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Immunologia Appunti scolastici Premium

Appunti completi e chiari di immunologia e immunopatologia.
Voto 30/30

Programma
Risposte cellulari e tissutali allo stress.
Processi di morte cellulare: necrosi, apoptosi.
Processi degenerativi da accumulo.
Barriere fisiche e biologiche dell’immunità innata.
Origine e funzione delle cellule dell’immunità innata.
L’endotelio e il... Vedi di più

Esame di Immunologia e immunopatologia docente Prof. M. Locati

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sottoclone che emerge non è in grado di interferire con le risposte, viene eliminato. Alcuni

sottocloni però acquisiscono capacità di resistenza grazie a meccanismi che interferiscono con il

quadro di eliminazione mediante la risposta infiammatoria da parte di M1 poiché si sviluppa un

quadro di escape in cui il macrofago ad agire non è più M1 ma M2 e quindi viene “favorito” il

tumore. In questo caso quindi il tumore recluta il macrofago usando le chemochine; il tumore nelle

fasi di partenza permette la polarizzazione del macrofago a M1 mentre nelle fasi successive lo

“imbroglia” mandandogli segnali che esso interpreta come uno stimolo di riparo del tessuto: il

macrofago quindi contribuisce al riparo tissutale trasformandosi in M2 e richiama Th2; inoltre il

macrofago riorganizza la matrice aprendo dei canali nello stroma del tessuto che le cellule tumorali

utilizzano per uscire dalla massa e dare invasione a distanza.

Poiché durante la risposta è necessario anche produrre nuovi vasi, M2 fa anche angiogenesi:

durante lo sviluppo di un tumore però l'angiogenesi ne favorisce la crescita.

Inoltre se M2 di solito favorisce lo sviluppo del parenchima per riparare il danno, qui il parenchima

è il tumore stesso, quindi M2 produce fattori di crescita le cellule tumorali.

I macrofagi svolgono un ruolo anche come cellule APC: presentano l'antigene poiché sono in graod

di riconoscere il microambiente e forniscono informazioni di contesto, affinché il linfocita possa

mettere in atto una risposta adattativa. 10 Marzo

Recettori dell'immunità innata

Il SI innato è necessario per istruire la risposta del SI adattativo a rispondere ai patogeni. In

individui che mancano della risposta innata, quella adattativa non è sufficiente, infatti:

- individui SCID (RAG-) mancano della fase di

scomparsa dell'agente patogeno mentre nella prima

fase la risposta è normale (verde).

- individui in cui manca la risposta immunitaria

innata, fin dall'inizio la risposta è difettiva (rosso)

anche se la risposta immunitaria specifica è

conservata.

- negli individui RAG- la carica che il sistema

immunitario deve controllare è preservata cosa che

invece non avviene per gli individui rossi.

Quindi il sistema immunitario innato è essenziale per mantenere a livelli gestibili il numero di

agenti patogeni da parte del sistema adattativo.

I recettori dell'immuntà innata sono i PRR (Pattern Recognition Receptor) hanno tutti una bassa

specificità a differenza dei recettori per l'antigene dell'immunità adattativa che hanno invece

un'altissima affinità.

I recettori dell'immunità innata sono tutti codificati in forma germinativa ovvero la proteina che

deriva dall'espressione dei geni è una proteina funzionale, i recettori della immunità adattativa

invece necessitano di un riarrangiamento. Quindi mentre i primi sono sempre uguali a se stessi, i

secondi sono presenti in un pannello con specificità diverse a causa del riarrangiamento.

Inoltre se per l'immunità innata è necessario un gene per ogni recettore (ne esistono circa un

centinaio), per l'immunità adattativa sono necessari pochissimi geni per produrre numerosi recettori.

Poiché i recettori per l'immunità innata sono pochi, rilevano grandi classi di patogeni e spesso sulla

stessa cellula ve ne sono più tipi diversi, non sono recettori clonali; quelli invece dell'immunità

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adattativa sono clonali poiché su una cellula si trova un unico recettore che conferisce un'unica

specificità.

Se l'obiettivo dell'immunità adattativa è avere numerosissimi recettori ad elevata specificità ma in

numero limitato di copie (in genere una), per l'immunità innata i recettori sono espressi un po'

ovunque e spesso una qualsiasi cellula esprime un intero pannello di recettori; questo significa che

la risposta innata può partire in tempi molto rapidi perché tutti i neutrofili si equivalgono in termini

di specificità per il target mentre nella risposta adattativa un solo linfocita esprime quello specifico

antigene e quindi è una risposta che impiega settimane di tempo per svilupparsi.

Un'altra differenza tra i due sistemi che i recettori dell'immunità adattativa riconoscono proteine,

quelli dell'immunità innata invece riconoscono qualsiasi struttura non proteica.

Nel caso di riconoscimento di tipo adattativo la discriminazione tra self e non-self non è insita nel

recettore e solo a posteriori è possibile definire se il recettore generato è specifico per il self (se è

specifico per il non self non è possibile definirlo!), nell'immunità innata invece è sicuro che la

struttura riconosciuta dal recettore esiste e che è una struttura invariante, ovvero ha una funzione

essenziale per la sopravvivenza dell'agente che la genera, una funzione strutturale non sacrificabile:

per questo motivo nella risposta innata la capacità di discriminare è assoluta, non esiste una singola

patologia autoimmune determinata per un errore di riconoscimento da parte dei recettori.

I recettori per l'antigene invece sono selezionati su base individuale: vengono generati

dall'individuo e devono essere educati nei primi mesi di vita del soggetto ed inoltre sono soggetti ad

errori che causano patologie autoimmuni.

I target dei PRR sono due grandi famiglie funzionali:

PAMPs (Pathogen-Associated Molecular Patterns) → varianti molecolari associati al

• patogeno o comunque ad un agente esterno, non per forza patogeno. Comprendono diverse

strutture, in particolare:

- glicoproteine → oligosaccaridi ricchi in mannosio

- acidi nucleici → sia ss che ds, riconoscimento di isole CpG

- proteine → ad esempio quelle che iniziano per formil-metionina

- lipidi complessi e carboidrati

Questi determinanti sono spesso espressi dal target in modo ripetuto: questo è importante

per l'attivazione dei linfociti B poiché i recettori che riconoscono queste strutture in realtà si

trovano anche sulle cellule per l'immunità adattativa.

DAMPs (Damage-Associated Molecural Patterns) → sono molecole di natura endogena

• rilasciate in sede extracellulare in seguito ad un danno associati a danno.

Esistono due grandi categorie di morte per una cellula: la necrosi che patologica e l'apoptosi

che è invece fisiologica e non viene percepita come pericolo.

La risposta infiammatoria parte invece quando i DAMPs si trovano in ambiente

extracellulare a causa di una cellula che è morta per necrosi: una cellula che muore per

apoptosi si accartoccia su se stessa ma mantiene la membrana, una cellula che muore per

necrosi invece esplode, perde capacità di membrana e rilascia alcuni determinanti molecolari

per cui i recettori hanno sensibilità.

Le cellule muoiono per necrosi sia a causa di infezioni da parte di un patogeno sia a causa di

risposte sterili quali traumi, tossine chimiche...

Le molecole DAMPs sono ad esempio: chaperoni molecolari, proteine nucleari, HSPs (Heat

Shock Proteins), HMGB1 (ha una funzione di carattere strutturale nel nucleo ed in

condizioni normali non è percepita dal SI).

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Tipi di recettori

I recettori per i determinanti molecolari possono essere di diverso tipo:

1. proteine solubili → possono trovarsi sia in ambiente extracellulare che circolanti in liquidi

biologici; questi includono delle proteine quali collectine, pentraxine ed il fattore C3 per il

complemento (il complemento è un sistema di proteine che complementa la funzione degli

anticorpi, è un effettore molecolare della risposta adattativa ma è anche un sistema di

attivazione anticorpo-indipendente);

2. recettori di membrana → si trovano sia sulla membrana plasmatica che su quella di

organelli; comprendono in particolare la famiglia TLR, ma anche altri tipi di recettori.

3. recettori a funzione intracitoplasmatica → comprendono i recettori NOD, RIG e sistemi

NOD-like

A seguito dell'identificazione del primo TLR4 gli altri 10 sono stati identificati per omologia di

struttura, ovvero prendendo la proteina nell'insieme e cercando proteine omologhe si trovano quelle

omologhe sull'intera struttura della proteina; poiché le proteine funzionano per domini isolando un

dominio alla volta e cercando omologie strutturali dominio per dominio è possibile trovare proteine

che hanno omologie funzionali ma strutture diverse.

Recettori solubili PRRs

Questa categoria di recettori comprende:

complemento – C3 → la sua specificità consiste nell'essere a valle dell'attivazione del

• complemento, ma è anche capace di riconoscere superfici di carattere microbico. C3 si attiva

anche in assenza dell'anticorpo da parte di strutture con cariche negative ripetute, ad

esempio acidi nucleici ma anche alcuni zuccheri (acido sialico).

ficoline e collectine → si assomigliano strutturalmente ed hanno un'organizzazione

• multimerica con una struttura di riconoscimento a teste globulari che poi si organizza e

attiva il sistema: attraverso le teste globulari riconoscono gli zuccheri tuttavia il

riconoscimento di uno zucchero singolo non attiva il sistema ma affinché esso si attivi le

teste globulari devono essere riarrangiate in forma multimerica.

