoplasma. Si producono delle molecole specifiche che

chelano il ferro 3 (non può entrare nella parete così), grazie ai fitosiderofori

entra nel citoplasma.

I fitosiderofori appartengono alla famiglia del Mas, questa famiglia deriva dalla

via della metionina. Metionina SAMS -> NAS -> NAAT -> Mas (solo le

monocotiledoni hanno questa via). Ma non è vero che tutte le mono hanno gli

stessi fitosiderofori. Nel caso dell’orzo c’è il gene che codifica per l’enzima NAS,

per NAAT e poi ci sono i geni per tutti gli enzimi che partecipano alla via di

produzione di questi siderofori. Per quanto riguarda il riso, si ferma alla

produzione di uno dei fitosiderofori, il riso è più sensibile alla carenza di ferro

dell’orzo e il fatto che l’orzo abbia più una vasta gamma dei siderofori è

pensato come uno dei motivi alla base per il quale l’orzo estrae in modo più

efficace il ferro dal terreno. Motivo per cui il riso è più sensibile alla carenza di

27

ferro rispetto all’orzo. Quindi si è pensato di mettere al riso i geni che non ha, si

sono fatti 3 costrutti, quello più interessante è quello che riguarda il gene IDS3.

Il gene GNAS1 riguarda l’overespressione delle nicotianamina sintasi (più da

controllo) e anche il GNAS1 + GNAAT è un controllo.

Linee transgeniche piantata in campi sperimentali (devono essere fatti con un

certo criterio, devono essere ripetuti, in varie zone, non ci deve essere un

effetto di terra/zona/microclima, le varie parcelle devono essere disposte in

modo corretto), non c’è differenza apprezzabile nella cresciuta e nei semi. La

concentrazione di ferro è leggermente maggior nei semi brown (con

tegumento) e poi nei semi brillati. Conclusione: l’aumento nelle varie piante

transgeniche c’è, non è un aumento esponenziale, perché comunque deve

essere mantenuto sotto controllo, la pianta non può avere una quantità di ferro

esagerata perché all’interno della pianta porta comunque svantaggi.

Approccio 1 + 4: 2 vettori indipendenti.

1. Gene per la ferritina, nicotianamina sintasi, nicotianamina transferasi,

sotto promotore della globulina. C’è LoxP, tra i due siti LoxP ci sono i geni

per la resistenza all’antibiotico, un promotore per l’actina + Cre. Questo

pezzo è una strategia che viene utilizzata per rimuovere tutta la porzione

che è interna ai due siti LoxP, in cui c’è il gene per la resistenza

all’antibiotico.

Un grande problema nelle piante transgeniche è la presenza dei geni per la

resistenza agli antibiotici; essa è indispensabile nelle prime fasi di produzione

della pianta transgenica, tuttavia al termine risulta deleterio sia dal punto di

vista ambientale (gene per la resistenza potrebbe entrare a far parte del

genoma di batteri del suolo, portando alla formazione di ceppi batterici

resistenti), sia dal punto di vista alimentare (consumando alimenti di questo

tipo si potrebbe incorrere nella formazione di microrganismi resistenti

nell’intestino di animali/uomo. Un’altra obiezione è che tutto questo possa

avvenire a livello del nostro apparato digerente. Potrebbe rendere resistenti ad

antibiotici dei batteri patogeni o non. C’è il rischio di trasferimento orizzontale.

Una delle grosse obiezioni riguardava la presenza di questi geni marcatori, geni

di resistenza agli antibiotici nelle piante transgeniche. Quindi si è cercato di

mettere i costrutti senza i marker fin dall’inizio. Una di queste tecniche è il

sistema Cre-Lox: sfrutta una caratteristica che è tipica di alcuni faggi. C’è un

enzima che è una proteina di 38 kDa, è una ricombinasi, riconosce dei siti

specifici (13 bp) e si lega ad essa, e catalizza il cross-over di questi siti che

vengono excisi e si lega il DNA, il tratto exciso viene degradato. Questo sistema

serve a scegliere i suo concatameri durante la replicazione del suo genoma.

Qual è l’idea? Se metto il gene di resistenza alla kanamicina tra due siti Lox e

lo trasferisco in pianta, posso usare questo sistema?

Non ci sono siti Lox nel sistema vegetale, non ci sono siti endogeni LoxP

 28

Per tutto questo sistema serve soltanto la proteina Cre, basta soltanto la

 sua funzione

Come posso fare?

GOI + CRE + LOXP + MS + LOXP -> quando la proteina è espressa e il gene è

indotto -> excisione dell’ultimo tratto compreso MS -> GOI + CRE + LOXP.

Questo sistema che, almeno a priori, potrebbe funzionare per excidere il

marcatore e quindi ottenere delle piante transgeniche che non presentano

problemi. Se tolgo anche CRE, dopo l’excisione trovo -> GOI + LOXP, gene MS e

gene per la CRE vengono tagliati, excisi e persi. Come deve essere il promotore

per la proteina CRE? Deve essere inducibile, o chimicamente inducibile (da

qualcosa che somministro) o inducibile dal calore (si prendono i semi, si

mettono al caldo), così almeno in una parte di questi semi si avrà l’excisione. I

più utilizzati sono quelli chimici, qual è la scelta?

Non ci deve essere un’attività basale endogena perché se no si attiva

 sempre

Deve essere rapidamente inducibile

 Alti livelli di espressione

 Non deve avere effetti tossici sulla pianta

 Deve essere dose dipendente e deve essere reversibile, non deve restare

 nella pianta l’effetto della somministrazione dell’agente chimico

Bisogna somministrarlo in modo semplici, quindi spruzzarlo sulle foglie o

 metterlo su agar

Ottenere un embrione che sia libero dal gene marcatore e quindi una

 pianta che sia ripulita

La cassetta genica deve essere un po’ più complessa, caso da induzione da

etanolo.

Aspergillus nidulans,

In il fattore trascrizionale alcR è attivato da etanolo ed

attiva la trascrizione di altri geni:

1. alcA che codifica per una alcol deidrogenasi (ADHI)

2. aldA che codifica per un’aldeide deidrogenasi (AldDHI)

Tutto questo sistema risponde quando c’è etanolo nell’ambiente. Ma questo

sistema lo posso utilizzare come promotore inducibile non vegetale. La

sequenza del gene ALCR (capace di legarsi a siti specifici presenti sul

promotore alcA) è posta sotto il controllo del promotore forte CaMV 35S; quindi

la proteina ALCR è sempre espressa. Ma il fattore di trascrizione si attiva

soltanto in presenza di etanolo, in assenza di questo non è funzionale. Se do

etanolo il fattore di trascrizione diventa attivo, ma per diventare attivo deve

trovare il promotore a cui questo si lega normalmente e quindi promotore lo

metto a monte. Il gene di interesse deve essere posto sotto un promotore che

non viene riconosciuto normalmente dalla pianta e che è sensibile all’alcol,

siccome il promotore non è riconosciuto dall’apparato di trascrizione vegetale

devo necessariamente aggiungere qualcosa che induce il promotore e questo

29

qualcosa deve essere per forza sotto un promotore che è riconosciuto dalla

cellula vegetale, perché se non lo fosse dovrei aggiungere un altro gene. ALCR

si lega al promotore, se prendo questo promotore e lo metto a monte del gene

di interesse [G o GOI] (poi si mette il terminatore) e se metto questo costrutto

nella cellula vegetale non otterrei nulla perché questo promotore non viene

riconosciuto dalla cellula vegetale. Ma se a monte di questo promotore metto il

gene AlcR (col terminatore) succede che quando il gene viene tradotto e

quando il fattore di trascrizione si attiva questo è in grado di legarsi al

promotore del gene AlcA. Ma il promotore di AlcR come deve essere per

far esprimere il gene? Deve essere il promotore 35S che viene riconosciuto

dalla cellula vegetale.

Il costrutto è composto da due elementi: il gene alcR e il promotore alcA. ALCR

è di origine non vegetale, il fattore trascrizionale ALCR non è in grado di

attivare altri promotori all’interno del genoma della cellula vegetale. L’etanolo

è un buon induttore: non è tossico, è biodegradabile.

CaMV + AlcR + T + promotore AlcA + GOI + T.

Fattori di trascrizione che rispondono a qualcosa di tipo chimico.

I recettori degli estrogeni basati sul sistema XVE (promotore per l’actina) è

regolato e altamente inducibile già da basse concentrazione di estradiolo. XVE

è una proteina di fusione: binding domain e da un attivatore della trascrizione

che deriva da VP16. Quando si attiva si lega al promotore a monte della

proteina Cre e attiva la trascrizione del gene Cre. Ci è cercato di ottenere

piante transgeniche con un maggior contenuto di ferro, ma anche piante senza

il gene per la resistenza. Per quanto mi sforzi non è vero che in tutte le cellule

della pianta sono sicura che avrò l’excisione, quindi ciò che ottengo nel

migliore di casi è una pianta chimerica, non è vero che tutte le sue cellule sono

identiche, alcune deriveranno da cellule ancestrali in cui è stato exciso il gene

per la resistenza e altre deriveranno da cellule che hanno il gene per la

resistenza. Le analisi successive le farò sui semi.

