Immunopatologia e patologie associate all'infiammazione

Appunti di patologia molecolare

Capitolo 1 – Introduzione

Una patologia può venir studiata a vari livelli:

• Epidemiologico (a livello di popolazione), al fine di comprendere quali popolazioni/luoghi sono colpiti dalla malattia.
• Individuale (a livello del singolo paziente), così da studiarne i sintomi nell’individuo e gli effetti sullo stesso durante il decorso.
• Fisiopatologico (studio a livello di singoli organi), per capire come si modifica funzionalmente e strutturalmente il singolo organo colpito.
• Istopatologico (studio a livello di singoli tessuti).
• Citopatologico (a livello di singole cellule), per capire quali siano le deviazioni funzionali delle cellule colpite.
• Patofisiologico della cellula (concentrandosi sui singoli organelli della cellula).
• Molecolare (concentrandosi sulle molecole coinvolte nella patologia), così da capire quali meccanismi e singole molecole sono alterate nella cellula.

Significato di patologia molecolare

Qual è il significato di patologia molecolare? È la scienza che si occupa di studiare le molecole colpite dalle diverse malattie (principalmente DNA, RNA e proteine). Lo studio delle malattie a livello molecolare è importante in quanto permette di conoscere i meccanismi eziopatologici alla base di diverse malattie umane (capire quali molecole sono coinvolte, come queste alterano alcuni meccanismi cellulari e quali sono le cause).

Lo studio delle cause di una malattia attraverso la patologia molecolare dà la possibilità poi di studiare, sviluppare e attuare delle misure preventive (correzione dello stile di vita, dell’alimentazione, ecc.), mentre la comprensione del meccanismo patogenetico permette di sviluppare terapie appropriate (per eliminare errori in questi meccanismi). Tutto ciò richiede delle indagini a livello molecolare.

Utilità dei test molecolari

• Studiare le cause di una malattia (mutazioni genetiche, riarrangiamenti per traslocazione di porzioni di DNA, variazioni dei quantitativi di RNA o proteine nella cellula, ecc.).
• Diagnosi di malattie (ad esempio, alcune infezioni da virus vengono diagnosticate grazie a test molecolari per osservare la presenza nel sangue di specifici RNA).
• Prevenzione e trattamento di una patologia (ad esempio, il cancro colon rettale può essere dovuto a mutazioni ereditabili del gene APC, quindi se un individuo possiede la mutazione può variare il proprio stile di vita in modo da prevenire la comparsa della malattia).

Un concetto fondamentale è che molte malattie sono multifattoriali e complesse, in quanto alla base vi sono una serie di diversi eventi che cambiano il livello di espressione di diversi geni e il quantitativo di diverse proteine nella cellula. L’identificazione e il monitoraggio dei cambiamenti dovuti alla malattia è essenziale per il disegno di nuovi farmaci capaci di agire specificatamente su quei cambiamenti (farmaci di nuova generazione).

Alcuni esempi di malattie che vengono trattate agendo a livello molecolare sui loro meccanismi patogenetici sono la leucemia mieloide cronica (CML), la leucemia linfoblastica acuta (ALL) e l’artrite reumatoide (RA).

Leucemia mieloide e cromosoma di Philadelphia

Il cromosoma Philadelphia consiste nel cromosoma 22 modificato per l'inserzione di un frammento terminale proveniente dal cromosoma 9. A seguito della traslocazione, il gene Abelson (ABL) passa dal cromosoma 9 alla regione di raggruppamento dei punti di rottura (BCR) del cromosoma 22 con formazione del gene chimerico ABL-BCR che codifica per una tirosina chinasi priva dei domini di regolazione negativa.

Storicamente, questa malattia è stata scoperta nel 1845, ma solamente nel 1986 è stata identificata la causa e appena nel 1998 è stato sviluppato un inibitore della proteina ABL-BCR (Imatinib); questo farmaco lega la chinasi chimerica a livello del suo sito di legame con l’ATP impedendo così il legame della molecola alla chinasi. La chinasi priva di ATP non è così in grado di fosforilare substrati a valle portando alla malattia.

Leucemia linfoblastica acuta

Questa malattia si osserva soprattutto nei bambini (è la più comune forma di cancro giovanile). Recentemente è stato scoperto che in questa malattia è coinvolta la chinasi JAK (1 e 3). Questa chinasi, recettore di IL-7, quando mutata fosforila le proteine STAT presenti nella cellula anche in assenza del legame di IL-7. Le STAT attivate inducono sopravvivenza e proliferazione della cellula (inibizione dell’apoptosi) che se troppo spinta a causa della mutazione porta alla leucemia linfoblastica acuta. È stato sviluppato un inibitore molecolare di JAK 3 in grado di legare il suo sito catalitico.