La necessità di multimeri impedisce al sistema di essere autoaggressivo: se la proteina

ingaggia una superficie self la densità di mannosio (ad esempio) è così bassa che la

probabilità che una seconda testa di mannosio venga ingaggiata è troppo bassa; sulla

superfici batteriche invece la probabilità di ingaggio di più di una testa globulare è alta

poiché la carica di mannosio è elevata. Queste strutture quindi riconoscono un DAMP in

funzione della sua distribuzione nello spazio.

Si trovano nei sieri e nei liquidi biologici, in particolar modo lo ficoline si trovano nel

surfactante polmonare.

A valle del riconoscimento si ha l'attivazione della cascata complementare di tipo lectinico.

La cascata complementare si può attivare in tre modi: classica mediante riconoscimento da

parte dell'anticorpo dell'antigene, via lectinica, via alternativa mediante C3. Nella via

classica la prima proteina reclutata si chiama C1 ed è strutturalmente identica alle collectine,

quindi l'omologia strutturale rivela un'omologia funzionale: quando due teste di C1 sono

ingaggiate dal target (coda dell'anticorpo) si attiva la cascata complementare; nell'attivazione

in assenza di anticorpo invece vengono ingaggiate le teste di una lectina che riconoscono gli

zuccheri; il risultato a valle è l'attivazione di MASP che attivano la cascata.

Le collectine sono quindi un modo per attivare la cascata complementare in assenza di

anticorpo, esse possiedono sia la funzione di sensing che la funzione di attivazione, due

funzioni che nella via classica appartengono a due molecole diverse.

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pentraxine → sono diverse proteine che hanno tutte in comune un dominio e comprendono

• corte pentraxine (CRP e SAP) e lunghe pentraxine.

La prima individuata è stata CRP (C Reactive Protein) ed è anche la molecola di cui più

frequentemente viene titolata la presenza: è una proteina reattiva a molte cose e tutte le volte

in cui si trova un agente infettivo nel sistema, il fegato ne produce grandi quantità.

La misurazione di CRP è del tutto aspecifica ma è estremamente sensibile al controllo della

carica batterica che il sistema sta curando.

La struttura di CRP assomiglia a SAP (SieroAmiloide P component) che è coinvolta nella

risposta che porta alla deposizione di amiloide; queste sono le due pentraxine corte e sono

quelle principali prodotte dal fegato a seguito di una risposta infiammatoria.

Le lunghe pentraxine presentano tutte un dominio extra: hanno un dominio pentraxinico cui

segue un secondo dominio eterogenico ma di cui non si conosce la funzione; sono tessuto

specifiche e vengono quindi prodotte direttamente dal tessuto soggetto all'infiammazione.

La funzione della pentraxine è quella di attivare il complemento: legano C1 e contribuiscono

all'attivazione della via classica. Quindi in generale i recettori PRR sono coinvolti

nell'attivazione del complemento.

CRP inoltre riconosce anche fosfatidilcolina: nelle cellule vitali la fosfatidilcolina si trova

sul layer interno delle membrane grazie all'azione dell'enzima flippasi la cui funzione è però

compromessa nella cellule che vanno incontro ad apoptosi e quindi perdono la disposizione

asimmetrica della fosfatidilcolina che diventa abbondante anche sul versante esterno; il

riconoscimento di fosfatidilcolina permette quindi il riconoscimento di corpi apoptotici

prima che essi vadano incontro a lisi.

PRR di membrana

FPR (recettori per i peptidi formilati) → sono recettori a sette domini transmembrana

• presenti sulla membrana plasmatica ed esistono in tre forme:

- FPR → riconosce ad alta affinità i peptidi formilati sulla metionina iniziale che

fungono da indicatori della presenza di una proteina derivante dal patogeno o dai

mitocondri (riconoscimento combinato di PAMP e DAMP) ma ha anche funzione

attivatoria: a seguito dell'ingaggio del peptide formilato viene attivato e attiva la risposta

infiammatoria

- FPRL-1 ed FPRL-2 → riconoscono sempre fMet ma a bassa affinità e hanno funzione

anti-infiammatoria; il loro ligando a maggior affinità sono le resolvine

mannose receptor → è coinvolto nella fagocitosi di microbi. Riconosce alcuni zuccheri

• terminali presenti a livello carboidrati di superficie dei microbi e che possono quindi essere

considerati PAMPs.

TLR (Toll-Like Receptor) → sono glicoproteine integrali di membrana e presentano tutti la

• stessa struttura, di cui sono importanti due domini funzionali:

- LLR → è il determinante esterno, ricco in ripetizioni di leucina; è strutturalmente

uguale in tutti i TLR in cui entrambe le catene contribuiscono a formare il sito di

riconoscimento del target

- TIR → si trova nel versante citoplasmatico ed è essenziale per il signaling

Questi recettori agiscono come dimeri e possono trovarsi sia sulla membrana plasmatica che

sulla membrana endosomale.

I TLR che si trovano sulla membrana plasmatica riconoscono diverse molecole espresse

sulla superficie dei microbi ma non sulla superficie delle cellule eucarioti sane, in

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particolare:

- LPS → che sono costituiti da una componente variabile, una struttura costante e un

lipide A che rappresenta la struttura biologicamente attiva e che viene riconosciuta. Si

trovano sulla membrana dei batteri Gram-: nonostante i batteri diversifichino molto i

loro LPS ogni recettore riconosce determinanti strutturali obbligate.

Gli LPS vengono riconosciuti da un dimero di TLR4

- peptidoglicani → si trovano sui batteri Gram+ dove LPS è assente; vengono

riconosciuti da un dimero di TLR2

- flagellina → proteine costituente dei flagelli

I TLR3/7/8/9 si trovano sulla membrana degli endosomi che fondono poi con i vacuoli di

fagocitosi e riconoscono gli acidi nucleici derivanti dalla digestione in corso del patogeno

(dsRNA, ssRNA, CpG DNA) ma non quelli della cellula stessa che non si trovano negli

endosomi infatti.

Il meccanismo di funzionamento è legato all'utilizzo di adattatori: i due domini TIR che si

affiancano nel dimero non sono cataliticamente attivi ma le attività chinasiche vengono

svolte da una famiglia di chinasi il cui coinvolgimento nella segnalazione è mediato da un

adattatore.

Gli adattatori possibili sono quattro proteine (MyD88, MAL/TIRAP, TRAM, TRIF) che

possono funzionare come omodimeri o eterodimeri e presentano a loro volta due domini:

- dominio TIR → aggancia il dominio TIR del recettore; quindi l'adattamento avviene

attraverso interazioni tra omodomini.

- dominio DD (Death-Domain, assomiglia alle strutture delle caspasi) → aggancia la

chinasi su di un loro dominio DD

I diversi eterocomplessi recettoriali utilizzano diversi adattatori: TLR4 utilizza tutti gli

adattatori, quindi la segnalazione a valle di TLR4 include tutti i segnali funzionali possibili

da parte dei TLR; TLR3 utilizza solo TRIF quindi a valle produce un unico segnale.

Quindi nella capacità dei fagociti di riconoscere il patogeno c'è anche la capacità di istruire

la risposta immunitaria a seconda dell'ingaggio che ha avuto: se ingaggia TLR4 o TLR3 la

risposta a valle è differente.

Gli adattatori attivano risposte differenti:

- MyD88 → induce l'attivazione del fattore di trascrizione NF-κB che attiva la trascrizione

di molecole di tipo infiammatorio (citochine TNF/IL-1/IL-6, chemochine CCL2/CXCL8, E-

selectine, costimoli) inducendo quindi infiammazione acuta e attivazione dell'immunità

adattativa

- TRIF → induce l'attivazione del fattore di trascrizione IRF3 che attiva la trascrizione di

IFN di tipo I, i quali inducono la risposta antivirale

Recettori citosolici

NOD-like receptors (NLRs) → sono una faiglia di 20 proteine citosoliche, alcune delle quali

• riconoscono PAMPs e DAMPs e reclutano altre proteine a formare un complesso di

segnalazione che promuove l'infiammazione.

Anch'essi presentano un dominio di sensing simile al dominio LLR dei TLR, un dominio di

dimerizzazione ed un dominio effettore che recluta altre proteine.

NOD1 lega il muramildipeptide, la struttura di base che tiene insieme la capsula dei batteri

Gram+ e viene liberato a seguito della degradazione della membrana batterica ad opera del

lisozima (contenuto nei granuli dei neutrofili con attività antibatterica); quindi il lisozima ha

una funzione antibatterica ma funge anche da effettore per generare un ligando che permette

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il riconoscimento del batterio.

I NLR vengono suddivisi sulla base del tipo di dominio effettore: CARD (caspase

recruitment domain), Pyrin domain o BIR.

Una sottofamiglia dei NLR sono quindi gli NLRP che presentano il Pyrin domain effettore:

essi riconoscono PAMPs e DAMPs formando complessi di segnalazione detti inflammasomi.

NALP3 è uno di questi recettori:

- presenta un sensore NALP

citoplasmatico che accoppia un adattatore

ASC con un'interazione di tipo

omodominico (pirinico - pirinico).

- ASC è un adattatore e aggancia una

proteina con un dominio CARD

equivalente;

- CARD attiva l'effettore caspasi1 (non

c'entra con apoptosi) la cui funzione è

processare IL-1, una citochina prodotta in

forma pro.