Si è riusciti comunque ad arrivare a delle piante di riso trasformate tramite geni

multipli e sono in condizioni ottimali di ferro e le piante crescono meglio

rispetto alla wt perché sono state fortificate e hanno dei geni per

l’assorbimento di ferro. Conclusione: la concomitante trasformazione dei geni

della ferritina e di IDS3 (sintesi dei fitosiderofori) è efficace.

Metabolismo primario -> A -> B -> C -> D -> E -> Catabolismo

|

F

Se voglio aumentare la quantità di E, prodotto del metabolismo secondario,

posso fare tante cose, ad esempio inibire il suo catabolismo. Posso trasformare

con solo una proteina master che regola contemporaneamente alcuni od

eventualmente tutti i geni che codificano per i vari enzimi della via, se trovo ad

30

esempio un fattore di trascrizione ad i geni che codificano gli enzimi della via,

si trasforma con un solo gene e si ottiene un effetto multiplo, un effetto a

cascata. È una buona strategia.

Invece di andare a sovra o sotto esprimere alcuni geni in un determinato

pathway, si può andare ad agire su fattori di trascrizione che regolano

l’espressione di più geni del pathway in questione (dei master regulator). Ad

esempio: piante knock out per il gene bHLH104 possiedono una alterata

omeostasi del ferro.

Per studiare determinati pathways è molto importante avere dei mutanti

fenotipici. Questi mutanti possono essere utilizzati sfruttando Agrobacterium. Il

T DNA inserito mediante Agrobacterium andrà a inserirsi casualmente

all’interno del genoma di Arabidopsis; può andare a inserirsi all’interno di un

gene (o nel promotore di quest’ultimo) andando a inibire la sua corretta

espressione. In questo caso, il vettore T DNA contiene solamente un gene

marker per la selezione (utile sia per interrompere il gene, sia per selezionare

le cellule trasformate). Dato che l’inserzione non è gene specifica ma casuale,

si provvede a trasformare un gran numero di cellule, al fine di avere la

probabilità statistica di interrompere il gene di nostro interesse e al fine di

introdurre un’interruzione in ogni gene.

Questo processo è noto come mutagenesi T DNA. Arabidopsis possiede un

genoma molto piccolo, contenente piccoli introni; l’inserzione di T DNA

generalmente produce un mutante knock out per un qualche gene. Al termine

si provvede a risalire al gene mutato, a partire dal fenotipo alterato.

Al termine della mutagenesi si provvede a ottenere piante omozigoti per tale

mutazione però alcune mutazioni in omozigosi possono essere però letali; in tal

caso si provvede a mantenere la pianta con la mutazione in eterozigosi.

Tornando al gene bHLH104 -> Si sono ottenuti due omozigoti mutanti per

suddetto gene.

Mediante un northern blot si è verificato il livello di trascrizione; entrambi i

mutanti non esprimono proprio questo gene. Andando ad alterare questo gene,

si dovrebbe ottenere delle variazioni riguardanti l’omeostasi del ferro. Togliendo

il ferro dal mezzo di coltura, i mutanti per questo gene si presentano clorotici e

con minor crescita delle radici, le quali si presentano piccole e poco sviluppate.

Andando ad analizzare il mezzo di coltura, nei mutanti si nota un aumento di

ATPasi per l’estrusione e l’acidificazione di ioni H+, al fine di acidificare il

terreno e migliorare l’assimilazione di calcio (ciò manca nelle piante cresciute

in presenza di ferro). Una mutazione del gene bHLH104 causa quindi una

differente attività delle ATPasi.

Andando ad analizzare l’assimilazione di ferro in terreno alcalino e acido, si

nota che in pH acido il mutante cresce bene e non vi sono differenze dal wild-

type. In terreno alcalino, sia il wild-type che i mutanti entrano in sofferenza

(soprattutto i mutanti). Si è poi over espresso il gene in questione; i mutanti

sovraesprimenti questo gene in assenza di ferro sono piante clorotiche che

31

però stanno meglio rispetto a una pianta wild type cresciuta in mancanza di

ferro. Anche in questo caso si è analizzata l’acidificazione del mazzo data dall’

estrusione di protoni dalla ATPasi; in questo caso si nota una maggior

acidificazione del mezzo vicino alle radici.

Il gene bHLH104 è quindi coinvolto nella regolazione di un gran numero di geni

coinvolti nella omeostasi del ferro. Mediante analisi di questo fattore di

trascrizione, si è scoperto che il fattore bHLH agisce insieme a un secondo

fattore di trascrizione; FIT. Mediante microarray si è inoltre scoperto che questi

due fattori trascrizionali influiscono su numerose attività della cellula oltre

all’omeostasi del ferro.

I metaboliti secondari delle piante

Le piante sono una sorgente di importanti composti, di rilevante interesse per

la medicina, per la cosmetica, per gli alimenti.

Il metabolismo primario riguarda vie metaboliche e molecole prodotte da tutte

le piante (es. pathway fotosintetici, glicolisi, sintesi di aminoacidi, etc.).

Il metabolismo secondario non è strettamente necessario alla vita della cellula

della pianta, tuttavia è necessario per quanto riguarda l’adattamento e risposta

della pianta nei confronti dell’ambiente.

I metaboliti secondari sono prodotti solo da alcune specie vegetali. I metaboliti

secondari servono per: difendersi da patogeni, erbivori, altre piante (molecole

che agiscono a livello del S.N, dell’apparato respiratorio, a livello

digestivo….degli insetti e dei parassiti); questo vale per le piante selvatiche, le

piante coltivate sono state selezionate per non produrre questi composti.

Ciò le ha rese appetibili dal punto di vista agroalimentare ma le ha rese

suscettibili all’attacco di parassiti e insetti; ciò ha reso necessario l’uso di

pesticidi, insetticidi e erbicidi (allelopatia: rilascio di molecole che vanno a

interferire con la crescita di altre piante competitive). Questa

caratteristica propria di alcune piante è molto studiata per creare piante

allelopatiche nei confronti di piante infestanti, in modo da creare delle co-

coltivazioni con piante di interesse agroalimentare e andando così a

risparmiare sull’utilizzo di erbicidi).

Vi sono varie interazioni allelopatiche:

Diretta: le molecole rilasciate dalla pianta A vanno a incidere

 direttamente sulla pianta B

Indiretta: le molecole rilasciate dalla pianta A vanno a agire su

 microrganismi contenuti nel terreno i quali possono attaccare la pianta B

mediante il rilascio di altre molecole nocive.

Diverse piante producono vari composti chimici nocivi e interessanti, ad

esempio il noce nero, il sorgo e l’eucalipto.

Attrazione di insetti impollinatori: produzione di varie molecole olfattive e

 gustative. Queste molecole sono molto grosse e dispendiose dal punto di

vista energetico; sono quindi prodotte solo in alcuni momenti della

stagione.

Protezione da raggi UV

Per concludere, il metabolismo secondario produce molecole fondamentali per

l’interazione della pianta con l’ambiente che la circonda; essi giocano quindi un

32

ruolo fondamentale nella sopravvivenza della specie. Le piante producono un

enorme quantità di metaboliti secondati, suddivisibili in metaboliti nitrogen

containing e without nitrogen. I metaboliti secondari derivano da molecole del

metabolismo primario. I metaboliti secondari sono molto importanti in quanto

molti metaboliti sono sfruttati dal punto di vista commerciale nell’industria

farmaceutica come molecole antibatteriche o anticancro. Una volta scoperto un

nuovo metabolita secondario, si ha il problema di produrne abbastanza per

coprire le esigenze industriali.

Uno dei principali problemi riguarda proprio la quantità in cui i metaboliti

secondari vengono prodotti; essi rappresentano tipicamente l’1% del peso

secco della pianta, inoltre essi vengono prodotti solo in alcune situazioni

particolari, solo in alcune stagioni o addirittura solo in alcune parti della

giornata. Hipericum

Molti metaboliti secondari sono anche tessuto specifici, ad esempio l’

perforatum produce l’ipericina solo in cavità secretorie a forma di ghiandole

traslucenti. Altri sono cellule specifici. Molti metaboliti secondari si trovano

segregati in determinati compartimenti cellulari.

La produzione di metaboliti secondari hanno i seguenti problemi:

Resa bassa

 Estrazione e purificazione molto costose

 Distruzione dell’ambiente e della biodiversità in seguito all’asporto di

 piante interessanti dal punto di vista industriale

Problemi di tipo etico-politico; la maggior parte delle piante interessanti

 sono localizzate in regioni tropicali; le nazioni industrializzate consumano

la maggior parte di questi prodotti derivanti da regioni tropicali

solitamente povere. Si corre quindi il rischio di sfruttare questi paesi

poveri.

Instabilità di rifornimenti causati dalle situazioni politiche di questi paesi

 (solitamente sono situazioni molto delicate)

Al fine di ovviare a questi problemi, si cerca di sintetizzare chimicamente questi

metaboliti secondari (Ad esempio la vanillina). Solitamente in questo modo

vengono prodotte molecole semplici e piccole (vanillina e acido acetilsalicilico).

Nella maggior parte dei metaboliti secondari, ci si trova davanti a composti

molto complessi, impossibili da sintetizzare chimicamente su scala industriale.

