Ingegneria metabolica

Principi di ingegneria metabolica

Serve un modello matematico che studi molte reazioni in contemporanea. Il metabolismo comprende tutte le reazioni biochimiche, non solo quelle che interessano l'operatore. La cellula cerca di ottenere energia dall'ambiente esterno, ha bisogno di nutrirsi e costruisce delle strutture necessarie al sostentamento partendo dalla costruzione di monomeri (acidi nucleici, proteine, acidi grassi). Oltre a costruire le macromolecole, le distrugge. Il metabolismo è un elenco di processi che riguarda l'energia, la gestione dei substrati e dei prodotti, la gestione dei metaboliti intracellulari. Il prodotto finale non è nient'altro che la biomassa.

L'obiettivo è quello di osservare i sistemi in vivo: si ridisegna e si ridefinisce il metabolismo in maniera semplicistica come un insieme di macro-processi, coerenti con il tipo di molecole che li compongono.

Categorie di macro-processi

• Ottenimento dell'energia
• Conversione dei nutrienti
• Sintesi di biomolecole a partire da monomeri
• Sintesi e degradazione di macromolecole (biomassa)

Osservabilità di un sistema

Capacità di guardare il sistema in tutte le sue componenti e valutarne la dinamica. Non si possono considerare i dettagli di un sistema se non si è in grado di osservarlo in toto. Le 4 categorie scritte sopra sono tutte misurabili.

• Energia: correlabile alla concentrazione di metaboliti extracellulari; controllare il livello di anidride carbonica e ossigeno è utile per capire lo stato di respirazione cellulare (processo che produce un alto livello di energia).
• Conversione dei nutrienti: misurabile attraverso il monitoraggio della variazione di substrato che viene fornito.
• Acetilcoenzima A: un metabolita che serve per la produzione di altre sostanze; questo aspetto non è monitorabile.
• Variazione di biomassa: misurabile in modo automatico (laser che misurano la torbidità). Per valutare se la biomassa è sufficiente, si misura la velocità di crescita. Nel chemostato la velocità specifica di crescita è uguale alla velocità di diluizione, data da F/V. La velocità di crescita, in particolari situazioni (chemostato, equilibrio) è facilmente misurabile.

Il metabolismo è descritto da 3 blocchi di coefficienti (1,2,4 punto) e da 1 blocco di variabili (3 punto). Il metabolismo è composto da cammini di reazioni e da regolazioni molto più complesse del semplice dosaggio di una sostanza: per studiare un sistema in vivo, non si può scorporare una singola unità, ma bisogna guardare il sistema in toto.

Se voglio studiare il metabolismo in vivo, reale, non posso estrapolare la singola reazione e studiarla da sola. La reazione, una volta estrapolata, si divide in reagenti, prodotti e catalizzatore: si ha controllo totale sulla singola reazione. In vivo non si ha lo stesso controllo: il catalizzatore viene prodotto e attivato in virtù dei sistemi di regolazione, e di conseguenza anche il consumo del substrato e la creazione del prodotto.

Se voglio studiare una singola reazione, per esempio la fermentazione del glucosio ad alcool etilico, resto nell'arco temporale di ore/giorni. Quello che si riesce a vedere nella finestra di ispezione è poco rispetto a ciò che davvero avviene. Quando le dinamiche sono troppo veloci (movimento delle ali di una mosca) o troppo lente (un fiore che sboccia), la finestra di ispezione non ci permette di vedere la dinamica del processo. Durante una fermentazione, si riescono a cogliere alcune cose, ma altri processi estremamente veloci o lenti non possiamo coglierli.

Quando si vuole guardare tutto il metabolismo, è più probabile che si riesca a osservare quella parte di metabolismo che ha dinamiche temporali che coincidono con i tempi di osservazione che possiamo permetterci. In vitro, le dinamiche e i tempi di osservazione sono dettati dall'operatore. In vivo ciò non è possibile, il tempo è dettato dal processo che sta avvenendo. Sono inoltre presenti metaboliti che non sono in grado di misurare, come i metaboliti intracellulari.