NALP3 percepisce PAMPs e DAMPs ed in particolare i cristalli di acido urico, un prodotto

del ciclo dell'urea che si associano a gotta (curabile con inibitori di IL-1), ma anche cristalli

di asbesto o silicio derivanti dall'ambiente o molecole batteriche (flagellina, LPS,

muramildipeptide..).

RIG-like receptors (RLRs) → sono sensori citosolici specifici per l'RNA virale che

• inducono la produzione di INF di tipo I antivirali. Esempi sono:

- RIG-I → retinoic-acid inducible gene I

- MDA5 → melanoma differentiation-associated gene 5

entrambi contengono un dominio 12 Marzo

Il sistema del complemento

Viene definito sistema poiché include un numero elevato di strutture molecolari.

Il sistema è basato su una cascata di zimogeni, in cui ogni molecola è il substrato di quella a monte

e l'effettore di quella a valle e sistemi specifici attivano la cascata.

Essendo una cascata il processo non è lineare, il rapporto non è 1:1 poiché gli enzimi catalizzano

più volte una stessa reazione, quindi si ha un'amplificazione.

Questa via può essere attivata da tre vie:

1. classica → parte dal riconoscimento antigene-anticorpo

2. alternativa → risposta immunitaria innata attivata dalla presenza di un patogeno

3. lectinica → la cascata è al servizio della risposta al patogeno a seguito della risposta di

alcuni recettori

Qualunque sia la via di attivazione si attua un processo che porta all'avvio del processo di attacco

alla membrana e che ha 3 funzioni effettrici: l'opsionizzazione, un processo che serve a rendere il

patogeno più facilmente fagocitabile, reclutamento di cellule infiammatorie e uccisione dei

patogeni.

Tra l'avvio del processo e la sua completa attivazione l'elemento di snodo è la proteina C3 che porta

a valle all'attivazione di una serie di mediatori. 21

Via classica

L'elemento di avvio è legato al complesso antigene-anticorpo.

Gli anticorpi sono molecole bifunzionali, costituiti da due porzioni:

FAB (Frammento Antigene-Binding) → è la porzione di riconoscimento dell'antigene ed è

• duplice; ogni anticorpo ha il suo FAB ovvero ha una specificità antigenica univoca poiché

possiede una FAB univoco che esprime in duplice copia.

FC → si trova nella porzione carbossiterminale ed è comune a tutti gli anticorpi dello stesso

• isotipo (nell'uomo esistono 5 isotipi). In funzione della classe di appartenenza dell'anticorpo

esso assume un nome: tutti si chiamano Ig a cui segue una lettera che identifica l'isotipo di

appartenenza (A, E, D, I, G, M). Tra i cinque isotipi umani solo due possono fissare

(attivare) il complemento ovvero IgM ed IgG.

Per fissare il complemento l'anticorpo deve poter vantare due caratteristiche:

1. deve aver legato l'antigene → un anticorpo che non ha ingaggiato l'antigene non fissa il

complemento

2. il complesso antigene-anticorpo deve poter ingaggiare con la porzione FC almeno due teste

globulari della prima proteina della cascata complementare della via classica ovvero il

sistema C1

I due anticorpi ingaggiati possono essere gli stessi o diversi ma l'importante è che siano vicini nello

spazio altrimenti i due FC sarebbero troppo lontani per poter ingaggiare le due teste C1.

Con la presenza di diversi FC vengono diverse funzioni dell'anticorpo, inoltre le classi anticorpali

entrano in gioco in momenti diversi durante la risposta immunitaria: se un soggetto viene esposto ad

un antigene la sua risposta anticorpale primaria è sempre IgM dipendente, alle esposizioni

successive nel tempo, il sistema adattativo si adatta e la cellula che sta producendo IgM riceve

informazioni dal sistema immunitario (T helper) e switcha la coda da IgM ad un altro Ig.

L'avvio della cascata complementare a valle della prima esposizione della via classica è sempre una

via IgM dipendente: il vantaggio deriva dal fatto che le IgM sono cinque subunità anticorpali (e

quindi presentano dieci siti di legame per FAB) tenute insieme da un peptide di giunzione, quindi

quando l'anticorpo ingaggia l'antigene la probabilità di avere due FC vicini nello spazio è molto alta

poiché quando l'anticorpo fissa il primo FAB, la probabilità che una seconda FAB si ingaggi è solo

dipendente dalla densità dell'antigene e non dalla concentrazione dell'anticorpo.

IgG invece presenta un unico FC quindi per avere due FC-IgG ingaggiati è necessario che vi siano

alte concentrazioni di anticorpo poiché se esso è poco concentrato, il secondo si legherà troppo

lontano e non potrà fissare il complemento.

Quindi per la risposta secondaria che dipende da tutte le forme anticorpali tranne IgM è necessaria

un'alta concentrazione di anticorpo perché solo in queste condizioni la densità di anticorpi

ingaggiati nello spazio è sufficiente per l'attivazione del complemento.

Le molecole coinvolte nella cascata sono dette C (da 1 a 9) ma non vengono utilizzate in ordine

numerico; le molecole coinvolte nella cascata di attivazione per via alternativa invece prendono il

nome di “fattore” seguiti da una lettera; le proteine regolatrici hanno altri nomi.

Il primo elemento che porta alla cascata di attivazione classica del complemento è C1, un

complesso molecolare complicato di cui viene ingaggiata la subunità ingaggiata C1q costituita da 6

catene uguali; nel mezzo di questa struttura a ventaglio si allocano due proteine in coppia chiamate

C1r e C1s due proteasi a funzione serina-esterasi che rappresentano gli effettori (C1q non ha

funzione catalitica).

C1r e C1s si tagliano a vicenda e poi reclutano C4, una molecola plasmatica, e la tagliano; il taglio

di C4 genera un frammento piccolo C4a ed un frammento grande C4b: in tutti i casi il frammento

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piccolo se ne va e svolge una funzione solubile mentre il frammento grande è trattenuto dove viene

prodotto e consente l'avvio dello step successivo; quindi C4b viene fissato mediante un ponte tio-

esterico.

Il successivo elemento della cascata C2 che si aggancia e viene tagliato sempre dalle serina-esterasi

C1r/C1s; a differenza degli altri elementi, per C2 a rimanere è il frammento piccolo C2a mentre il

frammento grande C2b se ne va.

La coppia di proteine C4b-C2a attaccata al complesso è in grado di convertire C3 grazie alla

funzione “C3 convertasi della via classica”: C3 viene riconosciuto e clivato e C3b viene

agganciato mediante un ponte tio-estere al complesso C4b-C2a.

C3 è il cuore del sistema perché questo step catalitico ha un'elevatissima efficienza.

Il sistema C4b-C2a-C3b acquisisce la capacità di riconoscere e clivare C5 e viene detto quindi “C5

convertasi della via classica”; anche in questo caso C5a se ne va e C5b si aggancia.

A questo punto termina l'attività di tipo catalitico e da qui in avanti le proteine si aggregano ma non

vengono processate o acquisiscono capacità catalitica.

Via lectinica

La differenza nel processo di attivazione del sistema rispetto alla via classica è il sensore poiché in

questa via non è richiesto il complesso antigene-anticorpo. La prima molecola che è stata

identificata in questa via è MBL (Mannose-Binding-Lectine) che ha una struttura identica a C1q ed

in cui la funzione di identificazione del target e di attivazione della cascata sono fuse nella stessa

proteina come farebbe il complesso antigene-anticorpo nella via classica.

L'omologia struttura-funzione si ha anche a livello della coda di MBL dove le due proteine MASP1

e MASP2 presenti in duplice copia fungono da serina-esterasi come C1r e C1s. MASP2 cliva sia

C4 che C2 esattamente come il complesso C1r-C1s.

La via lectinica è quindi uguale alla via classica ma differisce solo per il processo di attivazione.

Via alternativa

Questa via è differente dalle altre due; la cascata si attiva spontaneamente per via alternativa in certe

condizioni.

La via alternativa è basata su una funzione di C3 che ha capacità di autoattivazione (tick-over) cosa

che effettua regolarmente nel plasma. Il tick-over che sgancia C3a e produce C3b è facilitata da

alcune superfici che presentano cariche negative dense, in particolare il vetro così come gli acidi

nucleici. Quindi C3b prodotto si aggancia attraverso il ponte tio-esterico (o se non si aggancia si

inattiva grazie all'azione di acqua!) e svolge la sua funzione che in questa via passa attraverso

molecole che appartengono alla classe di “fattori”.

C3 attivato recluta il fattore b che viene clivato da C3b generando una molecola detta C3bBb che

acquisisce la capacità di convertire C3 ed è quindi la “C3 convertasi della via alternativa” la quale

cliva C3 generando C3a e C3b; C3bBb trattiene alcune C3b generando C3bBbC3b che a sua volta

cliva C5 e funge quindi da “C5 convertasi della via alternativa”.

Quindi ciò che differisce è essenzialmente tra la via alternativa e le altre due vie sono la C3

convertasi e la C5 convertasi.

Anche nella via alternativa C3b prodotto può ingaggiare il target mediante un ponte tio-esterico.

*C3 è la molecola i cui livelli plasmatici sono correlati al target, ovvero la quantità di C3 è uguale

alla quantità di target: nelle risposte sistemiche è la quantità di C3 eccessiva che si consuma ad

esaurire la risposta.