L’estrazione di metaboliti secondari utili è una strada percorribile, ma non

sufficientemente redditizia. Un’alternativa è la sintesi chimica del metabolita di

interesse; ciò è fattibile per molecole piccole come la vanillina o l’acido

acetilsalicilico. La sintesi chimica di molecole complesse è molto complicata. La

maggior parte dei metaboliti secondari è caratterizzata da una struttura

complessa e non sintetizzabile mediante procedure chimiche.

Al fine di ovviare a questi problemi si attua la produzione eterologa

(ricostruzione delle vie di produzione dei metaboliti secondari di interesse in

ospiti eterologhi come batteri, lieviti, cellule vegetali e piante più facilmente

33

coltivabili). Per attuare produzione eterologa si deve conoscere il pathway di

produzione del prodotto di interesse.

L’utilizzo e la coltivazione* di piante di interesse per la produzione di metaboliti

secondari sono:

La sostenibilità ambientale

 Alte rese di produzione, soddisfacenti la richiesta industriale

 Qualità ottimale e standard del prodotto

 Selezione di linee di piante maggiormente produttive

 Possibilità di aumentare la produzione mediante tecniche agronomiche

 (somministrazione di determinate sostanze in determinati periodi

dell’anno

(*coltivazione di piante di interesse in terra, al fine di estrarre il metabolita

secondario)

Tuttavia presenta i seguenti problemi:

Problematico per piante con cicli di vita molto lunghi, eccessivi per i

 tempi di produzione industriali

I terreni arabili sono limitati

Il problema dei limitati terreni arabili può essere ovviato mediante l’utilizzo di

colture cellulari vegetali; le cellule vegetali sono ottenibili a partire dai calli.

Questa tecnica presenta numerosi vantaggi quali:

Sintesi di metaboliti secondari in condizioni ambientali controllate,

 indipendenti dalla localizzazione geografica, dalle stagioni e dalle

condizioni del suolo.

Produzione di metaboliti secondari pathogen free (microrganismi e

 insetti)

Produzione “continua”

La produzione di metaboliti secondari in cellule in vitro ha anche dei lati

negativi: la produzione è difficilmente continua, in quanto la coltura in vitro è

condizione di elevato stress per le cellule vegetali. Questi stress possono

influire anche notevolmente sulla produzione del metabolita di interesse a

lungo periodo.

Le cellule indifferenziate in coltura in vitro producono bassissime quantità

 di prodotto in confronto alle cellule differenziate in vivo.

Vi sono problemi tecnici per quanto riguarda aerazione e agitazione delle

 colture liquide di cellule vegetali; essendo più grosse delle cellule

batteriche, sono più soggette a rottura.

Inibizione da feedback: alte concentrazioni di metabolita secondario

 bloccano la produzione di quest’ultimo; questo può essere evitato

mediante la continua rimozione del prodotto

Per migliorare le produzioni di metaboliti secondari si agisce:

Manipolando i vari parametri di produzione (componenti del medium,

 fitormoni, temperatura, pH, luce, dimensioni dei reattori, etc.) 34

Selezionando linee cellulari alto producenti

 Usando differenti tessuti o colture d’organo

Fino a una volumetria di 20 L si utilizzano bioreattori di vetro mentre per

volumetrie più alte si utilizzano bioreattori di acciaio. Ad oggi si utilizzano

anche reattori di plastica (sacche monouso di plastica trasparente).

Ad oggi si utilizzano anche elicitori.

Un elicitore è una sostanza che, quando introdotta in piccola concentrazione in

cellule vive, porta a una determinata e particolare risposta fisiologica. Il

razionale di questa tecnica è che la produzione di un metabolita secondario sia

una risposta difensiva nei confronti di uno stimolo esterno. Molti metaboliti

secondari sono collegati alla difesa della pianta nei confronti dei patogeni.

L’elicitazione è basata sull’utilizzo di un elicitore al fine di ottenere una risposta

della pianta, la quale produrrà di conseguenza il metabolita secondario di

interesse. Gli elicitori possono essere biologici (enzimi e polisaccaridi,

fitochimici prodotti dalla pianta stessa e prodotti in risposta a un danno fisico o

attacco da patogeni come l’acido jasmonico e i suoi precursori) e abiotici

(metalli pesanti, raggi uv, alta salinità, alta o bassa osmolarità, temperature

estreme…)

L’immobilizzazione delle cellule vegetali in coltura risolve il problema del

possibile stress da agitazione. L’immobilizzazione può essere fatta mediante

incapsulazione in capsule di agar o in calcio arginato. L’immobilizzazione può

condurre ad un aumento di produzione (non sempre).

Il papavero da oppio

Dalle capsule mature di papavero da oppio si possono ottenere svariati

metaboliti secondari con attività analgesiche. La capsula matura contenente i

semi viene incisa e l’estratto contenuto in essa (lattice) è caratterizzato dal

contenere alcaloidi. Gli alcaloidi sono una grande classe di molecole che si

possono trovare in variate specie (non solo vegetali ma anche animali come le

rane velenose). Gli alcaloidi sono molto rari (circa il 20% delle piante li

produce), solitamente le dicotiledoni ne producono di più. Gli alcaloidi possono

essere prodotti da tutta la pianta (datura) oppure solo in alcune parti (nelle

foglie nel caso del tabacco, nelle radici nel caso dell’aconito). Con il termine

alcaloidi si intende una sostanza organica di origine vegetale avente gruppi

amminici tali da impartire alla struttura un carattere basico, e dotata di grandi

effetti farmacologici in relazione all'assunzione di piccole dosi di sostanza (p.

es. caffeina, morfina, stricnina). Gli alcaloidi sono composti ciclici (molti

alcaloidi possiedono anelli eterociclici di varia complessità) contenenti un azoto

nello stato negativo di ossidazione. Sono noti centinaia di alcaloidi differenti.

Queste sostanze vengono prodotte:

A scopo difensivo nei confronti di insetti, funghi e erbivori.

 Molecole segnale come regolatori di fattori di crescita

 Molecole di riserva di azoto in caso di necessità

 35

Tuttavia, sfortunatamente, gli alcaloidi sono normalmente prodotti in

bassissime concentrazioni (e quindi sono altamente costosi). Gli alcaloidi sono

utilizzati in quanto hanno proprietà:

Analgesiche (morfina e codeina)

 Trattamenti per overdose (tebaina)

 Anti malarici: quinina

 Anti infiammatori

 Anti microbici

 Broncodilatatori

 Antipertensivi

Sintesi chimica

La struttura di molti alcaloidi rende impossibile l’ottenimento di quest’ultimi

mediante sintesi chimica. Piattaforme di espressione eterologa. La produzione

E.coli S. cerevisiae

per via microbica di alcaloidi è stata sviluppata in o e

costituisce una via interessante di produzione. L’efficienza di produzione di

oppiacei in microrganismi può contribuire a ridurre enormemente il costo di

queste sostanze.

Colture cellulare per la produzione di oppio

Vari alcaloidi sono prodotti in quantità quasi irrilevanti in cellule indifferenziate.

Mediante elicitazione si è provato ad aumentare le rese; questo approccio ha

leggermente migliorato la situazione ma comunque non è ancora sufficiente

per un approccio di tipo industriale.

Ingegnerizzazione dei pathways di produzione

Al fine di utilizzare l’ingegneria genetica, è indispensabile capire come

rigenerare e trasformare la pianta di interesse. Nel nostro caso, il papavero da

oppio è facilmente gestibile e trasformabile in vitro. È altresì importante capire

la via metabolica.

La morfina è prodotta a partire dalla tirosina -> la tirosina è convertita in

reticolina. Questa molecola è utilizzata in svariati pathways metabolici. La

reticolina è convertita in salutaridina e poi in tebaina, il primo composto della

famiglia delle morfine. La tebaina da origine sia alla codeina che alla opivarina,

le quali daranno entrambe la morfina. A partire da questo pathway, la prima

idea è stata quella di sovraesprimere i geni COR (per la codeinone reduttasi),

questi geni catalizzano la produzione di codeina e morfina. Questi geni sono a

valle del pathway di biosintesi della morfina.

La sovraespressione del suddetto gene ha portato a un aumento di produzione

di morfina e codeina come atteso; si è anche avuto un inatteso aumento della

tebaina. L’unica spiegazione possibile a questo inatteso aumento è dato dalla

presenza di punti di controllo e punti a collo di bottiglia per quanto riguarda la

sintesi e l’accumulo di morfina. Nonostante l’utilizzo di un promotore

costitutivo, l’analisi di altri tessuti (oltre alle capsule) non ha portato a nessun

aumento di alcaloidi. Gli alcaloidi sono prodotti sono a livello dei tessuti della

36

capsula; ciò è una buona notizia in quanto queste piante non avranno impatti a

livello ecologico (non aumentando il livello di alcaloidi a livello del suolo).

Questo aumento di produzione è tuttavia insufficiente.

