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Immunopatologia Appunti scolastici Premium

Reazioni di ipersensibilità con i vai meccanismi di patogenesi e esempi di malattie; tolleranza immunitaria (molecole MHC, patologie autoimmuni); tecniche di dosaggio degli anticorpi; citofluorimetria, immunofenotipizzazione e immunodeficienze. Gli appunti sono tratti dalle lezioni e sono basati sui libri consigliati: “Le basi patologiche delle malattie” (Robbins-Cotran) e “Immunologia... Vedi di più

Esame di Immunologia e immunopatologia docente Prof. P. Rizza

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Diminuzione della costimolazione tolerogena. Può essere causata da:

 Deficit di Fas L, per cui viene meno l’apoptosi dei cloni self.

- Deficit di CD40 L con deficit del sistema Fas delle cellule B.

-

Aumento della costimolazione immunogena.

 In modelli animali: l’aumento di TNF-a, B7-1, IL-4 sulle insulae induce la

- predisposizione a diabete tipo 1.

Un eccesso di morte cellulare per necrosi (come nei tumori): il complesso

- antigene + HSP determina uno stimolo immunogeno.

Il deficit di C1q causa una ridotta clearance materiale necrotico.

-

Una volta innescato il processo autoimmune con rottura della tolleranza

immunologica, i

meccanismi che determinano il danno tissutale e/o funzionale sono riconducibili a:

fagocitosi/citolisi delle cellule target

 formazione di immunocomplessi

 interferenza con la fisiologia cellulare (anti-Ach, TRAB).

Le strategie terapeutiche dirette al trattamento delle malattie autoimmuni possono

essere distinte in due tipologie:

Terapie standard includono:

 terapie sintomatiche: uso dell’insulina; ormoni tiroidei.

 terapie immunosoppressive: corticosteroidi, ciclofosfammide, ciclosporina.

 Terapie con citochine ed inibitori di citochine: uso di MoAbs chimerici anti TNF-α

 per artrite reumatoide.

Terapie con approcci sperimentali sono finalizzate a:

 Aumentare la soglia di attivazione immunitaria mediante

 a. blocco costimoli (CTLA4-Ig, anti-CD40L, blocco CD28-B7)

b. uso di citochine tolerogeniche (TGF-b, IL-10)

Modulare la risposta antigene-specifica attraverso l’induzione di tolleranza con

 vaccini “negativi” (insulina, collagene) o mediante lo shift Th1-2.

Ricostruire il sistema immunitario (ablazione-trapianto di midollo).

 Proteggere l’organo bersaglio (anti-C, anti-NOS, anti-chemochine etc.).

I criteri che consentono di definire come autoimmune una malattia sono distinti in:

1. Criteri maggiori; consistono in:

Presenza di infiltrati linfocitari localizzati nell’organo bersaglio o diffusi a diversi

 apparati.

Presenza di autoanticorpi e/o linfociti autoreattivi circolanti e/o localizzati a

 livello dell’organo bersaglio.

Possibilità di identificare ed isolare gli autoantigeni implicati nella reazione

 autoimmune.

Efficacia della terapia immunosoppressiva.

2. Criteri minori; comprendono:

Familiarità

 Associazione con HLA

 Sesso femminile

 Ipergammaglobulinemia

 Associazioni con altre malattie autoimmuni

La malattia viene definita come autoimmune quando almeno due di questi criteri

risultano essere soddisfatti.

A seconda della sede in cui si verifica la reazione immunopatologica le malattie

autoimmuni possono essere suddivise in

Sistemiche o generalizzate, se le reazioni autoimmuni sono dirette contro antigeni

 diffusi. I meccanismi patogenetici consistono prevalentemente nella formazione di

immunocomplessi autoanticorpo-autoantigene. Appartengono a questo gruppo:

LES, artrite reumatoide, sclerodermie e vasculite.

Organo-specifiche, se l’autoimmunità è diretta contro un singolo organo o tessuto. I

 meccanismi patogenetici consistono prevalentemente in auto-anticorpi anti-

recettori e reazioni di tipo IV (cellulo-mediata). Appartengono a questa categoria:

morbo di Addison, anemia perniciosa, epatiti autoimmuni, anemie emolitiche

autoimmuni.

Myasthenia gravis .

La miastenia è un’affezione neuromuscolare che si manifesta con un’anomala

affaticabilità muscolare. È talvolta localizzata, specie a carico dei muscoli oculomotori,

ma più spesso è generalizzata.

L’elettromiografia rivela un blocco neuromuscolare parziale senza poter chiarire se la

natura è presinaptica (dovuto a riduzione della produzione di acetilcolina) o post-

sinaptica (per l’interessamento dei recettori della placca motrice).