In tutto il processo è essenziale non perdere il target: C4 e C3 nella loro configurazione nativa

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presentano nella porzione profonda un ponte tio-estere che è altamente instabile; quando la porzione

a viene sganciata, il ponte tio-estere ha per poche frazioni di secondo reattività ed il substrato che

per il 99% delle volte sceglie è acqua: se il ponte reagisce con acqua la proteina viene inattivata; se

invece trova una struttura che non inattiva il ponte tio-estere, la struttura si aggangia e la subunità

non si inattiva e ne permette la localizzazione, ovvero le impedisce di andare in giro. Quindi

l'idrolisi del ponte tio-estere è un modo per inattivare le proteine che lo possiedono.

Le molecole con legame tio-esterico non sono vincolate alle altre subunità per rimanere agganciate.

Una volta che C5b è entrato a far parte del complesso, la struttura diventa piattaforma di aggancio

di una serie di molecole fino a C8; la molecola finale del processo che svolge funzione è C9: una

molecola anfipatica che ha due teste polari ai due lati e un corpo apolare e circola nel siero. Il

complesso di attacco alla membrana crea le condizioni per infilare 6 unità di C9 che si incastrano

nella membrana in modo da formare un barile al suo interno e genera quindi dei “buchi” nella

membrana del target che quindi muore.

Esiste una seconda molecola che svolge la stessa funzione detta perforina: è strutturalmente analoga

e si trova nei granuli del linfociti T citotossici, ovvero i linfociti killer che quando riconoscono un

bersaglio degranulano e rilasciano perforina che si organizza e crea dei buchi nella membrana.

Elementi di regolazione del sistema

Il primo elemento di regolazione del sistema è recettoriale; i recettori per i frammenti piccoli b sono

quattro detti CR(1,2,3,4).

CR3 e CR4 sono integrine-β2 e hanno quindi in comune CD18 mentre la catena α è diversa ed è

CD11b per CR3 e CD11c per CR4; queste molecole riconoscono C3b ma non quello coinvolto

nella costituzione del complesso di attacco alla membrana bensì quello che si trova intorno che non

essendo coinvolto nella prosecuzione della cascata prende il nome di “C3b inattivo” (nel senso di

non più attivo nella prosecuzione della cascata).

Il riconoscimento di C3b da parte di CR3 o CR4 porta a fagocitosi; quindi la funzione del

complemento opsonica (che facilita la fagocitosi) è legata all'attivazione del complemento che porta

alla produzione ci C3b.

Le cellule che esprimono CR3 e CR4 sono macrofagi, monociti, neutrofili..

CR1 (CD35) è un regolatore negativo dell'attività del complesso.

CR2 (CD21) è una molecola che fa parte del recettore per l'antigene del linfocita B: nei casi in cui

CD21 non è ingaggiato, il recettore per l'antigene del linfocita B funziona poco, se esso è ingaggiato

il recettore funziona meglio. Questo significa che il linfocita B che sta riconoscendo l'antigene se ha

un segnale complemento agganciato si attiva meglio poiché il complemento ha una funzione help.

Le molecole a che vengono generate durante l'attivazione del complemento vanno in circolo.

Per C3a e C5a esistono dei recettori apposta che sono recettori proteina G a sette domini

transmembrana e sono recettori chemiotattici. La funzione è quella di richiamare i fagociti: la

chemiotassi si basa sui gradienti a seconda dei quali la cellula fagocitica si muove verso il sito dove

si trova il patogeno; quindi la funzione dei frammenti a è di creare il gradiente!

Meccanismi di controllo

Il primo metodo per regolare il sistema è la presenza di inibitori. Il sistema della via classica parte

da C1 che ha una molecola di inibizione specifica detta C1-inibitore (che agisce solo nella via

classica): è una proteina plasmatica, una serpina. Quando C1-inibitore complessa C1r-C1s la sua

attività serina-esterasica si blocca.

Per C1-inibitore esiste una situazione di deficit su base genetica che porta all'angioedema ereditario:

il sistema C1-dipendente è iperattivo e l'effetto finale è la sovrapproduzione di C2b che è la frazione

24

solubile. C2b in circolo viene convertito in C2-kinina un vasodilatatore che porta ad edema per

attivazione della risposta vascolare che porta a problemi a livello solo della laringe.

Un secondo sistema di regolazione è per spiazzamento di C3b e C4b dal sistema del complesso.

CR1 compete con Bb per C3b e permette quindi di spiazzare Bb da C3b e bloccare la C3 convertasi

della via alternativa, e la stessa cosa avviene per spiazzamento di C4b nella via classica dove CR1

compete con C2a.

Un terzo meccanismo è la regolazione dell'efficienza della cascata attivando o inattivando C3b

mediante regolatori negativi: il principale di questi è il fattore I (i)che lavora su C3b quando esso è

stato sganciato dal complesso e lo cliva rendendolo inattivo.

Quindi se genero C3b per tick-over posso passare ad una risposta completa o perchè viene facilitata

la produzione o perchè mancano regolatori negativi; CR1 è una molecola specie-specifica e non ha

un corrispettivo procariotico quindi se inizio a decorare una membrana batterica con C3b su quella

membrana non ho un regolatore negativo, mentre se esso si aggancia ad una membrana eucariotica

questa ha a disposizione molecole come CR1 che facilitano l'attivazione di molecole inibitrici.

Questo spiega la logica dell'attivazione alternativa che prevede l'attivazione di un sensore e nel caso

di inattivarlo, ovvero viene costruito un target che prima non c'era; il rischio è che l'aggancio del

target avvenga in modo sbagliato e per evitare ciò le membrane che non devono essere riconosciute

come target sono dotate di meccanismi di protezione.

Persone con un deficit del fattore I manifestano un continuo consumo di C3b che continua a clivare

C3, e quindi un'aumentata sensibilità ai patogeni.

Alcuni soggetti invece mancano di regolatori negativi della famiglia di CR1: queste proteine sono

proteine di membrana cui sono agganciate mediante un ponte fosfatidilinositolico che viene

prodotto da un enzima specifico; soggetti che hanno un deficit nella funzione di questo enzima,

presentano un difetto nella regolazione negativa del sistema.

Questa situazione causa una patologia detta emoglobinuria parossistica notturna, ovvero presenza

di emoglobina libera nelle urine sporadicamente di notte che si esprime quindi con anemia; in questi

soggetti manca una funzione di regolazione negativa di attivazione della cascata complementare che

porta al riconoscimento di globuli rossi nel sangue come target da parte di C3b. La capacità di tick-

over di C3b è infatti legata al pH che di notte scende e permette alla quota di C3 che va in tick-over

spontaneo di salire: C3b si lega quindi ai globuli rossi a causa della mancata inattivazione della

cascata.

Un altro meccanismo di regolazione importante è legato all'attivazione di molecole che prevengono

il reclutamento di tutto il complesso di attacco alla membrana e non consente il reclutamento di C9.

I regolatori della famiglia di CR1 sono presenti negli eucarioti e non nei procarioti ma sono anche

specie-specifici quindi cellule di scimmia non bloccano la cascata complementare di uomo.

(100') Un trapianto di rene da un cane a una scimmia determinerebbe un rigetto da parte della

scimmia dell'organo trapiantato; la risposta di rigetto è strettamente anticorpo-dipendete che

richiede anticorpi e complemento: se viene condizionato il ricevente sostituendogli il plasma,

l'organo è tollerata.

Perchè si ha una risposta immuno-mediata in un soggetto non immunizzato in così poco tempo? La

presenza di un anticorpo contro il cane nella scimmia presuppone che l'antigene fosse già presente

nella scimmia e questo si trova nella flora batterica dell'intestino della scimmia. Diverse specie

hanno flore batteriche diverse che esprimono antigeni diversi, nel plasma della scimmia quindi

esistono dei residui zuccherini contro cui la scimmia ha fatto degli anticorpi poiché li ha

riconosciuti dalla su flora batterica e gli unici determinanti zuccherini contro cui non ha fatto

25

anticorpi sono quelli che si trovano sulle sue cellule. (gli anticorpi per i determinanti zuccherini

sono solo IgM). Quindi durante gli xeno-trapianti gli IgM reagiscono contro i determinati

zuccherini che si trovano sui vasi delll'organo trapiantato e quindi parte la cascata complementare.

La densità di questi target è bassa ma l'attivazione della cascata complementare non è controllata da

CD59 poiché la cellula dell'organo è di un'altra specie che ha altri regolatori negativi e quindi si ha

la fissazione del complemento e l'uccisione dell'organo in 1-2h.