Artrite reumatoide

È una malattia sistemica che consiste in una infiammazione cronica autoimmune che colpisce diversi tessuti, ma principalmente le giunture. In questa malattia sono coinvolte diverse citochine che sono responsabili della degradazione della matrice cartilaginea (avremo diminuzione delle cartilagini) e delle ossa (influenzando positivamente l’attività degli osteoclasti). Ad oggi, sono stati sviluppati e messi in commercio diversi farmaci di nuova generazione che bersagliano specifiche molecole infiammatorie e altri fattori che influenzano l’attività di fibroblasti e osteoclasti, così da rallentare il progresso della malattia.

Capitolo 2 – Infiammazione

La risposta infiammatoria (o infiammazione) è un meccanismo omeostatico del nostro organismo. Esso è una risposta protettiva del nostro organismo ad un danno. L’obiettivo di questo meccanismo è quello di rendere possibile ed agevolare l’eliminazione della causa di un danno e di stimolare il successivo processo di riparazione del tessuto leso.

L’infiammazione tuttavia, non è sempre qualcosa di positivo per il nostro organismo. Esistono infatti malattie dovute ad infiammazione (malattie infiammatorie croniche) come l’artrite reumatoide (la malattia provoca nell’individuo anche functio-lesa, in quanto intacca la possibilità di movimento dell’articolazione colpita).

Clinicamente, i segni cardine dell'infiammazione sono: calore della parte infiammata, arrossamento, tumefazione, dolore, alterazione funzionale (calor, rubor, tumor, dolor, functio laesa). L’infiammazione coinvolge diverse proteine, mediatori, cellule e vasi sanguigni. Come detto, il suo scopo è quello di agevolare l’eliminazione della causa del danno al tessuto (agevola però anche l’eliminazione delle cellule necrotiche e delle parti del tessuto danneggiate dal processo) e stimolare la successiva riparazione del tessuto. Il processo infiammatorio viene mantenuto sotto stretto controllo dal nostro organismo così da minimizzare il danno al tessuto.

La riparazione del tessuto può avvenire per rigenerazione (le cellule danneggiate vengono sostituite da cellule dello stesso tipo) oppure per cicatrizzazione/fibrosi (vengono sostituite da connettivo). La reazione infiammatoria può in alcuni casi causare danni considerevoli al tessuto (danno da infiammazione). Il danno può addirittura, in certi casi, divenire esso stesso la causa della malattia; questo solitamente se:

• La reazione è molto forte
• La reazione è prolungata
• La reazione è inappropriata (autoimmune)
• La reazione è eccessiva (ipersensibilità)

Patologie umane associate all’infiammazione sono: infezioni (funghi, parassiti, batteri), traumi e danni tissutali dovuti a sostanze chimiche o ad agenti fisici, reazioni immuni, necrosi tissutale, disordini emodinamici (aterosclerosi), neoplasie. L’infiammazione si può distinguere in cronica e acuta.

Il fenomeno della fibrosi e del danno tissutale si osserva in entrambi i casi, ma nella acuta è limitato mentre nella cronica è severo e progressivo (peggiora nel tempo). I segni locali e sistemici sono predominanti nella acuta mentre meno predominanti o latenti (ad esempio la silicosi che non dà sintomi per molti anni) nella cronica. Queste due forme possono comunque coesistere, infatti molte variabili legate all’infiammazione possono cambiare nel tempo portando una infiammazione acuta a divenire cronica (avremo una fase di transizione in cui cronica e acuta coesistono).

Componenti dell'infiammazione cronica/acuta e loro principali funzioni

Infiammazione acuta

Il teatro dell’infiammazione acuta è il microcircolo (capillare) che regola lo scambio dei nutrienti e dei rifiuti, dei gas e dei liquidi, il trasporto di ormoni e media la difesa dell’organismo contro i patogeni. Tutto ciò avviene a livello capillare in quanto la velocità di scorrimento del sangue al loro interno è molto minore rispetto agli altri vasi quindi gli scambi avvengono più facilmente.

Eventi principali che si susseguono nell’infiammazione acuta:

• Riconoscimento degli stimoli infiammatori (a livello del tessuto colpito)
• Produzione/rilascio dei mediatori iniziali (a livello del tessuto colpito)
• Cambiamenti vascolari
• Reclutamento dei neutrofili nel tessuto
• Formazione dell’essudato infiammatorio (un mix di siero, proteine, neutrofili e altre componenti immunitarie)

Non sempre si osserva l’essudato infiammatorio; in caso di scottature (danno da fonte energetica) avremo la formazione di un essudato incompleto costituito principalmente da Sali e acqua.