Si provò anche a silenziare i geni COR, mediante l’utilizzo della tecnica

dell’RNAi. Silenziando i geni COR, si è tentato di ottenere l’aumento di altri

metaboliti di interesse come la tebaina. Andando ad analizzare la produzione

mediante Thin layer chromatography, si ha un profilo di produzione di alcaloidi

decisdamente alterato. Nelle piante di controllo si ha la produzione di morfina,

codeina, tebaina e oriparina. Nelle piante che hanno subito RNAi si ha la

produzione di una grossa quantità di reticulina e dei sui derivati metilati

codamina, laudanina e laudanosina. L’RNAi ha quindi causato la produzione di

metaboliti diversi. Sorprendentemente, l’inibizione di geni COR conduce a un

accumulo di reticulina (posta svariati steps a monte del gene COR) anziché di

morfinone. Questo indica la presenza di numerosi controlli a feedback. Questi

risultati quindi sono molto importanti sia a livello applicativo che a livello di

ricerca di base.

L’uso di fattori di regolazione che controllano l’espressione di geni multipli

implicati in diversi steps di un pathway metabolico è stato evidenziato non solo

per la produzione di metaboliti secondari ma anche per metaboliti primari. Essi

possono essere quindi utilizzati per ottenere sovra espressioni di prodotti di

interesse; si può quindi lavorare su questi fattori trascrizionali, tuttavia ad oggi

ne sono noti in numero limitato. Uno di questi pochi fattori di trascrizione è il

TF WRKY1.

WRKY1 è una proteina contenente un dominio zinco dipendente legante il DNA,

esso è coinvolto nella risposta ad elicitori e/o di malattie. Gli elicitori sono in

grado di indurre la trascrizione del pathway di produzione degli alcaloidi; vi è

quindi l’ipotesi che il gene WRKY1 sia coinvolto nella regolazione di questo

pathway nel papavero. Questa ipotesi si è testata mediante sovraespressione

del gene WRKY1 in cellule di callo di papavero. Il risultato finale è che la

sovraespressione del suddetto gene porta a un aumento dell’espressione di

due geni. Il callo transgenico è stato utilizzato per rigenerare l’intera pianta.

Successivamente si è analizzata l’espressione del fattore di trascrizione nella

pianta adulta. L’espressione dello stesso fattore di trascrizione in foglie porta

alla sovraespressione di molti più geni (codificanti sia metaboliti primari che

secondari) di quelli espressi nel callo. Si può notare come sia decisamente

differente lavorare su cellule indifferenziate e cellule completamente

differenziate. Dai risultati della sovra espressione del gene WRKY1 si nota che

l’espressione genica nel callo e nella pianta adulta è molto differente.

L’espressione del gene WRKY1 nel papavero provoca un aumento della

produzione di tebaina molto variabile da linea a linea. La produzione di morfina

non aumenta. Si ha quindi l’aumento di produzione di un intermediario

localizzato più a monte rispetto alla morfina.

Una delle possibili spiegazioni è il fatto che questo TF non interagisca

direttamente con il promotore ma che sia ausiliario nella formazione di un

37

complesso trascrizionale, formato da altre proteine reprimenti eventuali

repressori della trascrizione e altre varie proteine stabilizzanti.

Catharanthus roseus

È molto utilizzata dal punto di vista medicinale in quanto produce la vinblastina

e la vincristina, molto utilizzate dal punto di vista di farmaci anticancro. Questi

due farmaci agiscono a livello dei microtubuli (si legano ai dimeri di

microtubulina, interferendo con la sintesi dei microtubuli e andando a

interferire con la divisione cellulare); sono farmaci antimitotici utilizzati in

svariate tipologie di tumori. Queste molecole hanno un’altissima richiesta,

tuttavia vengono prodotte in bassissima quantità in un pathway molto

complicato comprendente 35 intermedi, 30 enzimi, 30 geni e 2 geni regolatori.

Alcuni geni non sono tutt’ora noti. Queste molecole possiedono una struttura

molto complicata la quale rende impossibile una eventuale sintesi chimica.

Inoltre, al momento, la sintesi eterologa non è una via percorribile in quanto

alcuni geni del pathway non sono state ancora caratterizzati. Ad oggi si

procede mediante semisintesi, a partire da molecole prodotte dal pathway.

Inoltre, si cerca di coltivare il Catharanthus, nonostante questa pianta abbia

delle particolari richieste nutrizionali, di terreno e climatiche. Potrebbero essere

coltivati in serre ma il costo dell’intero processo per l’ottenimento dei due

alcaloidi di interesse sarebbe comunque troppo elevato. Si è quindi provato a

riprodurre le cellule di Catharantus in coltura cellulare, al fine di ottenere

colture cellulari producenti alcaloidi di interesse.

Al fine di aumentare la produzione sono stati:

Screenate linee cellulari alto producenti

 Ottimizzate le condizioni di coltura

 Utilizzati diversi elicitori

Tuttavia, in vitro, i due alcaloidi di interesse sono comunque prodotte in

bassissime quantità oppure non vengono neppure prodotti in linee cellulari

indifferenziate. Si è quindi pensato di aumentare la produzione di queste due

molecole mediante ingegneria genetica, utilizzando Agrobacterium

tumefaciens e il suo parente Agrobacterium rhizogenes. A.rhizonegens

possiede solo i geni per le auxine, le infezioni di questo microrganismo causano

la produzione abnorme di radici deformi. Il pathway per la produzione di

vincristina e vinblastina, oltre a essere molto complicato, è anche

compartimentalizzato in differenti cellule. La produzione dei vari intermedi è

fatta da diverse tipologie cellulari di tessuti differenti; gli enzimi dei primi

passaggi del pathway (str e tdc) sono ad esempio presenti solo a livello delle

cellule dell’epidermide.

Inoltre si assiste una compartimentalizzazione anche a livello subcellulare;

alcuni passaggi sono limitati nel cloroplasto, altri nel citoplasma, altri ancora

nel vacuolo. Con il passare degli anni si è scoperto che il cloroplasto è ancora

più fondamentale di quanto si pensasse; esso sente le alterazioni di luce, è

fondamentale per la segnalazione per la protezione dall’attacco di patogeni e di

38

ROS (questi segnali partono dal cloroplasto e vanno ad altri organuli cellulari;

questa è la segnalazione retrograda). Queste varie compartimentalizzazioni

della produzione di vincristina e vinblastina rende molto complicata la

produzione di queste molecole. Una delle prime cose fatte è stata quella di

sovraesprimere il gene G10H geraniol-10-idrolasi. Questo ha portato a un

aumento della produzione di geraniolo; si è anche ottenuta una

sovrapproduzione della catarantina, un precursore presente molto più a valle

rispetto al geraniolo. Si è anche sovraespresso il gene DXS (1 deossi D xilulosio

5 fosfato) presente a valle del gene G10H. In questo caso si è otttenuta la

sovrapporduzione di numerosi composti a valle del pathway. Inoltre si ha una

diminuzione del composto tabersosina. Si è quindi provvisto alla

sovraespressione di entrambi i geni, ottenuto un quadro differente dalla

semplice somma delle due sovraespressioni; si è ottenuta una maggior

quantità di alfalicina, serpentina e tabersosina.

I geni ORCA

Il metil jasmonato e gli elicitori purificati sono in grado di indurre una risposta

nei confronti dei patogeni. Simulando la presenza di un patogeno mediante la

somministrazione di queste sostanze, si ha l’induzione di numerosi geni

appartenenti a pathways per la produzione di metaboliti secondari. Da un

northern blot si ha che i geni str e tdc sono indotti dal MJ e dagli elicitori

purificati.

Si è provvisto quindi a identificare i geni risposta al MJ nel promotore str. Dato

che il gene str risponde al MJ, il suo promotore conterrà una JARE (jasmonate

responsive element).

Come è possibile identificare questo elemento?

Si procede “togliendo” pezzi di promotore e andando a mettere sotto il

controllo di quest’ultimo un gene marker rilevabile facilmente (come la GFP). In

seguito si è anche fatto un northern blot, al fine di verificare la trascrizione e

l’entità di quest’ultima. In questo modo si può rilevare la regione promotore (si

annulla l’espressione genica) e gli eventuali enhancer (in questi casi si assiste a

una riduzione dell’espressione genica). In seguito si è provvisto a

sequenziamento di queste regioni e si è provvisto a isolare le proteine leganti

queste sequenze. Queste proteine sono codificante da geni definiti ORCA1 e

ORCA2. Questi geni codificano per fattori di trascrizione sensibili al jasmonato.

In seguito si è provvisto a confermare il fatto che le proteine ORCA si legassero

al tratto di DNA corrispondente al promotore mediante Electrophoretic mobility

shift assay (EMSA). Il test EMSA conferma che le proteine ORCA1 e ORCA2 si

legano al tratto di promotore identificato in precedenza.

I prodotti dei geni ORCA1 e ORCA 2 si legano specificatamente alle JARE del

gene str. Si è provato ad overesprimere i geni ORCA. Le cellule sono state co-

trasformate transientemente con due costrutto:

Il primo costrutto conteneva un gene reporter (GUS) sotto il controllo del

 promotore del gene str.

Il secondo costrutto era variabile (si sono fatti diversi costrutti, per un

 totale di 4): 39

Costrutto con promotore forte CAMVe gene ORCA 1 in orientamento

o senso e antisenso

Costrutto con promotore forte CAMV e gene ORCA 2 in

o orientamento senso e antisenso

I geni antisenso sono utilizzati come controlli. Risultati:

Il gene ORCA 1 senso non ha un effetto sull’espressione nei confronti del

 gene marcatore.