Funzioni del complemento

1. opsonica → capacità di migliorare la funzionalità di cellule macrofagiche, è correlata alla

funzione positiva di C3 e C4 ed è regolata negativamente da CR1

2. pro-infiammatoria → le molecole C5a e C3a creano gradienti e reclutano cellule

macrofagiche; le frazioni del complemento sono anche frazioni attivatorie e non solo di

relcutamento (le chemochine invece hanno funzione di reclutamento ma non attivatorie)

3. lisi osmotica → è strettamente dipendente dalla formazione del complesso di attacco alla

membrana

4. autoregolazione negativa → nella via classica l'attivazione presuppone il riconoscimento di

un antigene legato ad un anticorpo (complesso immune) ma i complessi immuni sono

costituiti da antigeni che spesso sono polivalenti e sono riconosciuti da anticorpi a loro volta

polivalenti (da 2 a 10) quindi la creazione di un complesso immune può facilmente dare

complessi che progressivamente crescono e quando superano dimensioni critiche

precipitano e non stanno più in circolo. Questo è un rischio perché porta il complesso

immune che è il trigger per l'attivazione a ridosso di una membrana che può essere

scambiata dal sistema come se fosse un target, questo avviene nei vasi dove porta alle

vasculiti. Per evitare questo è necessario eliminare il complessi immuni quando crescono di

dimensioni: la funzione di regolazione della presenza dei complessi immuni è legata alla

funzione di CR1 che consente la clearance dei complessi immuni circolanti da parte dei

macrofagi della milza e

Il complemento è una delle principali cause delle patologie immuno-mediate nell'uomo. La

produzione di numerosi complessi immuni a seguito di una risposta infiammatoria acuta e la loro

precipitazione porta a diverse sintomatologie reumatiche. 16 Marzo

Mediatori solubili dell'infiammazione

Queste molecole intervengono quasi sempre in più di un aspetto dei vari processi, quindi più che un

sistema unidirezionale quasi sempre si parla di network, le molecole agiscono come un sistema che

regola in più di un aspetto biologico il processo. Il risultato biologico finale è una sorta di somma:

la cellula target integra segnali che arrivano da un sistema complesso in cui i mediatori agiscono in

maniera coordinata.

Mediano tutti gli aspetti: vasodilatazione, reclutamento, aumento della permeabilità vascolare, ma

anche gli aspetti di carattere sistemico (dolore, febbre, anoressia, leucocitosi..), per questa ragione i

mediatori sono fino ad oggi la maggioranza dei target di approccio farmcologico.

I mediatori solubili derivano da due fonti:

1. origine plasmatica → derivano da molecole presenti nel plasma ed in forma biologicamente

inattiva; un esempio è il complemento ma anche sistema delle chinine, cascata della

coagulazione e sistema fibrinolitico che però non intervengono nella regolazione della

risposta infiammatoria comunque quando vengono attivati producono mediatori che tra le

funzioni modulano la risposta infiammatoria.

26

2. origine cellulare → alcuni mediatori sono pre-sintetizzati (istamina) e pronti per essere

utilizzati, i trovano nei granuli e vengono attivati per secrezione; altri devono essere

sintetizzati pre-novo (es. citochine) che sono la maggioranza. Poiché la risposta

infiammatoria è fasica anche i suoi mediatori sono principalmente di tipo fasico e quindi

indotti durante il processo. In generale i mediatori della risposta immune in condizioni basali

sono pari a zero.

Le fonti sono un po' ubiquitarie: neutrofili, fibroblasti, epitelio in seguito a stimolazione;

qualsiasi tessuto risponde ad un danno con produzione di questi mediatori; dal punto di vista

quantitativo la produzione varia ma comunque il contributo netto varia da caso a caso.

Il meccanismo di funzione avviene in modo recettore-mediato, non sono effettori diretti.

I mediatori siolubili inoltre sono tutte molecole a breve emivita, sono fasiche anche in termini di

switch-off: questo perchè sono mediatori molto potenti e potenzialmente dannosi, nei casi di

inattivazione non efficiente mediano loro stessi patologia. L'inattivazione è la somma di numerosi

processi: la maggior parte viene regolata a livello trascrizionale; a livello post-trascrizionale invece

subiscono 3 processi: alcune vengono degradate, parte vengono processate (ovvero modificazioni

che ne cambiano la struttura) e parte vengono bloccate, affinchè questo avvenga è presente un

mediatore attivo ed una serie di mediatori che bloccano il mediatore attivo.

Ognuno di questi parametri è legato a funzioni biologiche che sono polimorfiche nella popolazione:

ogni individuo ha un controllo derivante dalla somma algebrica di tutti questi processi.

Mediatori di origine cellulare

Dei mediatori di origine cellulare sintetizzati de novo fanno parte le due principali amine vasoattive:

serotonina → nell'uomo la sua funzione è trascurabile poiché è presente nelle piastrine ma

• non nei mastociti (a differenza del topo); quindi il blocco della risposta come blocco della

serotonina ha effetti marginali nell'uomo (mentre funziona nel topo).

istamina → la fonte principale sono i mastociti e sia nei mastociti che nelle piastrine è un

• mediatore pre-sintetizzato,, si trova nei granuli e viene rilasciata in pochi minuti (così come

la serotonina nel topo!). Gli stimoli che ne inducono il rilascio sono: attivazione della

cascata complementare, stimoli lesivi fisici, reazioni immunitarie, citochine (IL-8, IL-1),

neuropeptidi (sostanza P).

Il target dell'istamina è il vaso di cui si occupa di regolarne il calibro e la permeabilità. Fa

questo interagendo con HR1 sulle cellule epiteliali e HR2 sulle cellule muscolari, due

recettori a a 7 domini trans-membrana. La somma dell'azione sui due recettori porta a

vasodilatazione ed aumento della permeabilità e quindi comparsa di edema che rappresenta

il punto di avvio dell'intero processo infiammatorio.

Un altro mediatore importante per lo stesso processo è prostaglandina E2. Il contributo

relativo di questi due mediatori dipende dal contesto di stimolo: nelle reazioni allergiche, il

cui avvio dipende da una risposta immunitaria specifica, l'edema è completamente

dipendente da istamina.

L'istamina interviene anche in altre attività biologiche:

- muscolatura liscia peribronchiale → determina broncospasmo, un'altra manifestazione

tipica delle reazioni di tipo allergico

- terminazioni nervose periferiche → determina prurito e dolore, assomiglia a

prostaglandina e2. Il dolore associato alla stimolazione delle terminazioni nervose si

esprime in una variante particolare del dolore che è il prurito.

Quindi istamina media: edema, broncospasmo e prurito, ovvero i tre principali effetti di una

risposta allergica acuta. 27

Gli altri mediatori di origine cellulari vengono prodotti a partire dall'acido arachidonico, la

molecola a monte dell'intero processo.

L'acido arachidonico siene rilasciato da fosfolipidi di membrana per azione di una fosfolipasi (in

genere A2) poiché è esterificato in posizione 2 in fosfatidilcolina; la fosfolipasi in condizioni

normali è inattiva e si trova nel citosol ma viene attivata a seguito dell'aumento della concentrazione

di ioni calcio che la porta sulla membrana dove rilascia l'acido arachidonico.

Il substrato entra in diverse vie metaboliche:

ciclossigenasi (COX) → esistono due varianti espresse in maniera diffusa ed una nel

• sistema nervoso; COX1 e 2 sono diverse dal punto di vista della regolazione:

- COX1 è un enzima costituitivo, normalmente non è regolato

- COX2 è inducibile quindi in condizioni basali non è espresso ma viene indotto

Questi due enzimi processano l'acido arachidonico e producono prostaglandine; le vie di

attivazione sono dipendenti dal contesto cellulare in cui si trovano: la conversione nelle

forme attive è funzione di enzimi diversi. Ad esempio la formazione di prostaciclina avviene

nella cellula endoteliale mentre nelle piastrine si forma trombossano A2: queste due

molecole hanno funzioni opposte! La prostaciclina è un vasodilatatore ed inibisce

l'aggregazione piastrinica, i trombossani sono vasocostrittori ed inducono l'aggregazione

piastrinica.

In condizioni fisiologiche l'equilibrio è a favore della prostaciclina: il tono dei vasi è quindi

prostaciclina-dipendente; in condizioni di patologia l'attivazione massiccia delle piastrine

sposta l'equilibrio e quindi localmente si ha aggregazione piastrinica (causa problemi in caso

di arterosclerosi).

Questi due precursori vengono poi convertiti in diversi distretti in vari mediatori, tra questi

c'è prostaglandina E2 che determina dolore e vasodilatazione.

Quindi durante una risposta infiammatoria vengono prodotti prostaglandina D ed E che

determinano un effetto analogo ad istamina; infatti bloccare la produzione di prostaglandina

E2 è un buon modo per bloccare la risposta infiammatoria.

lipossigenasi → esistono diverse varianti, in particolare la 5-lipossigenasi che insieme ad

• una proteina accessoria produce leucotrieni ed in particolare il precursore è il leucotriene

A4, dau cui si formano due classi di mediatori:

- leucotriene B4 → ha due specifici recettori ed è un chemioattraente

- coniugazione di glutatione e A4 con formazione di LTB4 e conversione progressiva di

LTB4 in LTC4, LTD4 ed LTE4 (via dei cisteinil-leucotrieni).

LTB4 viene considerato il primo reclutatore nelle fasi iniziali del processo e la sua cellula

target per eccellenza è il neutrofilo.

Il target principale dei cisteinil-leucotrieni è invece la muscolatora liscia e l'effetto principale

è vasocostrizione e broncospasmo.

Questo pathway può essere bloccato da un farmaco indicato per soggetti allergici.

lipossine → sono insieme a resolvine e protectine, derivati dalla cascata dell'acido

• arachidonico ma hanno attività anti-infiammatoria. LTA4 può dar vita ad un meccanismo di

biosintesi trans-cellulare ovvero passa dal neutrofilo alla piastrina dove è oggetto di un'altra

ossigenasi che produce lipossine.

Quindi nella risposta infiammatoria l'attivazione della cascata dell'acido arachidonico produce:

prostaglandine, leucotrieni e lipossine.