L’origine immunitaria della miastenia è data da alcune osservazioni:

associazione frequente con anomalie timiche

 riscontro di autoanticorpi multipli con specificità nei confronti di diversi organi

 associazione con altre malattie autoimmuni (morbo di Basedow, anemia perniciosa)

 associazione con antigeni MHC (B8, DR3) noti per la loro correlazione con patologie

 autoimmunitarie

L’origine autoimmune è, inoltre, confermata della descrizione di miastenie

sperimentali, molto simili alla malattia umana, e dalla dimostrazione della presenza

quasi costante, nel siero dei malati, di anticorpi diretti contro il recettore nicotinico

dell’acetilcolina (RACh).

Il meccanismo d’azione degli anticorpi anti-RACh è ancora incerto: la perdita di RACh

sarebbe dovuta ad una azione diretta degli anticorpi sui recettori; i complessi

anticorpi-recettore migrerebbero nella membrana (capping), scomparendo dalla

superficie

cellulare per internalizzazione. Il risultato consisterebbe in un aumento del tasso di

degradazione e di rinnovamento (turnover ) dei recettori.

Il timo dei miastenici presenta spesso delle anomalie anatomiche; è possibile

osservare la presenza di timoma epiteliale o linfoepiteliale, oppure iperplasia timica

con centri germinativi e follicoli linfoidi.

Il trattamento della Myasthenia gravis prevede l’impiego di

farmaci anticolinesterasici per migliorare la trasmissione muscolare;

 farmaci immunosoppressori (corticosteroidi e immunosoppressori citostatici);

 plasmaferesi (rimozione anticorpi anti-RACh)

 timectomia

Diabete mellito .

Il diabete insulino-dipendente (diabete di tipo I) è caratterizzato da una distruzione

selettiva delle cellule beta degli isolotti di Langherans deputati alla produzione di

insulina. Diversi argomenti suggeriscono che la malattia sia di origine autoimmune e

sotto il controllo genetico. A tal proposito sono stati identificati autoanticorpi anti-

cellule insulari; in particolare:

anticorpi anti-citoplasma delle cellule insulari (frequente cross-reazione con cellule

 Alpha producenti glucagone)

anticorpi contro antigeni di menbrana delle cellule beta.

Da notare che spesso questi anticorpi si ritrovano anche in pazienti affetti da altre

malattie autoimmuni (miastenia, tiroidite di Hashimoto) e nei familiari sani di soggetti

diabetici.

È coinvolta anche l’immunità cellulo-mediata. L’insulite è un’infiltrazione

infiammatoria

peri- e intra-insulare da parte di cellule mononucleate (linfociti, macrofagi) che

interessa preferenzialmente le cellule beta. Le cellule T dei diabetici inibiscono la

produzione di insulina da parte delle cellule insulari.

Il substrato genetico è determinato da:

associazione ad altre malattie autoimmuni

 elevato tasso di concordanza tra gemelli monozigoti

 ben stabilita associazione del diabete mellito con alcuni antigeni MHC classe II

 (DR3, DR4).

La storia naturale del diabete di tipo1 prevede cinque fasi:

fase 1: ereditarietà che determina suscettibilità genetica per lo sviluppo di malattie

 autoimmuni

fase 2: evento precipitante, per cui un fattore ambientale innesca il processo.

 fase 3: attivazione del sistema immunitario, con produzione di autoanticorpi o

 linfociti autoreattivi

fase 4: anomalie metaboliche iniziali che consistono nella perdita del picco precoce

 di secrezione insulinica

fase 5: esordio clinico con distruzione di gran parte delle cellule beta.

Lupus Eritematoso Sistemico .

Il Lupus Eritematoso Sistemico è una malattia infiammatoria cronica autoimmune

plurisistemica, che caratteristicamente colpisce i reni, le articolazioni, le membrane

sierose e la cute.

Il LES è una malattia autoimmune in quanto si formano autoanticorpi contro una

batteria di antigeni self. Questi comprendono: proteine plasmatiche, antigeni della

superficie cellulare, componenti citoplasmatici, DNA nucleare, ribonucleoproteine e

istoni.

Nella patologia lupica, gli autoanticorpi

si legano ad antigeni di superficie:

 globuli rossi: anemia emolitica

 piastrine: trombocitopenia autoimmune

 neutrofili e linfociti: leucopenia.

formano immunocomplessi:

 Vasculite

 artrite

alcuni autoanticorpi hanno un meccanismo patogenetico non chiarito:

 anti-SSA: fotosensibilità, rash, LES neonatale.

ANA (Anticorpi Anti-Nucleo)

Gli sono gli autoanticorpi più importanti ai fini diagnostici.

