Ingegneria Genetica, Prof. Laveder

Clonaggio

Clonaggio: riproduzione asessuata naturale o artificiale per cui si origina un individuo identico al precedente. L'ingegneria genetica utilizza tecniche per il clonaggio di vettori in cellule, per lo studio di proteine ricombinanti, per studiare un particolare gene, produrre una proteina ricombinante utile in modo rapido, per diagnosi o per originare organismi transgenici.

Fasi del clonaggio di un gene di interesse

Per clonare un gene di interesse ci sono tre fasi, in sintesi:

1. Ligazione del DNA ricombinante con il vettore

Il gene ricombinante deve essere tagliato dal DNA di origine, questo si fa con enzimi di restrizione. Una volta tagliato sarà integrato a un vettore, cioè una breve sequenza di DNA che deve avere un'origine di replicazione, un sito per il clonaggio del DNA ricombinante e un gene per aiutare la selezione (in genere si usano antibiotici, poiché la cellula ospite ne ottiene un vantaggio evolutivo, e anche perché è molto facile selezionare le cellule in cui la clonazione sarà avvenuta con successo).

Mobilità passiva: il vettore NON deve avere, per la sicurezza, geni per la coniugazione e per la mobilità passiva. Se un batterio che contiene un plasmide mobilizzabile, che contiene solo OriF, senza avere i geni per costituire il pilo, può acquisire un plasmide F per un collegamento (non mediato dal pilo) con un batterio che possiede il plasmide F. Il batterio con entrambi i plasmidi può poi passare il plasmide mobilizzabile ad un terzo batterio.

Il vettore sarà tagliato con gli stessi enzimi di restrizione usati per il gene di interesse, cosicché si generi con estremità uguali; grazie all'enzima ligasi (enzima non specifico, si limita a legare due frammenti) avviene poi la ligazione del gene e del vettore.

Problema: possono riformarsi legami intramolecolari!

2. Inclusione del plasmide ricombinante nella cellula ospite

Il plasmide ricombinante così costituito deve entrare nella cellula ospite, ma sia il DNA sia la membrana cellulare hanno cariche negative, per cui questo processo deve essere forzato. Il metodo più facile è quello chimico, utilizzando CaCl₂, accoppiato a shock termico, cosicché la membrana, prima irrigidita dal freddo, si apra più facilmente per favorire il passaggio del plasmide. Ci sono poi altri due metodi: elettroporazione e gene gun.

Passato del tempo, si suppone che il plasmide sia entrato nella cellula ospite, e avviene la replicazione in vivo del plasmide e quindi del gene esogeno.

3. Selezione e isolamento delle colonie in cui è avvenuta l'inclusione

Per selezionare esclusivamente le cellule col plasmide ricombinante si piastrano le cellule su un terreno selettivo. Se, per esempio, il vettore ha un gene di resistenza a un antibiotico, la piastra avrà quell'antibiotico disciolto e vivranno solo le cellule con il vettore integrato.

Per verificare poi se è avvenuta la corretta selezione, si può analizzare la corsa elettroforetica del DNA, confrontandola con dei controlli, cioè con il solo vettore e con il solo plasmide.

Amplificazione di un gene

In linea teorica, per amplificare un gene la cosa più veloce è processarlo alla PCR. Il problema di questo metodo è che è necessario avere una sonda che agisca da primer, e per avere la sonda bisogna conoscere bene la sequenza genica. Le sonde si possono ottenere da tecniche come la clonazione prima sintetizzata, che dunque non richiede la conoscenza precisa del gene di studio.

Esperimenti di DNA ricombinante

Il primo esperimento di DNA ricombinante fu fatto da Stanley e Boyer, che integrarono il gene per la resistenza alla canamicina in un vettore che aveva già la resistenza alla tetraciclina, in uno stafilococcus aureus. Un batterio che aveva integrato il plasmide ricombinante avrebbe acquisito due resistenze, quello che aveva integrato il solo vettore invece solo una. Per verificare al meglio il successo dell'esperimento, analizzarono su gel di elettroforesi le bande che si formarono.

A partire da questa tecnologia, si sono sviluppate nuove tecniche di produzione di proteine ricombinanti a scopo terapeutico, e si è anche sviluppato il progetto genoma umano. Per sequenziare l'intero genoma si procedette con metodo "omico", cioè si sequenziarono frammenti in ordine casuale, per poi procedere per via informatica alla creazione di una sequenza lineare. Si rivelò essere il metodo più economico e rapido.