Riconoscimento di microbi e cellule necrotiche

Nel riconoscimento sono coinvolti due sistemi, ossia innato e adattivo. Con l’innato, ossia il primo che entra in gioco, avremo il riconoscimento di moltissimi patogeni grazie ad un numero molto limitato di recettori (PRRs, pattern recognition receptor) presenti sulle membrane cellulari di linfociti, cellule dendritiche, macrofagi, neutrofili, cellule epiteliali ed endoteliali. Attraverso questi recettori, si ha un iniziale riconoscimento del patogeno direttamente nel sito di infezione. I PRRs riconoscono oltre alle molecole rilasciate o presenti sul patogeno anche sostanze rilasciate da cellule self morte. I segnali di pericolo (molecole) riconosciute dai PRRs sono i PAMPs (molecole presenti o rilasciate dal patogeno) e DAMPs (molecole rilasciate da cellule morte). Solitamente i PAMPs sono acidi nucleici, glicoproteine, lipoproteine e componenti della membrana microbica. A seguito del legame dei PAMPs con i PRRs, le cellule del sistema innato avviano la risposta infiammatoria producendo e secernendo citochine e chemochine con lo scopo di reclutare cellule immunitarie e inizializzare la risposta immunitaria adattativa.

Fanno parte del sistema immunitario innato i linfociti NK (Natural killer), i mastociti, gli eosinofili, i basofili, i macrofagi, i neutrofili e le cellule dendritiche: queste cellule hanno, tra loro, meccanismi di funzionamento molto diversi, ma sono tutte in grado di eliminare e/o di identificare gli agenti patogeni. La componente cellulare facente parte del sistema immunitario adattativo è costituita da linfociti.

Il nostro sistema immunitario innato è capace inoltre di distinguere microbi patogeni e non patogeni (commensali) sulla base della presenza o assenza di DAMPs. I microbi non patogeni presentano infatti PAMPs riconoscibili dalle cellule dell’immunità innata, ma non portano alla produzione di DAMPs da parte delle cellule del tessuto.

Esistono diverse tipologie di DAMPs:

• Proteine intracellulari (heat-shock proteins, proteine leganti il calcio, ecc.)
• Molecole non proteiche (ATP, acido urico, DNA, RNA, fosfolipidi alterati, ecc.)
• Proteine che derivano da matrice extracellulare generate solo in presenza di tessuto danneggiato (acido ialuronico)

Una proteina da shock termico è una sostanza proteica sintetizzata quando le cellule sono esposte alle alte temperature oppure ad alte condizioni di stress. Queste spesso agevolano il corretto ripiegamento delle proteine.

PAMPs e DAMPs vengono riconosciuti da TLRs (Toll-like receptors) e da NLRs (Nod-like receptors), ossia due diverse famiglie di PRRs. I TLRs si trovano nella membrana plasmatica e in quelle endosomiali e ha lo scopo di riconoscere microbi extracellulari o ingeriti dalla cellula. Il riconoscimento e attivazione del di un recettore TLR porta la cellula a produrre e secernere diverse molecole (quali citochine pro-infiammatorie). I TLRs possono venir distinti in MyD88 dipendenti e indipendenti. MyD88 è una proteina che prende parte in alcuni casi (MyD88 dipendenti) alla cascata di segnalazione che segue il riconoscimento del microbo e che porta all’attivazione del fattore di trascrizione NF-Kb che stimola la trascrizione di citochine infiammatorie e interferone antivirale di tipo 1.

Esistono diversi difetti di molecole appartenenti alle vie di segnalazione attivate dal riconoscimento di microbi da parte di TLRs. Si sono osservati difetti di MyD88, TLR-2, TLR-4, NF-kB, ecc.; questi difetti portano a una deficienza della risposta immunitaria (l’immunità innata non riesce ad uccidere i microbi).