Un processo molto lento che può avvenire all'interno di un micro sono le mutazioni, le quali hanno la potenzialità di cambiare sensibilmente le proprietà del ceppo. Un processo molto veloce è la continua formazione di messaggeri e la loro conseguente distruzione: nella finestra di osservazione, il pool degli RNA dell'insieme sembra più o meno costante.

Classi di sostanze da monitorare

• Substrati: molecole semplici o complesse
• Prodotti: molecole semplici o complesse
• Metaboliti intracellulari: molecole semplici o complesse
• Biomassa: se ti metti in condizioni ottimali nel bioreattori, puoi calcolare la biomassa a partire dai parametri del chemostato (m = D). Da un punto di vista molecolare è molto complicata.

Se la biomassa in vivo si può monitorare nella sua interezza, i suoi componenti fanno parte dei metaboliti intracellulari, ossia il pool delle sostanze che non sono in grado di misurare (non siamo in grado di osservare la quantità e la qualità delle proteine che la compongono, se non passando attraverso l'essiccamento, processo che toglie però la condizione 'in vivo').

Reazioni nel metabolismo

1. Reazione di ossidazione e degradazione: NADH viene usato nell'anabolismo per la creazione di nuove molecole, NADPH (prodotta attraverso particolari vie metaboliche, se è richiesta la cellula spinge i processi che ne favoriscono la produzione) viene usato nella catena di elettroni per produrre ATP. Spingendo la cellula a produrre il prodotto voluto, si rischia di accelerare altri processi che non permettono l'ottenimento del prodotto finale: si vuole arrivare alla creazione di una cellula essenziale, che non sprechi i reagenti che vengono forniti con una certa finalità.
2. Reazioni di biosintesi: con i monomeri ottenuti con la degradazione, si ottengono nuove molecole biologicamente attive. In queste reazioni di biosintesi non partecipano solo substrati, ma anche cofattori, coenzimi, adiuvanti, inibitori (in generale, sistemi di controllo). La produzione di F6P è un punto fondamentale della glicolisi o della gluconeogenesi: ha un sistema di regolazione che si basa sulla fosforilazione di una molecola, la quale fa da inibitore o induttore della reazione di formazione del F6P (quando c'è troppo ATP, si blocca il processo; quando ce n'è poco, il processo avanza). La biosintesi serve a creare composti che saranno utili per formare molecole ancora più grandi.
3. Reazioni di assemblaggio: i composti formati nelle reazioni di biosintesi vengono assemblati a formare macromolecole.
4. Reazioni di polimerizzazione: si ha un livello superiore rispetto all'assemblaggio.

Solitamente, le reazioni inverse sono catalizzate da enzimi diversi: non avvengono entrambe in virtù della termodinamica del sistema. La glicolisi trasforma la fonte di carbonio in acido piruvico, ma si può ripercorrere la reazione nel senso opposto, seguendo la gluconeogenesi: si prende un acido grasso e si ripercorre la glicolisi al contrario per arrivare all'acetil-coenzima A. Il ciclo dell'acido tricarbossilico non viene percorso in entrambi i sensi, sembra essere classificato solo in termini di catabolismo: nella sua interezza, a produrre NADH, viene usato solo in termini di catabolismo. Alcune delle reazioni che compongono il ciclo vengono usate per l'anabolismo, ma non tutte.

Reazioni cataboliche e anaboliche che riguardano le stesse sostanze, molto spesso avvengono in compartimenti separati. Vi è un ulteriore livello di complicazione: i blocchi di reazioni spiegati precedentemente sono tutti localizzati in compartimenti specializzati. La diversa localizzazione di un tipo di reazioni permette di risolvere matematicamente l'osservazione del livello dei metaboliti intracellulari. La difficoltà nel calcolare i metaboliti intracellulari è la spia di una conoscenza inesatta della localizzazione del metabolita all'interno della cellula.

Nello studiare le leggi metaboliche, prendiamo in considerazione solo i percorsi metabolici composti da una successione di reazioni biochimiche definite come realizzabili e osservabili: questa è una sotto-rappresentazione del metabolismo. La realizzabilità è un termine che o è presente o è assente. L'osservabilità è invece associata a un set di reazioni inizialmente non osservabili ma che lo diventano in seguito a calcoli che permettono di ricavare l'incognita. Queste due caratteristiche ci permettono di limitare il numero di reazioni da tenere in considerazione e ci permettono di creare un modello matematico.