Plasmidi

Sono sequenze di DNA circolare, di diversa lunghezza, naturalmente presenti nelle cellule, soprattutto batteriche. Possono essere DNA nudi (plasmidi o BAC e YAC che sono cromosomi artificiali in batteri e lieviti) oppure di origine fagica, cioè DNA protetti da una capsula proteica che media il riconoscimento con il batterio e facilita l'entrata del DNA nel batterio.

Tipi di plasmidi

Plasmidi F

DNA circolare, di circa 100 kbp, con un gene abbastanza ingombrante che codifica per la formazione del pilo, cioè una struttura che collega un batterio "maschio" ad un altro batterio. Tramite il pilo passa il plasmide. Alla fine della coniugazione, entrambi i batteri hanno il plasmide in doppio filamento.

Talvolta il plasmide si integra nel genoma batterico, e determina tramite coniugazione il passaggio da una cellula all'altra di plasmide + segmento di DNA (è troppo lungo per passare del tutto, per cui ne passa solo una sezione); questo fenomeno è importante per sequenziare il DNA batterico.

Plasmidi R

Plasmidi che portano uno o più geni per la resistenza a antibiotici. Utilissimi alle cellule ospiti, possono avere geni per la coniugazione, ma non è ovvio che sia così. I geni per la resistenza sono inseriti entro una sequenza che ne conferisce la peculiare caratteristica di trasponibilità: le sequenze trasposone, palindromiche al capo e alla coda dei geni R si possono scindere dal plasmide di appartenenza e fondere con un altro plasmide.

Gli antibiotici agiscono su sintesi di parete (ampicillina e penicillina) impedendo quindi la divisione cellulare e l’accrescimento oppure sulla sintesi proteica, agendo a livello dei ribosomi sulla subunità 30S o 50S, andando a interferire con l’inizio, l’allungamento o il termine della traduzione (canamicina, cloranfenicolo e altri). In risposta agli antibiotici, le proteine per la resistenza possono intervenire idrolizzando la molecola, impedendo il legame con il bersaglio o l’entrata nella cellula, oppure favorendo l’uscita dalla cellula dell’antibiotico. Alcune proteine resistenti agiscono a livello della parete, per cui possono diffondersi nel terreno e generare una resistenza indotta su cellule non resistenti; avviene la crescita, debole, di colonie satelliti, che sfruttano appunto la proteina resistente diffusa nei dintorni della colonia resistente.

Plasmidi colicinogenici

Plasmidi di dimensione molto limitata, presenti in alto numero di copie, che portano fondamentalmente due geni: uno per la sintesi di colicina, proteina molto dannosa per i batteri, e uno per la resistenza alla colicina. Il batterio che possiede questo plasmide uccide i batteri vicini ed è più competitivo per il nutrimento. Plasmidi non coniugativi, ma possono essere mobilizzati se contengono OriF. È molto utilizzato ColE1.

Plasmidi virulenti

Plasmidi che determinano la patogenicità di un batterio, altrimenti meno dannoso. Tra gli elementi che costituiscono i plasmidi ci sono i repliconi: sono la minima sequenza necessaria alla replicazione del plasmide nella cellula ospite, hanno un’origine di replicazione, geni codificanti proteine utili e sistemi per il controllo del numero di copie. Infatti, il replicone garantisce che ci sia un numero costante di copie di plasmidi, maggiore o minore a seconda della grandezza del plasmide stesso, ma non solo.

Replicone di ColE1

Costituito da un’origine OriC, a monte un gene (RNA II) che costituisce un primer per la replicazione, all’inizio del gene RNA II c’è in antisenso un breve gene RNA I, per il controllo di RNA II. Inizialmente è trascritto RNA II, fino a OriC. Una volta terminata la trascrizione, l’RNA II non è maturo e deve essere tagliato l’ibrido DNA-RNA. Questo processo, che porta alla maturazione dell’RNA II è reso possibile dall’RNasi H (origine batterica), ma avviene se e solo se l’RNA è ripiegato correttamente. È in fase di maturazione che avviene il controllo da parte del retrotrascritto RNA I, che si lega all’RNA II (kissing complex) e ne impedisce il corretto ripiegamento, cosicché non potrà avvenire la maturazione. Il legame tra i due RNA è stabilizzato dalla proteina ROP. RNA I tuttavia è una molecola con un’emivita breve, e la sua unica funzione è quella di controllo e regolazione del numero di copie. Infatti, più copie ci sono più è alta la concentrazione di RNA I, e più è forte la sua azione inibente. La replicazione del plasmide a partire da oriC avviene solo se il primer, cioè RNA II, si stacca, per cui RNA I regola e mantiene costante il numero di copie nella cellula, a meno che si può trattare la cellula con un antibatterico che inibisce la sintesi proteica, come per esempio la canamicina. La cellula non può dividersi perché la replicazione del genoma richiede la sintesi di proteine, invece il plasmide, in cui non avviene più la sintesi di ROP, si moltiplica in modo incontrollato, perché il complesso RNA I-RNA II non è così stabile, quindi RNA II si stacca e la polimerasi batterica, nel citosol, è una proteina piuttosto resistente, per cui continua a operare la replicazione del DNA plasmidico fino alla degradazione. Se ColE1 in condizioni fisiologiche si trova in 20 copie circa, con canamicina raggiunge le 100 copie. Questo è un grande vantaggio perché si riesce a ottenere con questo procedimento una grande quantità di DNA plasmidico. Un altro metodo per incrementare le copie di DNA plasmidico è rimuovere dal replicone i geni per ROP, cosicché aumenta fino a tre volte la quantità di copie!