Sono autoanticorpi contro il DNA a doppio filamento e contro un complesso antigenico

nucleare solubile detto antigene Sm (Smith). La presenza di un titolo elevato di questi

autoanticorpi è quasi patognomonica del LES: sono positivi nel 98 % dei LES, ma non

specifici, in quanto presenti in altre patologie, come Sclerosi sistemica, Artrite

reumatoide, Epatite autoimmune, Linfomi e Infezioni croniche.

L’eziologia del Lupus Eritematoso Sistemico è sconosciuta. Potenziali fattori eziologici

includono:

virus (EBV)

 ormoni (estrogeni)

 predisposizione genetica (HLA B8)

 farmaci (ad esempio procainamide).

Questi possono indurre perdita della tolleranza o suscettibilità acquisita ad auto-

+

antigeni, con produzione di cellule T CD4 autoreattive e conseguente iperattività da

cellule B policlonali.

Ciò determina la produzione di autoanticorpi e la formazione di immunocomplessi in

circolo e nei tessuti con danno tessutale (glomerulo nefrite, vasculite, serosite, artrite).

La diagnosi si basa sulla presenza di almeno quattro criteri (cumulativi), tra gli undici

proposti dalla ACR; i criteri per la classificazione del LES includono:

Rash malare

 Rash discoide

 Fotosensibilità

 Ulcere orali

 Artrite

 Malattia renale

 Malattia neurologica

 Malattia ematologica

 Disordine immunologico

 ANA positivi

La terapia deve essere individualizzata e dipende dall’organo interessato e dalla

gravità dell’interessamento. Scopo della terapia è sopprimere le manifestazioni di

malattia.

Anche se l’interessamento cutaneo può essere esteso e devastante da un punto di

vista estetico, la malattia non mette in pericolo di vita. Il danno all’epidermide nelle

lesioni cutanee sembra essere scatenato da agenti esterni come i raggi UV e

continuato da reazioni immunitarie cellulo-mediate simili a quelle delle reazioni del

trapianto contro l’ospite.

Le caratteristiche del danno epidermico comprendono:

Vacuolizzazione dei cheratinociti basali, ipercheratosi e diminuzione dello spessore

- dell’epidermide;

Rilascio di DNA e altri antigeni nucleari e citoplasmatici nel siero;

- Deposizione di DNA ed altri determinanti antigenici nella zona della membrana

- basale dell’epidermide.

LES discoide

Il è una forma di Lupus che interessa solo la cute. La malattia si localizza

di solito sopra il collo e si rende evidente sul volto, il cuoio capelluto e le orecchie. Le

lesioni esordiscono come papule leggermente rilevate, violacee, con una squama

ruvida di cheratina. Ingrandendosi, le lesioni assumono una forma a disco con la

periferia ipercheratosica e il centro depigmentato. Le lesioni possono arrivare a creare

cicatrici sfiguranti.

A livello istologico, nel derma papillare ed avventiziale è presente un infiltrato

linfocitario che determina atrofia dell’epidermide; si osserva, inoltre, ispessimento

della membrana basale.

Endocrinopatie Autoimmuni .

Tiroide: Morbo di Basedow, Tiroidite di Hashimoto, Mixedema idiopatico

 Surrene: Insufficienza cortico-surrenalica primitiva (morbo di Addison)

 Pancreas endocrino: Diabete mellito di tipo 1

 Ovaio/testicolo: Infertilità maschile autoimmune, Insufficienza gonadica primitiva

 Paratiroidi: Ipoparatiroidismo idiopatico

 Ipotalamo/ipofisi: Ipofisite autoimmune, Ritardo staturale

 Sistema endocrino: Diabete insipido centrale idiopatico, Diabete mellito di tipo I,

 forse Diabete mellito tipo 2

Tratto gastro-intestinale: Gastrite antrale (tipo B)

 Recettori ormonali: Miastenia grave.

 Tireopatie Autoimmuni

Le si classificano in:

Tiroidite atrofica o mixedema idiopatico consiste in un ipotiroidismo primitivo

 conclamato (mixedema).

Tiroidite cronica linfocitaria di Hashimoto si caratterizza per gozzo, infiltrazione

 linfocitaria della ghiandola con eutiroidismo e vari gradi di ipotiroidismo.

Morbo di Basedow (o malattia di Graves) si presenta con gozzo diffuso e

 ipertiroidismo

spesso associato a oftalmopatia basedowiana (esoftalmo).

Dal punto di vista genetico, le tireopatie autoimmuni mostrano la tendenza della

patologia ad aggregarsi nell'ambito di alcune famiglie. Anticorpi anti-tiroide sono

riscontrati in circa il 50% dei parenti di primo grado dei pazienti con Tiroidite di

Hashimoto o Morbo di Basedow. È stata inoltre rilevata un’elevata frequenza degli

antigeni HLA-DR5 o HLA-B8/DR3.