Gli NLRs sono presenti non solo nei vertebrati ma anche in organismi evolutivamente inferiori. A conferma di ciò, questi recettori sono stati osservati per la prima volta (nel 1956) all’interno di cellule vegetali, dove giocano un ruolo importante nella resistenza a parassiti e microbi patogeni. Gli NLRs sono evolutivamente molto conservati (hanno funzione di difesa in tutti i diversi organismi in cui si ritrovano), sono espressi prevalentemente nel citosol di diversi tipi cellulari (prevalentemente cellule epiteliali e dell’immunità innata) allo scopo di riconoscere segnali relativi ad invasione intracellulare anche se alcuni di essi non riconoscono microbi ma fanno parte di complessi citoplasmatici detti inflammasomi (complessi multiproteici che percepiscono prodotti come l’acido urico e i cristalli di colesterolo provenienti da cellule morte) capaci di attivare la caspasi 1 (enzima capace di effettuare dei tagli a livello di specifiche cisteine e acidi aspartici di proteine) che trasforma la IL-1β nella forma biologicamente attiva capace di agire sulle cellule endoteliali dei vasi stimolando l’esposizione di recettori per i leucociti (si ha avvio del processo di reclutamento dei leucociti).

Nell’uomo esistono ben 23 diverse famiglie di NLRs, tuttavia i più importanti sono i NOD 1 e 2 che possono essere oggetto di mutazione causando alcune patologie infiammatorie croniche intestinali. NOD 1 e 2 sono in grado di percepire molecole prodotte dai batteri (ad esempio peptidoglicani della parete batterica). I recettori NOD una volta attivati sono in grado, attraverso diverse vie di segnalazione di attivare i fattori MAPK e NF-kB che stimolano l’espressione di numerosi geni per proteine coinvolte nella risposta immunitaria (geni per svariate citochine e chemochine).

Mediatori dell’infiammazione

I mediatori dell’infiammazione hanno normalmente una emivita molto breve, tuttavia sono molto importanti in quanto essi regolano la successione di eventi tipica dell’infiammazione. Essi possono essere prodotti localmente (dalle cellule del sito di infiammazione) oppure possono derivare da precursori inattivi presenti in circolo che si attivano a livello del sito di infiammazione. Molti di questi mediatori agiscono legando direttamente specifici recettori, tuttavia alcuni di essi (ROS, proteasi lisosomiali, ecc.) hanno azione enzimatica e/o tossica diretta. I mediatori prodotti localmente possono risultare preformati e presenti all’interno della cellula già prima dell’infiammazione (istamina, serotonina, ecc.) oppure possono venir prodotti e secreti dalla cellula più o meno rapidamente in risposta all’evento infiammatorio (NO, prostaglandine, leucotrieni, ROS, ecc.); dei mediatori presenti invece come inattivi nel plasma sanguigno fanno parte i fattori del sistema del complemento e il fattore XII.

Le più importanti citochine pro-infiammatorie che a livello locale agiscono attivando le cellule endoteliali, sono:

• TNF
• IL-1
• IL-6

Cambiamenti vascolari

Reazioni vascolari a livello capillare durante l’infiammazione sono:

• Vasocostrizione transiente (se questa avviene dura solitamente pochi secondi).
• Vasodilatazione a livello del capo arteriolare (porta a calor ossia aumento della temperatura nella zona di infiammazione e rubor ossia rossore) con aumento della pressione idrostatica; la vasodilatazione è dovuta a perdita del tono delle cellule muscolari del vaso.
• Aumento della permeabilità vascolare (il microcircolo diventa più permeabile e fluidi proteici si muovono verso il compartimento extra-vascolare portando a tumor ossia rigonfiamento) contemporaneo alla vasodilatazione.
• Aumento della viscosità del sangue (dovuto alla fuoriuscita di fluidi) e diminuzione della sua velocità di scorrimento (che può raggiungere la stasi importante per l’adesione di neutrofili alla parete del vaso durante il processo di marginazione).

L’essudato nell’infiammazione acuta è formato principalmente da acqua, molecole del complemento, anticorpi e farmaci. Questo essudato si forma grazie all’azione di mediatori infiammatori specifici che legando recettori presenti sulle cellule dell’endotelio vascolare attivano in queste cellule delle chinasi che fosforilano proteine contrattili e del citoscheletro portando a contrazione di queste cellule (si ha così allargamento delle giunzioni intercellulari e aumento della permeabilità del vaso).

Reclutamento dei leucociti

Reclutamento dei leucociti nel tessuto:

• Fase di marginazione e rotolamento (si osservano con la diminuzione della velocità del sangue nel vaso).
• Adesione stabile (si ha per aumento dell’affinità delle integrine di membrana del leucocita alle selectine presenti sulla membrana delle cellule endoteliali) mediata da chemochine.
• Migrazione attraverso l’endotelio (ossia trasmigrazione) e migrazione all’interno del tessuto per chemotassi.

Gli agenti chemiotattici vengono prodotti nel tessuto sito di infezione soprattutto da: macrofagi, cellule endoteliali e microbi residenti.