Dopo che la fosfolipasi A2 ha staccato acido arachidonico dalla fosfatidilcolina, viene prodotta

lisofosfatidilcolina; al gruppo -OH della lisofosfatidilcolina vine aggiunto un gruppo -CH3 a

28

formare il fattore attivante delle piastrine (PAF). Questo fattore attiva le piastrine ma in realtà

l'aggregazione piastrinica dovuta alla sua attività è minoritaria, mentre il principale target sono:

monocito macrofagi, endotelio e neutrofili quindi la sua funzione è comparabile al leucotriene A4.

Il tempo necessario per produrlo è di qualche minuto poiché è necessaria solo una metilazione, è

una sorta di mediatore a monte. La sua attività nel sistema dura qualche minuto finchè PAF acetil-

idrolasi plasmatiche ne bloccano l'azione; sono polimorfiche poiché ne esistono 3.

Sistema degli interferoni

Include tre tipi di IFN:

1. IFN di tipo I → sono IFN α e β la cui sintesi è ubiquitaria; complessivamente sono 27 IFN.

È il sistema di protezione per eccellenza dai virus poiché qualsiasi cellula che sia oggetto di

infezione virale deve avere a disposizione un segnale con cui comunica che è stata infettata

da un virus.

Il nome interferone deriva dal fatto che interferiscono con l'infezione virale e rendono la

cellula meno suscettibile alla replicazione virale.

L'effetto avviene grazie all'attivazione del sistema JAK/Stat che porta all'induzione di

proteine, in particolare molecole che interferiscono con la replicazione del genoma del virus

prima che il virus la infetti: ad esempio PKR che inibisce la sintesi di proteine virali e le

proteine Mx.

La sintomatologia legata alle infezioni virali si distingue in una componente specifica legata

al virus ed una componente influenzale che rimane sempre la stessa poiché dipende dal

interferone.

Questo tipo di effetto porta ad un'induzione della risposta specifica in particolare l'induzione

delle molecole di classe MHC di classe I che rappresentano le molecole di passaggio tra la

risposta innata e quella specifica; quindi in una prima fase le cellule infettate sono efficienti

nel presentare il virus, e la prima funzione del virus sarà quella di bloccare la produzione di

MHC (che era a livelli alti). Le cellule che diventano MHC negative, che ne perdono

l'espressione a causa del virus, diventano il target delle cellule NK che hanno una sorta di

controllo negativo: mentre le cellule killer hanno bisogno di un bersaglio, queste cellule

uccidono se non trovano un inibitore che è MHC di classe I.

quindi hanno attività antivirale sia perchè bloccano il virus, sia perchè lo rendono più

detectabile sia perchè permettono l'azione di cellule NK.

2. IFN di tipo II → è l'interferone γ che ha una funzione nelle risposte immunitarie specifiche

3. IFN di tipo III → IFN ω.

Citochine pro-infiammatorie primarie

Queste molecole non agiscono in maniera isolata bensì con una logica di network ovvero si

regolano a vicenda attivando dei processi a valle che medianti feedback di inibizione a monte

bloccano le stesse citochine. Questo sistema integrato determina due condizioni a livello

terapeutico:

- opportunità → se la risposta è legata ad un network, il blocco di una molecola a monte

blocca tutto

- problema → è necessario identificare quindi qual'è la citochina a monte del processo e

qual'è la fase della malattia in cui agisco.

Le tre molecole che compongono il network sono:

IL-1 → il sistema IL-1 è costituito da una citochina (di cui ne esistono 12) come IL-1 che

• agisce su un sistema recettoriale fatto da due catene strutturalmente analoghe ma diverse:

IL-1R1 e IL-1AcP. Il complesso recettoriale non ha attività intrinseca ma necessita di

adattatori per poter segnalare all'effettore; la molecola effettrice è una serina-chinasi facente

29

parte della famiglia IRAK.

IL-1 in condizioni basali non è presente ma la sua produzione da parte dei fagociti viene

indotta da stimolazioni di tipo infiammatorio (se stessa, altre citochine pro-infiammatorie).

Questo pathway è particolarmente vero per IL-1β mentre IL-1α è prodotta dalle cellule

epiteliali ma comunque attiva lo stesso recettore.

Esiste poi una terza citochina IL-1ra che è in grado di legare IL-1R1 ma non IL-1AcP: in

questo modo blocca il sito di legame di IL-1 impedendo il reclutamento di adattatori

molecolari e agendo quindi da antagonista.

È presente anche un'altra catena recettoriale che lega IL-1β, IL-1R2 strutturalmente uguale a

IL-1R1 ma tronca a livello citoplasmatico ovvero mancante del dominio TIR (Toll-R1-

Receptor) che aggancia il dominio TIR sull'adattatore MyD88 e che permette l'attivazione

dell'effettore; anche IL-1R2 è quindi un inibitore del sistema.

IL-1R2 può anche essere tagliato e fungere come una decoy solubile.

Gli effetti locali di IL-1 sono: attivazione dell'endotelio, della cascata di attivazione,

espressione di integrine, aumenta la sopravvivenza dei neutrofili... oltre a questo nel SNC,

fegato e midollo osseo attiva meccanismi molecolari di espressione sistemica: febbre,

leucocitosi..

TNF (Tumor Necrosis Factor) → TNFα è il mediatore della risposta infiammatoria e agisce

• su due recettori: TNF-R1 e TNF-R2 (p75); i due recettori hanno una struttura simile ma

TNF-R1 presenta un “dominio di morte” che gli consente di mediare apoptosi, mentre TNF-

R2 al contrario media la sopravvivenza delle cellule.

TNF è prodotto come pro-citochina di membrana e viene accorpato poi come un omotrimero

fissato sulla membrana; viene poi processato dall'enzima TACE ed infine l'omotrimero

ingaggia un omotrimero recettoriale. Anche in questo caso quindi i recettori per funzionare

devono aggregare.

L'attivazione della cascata è dovuta agli adattatori TRAD e TRAF che attivano la chinasi RIP

in grado di sbloccare il sistema NF-Kb.

Le attività biologiche di TNF sono uguali a quelli di IL-1 ma TNF è più veloce, mentre sono

diverse le funzioni a livello sistemico.

IL-6 → indotta da IL-1 e TNF, ha come target i fagociti che presentano dei recettori formati

• da tre catene: una IL-6α e due gp130.

La catena IL-6Rα non entra nella trasduzione ma è essenziale per reclutare catene gp130 e

per la loro dimerizzazione, necessaria alla segnalazione; IL-6Ra funziona anche in versione

solubile: cellule che non hanno IL-6Rα possono acquisire risposta per trans-signaling.

IL-6 è attiva localmente ma è soprattutto un mediatore a distanza: la risposta epatica, che fa

parte della risposta sistema, è quasi completamente dipendente da IL-6. 17 Marzo

Chemochine e reclutamento leucocitario

Le chemochine intervengono nel reclutamento dei leucociti; il processo di reclutamento è un

processo in cui la cellula da una situazione di resting riconosce un gradiente lungo cui cammina,

con una porzione dove ci sono i lamellipodi davanti ed una porzione detta uropodo a livello della

coda.

Agenti chemiotattici

1. di origine batterica → peptidi formilati

2. di origine endogena:

- lipidi 30

- derivati dall'attivazione complemento (C5a, C3a) → associati al patogeno poiché

derivano dall'attivazione in sede, dove si trova il patogeno

- chemochine → prodotte dall'ospite

Le chemochine sono la più grossa famiglia di citochine e sono tutte costituite da tre foglietti beta

paralleli e una struttura alfa-elica che costituisce la code C-terminale; la porzione N-terminale non è

strutturata, non ha una configurazione rigida e la sua attività biologica è strettamente dipendente da

questa porzione.

La sovrapposizione della struttura di diverse chemochine è perfetta ad eccezione della coda N-

terminale.

Le chemochine hanno tutte la stessa funzione ovvero hanno azione chemiotattica attraverso

l'interazione con una famiglia di recettori a sette domini transmembrana.

Per classificare le chemochine si utilizza la posizione delle cisteine (che determina il folding

proteico) ed in particolare sulla posizione delle prime due cisteine nella porzione N-terminale:

queste due cisteine sono tra loro separate da un numero variabile di amminoacidi di altra natura;

sulla base di questo vengono classificate in:

- CC se le due cisteine sono adiacenti, sono la maggior parte

- CXC presentano un amminoacido nel mezzo e sono anch'esse numerose

Oltre a queste esistono solo 3 chemochine diverse:

- una CX3C → presenta tre amminoacidi

- due XC → hanno una sola cisteina all'N-terminale

A questa classificazione per le chemochine segue una L ed un numero che è determinato dal

posizionamento dei gen codificanti per queste proteine sui cromosomi: ad es. CCL1 è la prima

chemochina che sul cromosoma corrispondente è posizionata della famiglia CC, ed è un ligando;

CCL10 sarà il decimo componente della famiglia..

le due cisteine iniziali non hanno un ruolo strutturale tra di loro, non formano un ponte disolfuro,

tuttavia i recettori delle chemochine rispettano le famiglie: le chemochine CCL legano molti

recettori della famiglia CCR, ovvero le famiglie non mescolano i recettori.

Le chemochine sono tutte proteine secrete e solubili ad eccezione di CX3CL1 che è una

chemochina di membrana.