Il gene ORCA 2 senso ha un effetto di sovraespressione nei confronti del

 gene marcatore.

I geni antisenso ORCA 1 e 2 non influiscono sull’espressione del gene

 marcatore.

In seguito si è andato a verificare la sensibilità dei fattori trascrizionali ORCA 1

e 2 nei confronti dell’acido jasmonico. Le cellule di cataranto sono state

esposte al metil jasmonato e ad altri elicitori; in seguito si è andato ad

analizzare la presenza di mRNA mediante Northern Blot. Nel caso di ORCA 1,

non vi è differenza tra controllo e campione trattato con metil jasmonato; la

trascrizione del gene ORCA 1 non è quindi attivato da metil jasmonato. Nel

caso di ORCA 2, in seguito al trattamento con metil jasmonato, si ha una rapida

induzione del gene ORCA2. Nel caso di ORCA 2, si è anche verificata

l’espressione di STR. Il picco di espressione del gene ORCA2 è seguito da un

picco di espressione del gene STR. Il gene ORCA 2 quindi lega il promotore di

str, causando l’espressione dell’omonimo gene.

In seguito si è provvisto a indagare a cosa avrebbe condotto la

sovraespressione del gene ORCA 2; oltre all’espressione di STR, il gene ORCA 2

causa l’attivazione di numerosi geni codificanti enzimi importanti nel pathway

di produzione della vincristina e della vinblastina. In seguito alla

sovraespressione di ORCA 2 si ottiene a un aumento di triptamina (aumento

atteso) ma porta anche a una inattesa diminuzione della produzione di

secologanina. Questo è la presunta causa della diminuzione della quantità di

tabersonina. I livelli di serpentina e di catarantina sono aumentati.

Ciò che conta è che nonostante tutti questi aumenti e diminuzioni, non si ha

nessuna influenza sui prodotti finali vincristina e vinblastina. Da questi cali e

aumenti, si nota che il fattore di trascrizione ORCA 2 è un master regulator, il

quale modula in modo complesso l’interno pathway metabolico, aumentando la

produzione di alcuni intermediari e nel contempo diminuendo degli altri.

Oltre a ORCA2, ci sono ulteriori fattori di trascrizione che possono essere testati

(ZTC1, 2 e 3). I fattori di trascrizione ZTC sono dei repressori del pathway. Si è

testato il caso in cui la sovraespressione del gene ORCA 1 portasse alla

sovraespressione dei geni ZTC1 ,2 e 3.

Ciò è vero; questo può spiegare i livelli alterati della produzione di metaboliti.

Si è operata la stessa cosa per il gene del pathway TDC. Come fatto per STR, si

è andato a identificare i fattori di trascrizione che regolano questo gene.

L’identificazione del fattore di trascrizione di TDC è stata fatta mediante

activation tanning. Nel costrutto utilizzato in questa tecnica sono stati inseriti 4

promotori forti 35S. Suddetto costrutto è stato inserito nel genoma delle piante

40

mediante trasformazione con Agrobacterium. Questo costrutto può causare una

forte attivazione dei geni disposti nelle vicinanze del sito di inserzione del

costrutto; ciò perché contiene ben 4 promotori forti. In questo modo si è

cercato di inserire più volte questo tipo di costrutto, in modo da ottenere

almeno una volta la sovraespressione di ogni gene in Arabidopsis.

Nel costrutto sono presenti anche geni per la resistenza all’ampicillina,

all’igromicina e una origine di replicazione. Una delle due resistenze è utile per

la selezione dei trasformati, l’altra ci permette di isolare il gene contiguo al sito

di inserzione. Si agisce nel seguente modo; in seguito all’inserzione si provvede

a estrarre il genoma e a digerirlo; in questo modo si provvede a creare un

segmento di DNA circolare contenente l’origine di replicazione e i geni per la

resistenza. Si costruisce quindi una library in E.coli e si opera la selezione al

secondo antibiotico (quello per isolare il gene continuo al sito di inserzione). In

seguito si estrae il plasmide, si procede mediante PCR e sequenziamento e poi,

mediante metodi bioinformatici, si capisce dove si è inserito il plasmide.

Diverse linee di cataranto è stata trasformata nel seguente modo, al termine si

è andato a investigare in quante linee vi era una sovraespressione del gene

TDC. L’espressione aumentata del gene TDC potrebbe essere causata da

un’inserzione del costrutto causante sovraespressione a monte (per i nostri fini

non sono rilevanti) del gene TDC oppure a monte del gene del fattore

trascrizionale attivante la trascrizione del gene TDC (quelli che ci interessano).

Si è trovata una open reading frame (un gene), la quale è stata chiamata per

analogia ORCA3.

Suddetto gene (il suo cDNA) è stato sovraespresso in cellule di cataranto. Si è

andato a fare un northern per verificare la sovra-espressione del gene ORCA e i

geni sovraespressi a causa di ORCA3.

Dal northern si nota che il fattore di trascrizione attiva un gran numero di geni,

tra cui TDC, STR, D4H. Il gene G10H non è attivato.

A livello di produzione di metaboliti, si ha un aumento di triptamina, di

strictosidina e di serpentina (un ramo del pathway). La produzione di loganina

rimane inalterata (l’altro ramo del pathway). Non c’è nessun effetto sui

metaboliti di interesse, ovvero vincristina e vinblastina. Da ciò si può notare

che l’aumento dei metaboliti di un solo ramo del pathway non conduce a nulla;

i metaboliti di entrambi i rami devono essere sovraprodotti. Questi pathways

non sono solo quindi molto complessi già di per sé ma hanno anche una precisa

localizzazione tissutale e cellulare. Per concludere, anche in seguito a ulteriori

studi, il modello di attivazione precedente (ORCA 2 agisce sia sui geni

biosintetici sia sui repressori) si complica. Infatti, mediante northern, si è visto

che ORCA2 attiva ORCA3, il quale può interagire o con i geni biosintetici o con i

geni repressori. Questo pathway è decisamente più complicato rispetto a quello

ipotizzato in principio.

Il fosforo è un nutriente essenziale per la vita. Il fosforo è soprattutto prodotto

in Marocco, ma anche in Cina, USA, Sud Africa. Il fosforo è necessario per la

crescita delle piante. Lo sfruttamento delle regioni produttrici di fosforo

potrebbe portare a un minor utilizzo di questo elemento, ciò potrebbe avere

ripercussioni anche a livello agricolo. Durante la crescita e lo sviluppo, i semi

41

accumulano fosforo sotto forma di acido fitico (mioinositolo). Questa molecola

rappresenta circa il 2% del peso secco dei semi e rappresenta circa il 70-80% di

tutto il fosforo presente nel seme. Durante la germinazione, questo deposito di

fosforo è utilizzato per la crescita. L’acido fitico possiede molte cariche

negative date dal fosforo, ciò causa la chelazione di acido fitico con metalli

carichi +, come lo zinco. L’acido fitico può essere degradato dalla fitasi, la

quale rende disponibile il fosforo, sotto forma di fosfato. L’enzima fitasi è

prodotta da batteri presenti nella rizosfera (parte del terreno vicino alle radici).

Gli animali monogastrici (noi compresi) non possiedono la fitasi e quindi non

riescono a digerire questa molecola. Il fosforo deriva da piante morte, le quali

verranno degradate. Il fosforo viene assorbito e accumulato da piante vive, le

quali possono utilizzarlo o immagazzinarlo nei semi. I semi possono anche

essere utilizzati come fertilizzante in quanto nel terreno sono presenti batteri

che metabolizzano l’acido fitico. Oltre al fosforo ambientale, è necessario

introdurre nel terreno fonti di fosforo. Queste aggiunte, se eccessive, possono

portare a fenomeni di eutrofizzazione, con pesanti conseguenze per gli

ecosistemi acquatici.

L’acido fitico è un anti-nutrizionale in quanto, a causa delle se proprietà

chelanti, può causare la diminuzione dei nutrienti essenziali.

L’acido fitico è funzionale per le esigenze dei semi in germinazione ma non è

controproducente sia perché è un fattore anti-nutrizionale sia perché quando

escreta con le feci degli animali provoca una serie di danni ambientali fra cui il

proliferare di alghe nel mare con fenomeni di eutrofizzazione. L’acido fitico lega

non solo il fosfato ma anche gli ioni carichi positivamente fra cui il magnesio e

anche il ferro. Non solo quindi c’è un problema di scarsa assunzione del ferro

ma c’è anche un problema di sottrazione del ferro dal tratto digerente. Una

strategia diversa è quella di agire a livello di acido fitico, ottenere degli alimenti

che hanno meno acido fitico.

Una delle strategie che viene usata è quella di aggiungere delle fitasi

microbiche per esempio ai mangimi. Il fitato lega nel seme fosforo e altri

minerali però una volta che il seme inizia il suo sviluppo si attiva un enzima che

è detto fitasi che degrada il fitato e permette la liberazione degli ioni che

diventano disponibili alla crescita e allo sviluppo del seme che non è ancora in

grado di assumerli dal terreno. Se quindi si aggiungono le fitasi ai mangimi gli

animali possono mangiare fitato e ridurre il fitato escreto -> vantaggio

nutrizionale ed ecologico.

