Ingegneria metabolica delle piante

F

Se voglio aumentare la quantità di E, prodotto del metabolismo secondario,

posso fare tante cose, ad esempio inibire il suo catabolismo. Posso trasformare

con solo una proteina master che regola contemporaneamente alcuni od

eventualmente tutti i geni che codificano per i vari enzimi della via, se trovo ad

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esempio un fattore di trascrizione ad i geni che codificano gli enzimi della via,

si trasforma con un solo gene e si ottiene un effetto multiplo, un effetto a

cascata. È una buona strategia.

Invece di andare a sovra o sotto esprimere alcuni geni in un determinato

pathway, si può andare ad agire su fattori di trascrizione che regolano

l’espressione di più geni del pathway in questione (dei master regulator). Ad

esempio: piante knock out per il gene bHLH104 possiedono una alterata

omeostasi del ferro.

Per studiare determinati pathways è molto importante avere dei mutanti

fenotipici. Questi mutanti possono essere utilizzati sfruttando Agrobacterium. Il

T DNA inserito mediante Agrobacterium andrà a inserirsi casualmente

all’interno del genoma di Arabidopsis; può andare a inserirsi all’interno di un

gene (o nel promotore di quest’ultimo) andando a inibire la sua corretta

espressione. In questo caso, il vettore T DNA contiene solamente un gene

marker per la selezione (utile sia per interrompere il gene, sia per selezionare

le cellule trasformate). Dato che l’inserzione non è gene specifica ma casuale,

si provvede a trasformare un gran numero di cellule, al fine di avere la

probabilità statistica di interrompere il gene di nostro interesse e al fine di

introdurre un’interruzione in ogni gene.

Questo processo è noto come mutagenesi T DNA. Arabidopsis possiede un

genoma molto piccolo, contenente piccoli introni; l’inserzione di T DNA

generalmente produce un mutante knock out per un qualche gene. Al termine

si provvede a risalire al gene mutato, a partire dal fenotipo alterato.

Al termine della mutagenesi si provvede a ottenere piante omozigoti per tale

mutazione però alcune mutazioni in omozigosi possono essere però letali; in tal

caso si provvede a mantenere la pianta con la mutazione in eterozigosi.

Tornando al gene bHLH104 -> Si sono ottenuti due omozigoti mutanti per

suddetto gene.

Mediante un northern blot si è verificato il livello di trascrizione; entrambi i

mutanti non esprimono proprio questo gene. Andando ad alterare questo gene,

si dovrebbe ottenere delle variazioni riguardanti l’omeostasi del ferro. Togliendo

il ferro dal mezzo di coltura, i mutanti per questo gene si presentano clorotici e

con minor crescita delle radici, le quali si presentano piccole e poco sviluppate.

Andando ad analizzare il mezzo di coltura, nei mutanti si nota un aumento di

ATPasi per l’estrusione e l’acidificazione di ioni H+, al fine di acidificare il

terreno e migliorare l’assimilazione di calcio (ciò manca nelle piante cresciute

in presenza di ferro). Una mutazione del gene bHLH104 causa quindi una

differente attività delle ATPasi.

Andando ad analizzare l’assimilazione di ferro in terreno alcalino e acido, si

nota che in pH acido il mutante cresce bene e non vi sono differenze dal wild-

type. In terreno alcalino, sia il wild-type che i mutanti entrano in sofferenza

(soprattutto i mutanti). Si è poi over espresso il gene in questione; i mutanti

sovraesprimenti questo gene in assenza di ferro sono piante clorotiche che

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però stanno meglio rispetto a una pianta wild type cresciuta in mancanza di

ferro. Anche in questo caso si è analizzata l’acidificazione del mazzo data dall’

estrusione di protoni dalla ATPasi; in questo caso si nota una maggior

acidificazione del mezzo vicino alle radici.

Il gene bHLH104 è quindi coinvolto nella regolazione di un gran numero di geni

coinvolti nella omeostasi del ferro. Mediante analisi di questo fattore di

trascrizione, si è scoperto che il fattore bHLH agisce insieme a un secondo

fattore di trascrizione; FIT. Mediante microarray si è inoltre scoperto che questi

due fattori trascrizionali influiscono su numerose attività della cellula oltre

all’omeostasi del ferro.

I metaboliti secondari delle piante

Le piante sono una sorgente di importanti composti, di rilevante interesse per

la medicina, per la cosmetica, per gli alimenti.

Il metabolismo primario riguarda vie metaboliche e molecole prodotte da tutte

le piante (es. pathway fotosintetici, glicolisi, sintesi di aminoacidi, etc.).

Il metabolismo secondario non è strettamente necessario alla vita della cellula

della pianta, tuttavia è necessario per quanto riguarda l’adattamento e risposta

della pianta nei confronti dell’ambiente.

I metaboliti secondari sono prodotti solo da alcune specie vegetali. I metaboliti

secondari servono per: difendersi da patogeni, erbivori, altre piante (molecole

che agiscono a livello del S.N, dell’apparato respiratorio, a livello

digestivo….degli insetti e dei parassiti); questo vale per le piante selvatiche, le

piante coltivate sono state selezionate per non produrre questi composti.

