Immunologia - misurazione dele affinità delle reazioni

Metodi per la misurazione dell'affinità delle reazioni Ag-Ab

Principali metodi di misurazione

• La dialisi all'equilibrio
• La fluorescence quenching
• La surface plasmon resonance (SPR)

Dialisi all'equilibrio

La dialisi all'equilibrio rappresenta la prima attendibile tecnica di misurazione dell'affinità delle interazioni Ag-Ab. Essa è particolarmente adatta per studiare l'affinità di Ab per apteni o per antigeni di piccole dimensioni. Una soluzione di anticorpo (a concentrazione nota) viene messa all'interno di un sacchetto da dialisi ed equilibrata con una soluzione di aptene o piccolo antigene marcato radioattivamente (inizialmente posta al di fuori della membrana da dialisi). All'equilibrio, la concentrazione fuori dal sacchetto da dialisi corrisponde all'Ag libero mentre la concentrazione all'interno del sacchetto corrisponde all'Ag legato all'Ab più l'aptene libero. Da questo si può ricavare la concentrazione dell'Ag legato all'Ab. I limiti di questa tecnica sono dovuti al peso molecolare dell'Ag, che dev'essere di piccole dimensioni e diffusibile.

Fluorescence quenching

La fluorescence quenching è una tecnica che permette di misurare la fluorescenza delle proteine. Le proteine contengono tre amminoacidi che causano fluorescenza ultravioletta: la fenilalanina (phe), la tirosina (tyr) e il triptofano (thr). Ai fini pratici, la fluorescenza emessa dalla phe non può però essere stimata, pertanto si considera solo quella emessa da tyr e thr, che dipende dalla lunghezza d'onda per l'eccitamento e l'emissione.

Esistono due principali forme di fluorescence quenching: statica e dinamica.

La fluorescence quenching statica misura l'affinità del complesso formato fra il fluoroporo (Ab) e il quencher (Ag) [lo "spegnitore"] che non è fluorescente.

Nella fluorescence quenching dinamica invece il quencher interagisce con il fluoroporo durante il periodo di stato eccitato e ad essa è applicabile la seguente relazione:

Ka = [F-Q]/[F]•[Q]

Dove [F-Q] rappresenta la concentrazione del complesso fluoroporo-quencher; [F] la concentrazione del fluoroporo non complessato e Ka la costante di associazione del complesso. Quando l'Ab lega l'Ag si spegne la fluorescenza dell'Ab e dalla perdita di fluorescenza si può calcolare la quantità di Ag legato all'Ab. La frazione di fluorescenza residua (F/F₀) rappresenta la frazione di fluoroporo (Ab) che non è complessata.

f = F/F₀

La concentrazione totale di fluoroporo è data da:

[F]₀ = [F] + [F-Q]

[F-Q] = [F]₀ - [F]

Ka = ([F]₀ - [F]) / [F]•[Q] = [F]₀ / [F]•[Q] - 1/[Q]

[F]₀ / [F]•[Q] = Ka