Un’altra strategia è quella di ottenere degli animali che abbiano già la fitasi:

enviropig, sono dei maiali transgenici ingegnerizzati con il gene per la fitasi

E. coli,

derivante da questo gene è espresso poi a livello delle ghiandole

salivari. Questo è stato messo a punto da ricercatori canadesi. Un altro

approccio è quello di ridurre la quantità di fitato nei semi, il fitato comunque è

importante per la pianta soprattutto per la germinazione quindi bisogna essere

42

consapevoli che se si va a ridurre il fitato dei semi dobbiamo aspettarci delle

piante che germinino con un minor vigore. Devo fare dei mutanti: mutanti

naturali o mutanti per mutagenesi indotta (agenti chimici, raggi X) o per

ingegnerizzazione (si agisce lungo la catena di produzione del fitato o

aumentando il livello di alcuni enzimi o silenziando il livello di geni che

codificano per altri enzimi). Ci sono due approcci: o aumento il livello di fitasi o

diminuisco il livello di alcuni geni che fanno parte del pathway di produzione

cercando però di mantenere il più possibile il pathway integro perché è molto

importante per la fisiologia della pianta.

I mutanti naturali sono stati fatti dei semi con una quantità normale di fosforo

ma con una quantità ridotta di acido fitico. Se diminuisco la quantità di fitato

lpa,

aumenta la quantità di fosforo libero. Il lavoro è stato fatto su mais -> poi

in riso e in altre piante. Isolamento di mutanti, osservazione e analisi della

quantità di fitato seguito dai metodi del breeding, incrocio il mutante e vado a

lpa.

vedere nella progenie quelli con caratteristiche migliori di NESSUN

APPROCCIO GENETICO. La riduzione Questi semi sono stati somministrati agli

lpa

animali e il livello di fosforo con danni ecologici è diminuito. Questi mutanti

hanno un’aumentata disponibilità di ferro, zinco e calcio. Qual è la difficoltà? È

che nonostante il contenuto di fosforo e degli altri minerali siano mantenuti ad

alti livelli però ci sono delle cattive performance a livello germinativo.

L’emergenza della parte aerea e della radichetta, la tolleranza allo stress della

pianta e la quantità e la qualità dei semi prodotti non fittavano le richieste a

livello agronomico, la pianta ne soffriva.

Mutanti transgenici soprattutto su riso, sono stati identificati alcuni geni che

fanno parte del pathway che porta all’acido fitico. Questo pathway è molto

complesso, comprende il mio-inositolo, è un carboidrato che gioca un ruolo

importante nell’economia della pianta perché è coinvolto in tantissimi processi:

metabolismo secondario della pianta, nella trasduzione del segnale

(fondamentale), nella biogenesi delle membrane e del traffico vescicolare,

fondamentale per la formazione dell’embrione, per la regolazione genetica, per

la risposta a stress abiotici e biotici; entra come cofattore di molte proteine. Se

vogliamo agire su questo pathway dobbiamo cercare di mantenere il livello di

mio-inositolo il più invariato possibile.

La prima cosa che è stata fatta è agire a livello dell’IPK1 (chinasi) che agisce in

fondo alla catena che dal mio-inositolo arriva all’acido fitico. Questo è stato

silenziato usando un costrutto RNAi, questo forma un messaggero a forma di

harpin, non è stato osato un promotore costitutivo ma dell’oleosina 18 che è

seme-specifico. C’è anche il gene della resistenza sotto un promotore della

ubiquitina di mais (promotore di un gene housekeeping, quindi forte). Fra le

piante positive (al marcatore) screenate, 14 piante T0 hanno dimostrato un

elevato livello di fosfato e sono state selezionate. Quelle che fra queste 14

perché?

erano le migliori sono state ulteriormente selezionate, Per poter

43

arrivare dalla generazione T0 alla T1, queste piante sono state cresciute in

serra fino a maturità; sono state autoimpollinate per ottenere delle piante

omozigoti. Dopo successivo screening la progenie di solo 2 piante hanno

mostrato il più alto contenuto di fosfato libero. Queste sono state

autoimpollinate e poi sono state selezionate le migliori, sono state

autoimpollinate e sono state selezionate ancora le migliori. Poi sono state fatte

le analisi per vedere l’espressione del transgene, sono state selezionate quelle

con un’espressione minore del transgene. Si va a vedere anche l’espressione di

geni collegati al pathway che non devono essere cambiati. Il contenuto di

fosforo totale è praticamente invariato, la quantità di fosforo libero è molto

maggior nelle piante transgeniche, per quanto riguarda il contenuto di acido

fitico diminuisce molto nelle piante transgeniche. Bisogna anche vedere il

livello di mio-inositolo e questo rimane inalterato. Si può concludere che il

silenziamento di questo gene IPK1 non intacca i livelli di mio-inositolo.

Mediante spettrometria ad assorbimento atomico è stato visto il livello di alcuni

ioni nelle piante non transgeniche e in quelle transgeniche, c’è un più alto

livello variabile nelle piante transgeniche.

Ma come germinano questi semi? I controlli e i transgenici hanno lo stesso

comportamento: stessa velocità di germinazione, stesso sviluppo della

radichetta e della parte aerea.

Valutazione agronomica: considerare l’altezza della pianta, il numero di grani

per pannicolo (insieme dei semi), la lunghezza del pannicolo, il numero dei

semi, peso secco nel numero di semi.

Conclusioni: agire silenziando questo gene molto a valle è una strategia che ha

avuto successo, una buona strategia, non ha danneggiato cose importanti.

Altra strategia: aumentare, overesprimere il gene della fitasi, che normalmente

è sotto controllo temporale, si attiva solo a livello della germinazione. È stato

preso il gene AtPAP15 da Arabidopsis, sono state ottenute 15 linee T0 e i livelli

di espressione del transgene sono stati analizzati per PCR. Queste piante sono

state autoimpollinate e portate alla generazione T3. È stato fatto un SB per

vedere se il transgene è presente in singola copia o copia multipla, in questo

caso è in singola copia e si esprime correttamente (lo si vede dal WB). L’attività

della fitasi rispetto al wt è maggiore, sono state analizzate le foglie (transgene

sotto promotore costitutivo). Le piante sono state messe in sabbia: in

condizioni normali le piante transgeniche non mostrano alcuna differenza

sostanziale, lo stesso si può dire quando nel terreno c’è del fosforo libero, c’è

comunque una diversità tra le piante in A rispetto a quelle in B, quelle in B

hanno più massa, perché è stato aggiunto del fosforo. Nel caso C invece, dove

è stato aggiunto fosforo legato a fitato, la pianta wt non sta molto bene, le

piante transgeniche sono capaci di utilizzare il fitato, sono capaci di utilizzare il

fosforo legato a fitato perché sono capaci di degradare il fitato già nelle radici.

44

Il fitato entra nelle radici e qui è subito digerito dalla fitasi e rende disponibile il

fosforo.

INATTIVAZIONE DI TOSSINE

Ci sono alcune piante che producono proteine o altri composti che potrebbero

essere interessanti per il nostro consumo ma che non possiamo utilizzare

perché contengono tossine. La maggior parte delle tossine sono allergeni e

sono molecole del metabolismo secondario con funzione di difesa. Da una

parte queste tossine sono importanti per la vita e l’ecologia della pianta.

Bisogna abbassare il livello di tossine ma non troppo se no le piante risultano

estremamente sensibili a patogeni o a stress ambientali. La quantità delle

tossine viene regolata tramite regolazioni delle condizioni di crescita.

Selezionerò linee con il più basso contenuto di tossine, alcune di queste tossine

possono essere inattivate ad esempio con l’innalzamento della temperatura e

altri metodi come ad esempio la macerazione, la fermentazione, che possono

degradare le molecole tossiche.

Le strategie quali possono essere per agire a livello biotecnologico?

Possono varie, ad esempio abbassare il livello delle tossine diminuendo o

aumentando enzimi coinvolti nella produzione di questa tossina, oppure si può

agire a livello di regolatori, di fattori trascrizionali che possono silenziare più

geni contemporaneamente nello stesso pathway.

Il cotone contiene gossipolo che è una tossina, derivante dal metabolismo

secondario. Il cotone è molto coltivato, molto utilizzato come fibra tessile; è

coltivato in moltissimi paesi e noi lo utilizziamo come fibra tessile perché ha

livello di gossipolo estremamente alti. In realtà la pianta produce una grande

quantità di semi e questo fa del cotone la terza pianta coltivabile in termini di

quantità di semi. Sono semi oleosi e se contiamo la quantità di semi che

vengono prodotti annualmente produrrebbero 9.4 milioni di proteine quantità

necessaria per soddisfare per un anno un gran numero di persone. Il gossipolo

è presente in tutte le parti della pianta, in ghiandole. È presente

costitutivamente ed è indotta la sua produzione in seguito ad infezione

microbica. Le ghiandole sono presenti sulla foglia ma anche nel seme.