Queste proteine vengono riconosciute da dei recettori tutti accoppiati a proteine G la cui subinità

alfa è di tipo inibitorio. Questi recettori fanno parte di una sottofamiglia a cui appartengono anche i

recettori per PAF e a loro volta sono raggruppabili in gruppi.

La porzione N-terminale dei recettori ha una serie di cariche elettriche negative nette, in parte date

da residui di acido aspartico e glutammico ed in parte di tirosine che vengono solfatate; poiché le

chemochine hanno carica netta positiva, la prima interazione tra i due è un'interazione di carica che

di per sé non è però attivatoria. Ciò che attiva è l'orientamento dell'ammino-terminale della

chemochina nel contesto dello spazio che si forma nello spazio transmembrana; la porzione N-

terminale della chemochina interagisce quindi con il recettore ne determina l'attività biologica e

l'attivazione. Quindi una modificazione dell'N-terminale della chemochina ne modifica l'attività

biologica.

Una volta attivata la proteina G attivano una serie di segnali da stress che porta ad eventi

trascrizionali ma anche eventi che portano a migrazione grazie alla riorganizzazione del

citoscheletro.

L'organizzazione del movimento deriva da una sintesi dei segnali che si realizzano a livello del polo

anteriore della cellula, quello in direzione del movimento; nel polo anteriore la funzione del segnale

che parte dal recettore per le chemochine è l'attivazione dell'integrina; sul polo posteriore la cellula

31

organizza actina e si appoggia sul polo posteriore bittando in avanti il citoplasma. Durante il

processo riorganizza anche la disposizione dei recettori: i recettori per le chemochine vengono

portati avanti in modo che possa partire il segnale che attiva il processo, mentre sul polo posteriore

porta delle molecole di adesione (es. ICAM-3, CD43..) in modo da mediare un fenomeno di

“cammino in fila indiana” poiché la coda della cellula davanti fa da punto di aggancio per la testa

della cellula che la segue. Quindi il segnale di questi recettori passa per segnali da stress e attività

trascrizionali e anche da small-GTP-BP che è legata alla loro capacità di migrare.

I recettori per le chemochine sono numerosi (23 o 24) e prendono il nome della chemochina+R

(CCR, CXCR..); essendo la metà significa che una chemochina è riconosciuta da più di un recettore

e viceversa un recettore riconosce più di una chemochina. Alcuni recettori stabiliscono comunque

interazioni monogamiche (un recettore-un ligando). Questo concetto viene detta promiscuità, un

altro concetto è il “robustness” ovvero sullo stesso recettore agiscono più ligandi perchè questo

fornisce robustezza al sistema.

Diversi recettori reclutano cellule diverse:

- CXCR1 e CXCR2 reclutano neutrofili

- CCR1, CCR2, CCR5 reclkutano i monocitomacrofagi

- CXCR3 recluta i T helper 1

- CCR3 e CCR4 reclutano i T helper 2

Questi recettori quindi non sono espressi in modo ubiquitario! Ma ciascuna cellula esprime i

recettori corrispondenti.

Tuttavia non solo i T-helper-1 esprimono CXCR3 ma anche le cellule NK lo esprimono; così come

anche i basofili e gli eosinofili esprimono CCR3 e CCR4.

Questo indica che da un punto di vista biologico, se induciamo una risposta immunitaria specifica di

tipo 1, la risposta è sostenuta da INF-gamma che usa queste chemochine per attirare cellule che

hanno in comunque il recettore per quelle chemochine, ovvero NK e T-helper-1; quindi cellule

biologicamente diverse ma che devono essere reclutate insieme durante la risposta presentano lo

stesso set di recettori per le chemochine. Quindi le chemochine coordinano la risposta facendo in

modo che durante la risposta immunitaria, la comunicazione tra i diversi tipi cellulari è possibile

solo grazie alla presenza degli stessi recettori che le portano quindi nello stesso sito.

Per questa ragione questi ligandi non arrivano dal patogeno, poiché presuppongono che l'ospite

abbia deciso di dare una risposta specificamente orientata da un mix cellulare. Nelle fasi acute

quello che accade è sempre uguale: arrivano i neutrofili che legano molecole affini a IL-8 mediante

i recettori CXCR1 e CXCR2; nella fase cronica arrivano i monociti grazie ad un secondo set di

chemochine che l'ospite ha prodotto. Quindi per bloccare la risposta in fase acuta/cronica bisogna

bloccare i recettori corrispondenti.

Regolazione del sistema delle chemochine

Ci sono quattro livelli di regolazione:

1. produzione

2. processazione

3. presentazione

4. distribuzione nei tessuti

Produzione

Le chemochine si dividono in due grandi categorie

inducibili → quelle che lavorano in una risposta infiammatoria fasica; rappresentano la

• maggior parte

costitutive → svolgono la stessa funzione di quelle inducibili, ovvero reclutano specifici

• 32

leucociti con la differenza che mentre nella risposta infiammatoria il reclutamento è indotto

da un'alterazione dell'omeostasi, nell'ambito della risposta immunitaria specifica tantissime

cellule circolano normalmente nei tessuti ed hanno quindi un traffico costitutivo tra sangue e

tessuti. Poiché non tutte le cellule devono giungere a tutti i tessuti ma vengono richiamati da

chemochine costitutive per ogni specifico organo.

Processamento

Tutte le chemochine sono processate ovvero vengono prodotte come molecole lunghe 60-70aa e poi

all'N-terminale (essendo libero strutturalmente) vengono tagliate da parte di diverse proteasi.

La probabilità che un sistema ELISA discrimini tra una proteina lunga 70aa ed una clivata e lunga

68aa è zero, quindi la misurazione della concentrazione delle chemochine non è in grado di dirci

quale siano già attive; tuttavia l'attività biologica in seguito al clivaggio cambia enormemente,

quindi le misurazioni ELISA misurano un'entità biologica ma non sono precise del misurare

l'attività biologica.

Il cambiamento di attività biologica può anche essere che la chemochina sia inattiva prima di essere

processata e si attivi in seguito nel tessuto solo quando viene processata. Quindi alcune pur essendo

prodotte in condizioni omeostatiche si attivano solo dopo processazione e attivano un processo

infiammatorio.

In altri casi la processazione genera un N-terminale diverso facendo sì che la chemochina diventi un

'agonista di un recettore diverso. Questo poiché il primo step di interazione è di carica quindi

l'affinità di ingaggio è un po' per tutti i recettori mentre l'affinità vera è data dall'N-terminale che

quindi varia in base alle diverse processazioni.

Presentazione

Le chemochine sono solubili ma vengono presentate alle cellule endoteliali interagendo con

strutture di GAG. Quindi le chemochine non hanno un solo ingaggio con l'N-terminale sul recettore

ma anche un altro dall'altro lato con i GAG; anche questo step è di regolazione poiché la

composizione dei GAG delle cellule endoteliali cambia in funzione dello stato di attivazione.

Questo ingaggio vale per tutte le chemochine ad eccezione di CX3CL1: questa chemochina presenta

una testa che interagisce con il recettore ed una coda che fa a meno dell'interazione con il GAG.

Distribuzione ai tessuti

Oltre ai recettori tipici che inducono chemiotassi e reclutano i leucociti, esistono anche 4 recettori

atipici (ACKR) poiché non fanno migrare le cellule poiché non sono in grado di attivare proteine G

(anche se sono a sette domini transmembrana).

Tuttavia mutanti difettivi per questi recettori hanno difetti di reclutamento di numerosi tipi di cellule

poiché soprattuto due dei quattro legano metà del sistema delle chemochine.

La funzione di questi recettori è quella di costruire i gradienti: diversamente dagli altri stimoli

chemotattici che sono prodotti dal patogeno, questi sono prodotti dall'ospite che si deve occupare

quindi della loro produzione e della loro degradazione; la degradazione è ad opera di questi recettori

che hanno quindi funzioni scavenger. In assenza di questi recettori il distretto anatomico raggiunge

una concentrazione saturante in tutto il distretto e quindi non si ha più gradiente.

Il recettore DARC invece non ha questa funzione scavenger bensì ha una funzione di trasporto;

questo recettore si trova sugli endoteli e la sua funzione è quella di trasportate la chemochina dal

polo basale a quello apicale dove poi il GAG la presenta al leucocita.

Poiché le chemochine sono citochine svolgono anche altre attività biologiche non chemiotattiche:

alcune controllano angiogenesi e fibrosi, alcune sono essenziali per lo sviluppo del SNC, inducono

sopravvivenza cellulare. 33

Il loro ruolo in patologia è a funzione positiva: conferiscono difesa, sviluppano angiogenesi.. altri

aspetti però si estrinsecano con un ruolo negativo: hanno un ruolo nei tumori, aterosclerosi e

patologie autoimmuni; tutte le patologie umane sono associate a set di chemochine specifiche.

Per comprendere quali chemochine sono coinvolte è possibile utilizzare sistemi knock-out.

Il knock-out di un qualsiasi recettore causa un fenotipo: questo è in disaccordo con la “robustness”

del sistema, con la sua ridondanza. Quindi qualsiasi recettore (o ligando) ha funzioni ridondanti in

alcune situazioni ma in altre acquisisce una valenza univoca e non ridondante e quindi la sua

eliminazione causa un fenotipo.

