Ingegneria Genetica, Prof. Laveder

NUCLEASI

Le nucleasi possono essere di due tipi, esonucleasi, tagliano il legame fosfodiestereo alle estremità, mentre

le endonucleasi tagliano i legami fosfodiesterici nel mezzo del DNA, in precise sequenze di riconoscimento.

Endonucleasi: Gli enzimi di restrizione sono endonucleasi, ne sono stati isolati moltissimi da diversi ceppi

batterici, ogni ceppo ha all’incirca il suo, esistono come difesa del batterio dall’infezione fagica, infatti

tagliano il DNA del fago non appena entra, cosicché non possa avvenire la fase precoce; il DNA genomico si

protegge poiché avviene la metilazione in regioni dove taglierebbe l’enzima di restrizione!

Possono essere di II tipo, che sono i più utili perché tagliano un punto preciso della sequenza di

riconoscimento, o di tipo I e III, che invece tagliano un punto casuale della sequenza che riconoscono. A

seconda di quanto lunga è la sequenza di riconoscimento varia la frequenza di taglio, enzimi con una

sequenza di 6-8 nt tagliano molto raramente e sono usati per generare frammenti specifici o più grandi,

quando non sarebbe utile avere troppi piccoli frammenti, invece enzimi che riconoscono una sequenza di 4

nt circa tagliano più spesso, e generano piccoli frammenti utili per trovare un gene o costruire librerie. Alcuni

enzimi tagliano estremità piatte (per esempio Hind I), poco comode perché meno facilmente si legano tra

loro, altri estremità sporgenti, in 5’ o in 3’; tra questi c’è EcoRI, il più utilizzato, ma ne sono usati anche altri.

Isoschizomeri: due enzimi di restrizione diversi, che tuttavia NOMENCLATURA: le prime tre lettere

riconoscono lo stesso sito e tagliano allo stesso modo, indicano il nome del batterio da cui

generano estremità compatibili tra loro l’enzima è stato isolato, una quarta

lettera, eventuale, indica il sierotipo,

Neoschizomeri: due enzimi diversi che riconoscono la stessa lettere maiuscole o numeri indicano il

sequenza ma effettuano un taglio in posizione diversa ceppo e numeri romani indicano

Isocaudameri: due enzimi diversi che riconoscono siti diversi l’ordine di scoperta.

ma danno origine a estremità appiccicose uguali.

Meccanismo di taglio: ogni enzima può interagire con molte sequenze di DNA, tuttavia solo quando incontra

la sequenza specifica vi si lega e provoca un’incurvatura nella regione; le sequenze di riconoscimento sono

sequenze palindrome, cioè il filamento sottostante risulta avere la stessa sequenza del filamento sovrastante

se letti entrambi nel verso 5’3’.

Eco RI: forma un dimero he si lega al DNA e riconosce la REGOLA DELLE NUCLEASI

sequenza GAATTC, ma in realtà interagisce con una decina di DNasi: generalmente idrolizzano il

basi a monte e a valle della sequenza, taglia tra G e A, prima un legame fosfodiesterico con 3’ (OH) e

filamento e poi l’altro, la sequenza di basi ai lati del sito di 5’-fosfato

riconoscimento influenza l’efficienza del taglio e quale

filamento sarà tagliato prima! RNasi: generalmnete idrolizzano il

BamHI: legame fosfodiestrico con 3’-fosfato,

riconosce la sequenza GGATCC, e la taglia a livello di 5’(OH)

G, per idrolisi. Nell’estremità 3’ si genera un gruppo ossidrilico,

mentre in 5’ c’è un gruppo fosforico.

Sono utilizzate anche altre nucleasi, per lo studio di esoni e introni e altro; in generale le nucleasi possono

tagliare o due filamenti insieme, o uno solo alla volta, e questo è un elemento da considerare a seconda dello

scopo dell’esperimento.

Endonucleasi S1: taglia un filamento di DNA alla volta, è utile per riconoscere sequenza introniche, il DNA

interagisce con il suo filamento complementare di mRNA, ci costituisce quindi un ibrido DNA-RNA, che sarà

completamente adeso dove ci sono le sequenze esoniche, mentre si formeranno anse di DNA all’altezza delle

sequenze introniche. Si interviene quindi con l’enzima S1, che taglia solo gli introni. Si procede poi con la

digestione dell’mRNA, quindi si ottengono solamente le sequenze esoniche del DNA, cioè quelle codificanti

proteine.

Esonucleasi: possono tagliare un solo filamento alla volta (esonucleasi II) oppure due alla volta (Bal 31). Sono

usate insieme alle endonucleasi per mutagenesi in vitro. Avendo un ssDNA, lo si fa interagire con un primer

sintetizzato in vitro che porti la delezione, cioè se si deve eliminare la regione B, si mette un primer che abbia

parte della regione A e parte della C, l’ssDNA interagirà con il primer e il segmento B formerà un’ansa che

non sarà copiata. Polimerasi e ligasi, a partire dal primer sintetizzeranno un filamento complementare.

Endonucleasi taglia l’ansa formata dal filamento B, dal taglio procede l’esonucleasi II, che procede all’idrolisi

dell’intero filamento stampo, lasciando intatto quello neosintetizzato.

DNasi pancreatica I: taglia il DNA, a singolo filamento.

 Molto usata per creare sonde, tramite nick translation, cioè fa un’incisione su un filamento, in regioni

ricche di AT (ma in realtà non è un enzima particolarmente selettivo).

 È anche utilizzata per studiare le interazioni DNA-proteina, poiché non taglia il DNA se questo

interagisce con le proteine.

 Si usa per rimuovere DNA in preparazioni di RNA.