Il gossipolo è tossico perché si lega ai cationi bivalenti e in special modo al

ferro, quindi produce una fragilità dei globuli rossi. Analisi post mortem

mostrano larghi e generalizzati edemi, cavità toraciche peritoneali piene di

fluidi; si lega anche alla lisina e questa tossina si accumula nell’organismo e

non viene facilmente catalizzata. Non abbiamo accesso quindi ad una quantità

biodisponibile di proteine.

È stata utilizzata la tecnica dei mutanti naturali per selezionare del cotone che

fosse libero da gossipolo, ci sono mutanti senza ghiandole. Sotto condizioni di

campo queste piante erano troppo suscettibili all’attacco da insetti perché

mancano i terpenoidi. Si ottengono dei mutanti di questo tipo che però non

45

hanno storia dal punto di vista della coltivazione. Il gossipolo, come vari

terpeni, derivano da cadinene, la cadinene sintasi è il primo enzima di una

catena che porta alla sintesi di gossipolo. Si è pensato di utilizzare la tecnica

del silenziamento tessuto-specifico, il costrutto è stato messo sotto un

promotore tessuto-specifico per il seme che permette di interrompere questa

via di sintesi. Il costrutto è sempre RNAi.

[Differenza tra wt e nullo: le piante nulle sono quelle in cui non si è inserito

bene il transgene o non c’è il gene di interesse; il vero controllo è la pianta

nulla.] 24/11

Vi sono però due possibili scenari:

Il silenziamento mediante RNAi può propagarsi dal suo punto di origine

 all’intera pianta, silenziando il gene specifico nell’intera pianta. In questo

caso si avrebbe un abbassamento di gossipolo e di altri terpenoidi

nell’intera pianta, esponendola a possibili infezioni da patogeni (ciò è

male).

Il silenziamento del gene cadinene sintasi potrebbe essere ereditato da

 ulteriori generazioni (ciò è bene).

Il costrutto per il silenziamento è stato introdotto in cellule di cotone mediante

Agrobacterium, esso era formato dalla sequenza ihpRNA sotto il controllo del

promotore seme specifico per le globuline.

Si è ottenuta cosi una progenie, su cui si è indagata l’attività del gene cadinene

sintasi. Nelle piante transgeniche generalmente si aveva una minor

espressione del gene cadinene sintasi e quindi un minor contenuto di

gossipolo. Solo in alcune piante si notava un contenuto normale di gossipolo,

paragonabile a quello delle piante wild type; in queste piante si è avuto la

perdita del costrutto.

In seguito si è andato ad analizzare il contenuto di gossipolo in altre parti della

pianta della progenie.

Contrariamente a quanto successo per la generazione precedente, dove l’RNAi

migra in altre zone della pianta, nella progenie il transgene si esprime solo nei

semi della pianta; il livello di gossipolo in altre parti della pianta non mostra

differenze rispetto alle piante wild type e di controllo.

Nella progenie T1, l’RNAi quindi non migra in altri tessuti della pianta ma

rimane confinato nei tessuti dei semi. Inoltre, il carattere “basso contenuto di

gossipolo nei semi” è mantenuta nel corso delle generazioni. Il livello di

gossipolo in prodotti edibili deve essere inferiore a 600 p.p.m. (parti per

milione). In semi di cotone transgenici si ha un livello di 200 p.p.m. e quindi

sono teoricamente edibili.

Conclusioni: questo protocollo applicato al cotone ha dato risultati positivi e

può essere applicato anche ad altre tipologie di piante producenti tossine,

46

come ad esempio Lathyrus sativus, una pianta producente una neurotossina

nei semi.

I semi di questa pianta, se consumati per lunghi periodi, possono dare problemi

a livello neuronale.

Mediante il protocollo applicato al cotone, si potrebbe ridurre il contenuto di

neurotossina in Lathyrus sativus.

Inattivazione degli allergeni

L’allergia nei confronti dei cibi è un problema di salute mondiale, soprattutto

per bambini dei paesi occidentali. Le noccioline (peanuts) rappresentano uno

dei cibi che causa maggior problemi a livello di allergie. Le reazioni di allergia

riguardano soprattutto la pelle, il tratto respiratorio e il tratto gastro intestinale.

I sintomi comuni incldono orticaria acuta, vomito, edema laringeo, ipotensione

e disritmia. Le noccioline sono utilizzato in modo quasi ubiquitario nell’industria

alimentare, ciò è un grande problema per le persone allergiche a questo cibo.

Le noccioline contengono 13 allergeni (ARA h 1-13), di natura proteica,

appartenenti a 7 famiglie differenti. Eccetto ARAh1 e ARAh3, il peso molecolare

degli altri allergeni ARA varia da un range di 5 a 17 kD. I geni corrispondenti ai

13 allergeni sono stati caratterizzati, identificando così la sequenza lineare

degli epitopi degli allergeni delle noccioline. Gli allergeni più importanti sono

ARA h1, ARA h2 e ARA h3.

NOTA

Le piante con resa di produttività migliore sono ottenibili mediante:

Breeding classico: incrocio tra piante selezionate

 Mutagenesi random con mutageni fisici o chimici

 Mutagenesi sito-specifica, la quale comprende l’inserimento di tratti di

 DNA al fine di interrompere specifici geni

Transgenesi e cisgenesi: inserimento di geni derivanti da piante differenti

 nel primo caso e da piante della stessa specie o da specie molto vicine

nel secondo caso

Vi sono più metodi per ridurre il potenziale allergenico nelle arachidi:

Trattamento con calore: le arachidi vengono trattate a caldo (arachidi

 tostate) al fine di denaturare le proteine causanti allergia e diminuire così

l’allergenicità.

Breeding classico: incrocio di piante ipoallergeniche (caratterizzate da un

 minor contenuto di proteine allergeniche) al fine di ottenere una varietà

con basso contenuto di allergeni.

Questo metodo ha portato a risultati ma in tempi troppo lunghi

 Mutanti ottenuti mediante irraggiamento: si sono ottenuti mutanti, alcuni

 privi di proteine allergeniche

-ingegneria genetica: si è silenziato il gene che codifica le proteine

 allergeniche, mediante inserimento mediante Agrobacterium di un

plasmide contenente il costrutto di silenziamento. 47

Le piante transgeniche sono state poi analizzate mediante western blot, il

quale ha individuato un calo di proteine allergeniche. I semi di queste piante

sono state analizzate per il loro potenziale allergico mediante test ELISA,

utilizzando anticorpi IgE derivanti dal siero di pazienti allergici. Gli anticorpi IgE

sono adesi ai pozzetti. In seguito si sono aggiunti degli anticorpi specifici per

l’antigene adeso e degli anticorpi anti-anticoporpo, quest’ultimi coniugati a un

enzima. In seguito si è aggiunto il substrato dell’enzima. L’enzima converte il

substrato in un prodotto colorato. L’intensità del prodotto colorato è

direttamente proporzionale alla quantità di enzima, la quale è a sua volta

proporzionale alla quantità di antigene. Pazienti con differenti livelli di IgE nel

siero sono stati selezionati per determinare la risposta individuale

all’esposizione ai semi trasngenici selezionati di noccioline, in comparazione a

un controllo wild type. I risultati mostrano una significante riduzione

dell’allergene ARA h 2 nelle piante trasngeniche, con conseguente diminuzione

dell’allergenicità dei semi transgenici.

Riduzione del cianuro nei semi

Il cianuro è contenuto nei semi. Esso è un potente veleno con un ampio spettro

di azione nell’organismo. Esso è attivo sotto forma di gas altamente volatile e

dall’odore di mandorla. Il cianuro ha funzione protettiva nei confronti di erbivori

e larve di insetti, sotto forma di glicosidi cianurati (es. amigdalina, presente

nelle mandorle). Oltre a funzione protettiva, suddetti glicosidi svolgono un ruolo

importante nel metabolismo dell’azoto. Si pensa che queste molecole siano

molecole di trasporto di azoto dalle foglie alle radici, nelle quali è utilizzato per

la sintesi di amminoacidi.

La sintesi di glicosidi cianurati parte dalla valina, la quale viene convertita in

linamarina. Questa molecola può entrare in due vie differenti; la prima è

innescata da rotture cellulari (via di risposta a patogeni), la seconda riguarda la

pianta intera. La linamarina è conservata nel vacuolo, al fine di evitare il

contatto con la linamarasi, l’enzima che conduce nella via di risposta ai

patogeni e che porta alla formazione di acido cianidrico e acetone. Nell’altra

via, la linamarina sintetizzata dalle foglie viene convertita nella sua forma

glucosinata linustatina e viene trasportata fino alle radici.

La cassava è una pianta nativa del sud america, la quale produce il suo relativo

tubero. La cassava ha molti tratti desiderabili come:

La crescita in souli poveri

 Resistenza alla siccità

 Resistenza agli erbivori

 Raccolta di prodotti dai 6 mesi fino ai 3 anni

 Ottima forte di carboidrati

Tuttavia possiede alti livelli di glucosidi cianogeni, inclusa la linamarina. Il suo

consumo può portare a problemi di salute molto rilevanti, come ad esempio la

paralisi permanente. Solitamente, il livello di cianuro in cassava viene diminuito

“manualmente”, facendo a pezzi i tuberi, grattuggiandoli e facendoli macerare

48

in acqua. I composti contenente cianuro sono molto volatili, mediante queste

operazioni la cassava si libera dell’acido cianidrico. Ad oggi si cerca di agire

mediante approcci genetici, cercando di abbassare l’attività di enzimi al fine di

abbassare il livello di linamarina oppure andando ad agire sugli enzimi che

portano allo smaltimento di cianuro.