La patogenesi della Tiroidite di Hashimoto, del Mixedema Idiopatico e del Morbo di

Basedow prevede:

Citotossicità anticorpo-dipendente complemento-mediata

- Citotossicità diretta o indiretta mediata dalle cellule T

- Deposizione locale di immunocomplessi.

-

Nelle tireopatie autoimmuni si osservano reazioni immunitarie cellulo-mediate dirette

contro antigeni specifici della tiroide umana (sicuramente la Tg). I linfociti T e B

circolanti non presentano nessuna anomalia tranne un aumento dei linfociti T

+

circolanti CD8 , (indice del grado di attività del processo autoimmune). I linfociti

infiltranti la tiroide producono elevate quantità di autoanticorpi anti-tiroide.

In particolare, caratteristico nel Morbo di Basedow è la presenza di autoanticorpi anti-

recettore. Gli anticorpi tiroidostimolanti (una volta chiamati LATS) fanno parte della

classe di immunoglobuline IgG ed hanno il compito di attivare il sistema adenilciclasi

di membrana del recettore del TSH con conseguente produzione di ormoni tiroidei.

La secrezione di anticorpi anti-recettore del TSH costituisce la base patogenetica

dell'ipertiroidismo nel morbo di Graves-Basedow. Il recettore del TSH è una

glicoproteina di membrana con il sito di legame per il TSH nella subunità A.

Gli Anticorpi anti-recettore del TSH includono:

Anticorpi inibenti il legame del TSH (TBII) (dosaggio radiorecettoriale)

 Anticorpi bloccanti il recettore del TSH (TSH-R-BAb) (dosaggio biologico)

 Anticorpi stimolanti il recettore del TSH (TSH-R-SAb ) (dosaggio biologico)

I TSH-R-B-Ab bloccano il legame del TSH al TSH-R, riducendo: la produzione cAMP,

l’uptake dello iodio, la sintesi della Tg, della TPO e degli OT (ormoni tiroidei), la

crescita cellulare.

Il dosaggio dei TRAb è utile:

Nella valutazione diagnostica dei pazienti con oftalmopatia basedowiana non

 associata ad ipertiroidismo in atto.

Nella diagnosi differenziale tra gozzo nodulare tossico e gozzo nodulare con

 sovrapposto morbo di Basedow.

Nella predizione delle recidive di ipertiroidismo nei pazienti basedowiani.

 Nella valutazione del rischio di ipertiroidismo o di ipotiroidismo neonatale

 transitorio nei bambini di madri affette da morbo di Basedow o tiroidite

autoimmune.

Gli Anticorpi Anti-Ormoni Tiroidei includono:

Anti-T3 ed Anti-T4 e un particolare tipo di anticorpi anti-Tg.

- Anticorpi Anti-Tireoperossidasi (TPO)

-

È opportuno richiedere gli anticorpi antitireoglobulina (Tgab) e antitireoperossidasi

(TPOab) in condizioni di: ipotiroidismo, ipertiroidismo, gozzo uni o multi nodulare,

oftalmopatia, familiarità per malattie autoimmuni tiroidee, altre malattie autoimmuni

organo specifiche,, anomalie cromosomiche (sindrome di Turner, sindrome di Down).

Le tireopatie autoimmuni mostrano associazione con altre malattie autoimmuni, in

particolare: Gastrite Atrofica e Anemia Perniciosa, oltre che con Diabete di tipo I,

Miastenia Grave, Morbo di Addison, che si presentano con minore frequenza.

Non si osserva nessuna chiara associazione con malattie autoimmuni sistemiche,

come AR, LES.

Ci sono diverse metodiche che permettono la determinazione del dosaggio di

anticorpi.

Tecnica Radioimmunologica

La si avvale dell’impiego di anticorpi rivolti verso alcuni

enzimi che si comportano come antigeni nelle malattie autoimmuni endocrine. Questi

comprendono: anticorpi anti 21 idrossilasi, anticorpi anti 17 idrossilasi, anticorpi anti

p450,

Metodica Immunoenzimatica ELISA

La ( ) utilizza enzimi per evidenziare la reazione

antigene-anticorpo. Permette l’identificazione di anticorpi organo e non organo

specifici nelle malattie autoimmuni endocrine e non: anticorpi anti gliadina, anticorpi

anti cardiolipina.

Metodica Di Immunofluorescenza Indiretta

La utilizza fluorocromi come marcatori

della reazione antigene-anticorpo. Questo test può essere allestito con due metodi:

Metodo diretto, per cui l’anticorpo specifico coniugato al fluorocromo si fa

 direttamente aderire agli antigeni cellulari.