Controllo rilassato: controllo della replicazione è mediato dall’RNA, non da proteine! Avviene in plasmidi con basso numero di copie, 20 copie di ColE1 costituiscono circa il 4% dell’intera composizione del DNA cellulare. Sono plasmidi non coniugativi, talvolta possono avere OriF (mobilitazione passiva).

Controllo stringente della replicazione: Per plasmidi F e R il controllo è stringente perché è mediato da una proteina, Rep A, la quale come monomero agisce da attivatore della trascrizione, mentre come dimero agisce da inibitore. Quando il numero di copie è maggiore di uno, aumenta la concentrazione di RepA, e l’equilibrio si sposta verso la dimerizzazione. Come dimero, Rep A si lega agli iteroni R1, R2, R3 (tre sezioni di DNA regolatrici) di due diversi plasmidi, si forma quindi un complesso proteina plasmidi e la replicazione non può più avvenire. F e R sono plasmidi abbastanza lunghi, e se fossero presenti in più di 2-6 copie andrebbero a compromettere l’attività cellulare, per questo avviene un controllo stringente, un plasmide infatti non ha alcuna intenzione di ledere la cellula ospite.

Cosa succede quando la cellula si divide?

Per plasmidi a controllo rilassato: il numero di copie è talmente alto che sicuramente una divisione casuale porterà alla formazione di due cellule figlie, entrambe con il plasmide. Dopo la divisione quindi il numero di copie di plasmide nelle due cellule figlie è diverso, ma la regolazione con RNA II/RNA I agirà per riportare un equilibrio.

Per plasmidi a controllo stringente invece la segregazione è controllata, esattamente come è controllata la segregazione del genoma. Nel genoma troviamo parA e parB, geni per la sintesi di un eterodimero parA/parB che funge da attivatore di trascrizione di parS, legandosi a oriS. Queste interazioni implicano l’ancoraggio del genoma a un sito vicino al setto: ogni cellula figlia avrà un genoma. Mutanti per parS possono portare alla formazione di cellule con due genomi e cellule senza genoma. I plasmidi F si segregano allo stesso modo, cosicché entrambe le cellule abbiano il plasmide.

Incompatibilità

Non sempre i plasmidi sono compatibili, in una cellula possono coesistere più plasmidi diversi, ma in linea generale sono incompatibili plasmidi che abbiano lo stesso sito per ParS, che siano della stessa categoria o che abbiano lo stesso replicone. Per cui ColE1 e F sono compatibili, F e R no, e si segregano in due cellule diverse, una avrà solo F, l’altra solo R.

Classi di batteriofagi

Ci sono diverse classi di batteriofagi, quelli icosaedrici e quelli bastoncellari. In generale a seguito dell’infezione virale si succedono diverse fasi: una precoce, in cui avviene la replicazione del DNA virale, una tardiva in cui ha inizio la sintesi delle proteine della capsula e l’impacchettamento del DNA all’interno, e infine, per alcuni fagi, la lisi della cellula ospite e la diffusione dell’infezione.