Il problema è capire quali reazioni scartare a priori e quali invece tenere e ricavare attraverso calcoli: il numero di reazioni è a piacere o è un numero che ha un range preciso? Quante variabili posso calcolare dall'equazione? Il numero di variabili che posso calcolare dipende dal numero di equazioni. Se si riescono a individuare quali sono i punti più importanti di un sistema, si possono deregolare per aumentare la produzione di un certo prodotto: possiamo farlo perché siamo in possesso di tecnologie che ci permettono di agire sul percorso metabolico. Si può agire da un punto di vista biochimico (enzimi) o direttamente sul DNA. La manipolazione atta al silenziamento genico, attraverso la perturbazione di un gene, non mi garantisce la perturbazione dell'interno metabolismo. In silico knock-out: togliendo un gene, si valuta l'impatto del knock-out sull'intero organismo.

La caratteristica principale delle mutazioni è la specificità: le modifiche sono mirate, atte ad ottenere una situazione voluta. È molto diverso dal metodo classico di ingegnerizzazione a livello industriale. Si deve avere una quantificazione dell'impatto di una modificazione sul metabolismo. Devo quantificare il livello di metaboliti intracellulari e le velocità delle reazioni intracellulari. Nella prima parte quantifico le velocità delle reazioni, nella seconda parte quantifico le variazioni di velocità dovute alle modificazioni. Nella prima parte ho bisogno di equazioni, nella seconda parte ho bisogno delle derivate delle variabili ricavate nella prima parte. La quantificazione delle variazioni ci permette di scoprire qual è la variazione ottimale.

Il concetto cardine dell'ingegneria metabolica è il flusso metabolico. Non sono prese in considerazione le perturbazioni ambientali perché non sono specifiche o selettive. Con applicazione iterativa si intende la successione tra perturbazione e quantificazione: è un modo di migliorare in maniera razionale, specifica e non randomica le proprietà cellulari. Globalmente mi interessa quale variazione massimizza il flusso. Parzialmente mi serve un microscopio che mi permetta di guardare in vivo cosa sta succedendo.

Con cammino lineare si intende un una serie di processi in cui i metaboliti non partecipano ad altri cammini: ogni ramificazione mi fa uscire dal cammino lineare. Il metabolismo non è altro che un insieme di tanti cammini lineari, che hanno dei punti in comune tra di loro. Il flusso è uno solo ed è riferito all'intero cammino, è la velocità dell'intero cammino (diverso dalle velocità delle singole reazioni, che sono diverse tra di loro). La reazione totale viene considerata come una meta-reazione. Non si possono calcolare la v_max e la k dell'intera reazione: il cammino metabolico esiste come 'catena di trasformazione' ma non è catalizzato da un meta-enzima. Si possono sì calcolare una meta-k e una meta-v_max ma non sono correlabili a nessun enzima!

Il flusso J è uguale alle velocità delle singole reazioni SOLO allo stato stazionario, perché in questa condizione sono tutte uguali tra di loro (è la definizione dello stato stazionario). Questa condizione è presente all'interno della cellula: definire lo stato stazionario all'esterno di una cellula è complicato. Lo stato stazionario extracellulare è definito nel momento in cui la variazione delle concentrazioni dei metaboliti extracellulari è nulla. Lo stato stazionario extracellulare non garantisce lo stato stazionario intracellulare, che non è osservabile. Si suppone che lo stato stazionario extracellulare sia sufficiente per descrivere anche quello intracellulare. Non posso parlare di quantificazione di flussi metabolici in nessun transitorio: si può quantificare solo alla fine della perturbazione, quando si è passati da un primo stato stazionario ad un secondo stato stazionario. Se allo stato stazionario tutte le velocità di un cammino metabolico lineare sono uguali tra di loro, le concentrazioni dei singoli metaboliti sono tutte diverse (perché hanno k_m e v_max diverse).