Ciò le ha rese appetibili dal punto di vista agroalimentare ma le ha rese

suscettibili all’attacco di parassiti e insetti; ciò ha reso necessario l’uso di

pesticidi, insetticidi e erbicidi (allelopatia: rilascio di molecole che vanno a

interferire con la crescita di altre piante competitive). Questa

caratteristica propria di alcune piante è molto studiata per creare piante

allelopatiche nei confronti di piante infestanti, in modo da creare delle co-

coltivazioni con piante di interesse agroalimentare e andando così a

risparmiare sull’utilizzo di erbicidi).

Vi sono varie interazioni allelopatiche:

Diretta: le molecole rilasciate dalla pianta A vanno a incidere

 direttamente sulla pianta B

Indiretta: le molecole rilasciate dalla pianta A vanno a agire su

 microrganismi contenuti nel terreno i quali possono attaccare la pianta B

mediante il rilascio di altre molecole nocive.

Diverse piante producono vari composti chimici nocivi e interessanti, ad

esempio il noce nero, il sorgo e l’eucalipto.

Attrazione di insetti impollinatori: produzione di varie molecole olfattive e

 gustative. Queste molecole sono molto grosse e dispendiose dal punto di

vista energetico; sono quindi prodotte solo in alcuni momenti della

stagione.

Protezione da raggi UV



Per concludere, il metabolismo secondario produce molecole fondamentali per

l’interazione della pianta con l’ambiente che la circonda; essi giocano quindi un

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ruolo fondamentale nella sopravvivenza della specie. Le piante producono un

enorme quantità di metaboliti secondati, suddivisibili in metaboliti nitrogen

containing e without nitrogen. I metaboliti secondari derivano da molecole del

metabolismo primario. I metaboliti secondari sono molto importanti in quanto

molti metaboliti sono sfruttati dal punto di vista commerciale nell’industria

farmaceutica come molecole antibatteriche o anticancro. Una volta scoperto un

nuovo metabolita secondario, si ha il problema di produrne abbastanza per

coprire le esigenze industriali.

Uno dei principali problemi riguarda proprio la quantità in cui i metaboliti

secondari vengono prodotti; essi rappresentano tipicamente l’1% del peso

secco della pianta, inoltre essi vengono prodotti solo in alcune situazioni

particolari, solo in alcune stagioni o addirittura solo in alcune parti della

giornata. Hipericum

Molti metaboliti secondari sono anche tessuto specifici, ad esempio l’

perforatum produce l’ipericina solo in cavità secretorie a forma di ghiandole

traslucenti. Altri sono cellule specifici. Molti metaboliti secondari si trovano

segregati in determinati compartimenti cellulari.

La produzione di metaboliti secondari hanno i seguenti problemi:

Resa bassa

 Estrazione e purificazione molto costose

 Distruzione dell’ambiente e della biodiversità in seguito all’asporto di

 piante interessanti dal punto di vista industriale

Problemi di tipo etico-politico; la maggior parte delle piante interessanti

 sono localizzate in regioni tropicali; le nazioni industrializzate consumano

la maggior parte di questi prodotti derivanti da regioni tropicali

solitamente povere. Si corre quindi il rischio di sfruttare questi paesi

poveri.

Instabilità di rifornimenti causati dalle situazioni politiche di questi paesi

 (solitamente sono situazioni molto delicate)

Al fine di ovviare a questi problemi, si cerca di sintetizzare chimicamente questi

metaboliti secondari (Ad esempio la vanillina). Solitamente in questo modo

vengono prodotte molecole semplici e piccole (vanillina e acido acetilsalicilico).

Nella maggior parte dei metaboliti secondari, ci si trova davanti a composti

molto complessi, impossibili da sintetizzare chimicamente su scala industriale.

L’estrazione di metaboliti secondari utili è una strada percorribile, ma non

sufficientemente redditizia. Un’alternativa è la sintesi chimica del metabolita di

interesse; ciò è fattibile per molecole piccole come la vanillina o l’acido

acetilsalicilico. La sintesi chimica di molecole complesse è molto complicata. La

maggior parte dei metaboliti secondari è caratterizzata da una struttura

complessa e non sintetizzabile mediante procedure chimiche.

Al fine di ovviare a questi problemi si attua la produzione eterologa

(ricostruzione delle vie di produzione dei metaboliti secondari di interesse in

ospiti eterologhi come batteri, lieviti, cellule vegetali e piante più facilmente

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coltivabili). Per attuare produzione eterologa si deve conoscere il pathway di

produzione del prodotto di interesse.

L’utilizzo e la coltivazione* di piante di interesse per la produzione di metaboliti

secondari sono:

La sostenibilità ambientale

 Alte rese di produzione, soddisfacenti la richiesta industriale

 Qualità ottimale e standard del prodotto

 Selezione di linee di piante maggiormente produttive

 Possibilità di aumentare la produzione mediante tecniche agronomiche

 (somministrazione di determinate sostanze in determinati periodi

dell’anno

(*coltivazione di piante di interesse in terra, al fine di estrarre il metabolita

secondario)

Tuttavia presenta i seguenti problemi:

Problematico per piante con cicli di vita molto lunghi, eccessivi per i

 tempi di produzione industriali

I terreni arabili sono limitati



Il problema dei limitati terreni arabili può essere ovviato mediante l’utilizzo di

colture cellulari vegetali; le cellule vegetali sono ottenibili a partire dai calli.

Questa tecnica presenta numerosi vantaggi quali:

Sintesi di metaboliti secondari in condizioni ambientali controllate,<