Metodo indiretto, per cui, in una prima fase, l’anticorpo non coniugato si fa aderire

 agli antigeni cellulari; in una seconda fase, si aggiunge un anticorpo secondario,

che riconosce il frammento Fc dell’anticorpo primario, coniugato con un

fluorocromo.

Un particolare tipo di immunofluorescenza indiretta è a doppia colorazione: si avvale

dell’impiego di un anticorpo roda minato legato all’anticorpo antiormone e di un

antisiero fluoresceinato complessato al siero del paziente. I due complessi sono legati

all’antigene fissato sul vetrino.

Relativamente alle tireopatie autoimmuni, gli anticorpi anti tireoglobulina e gli

anticorpi anti tireoperossidasi vengono dosati mediante ELISA e RIA; il dosaggio degli

anticorpi anti recettore del TSH è realizzato mediante RIA e/o metodica radio

recettoriale.

Citofluorimetria citometria a flusso

La (o ) è una tecnica che permette la

misurazione e la caratterizzazione di parametri fisici e chimici di particelle biologiche o

di cellule contenute in una sospensione.

Tale tecnica permette di valutare contemporaneamente più parametri in diverse

migliaia di cellule ad una velocità molto rapida. Essa si basa sull’utilizzo di sonde o

reagenti fluorescenti specifici, che permettono di studiare caratteristiche funzionali e

strutturali di cellule, sia normali che neoplastiche. Alcuni citofluorimetri sono inoltre in

grado di separare fisicamente da una sospensione eterogenea sottopopolazioni di

cellule sulla cui membrana è presente una struttura riconosciuta da una sonda

specifica. Questa procedura è chiamata “cell-sorting”.

Negli ultimi anni la CFM ha raggiunto una notevole diffusione, sia in laboratori clinici

che in laboratori di ricerca. Fattori che hanno contribuito a questo notevole sviluppo

sono:

la possibilità di utilizzare più laser di emissione, che permette di effettuare analisi

 multiparametriche a quattro e più colori;

la disponibilità di MoAb marcati con un’ampia gamma di fluorocromi e diretti contro

 una larghissima varietà di Ag di membrana e/o intracellulari;

la riduzione dei costi e della complessità nell’utilizzo dello strumento.

L’ipiego di questa tecnica offre, dunque, numerosi vantaggi:

possibilità di analisi multiparametrica

 elevato numero di cellule esaminate

 rapidità dei tempi di analisi (oltre 1000 cellule/sec)

 obiettività, riproducibilità e affidabilità statistica delle letture

 i campioni possono essere processati senza perdere la vitalità cellulare

Ciononostante presenta alcuni limiti:

analisi di cellule molto rare, che a causa del loro ridotto numero in confronto agli

 eventi analizzati potrebbero essere difficilmente separabili dal “rumore di fondo”

necessità di dover lavorare con campioni in fase monodispersa

 impossibilità di localizzare la sede di provenienza del segnale in caso di

 contemporanea presenza di marcatori nei diversi compartimenti cellulari

Principio di Yunzionamento della citometria a flusso.

1. Le cellule di una popolazione eterogenea vengono aspirate dalla provetta e

immesse in una camera di flusso dove vengono separate le une dalla altre.

2. Ogni singola cellula viene poi attraversata da un fascio di luce che eccita i

fluorocromi e determina l’emissione di un segnale fluorescente.

3. Il segnale passando attraverso un sistema di filtri e specchi raggiunge un

rivelatore.

4. Viene quindi processato elettronicamente, trasformato da analogico a digitale e

inviato all’analizzatore, che elabora il dato e lo visualizza tramite un grafico.

5. Attraverso piastre di deflessione le cellule analizzate possono essere raccolte

separatamente tramite un processo definito “sorting”.

Le componenti di un citofluorimetro a flusso includono:

sistema fluidico.

Il Produce un flusso laminare intorno alla sospensione cellulare,

 permettendo il passaggio delle particelle ad una velocità costante, allineate lungo

un identico asse, attraverso il punto di rilevazione (cella di flusso). E’ importante

evitare la formazione di aggregati cellulari.

La velocità di efflusso delle cellule viene valutata come numero di eventi al secondo:

numero di particelle che hanno incontrato il raggio di luce nell’unità di tempo.

camera a flusso.

La Le cellule monodisperse (da sangue periferico, da aspirato

 midollare, agoaspirato da tessuti solidi) vengono aspirate in una camera a flusso,

dove vengono diluite e allineate tramite un sistema fluidico a flusso laminare. Nel

flusso coesistono una corrente interna ed una esterna (sheat), una soluzione salina

isotonica, che confina la sospensione cellulare al centro del flusso. La pressione di

spinta e la diluizione del campione consentono una velocità di conta più o meno

costante, che può essere regolata tra 200 e 2000 cellule/sec.