RNasi A pancreatica: si usa in mini-prep per digerire RNA. Enzima molto resistente, inoltre non richiede

cofattori e ioni divalenti.

RNasi H: isolato da retrovirus, va a idrolizzare RNA che formano eteroduplex con DNA. Tagliando un

ribonucleotide alla volta, lascia estremità 3’(OH) di RNA libera, che può agire da primer per la DNApol. Agisce

in modo opposto rispetto alle tipiche RNasi, generando estremità 5’-fosfato, 3’OH

LIGASI

In vivo serve a legare le inserzioni di DNA dopo la rimozione dei primer e la sintesi del DNA sostitutivo, mentre

in vitro è usata per legare l’inserto ai plasmidi. Sono stati isolati diversi tipi di ligasi, la più usata è quella del

fago T4, per metodi più complessi si usa una ligasi termofila.

La ligasi in vitro lega con più facilità estremità coesive, meglio se sporgono di molte basi, il processo è meno

efficiente se le basi sporgenti sono poche o 1 (TA cloning), ed è in assoluto inefficiente se bisogna legare

estremità piatte, si può intervenire con la tecnologia DNA linker per renderle appiccicose, o in alternativa

bisogna aumentare di 83 volte la concentrazione del DNA, eventualmente addensandolo con PEG.

La reazione può essere intermolecolare o intramolecolare, cioè al seguito di un taglio con un enzima che

genera le stesse estremità sui due filamenti, questi possono legarsi tra loro (intermolecolare, utile per il

clonaggio), o legare il DNA da cui sono stati tagliati (intramolecolare, si cerca di sfavorirla). La reazione

avverrebbe con maggiore efficienza a 37°, trattandosi di un enzima fagico, ma a quelle temperature la

cinetica molecolare nella soluzione risulta eccessiva, per cui si preferisce svolgere la reazione a 4-16°.

Come si prepara e si svolge il processo in vitro: si pone in una soluzione di tampone adeguato (con ATP)

l’enzima e i suoi cofattori, il DNA plasmidico e l’inserto linearizzati. I due DNA linearizzati tendono a interagire

con legami idrogeno, e le estremità appiccicose si legano in modo provvisorio, la ligasi, attivata da ATP (ATP+

ligasi PPi + AMP-ligasi) interagisce con il gruppo P in 5’ e si forma un legame tra i due fosfati (quello

dell’AMP e quello in 5’). Questo porta alla formazione di un legame tra il gruppo –OH in 3’ e il fosfato in 5’.

La ligazione avviene se e solo se ho 5’-P3’ –OH.

FOSFATASI e CHINASI

Le fosfatasi defosforilano, le chinasi fosforilano. In genere è defosforilato il P in 5’, la reazione è più efficiente

se le estremità sono sporgenti in 5’ perché P è più esposto; se invece le estremità sono sporgenti in 3’ la

reazione è poco efficiente o non avviene, per via dell’ingombro sterico. È un enzima utile perché lo si può

usare per defosforilare l’inserto e impedire quindi che avvengano reazioni intramolecolari, inoltre si dà una

direzionalità al legame con l’inserto.

Fosfatasi alcalina è quella più usata, estratta dal gambero, anche se troppo termolabile, o dal vitello, ce ne

sono altre ma si rischia che l’affinità dell’enzima per il DNA sia eccessiva.

TOPOISOMERASI

Svolge il DNA nelle regioni ricche di TA, si lega a sequenze specifiche e nello specifico a una base, con una

reazione tra il fosfato e la tirosina nel sito attivo dell’enzima. Il legame rimane anche se il nucleotide è scisso

dal DNA, e a quel punto è favorito il legame di quel nucleotide con un altro filamento, che attacca il legame

fosfodiestereo e avviene il rilascio della topoisomerasi (A COSA SERVE ESATTAMENTE?????)

POLIMERASI

Esistono diversi tipi di polimerasi, le più usate in vitro sono la taq polimerasi che resiste al calore e si usa per

la PCR, ma ha scarsa attività di correzione di bozze, per cui introduce molti errori. La polimerasi I, con attività

di polimerizzazione 5’3’, esonucleasi 3’5’ per la correzione di bozze e esonucleasi 5’3’ per l’attività di

nick translation e sostituzione del primer RNasico. Ultimamente si preferisce usare la polimerasi I di Klenow,

che ha una delezione della regione esonucleasica 5’3’, per cui la polimerasi modificata è capace di

polimerizzare nuovi segmenti dove il DNA è presente in singolo filamento, senza tuttavia rimuovere e

sostituire i nucleotidi presenti alla fine del nick.

L’oloenzima di Klenow è usato per sostituire i primer di sonde radioattive, sintetizzate a partire da un nick

creato da DNasi I, una polimerasi integra a partire dal nick produce un filamento stampo rimpiazzando i

nucleotidi già esistenti con nucleotidi marcati, così si produce un filamento stampo del gene completamente

marcato. Klenow completa i nick, sempre con nucleotidi marcati. Poi DNasi specifica elimina DNA non

marcato, se per esempio quello marcato non ha fosfato ma solfato.

La polimerasi III ha solo attività di polimerizzazione, ed è quella usata per la polimerizzazione e la replicazione

del DNA.

Clonaggio del DNA

I) Restrizione: in un piccolo volume di DNA si mette una soluzione tampone che favorisca l’azione

dell’enzima di restrizione, con Sali alla giusta concentrazione, ioni magnesio, cofattori

fondamentali, agenti riducenti e con un pH controllato. Il tampone è molto concentrato. Si mette

infine l’enzima e si fa reagire alla temperatura ottimale, ci sono enzimi termofil