Nella cassava c’è una produzione di acido cianidrico che non impedisce ma può

andare ad inficiare la qualità del prodotto finale. Nella pianta ci sono due

diverse vie: una che viene imboccata quando c’è una rottura nelle foglie ad

esempio, dalla linamarina si arriva direttamente in due passaggi all’acido

cianidrico, e l’altra è delle piante intatte, il composto viene localizzato nel

vacuolo. Nei tuberi, invece, c’è pochissima quantità dell’enzima HNL e quindi si

arriva molto poco all’acido cianidrico. Il passaggio da cianodrina fino ad acido

cianidrico può avvenire anche spontaneamente a condizione pH > 5 e

temperatura elevata, condizioni utilizzate quando il tubero viene raccolto e

prima di mangiarlo. Nel tubero della cassava c’è un certo livello di acido

cianidrico e di cianidrina, questi devono essere eliminati prima del consumo.

Siccome nei tuberi c’è un basso livello di HNL questo si fa macerando e portare

nelle condizioni necessarie tutto l’acido cianidrico che è volatile. Sono state

fatte varie prove: o si inibisce la produzione di linamarina per inibire la

produzione finale di acido cianidrico e quindi si inibiscono i due geni

Cyp79D1/D2 che codificano per due proteine simili che codificano per il primo

step (bloccare la sintesi del composto tossico); oppure si aumenta l’attività

dell’HNL in modo che si abbia una maggiore evoluzione di cianidrina ad acido

cianidrico, quindi si ha la dispersione gassosa di composti tossici.

Per quanto riguarda la sovraespressione dei due geni CYP79D1/D2è stata fatta

l’espressione antisenso dei due geni, è stata fatta in modo specifico per la

foglia. Il costrutto RNAi si esprime solo nelle foglie e si utilizza il promotore

CAB1, promotore tipico della fotosintesi.

È stato ottenuto il callo che è stato rigenerato, dalla rigenerazione di questo si

formano embrioni somatici. Embriogenesi somatica deriva da una cellula non

zigotica, da una cellula del tessuto, del soma della pianta; è un’embriogenesi

che interessa un’unica cellula del callo che va incontro ai vari steps tipici

dell’embriogenesi tugur (?). Si parte da una sola cellula e si arriva alla pianta.

Si mette l’espianto trasformato su un terreno in cui c’è sia la selezione sia gli

ormoni per arrivare a callo, le cellule trasformate avranno la possibilità di

crescere. La corretta integrazione del DNA è stata confermata con PCR.

Sulla stessa pianta è stata fatta la PCR per uno e per l’altro gene quindi si

vanno a selezionare quelle piante in cui sono presenti entrambi. Su queste

piante si è andato a vedere il contenuto della linamarina. Nel wt il contenuto è

espresso al 100% (per comodità), non c’è correlazione tra la riduzione dei

trascritti dei due enzimi e i livelli di linamarina. 49

In queste piante si è andato a vedere il contenuto di linamarina nelle radici, il

transgene in questo caso viene silenziato a livello della foglia. La PCR dice che

non c’è nessuna apprezzabile riduzione dei livelli dei trascritti CYP79D1 e

CYP79D2. Però se si va a vedere il contenuto di linamarina si può vedere che è

un contenuto bassissimo, molto più basso delle foglie. Questo dipende dal

ridotto trasporto della linamarina dalle foglie alle radici. Queste piante

antisenso morivano quando sono state trasferite su un suolo, in vaso, che era

privo di azoto. Questi composti hanno ruolo anche di deposito oltre che come

deterrenti per patogeni.

Ma cosa succede se questi due geni vengono sottoposti al controllo di un

promotore specifico per il tubero? Sono stati messi in un costrutto antisenso

sotto controllo del promotore della patatina (proteina presente in tanti tuberi)

-> la PCR conferma il silenziamento e anche il SB. Nelle radici sono quasi

completamente silenziati mentre nelle foglie non sono silenziati correttamente.

Il silenziamento a livello delle radici non influenza i livelli di trascritti nelle

foglie. Per quanto riguarda il contenuto di linamarina rimane inalterato sia nelle

foglie che nelle radici. Le piante trasgeniche con il costrutto silenziato nelle

radici crescono normalmente su suoli, terreni che mancano di azoto.

Le foglie sono il sito primario di sintesi di linamarina (vero nella cassava, non è

detto che vale per tutte le specie vegetali) e quindi la linamarina sintetizzata

viene trasportata alle radici probabilmente principalmente allo scopo di essere

una riserva di azoto.

Altra strategia: overespressione del gene HNL.

Conclusioni: allergeni e tossine sono molto abbondanti e ubiquitari nelle piante

(sono presenti in tutte le specie vegetali, con scopi diversi), molti di questi sono

stati abbassati con diverse pratiche altri invece no. Possono essere ridotti con

strumenti convenzionali: pratiche agricole, miglioramento classico,

mutagenesi, trattamento post raccolto oppure agendo a livello transgenico.

Queste strategie devono essere considerati sulla base di rischi e benefici.

Molecular pharming

I prodotti che possono derivare dalle piante possono essere prodotti

farmaceutici, ad esempio il tassolo (estratto dalla corteccia), non è neanche GE

(geneticamente modificato). Posso utilizzare anche ingegnerizzando, facendo

necessariamente dell’ingegneria genetica delle piante per produrre composti

farmaceutici o per produrre dei composti di interesse industriale.

Ci può essere l’interesse di utilizzare la cellula vegetale come bioincubatore:

molti anticorpi o molecole di interesse per scopi medici per essere attive vanno

incontro a maturazione, sono importanti le PTM (modificazioni post-

traduzionali), dopo questo la proteina diventa matura ed efficace. La

glicosilazione è molto frequente e rappresenta il 40% delle proteine sul

50

mercato delle proteine ricombinanti. Gioca un ruolo fondamentale perché

influenza il corretto folding della proteina e quindi la stabilità.

I batteri non hanno la capacità di fare correttamente la maturazione di queste

proteine, non hanno tutto l’iter di PTM che ha una cellula eucariote. Quindi

vengono utilizzati spesso per ottenere un corretto folding delle proteine delle

linee cellulari di mammifero, tipo le CHO (chinese hamster ovary). Anche le

cellule vegetali sono eucariotiche e fanno esattamente la stessa cosa, la

maggior parte delle proteine vegetali vanno incontro a modificazioni post

traduzionali, quindi possono essere utilizzate al posto delle linee cellulari di

mammifero. Sono ricerche abbastanza recenti, 2012, ma stanno procedendo

abbastanza velocemente. Perché usare le piante?

Vantaggi

Riduzione dei costi

 Stabilità, si può fare una produzione in materiale vegetale

 particolarmente stabile come il seme o di facile

raccolta/somministrazione

Sicurezza, perché si è liberi da ogni eventuale patogeno animale, la

 produzione in cellule animali può comportare la presenza di qualche

patogeno che deriva dalle cellule umane e quindi tossico per noi; per

quanto riguarda le piante i rischi di contaminazione di questo tipo sono

nulli

Svantaggi:

Possibilità di contaminare l’ambiente

 Difficile da controllare la sicurezza del campo

 Contaminazione del food supply

 Sicurezza per la salute che possono variare da caso a caso, da persona a

 persona

Strategie per la trasformazione

Trasformazione stabile nucleare, usando Agrobatterio inserisco stabilmente

il transgene, vantaggi: utilizzata per produrre una grande quantità di proteine e

facilmente conservabile; svantaggi: incroci con piante non trasformate.

Trasformazione stabile del cloroplasto, sviluppo sotto promotore

procariotico e invece che utilizzare Agrobatterio, utilizzo un metodo fisico

(particle gun) e vado a targettare il genoma del cloroplasto. Vantaggi: non si ha

una fuga del transgene perché i cloroplasti non sono presenti nel polline, nel

polline è presente solo il genoma nucleare; l’ovulo porta sia il genoma nucleare

che quelli citoplasmatici che sono ad eredità materna; non si ha quindi il

problema di fuga del transgene che va ad inquinare l’ambiente. Altro vantaggio

è che c’è un numero molto elevato di cloroplasti soprattutto a livello delle

foglie, se si arriva ad omoplasmia (tutti i cloroplasti sono trasformati), non ho

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PESO

1.26 MB

AUTORE

elaisa9

PUBBLICATO

6 mesi fa


DETTAGLI
Corso di laurea: Corso di laurea magistrale in biotecnologie molecolari e industriali
SSD:
A.A.: 2018-2019

I contenuti di questa pagina costituiscono rielaborazioni personali del Publisher elaisa9 di informazioni apprese con la frequenza delle lezioni di Biotecnologie vegetali e studio autonomo di eventuali libri di riferimento in preparazione dell'esame finale o della tesi. Non devono intendersi come materiale ufficiale dell'università Insubria Como Varese - Uninsubria o del prof Bracale Marcella.

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