Le particelle cosi disposte attraversano ortogonalmente un raggio di luce

monocromatico, prodotto da una sorgente laser o da speciali lampade.

sistema di illuminazione.

Il Consiste di un fascio di luce, che incide sul materiale in

 sospensione e che permette di produrre segnali di rifrazione della luce e/o

emissione di fluorescenza.

Nella grande maggioranza dei citofluorimetri si utilizza una sorgente laser ad ioni

Argon centrata su una lunghezza d’onda di 488 nm (blu). Tale luce consente una

efficace misura dei parametri fisici, inoltre permette la contemporanea eccitazione di

diversi fluorocromi.

Un’alternativa più economica è costituita dall’uso dei citometri a lampada, che hanno

come fonte di eccitazione una lampada a vapori di Mercurio o Xenon che non richiede

particolari sistemi di raffreddamento. Sono utili per le applicazioni che riguardano

particolari fluorocromi (es. quelli utilizzati per la marcatura del DNA). Hanno però dei

limiti dovuti alla bassa potenza erogata, scarsa stabilità della luce di emissione, rapido

decadimento.

Quando viene colpita dal fascio di luce emesso dal laser, la cellula emette segnali di

luce diffusa in base alle proprie caratteristiche fisiche e morfologiche, per fenomeni di

rifrazione, riflessione, e diffrazione. In particolare la luce dispersa in avanti (Forward

Scatter) è legata alle dimensioni delle cellule, mentre la luce riflessa a 90° (Side

Scatter o Right Scatter) è da attribuire a parametri della morfologia cellulare come la

granulosità del citoplasma, il rapporto nucleo/citoplasma, la rugosità di superficie.

La combinazione dei segnali di scattering permette di creare un particolare diagramma

di dispersione, noto come Citogramma. Permette di discriminare tra diverse

popolazioni cellulari basandosi solamente sulle loro caratteristiche fisiche.

Il secondo tipo di segnale luminoso rilevato da un citofluorimetro è la Fluorescenza.

In citofluorimetria vengono rilevati segnali fluorescenti generati:

dall’utilizzo di MoAb marcati con fluorocromi (FITC, PE, PerCp, APC, ecc) specifici

 per antigeni presenti sulla membrana, nel citoplasma, nel nucleo;

da fluorocromi che si legano in maniera stechiometrica a determinate sostanze

 come il DNA e l’RNA.

Ogni fluorocromo presenta una caratteristica lunghezza d’onda per l’eccitazione e

l’emissione. Ci sono quattro diverse opzioni: 488nm blu (Fluoresceina-FITC;

Ficoeritrina-PE), 633nm rosso (Alloficocianina-APC), 405nm viola (Pacific Blue), 350nm

UV (DAPI).

Vi sono dei limiti da considerare nella scelta dei fluorocromi da utilizzare in

combinazione:

la lunghezza d’onda di eccitazione

 le bande di emissione devono essere sufficientemente separate da permettere

 la loro appropriata misurazione.

Come lavorano i fluorocromi?

un laser eccita il fluorocromo

- il fluorocromo eccitato sale nel livello successivo della nuvola elettronica

- il fluorocromo ritorna al livello originale e rilascia l’energia in eccesso come

- fotone

i fotoni emettono a lunghezze d’onda maggiori rispetto a quelle a cui vengono

- eccitati.

sistema ottico.

Il Canalizza la luce incidente sulle particelle che l’attraversano,

 registra la luce diffusa e la fluorescenza emessa dai fluorocromi, dirigendole

entrambe verso appropriati dispositivi opto-elettronici, ovvero i tubi

fotomoltiplicatori.

sistema elettronico.

Il Trasforma la luce diffusa e la fluorescenza in impulsi elettrici

 (analogici). Le ampiezze di tali impulsi vengono distribuite elettronicamente in

canali, permettendo la creazione di istogrammi, che rappresentano il numero di

cellule contro il numero di canali.

sistema di analisi dei dati.

Il Consiste di un software che permette l’analisi di una

 grande quantità di informazioni ricevute dall’acquisizione di dati multiparametrici. Il

software garantisce lo studio e l’analisi indipendente di una particolare popolazione

cellulare.

Esistono diversi modi per rappresentare un dato citofluorimetico. La rappresentazione

più semplice è costituita dall’istogramma dove l’ascissa riporta l’intensità di

fluorescenza e l’ordinata il numero di cellule che esprimono o meno l’antigene

(diagramma di distribuzione).

L’analisi statistica si basa sull’impostazione di cursori che delimitano le aree di

interesse, e sulla quantificazione degli eventi cellulari che rientrano in tali aree. Per

ogni picco è possibile calcolare dati statistici (valore medio, deviazione standard,

coefficiente di variazione, ecc).