• Icosaedrici virulenti (T4, T3, T7): Sono costituiti da una capsula icosaedrica proteica, in cui è contenuto il genoma, e una coda proteica fondamentale per l’infezione della cellula bersaglio. Possono essere fagi virulenti, che intraprendono cioè esclusivamente il ciclo litico (T3, T4, T7), o fagi temperati, come λ, che a seconda della vitalità della cellula ospite possono intraprendere il ciclo litico o il ciclo lisogeno. I fagi virulenti hanno un DNA di circa 50 kb, in cui tutti i geni sono essenziali. Come vettore: Il DNA fagico, in generale, è piuttosto compresso all’interno della capsula, quindi non sarebbe possibile integrare altri segmenti di DNA, senza alterare la funzionalità del fago.
• Icosaedrici temperati (λ): hanno un complesso sistema di regolazione per determinare il ciclo da intraprendere. La regolazione avviene grazie alla proteina CII, molto instabile (è aiutata da CIII), se il batterio riesce a degradarla, quindi se è abbastanza in salute, si instaura il ciclo litico. Altrimenti, se CII resiste nel citoplasma, va ad attivare il repressore del ciclo litico e CI, e inizia il ciclo lisogeno. Se si è instaurato il ciclo lisogeno, la cellula non potrà essere infettata dallo stesso virus, e ponendo batterio e virus insieme su una piastra si può vedere la presenza dopo l’incubazione di placche di lisi torbide, in cui a partire dall’infezione di un batterio e dalla sua lisi si è instaurata un’infezione di portata maggiore. Tuttavia in alcuni batteri il DNA fagico avrà intrapreso la via lisogena, per cui il batterio non potrà essere lisato, e per questo le placche risulteranno torbide. Solo un fago mutato potrà originare placche chiare. Come vettore: Nel contesto di una clonazione, non è utile che il DNA fagico si integri nel DNA batterico, per cui, nell’ottica di utilizzare lambda come un vettore, si possono rimuovere i geni per l’integrazione e una regione centrale di non nota utilità, i cui geni non sono essenziali. Si dà origine quindi a un fago solo litico, con 9 kb di DNA ricombinate che possono essere integrate.
• Fagi bastoncellari: il più noto è M13. Costituiti da un DNA circolare a singolo filamento (o talvolta RNA), sono costituiti da una capsula proteica di proteine tutte uguali che si assemblano intorno al DNA, in genere non lisano la cellula, e sono detti "gentili", il batterio è solo indebolito dalla presenza del virus, una parte delle copie del DNA replicato rimangono nella cellula batterica, un’altra parte, replicata con meccanismo a circolo rotante, esce dalla cellula con la capsula, cosicché l’infezione sia mediata sia da virus che escono dalla cellula sia dalla divisione cellulare della cellula infetta. Oltre alla parte filamentosa ai capi del virus ci sono due regioni proteiche diverse, che conferiscono asimmetria al fago, una di queste è fondamentale per l’infezione, il fago riconosce la cellula bersaglio, che deve essere "maschio", cioè deve avere i geni per la formazione pilo, attraverso il quale passa il genoma fagico. Come vettore: Questi fagi sono utilissimi per il sequenziamento del DNA con il metodo di Sanger (adesso meno usato), per il fatto che il DNA al loro interno è a singolo filamento, utile anche per il sequenziamento di librerie di cDNA che date le dimensioni ridotte del fago risultano comprimibili in un piccolo spazio (cioè in poco spazio c’è un intero genoma eucariotico, in genere, che può essere facilmente sequenziato). È anche interessante per il fatto che un solo gene del genoma fagico codifica per la proteina di rivestimento, modificando questo gene e immettendone un altro che codifica per un'altra proteina si può dare origine a un fago con una capsula proteina che costituita dalla proteina ricombinante di interesse, facilmente isolabile. In questi fagi è inoltre facile indurre una mutazione puntiforme.

Per esempio: ho M13 wt, con tre regioni A, B e C, introduco un nuovo filamento con le regioni A e C. Data la similitudine tra i due filamenti questi formeranno un eteroduplex, il filamento wt tuttavia avrà una parte, la B, non appaiata. Facendo procedere poi la replicazione dell’eteroduplex, con basi modificate (zolfo al posto di fosforo) otterrò due filamenti diversi, ma la regione B avrà ancora fosforo. Introducendo un endonucleasi, questa taglierà solo le regioni con il fosforo, e dal taglio un’esonucleasi procederà a degradare tutto il filamento wt, lasciando solamente quello modificato.

Il vantaggio di usare i fagi è notevole, perché naturalmente un fago immetterebbe in un batterio il suo DNA, per cui si rivela un vettore ad alta efficienza di integrazione del DNA plasmidico, produce inoltre grandi quantità di DNA. Lo svantaggio è che l’inserto deve avere dimensioni ben precise perché il fago sia funzionante e possa avvenire l’impacchettamento.

Vie naturali di entrata del DNA in un batterio

• Coniugazione: avviene naturalmente in E. coli, ma non è praticabile per sicurezza.