Oltre all’istogramma è possibile utilizzare una serie di rappresentazioni bidimensionali,

che permettono di mettere in correlazione due parametri tra di loro: il dot-plot, nel

quale ogni singolo punto rappresenta un evento; il contour-plot, in cui si visualizzano

aree aventi la stessa densità mediante linee concentriche.

Sono molteplici le applicazioni della citofluorimetria; le principali includono:

immunofenotipizzazione, viabilità cellulare, variazioni di pH, proliferazione e motilità

cellulare, sorting, stato di ossidoriduzione, potenziale di membrana, struttura della

cromatina, proteine totali, attività enzimatica, sintesi del DNA, degradazione del DNA,

espressione genica, metabolismo ossidativo, carica superficiale, etc.

Una delle maggiori applicazioni della citofluorimetria è rappresentata dall’analisi (e

sorting) delle diverse popolazioni di cellule del sangue. Si sfruttano fondamentalmente

due caratteristiche:

1. la maggior parte delle cellule del sangue mostrano distinti profili di forward and

side scatter

2. le diverse popolazioni cellulari esprimono sulla propria superficie markers specifici

che le discriminano dalle altre.

L’ Immunofenotipizzazione è una tecnica utilizzata per identificare il tipo esatto di

cellule che costituiscono un tessuto particolare attraverso la valutazione di Ag

presenti sulla membrana cellulare o intracitoplasmatica. È Clinicamente importante sia

nel campo delle neoplasie ematologiche che in quello dell’immunopatologia.

Lo studio di tali neoplasie si basa essenzialmente su 4 obiettivi:

dimostrazione della presenza nel campione di cellule anormali;

 caratterizzazione, con individuazione della linea cui appartengono e del loro stadio

 di maturazione;

eventuale dimostrazione della loro clonalità;

 eventuale evidenziazione di fenotipi peculiari, direttamente associabili con una

 determinata entità nosografica e/o utili per tracciare la presenza delle cellule

neoplastiche durante il follow-up successivo alla terapia o al trapianto.

Una delle principali applicazioni cliniche e sperimentali della citofluorimetria riguarda

l’immunofenotipizzazione linfocitaria, che consiste nell’utilizzazione di anticorpi

specifici diretti verso i diversi marcatori di membrana CD al fine di differenziare,

all’interno di un pool di linfociti provenienti da un dato campione, le diverse

sottopopolazioni.

I linfociti B, coinvolti nell’immunità di tipo umorale, sono caratterizzati dal possedere

alcuni specifici marcatori, tra cui i CD19 e i CD21. I linfociti T, responsabili della

risposta immunitaria di tipo cellulare, invece, oltre a possedere il marcatore di

helper,

membrana CD3, sono divisi in due sottopopolazioni: i CD4+, o linfociti T e i

CD8+, o citotossici.

L’immunofenotipizzazione linfocitaria consente quindi di valutare, all’interno di un

campione, la diversa percentuale di queste sottopopolazioni linfocitarie.

Un’altra applicazione della citofluorimetria è la misura del DNA cellulare, che permette

di quantificare le deviazioni dal normale contenuto diploide di DNA delle cellule

neoplastiche. Queste anomalie sono un importante parametro per la valutazione di

tumori sia solidi che ematologici. Una delle prime applicazioni della citofluorimetria è

stata proprio l’analisi della posizione nel ciclo cellulare, effettuata tramite

quantificazione del DNA cellulare. La citofluorimetria è ancora oggi la tecnica più

utilizzata per una veloce ed accurata determinazione della distribuzione delle cellule

nelle varie fasi del ciclo cellulare.

Un’altra applicazione è l’analisi del ciclo cellulare. Nel metodo più semplice, il

contenuto di DNA è rilevato usando un colorante fluorescente in grado di legare il DNA

con alta affinità.

Lo Ioduro di propidio è il colorante più comunemente utilizzato. Di natura

fenantridinica, si intercala tra le basi del DNA a doppia elica, formando un complesso

stabile, che emette fluorescenza rossa quando viene eccitato. Dopo essersi legato al

DNA, aumenta notevolmente la propria fluorescenza. Richiede la permeabilizzazione

della membrana plasmatica.

L’Hoechst 33342 è meno utilizzato, ma rappresenta una valida alternativa quando è

richiesto la colorazione di cellule non permeabilizzate (vive).

Il monitoraggio della proliferazione cellulare e posizione in ciclo per mezzo della

misurazione del DNA quale singolo parametro pone diverse limitazioni:

non permette di distinguere cellule in G0 da quelle in G1 (stesso contenuto di DNA)

 non permette di distinguere cellule in G2 da quelle in M (stesso contenuto di

 DNA);

totale mancanza di informazioni circa la cinetica cellulare.

È possibile realizzare un’analisi multiparametrica, per cui assieme al contenuto di DNA

vengono valutati altri parametri della cellula strettamente correlati alla sua posizione

nel ciclo. L’analisi multiparametrica è diventata il metodo preferenziale per studiare le

connessioni tra la progressione nelle varie fasi del ciclo di una cellula e la sua crescita

(es. contenuto di RNA, specifiche proteine), attivazione (es. specifici markers di

superficie), proliferazione (es. Ki67, specifiche cicline) e differenziazione (es. specifici

markers tumorali).

Per esempio, le cellule in fase G2, con contenuto di DNA pari a 4n, avranno

fluorescenza doppia rispetto alle cellule in fase G1 (contenuto di DNA 2n). Le cellule in

S, avranno fluorescenza intermedia. Le cellule apoptotiche sono ipodiploidi.

È possibile, anche, effettuare la valutazione dell'apoptosi mediante marcatura

con Annessina V/colorante.

Durante l’apoptosi le cellule subiscono specifiche modificazioni morfologiche, che

portano alla perdita dell’integrità della membrana, alla formazione di corpi apoptotici e

alla morte della cellula. Un cambiamento che avviene nella membrana cellulare

durante le prime fasi del processo apoptotico è la traslocazione della fosfatidilserina

(PS) dal lato interno della membrana a quello esterno. E’ possibile rilevare PS

utilizzando Annessina V marcata, una proteina di 35 kDa che in presenza di specifiche

concentrazioni di calcio è in grado di legarsi con alta affinità alla PS.

Un metodo molto importante nello studio dell’apoptosi utilizza la colorazione

dell’Annessina V in combinazione con un colorante, che lega gli acidi nucleici, in grado

di discriminare tra cellule vive e morte (viability probe). I due coloranti più utilizzati

sono PI (Ioduro di propidio) o 7AAD (7-Amino-actinomicina D). Grazie a questa

combinazione possiamo ottenere un profilo dove le cellule vitali risultano negative ad

entrambi i markers, quelle nelle prime fasi dell’apoptosi sono positive all’Annessina V

e negative alla viability probe, quelle nella late apoptosi sono positive per entrambi i

markers.

La Compensazione è un processo che ha lo scopo di sottrarre da un certo canale una

quota fissa di segnale relativo all’emissione di un altro fluorocromo.

Nonostante tutte le accortezze, succede infatti che una radiazione di una certa

intensità, di un fluorocromo si sovrappone alla lunghezza d’onda del fluorocromo

successivo. Es: si sottra dal canale del PE

(rosso), una quota fissa di segnale

dovuto alla interferenza del FITC

(verde), e viceversa.

L’analisi multiparametrica, uno dei più potenti aspetti della citofluorimetria a flusso,

permette di affrontare i problemi biologici della eterogeneità cellulare. Sfrutta due

operazioni fondamentali della CFM: il gating e il sorting.

Il Gating, utilizzando una finestra elettronica, permette di isolare una determinata

popolazione da tutte le altre cellule, e di analizzare i parametri successivi solo

all’interno della popolazione “ghettata”, dividendola così in ulteriori subpopolazioni.

Il Sorting è un gating reale, che consente di raccogliere fisicamente le popolazioni che

sono state separate dal resto della miscela. Si stabiliscono delle finestre di selezione

per identificare le popolazioni di interesse che verranno separate e raccolte in provette

distinte. Le cellule mantengono la vitalità dopo il sorting.

Distinguiamo:

Citofluorimetri a circuito chiuso: il campione analizzato viene perso

 Citofluorimetri a circuito aperto: il campione incontra il fascio di luce laser in aria,

 per poi essere recuperato selettivamente dopo il sorting.


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Fredo88

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7 mesi fa


DESCRIZIONE APPUNTO

Reazioni di ipersensibilità con i vai meccanismi di patogenesi e esempi di malattie; tolleranza immunitaria (molecole MHC, patologie autoimmuni); tecniche di dosaggio degli anticorpi; citofluorimetria, immunofenotipizzazione e immunodeficienze. Gli appunti sono tratti dalle lezioni e sono basati sui libri consigliati: “Le basi patologiche delle malattie” (Robbins-Cotran) e “Immunologia Cellulare e Medica” (Abbas).


DETTAGLI
Corso di laurea: Corso di laurea magistrale in biologia
SSD:
Università: Calabria - Unical
A.A.: 2014-2015

I contenuti di questa pagina costituiscono rielaborazioni personali del Publisher Fredo88 di informazioni apprese con la frequenza delle lezioni di Immunologia e immunopatologia e studio autonomo di eventuali libri di riferimento in preparazione dell'esame finale o della tesi. Non devono intendersi come materiale ufficiale dell'università Calabria - Unical o del prof Rizza Pietro.

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