Rapporto tra recettori per le chemochine ed HIV

HIV è un virus dsRNA che ha affinità per alcune popolazioni leucocitarie grazie alla molecola

gp120 che gli permette di entrare nelle cellule stesse; il contro-recettore che riconosce gp120 è fatto

da due proteine: CD4 e un recettore per chemochine.

Il recettore per chemochine può essere CCR5 (associato al reclutamento dei monocitomacrofagi) o

CXCR4 (omeostatico).

Gp120 di HIV cambia con il tempo e l'infezione di un nuovo target da parte di HIV parte sempre da

ceppi virali che usano CCR5 e che quindi reclutano macrofagi e vengono detti M-tropici.

Con il tempo la malattie evolve e cambia la struttura del loop che porta all'ingaggio di CXCR4 che

recluta i T-helper, quindi i virus che reclutano CXCR4 vengono detti T-tropici.

Quindi HIV è prima M-tropico e poi T-tropico.

La suscettibilità degli individui all'infezione è regolata dal sistema CCR5 e CXCR4: un

polimorfismo nel gene di CCL5 (ligando di CCR5) produce più CCL5 e quindi è disponibile meno

CCR5 (poiché si lega al ligando), quindi questi soggetti hanno una progressione ad AIDS più lenta.

Un altro esempio è la variante allelica ∆32 nella sequenza codificante di CCR5 che porta ad un

frameshift che determina l'assenza di CCR5; soggetti omozigoti per questo allele è del 0,5-0,8% e

questi soggetti non possono essere infettati con HIV.

Probabilmente questa delezione si è sviluppata come protezione dal vaiolo che usa la stessa porta di

ingresso di HIV; soggetti mancanti di CCR5 si sono stabilizzati poiché proteggeva da vaiolo e oggi

torna come elemento di protezione da HIV.

Anche se comunque è presente di CXCR4, l'infezione parte sempre da CCR5.

I soggetti con ∆32 però un virus West-Nail possono essere infettati da questo virus che causa

encefalite e morte; questo poiché CCR5 è essenziale per il reclutamento dei linfociti che nel

cervello proteggono da quel virus.

Chemochine e tumori

Controllando il reclutamento leucocitario hanno una funzione di protezione dal tumore in alcune

fasi (ma di promozione in altre); allo stesso tempo controllano angiogenesi, un processo essenziale

per la crescita del tumore.

Le chemochine possono anche facilitare la metastatizzazione dei tumori a distanza e l'invasione da

parte di cellule tumorali.

Esistono anche farmaci in grado di bloccare le chemochine: uno blocca CXCR4 (sviluppato contro

HIV, ma tossico poiché il suo ligando lavora nel midollo osseo che in assenza di recettore si

“svuota” di cellule che finiscono tutte in circolo), oggi viene usato per mobilizzare cellule da

midollo osseo! Il secondo blocca CCR5 e viene utilizzato per bloccare HIV. 19 Marzo

Infiammazione sistemica 34

In condizioni di una risposta infiammatoria sufficientemente intensa o in caso di caratteristiche

individuali che impediscono all'individuo di combattere efficacemente l'infezione, si hanno risposte

infiammatorie sistemiche.

La prima componente della risposta di fase acuta è la modificazione dei livelli di leucociti

circolanti, nella maggioranza dei casi si esprime come leucocitosi ovvero al raddoppio dei leucociti

circolanti, in casi estremi anche 7-8volte i livelli basali!

Si parla di leucocitosi fino a 20000/microlitri, si parla di leuchemoide fino ai 40000/microlitri,

valori superiori a 40mila/microlitri si osservano in pazienti affetti da leucemia.

Nella maggioranza dei casi questo processo è positivo ed è determinato da:

- aumentato rilascio

- aumentata produzione

e ha come funzione l'aumento di precursori disponibili.

In alcuni casi si ha invece leucopenia, più rara come risposta al processo infiammatorio, ed il

meccanismo è opposto ovvero si ha una riduzione dei precursori ed è l'effetto dell'attivazione

dell'asse dei TNF che in risposta ad alcuni agenti infettivi raggiunge concentrazioni nel midollo

sufficienti a portare a deplezione dei leucociti.

In alcune forme ci sono leucopenie legate a forme di trapping di monociti (e non dei leucociti) in

determinati distretti.

Le leucocitosi possono riguardare tutte le forme di leucociti oppure pososno riguardare solo un

determinato lineage, ad esempio dei neutrofili. Ad esempio nel caso di PMN la leucocitosi è

l'effetto combinato di agenti che agiscono sul midollo e sostengono la mobilizzazione e la

produzione dei leucociti.

Nelle forme che rispondono ai virus la leucocitosi è sostenuta da una componente leucocitaria di

linfociti T, il mediatore è IL-7 che interviene in questo lineage ed è attiva nel midollo.

Se invece c'è un'espansione nella formula dei leucociti di tipo eosinofilo, la risposta è dovuta ad

un'infezione da protozoo o ad una reazione di tipo allergico.

Nella gran parte dei casi la leucocitosi è mista comunque, in alcuni casi c'è un aumento di

popolazioni di tipo monocitario dovuto ad un blocco del reclutamento in periferia ed è indicativa di

una forma cronica.

L'altro sintomo legato alla risposta di tipo sistemico è febbre. La febbre nasce in un contesto di

assenza di risposta immunitaria adattativa, ma noi percepiamo la febbre come un effetto negativo

poiché abbiamo una risposta immunitaria adattativa ed una protezione da agente infettivo ovvero

isolando la risposta immunitaria di tipo innato in vitro, in funzione della temperatura la capacità di

fagocitosi e di killing dei batteri sale linearmente con la temperatura dai 37° ai 42°.

Il meccanismo è legato alla produzione di heat-shock proteins che rispondono allo shock termico e

sono coinvolte nei meccanismi di sensing del patogeno; anche nell'uomo come nei vertebrati

primitivi che mancano della risposta adattativa, la risposta febbrile agisce potenziando la risposta

innata. Mimando in vitro una risposta adattativa, con l'aumento della T corporea questa perde

efficienza.

Per aumentare la T corporea abbiamo a disposizione due meccanismi:

1. produrre più calore → è un processo che avviene su base ormonale di tipo beta-adrenergico

e tiroideo ed è legata al disaccoppiamento nella fosforilazione ossidativa nei mitocondri

2. ridurre la dispersione di calore → il processo è neuro-mediato ed è legato al controllo del

calibro dei vasi ed alla distribuzione del flusso; in una prima fase si ha una chiara

ridistribuzione del flusso a prevalenza splancnica (organi profondi) escludendo cute e

muscoli. 35

Da dove arriva la risposta?

Si parte dalla risposta ad un agente infettivo basata sul riconoscimento a batteri G+ o G- che porta

alla produzione di citochine proinfiammatorie primarie che normalmente agiscono localmente; nel

caso di una risposta sistemica raggiungono concentrazioni sufficienti da agire a distanza in

particolare a livello dell'ipotalamo che ospita il centro termoregolatore.

A livello dell'ipotalamo le citochine proinfiammatorie primarie (pirogeni endogeni) o i prodotti

derivati dai patogeni (pirogeni esogeni) raggiungono le cellule endoteliali che stanno nel nucleo

sopraottico ventricolare; queste cellule presentano i recettori TLR per i pirogeni esogeni e i recettori

per le citochine proinfiammatorie primarie. Localmente la risposta porta ad una produzione locale

di IL-6 che determina una produzione di prostaglandina E2 dovuta alla produzione di COX2,

l'effetto è un aumento del cAMP che resetta il centro termoregolatore. Il centro ha un effetto

periferico che controlla distribizione del flusso ematico e di conseguenza aumento della T profonda

ed un effetto sulla corteccia (behavioral changes?).

Al centro di questa risposta il pirogeno endogeno più potente è IL-1 anche se l'effetto successivo è

IL-6 ed infine prostaglandina E2; per questo gli antiinfiammatori non steroidei sono ottimi per

inibire la risposta febbrile poiché inibiscono COX2.

Gli effetti di questa risposta sono:

1. effetto su cellule dell'immunità innata

2. effetti metabolici → aumento della glicogenolisi e quindi rilascio di zucchero ed aumento

della glicemia

3. metabolismo lipidico → aumento rilascio di acidi grassi e quindi presenza di chetoni

Questi effetti hanno lo scopo di rendere disponibili fonti energetiche per sostenere la risposta che

localmente deve agire nei confronti del patogeno.

Nella gran parte dei casi batterici, i batterici crescono meglio a temperature di pochi gradi sopra i

37°, nel caso dei virus invece essi non tollerano bene l'aumento di temperatura quindi dal punto di

vista della risposta antivirale la febbre è di per sé un modo per abbattere la replicazione virale.

Viene anche attivato l'inflammasoma ovvero un complesso che processa IL-1 (prodotta come

procitochina) nella citochina attiva, grazie all'attivazione di caspasi-1 che viene a sua volta attivata

grazie ad un clivaggio; il suo clivaggio è legato ad un complesso che appartiene alla famiglia delle

proteine NALP questo processo è controllato da proteine con funzione regolatoria negativa di tipo

inibitorio: pirina e cardinal.

Per i geni codificanti queste proteine esistono mutazioni puntiformi che attivano gli attivatoti

(NALP) o inibiscono gli inibitori (pirina o cardinal) che causano sintomi febbrili su base genetica

(es. febbre mediterranea familiare); questi pazienti sono in terapia con IL-1ra che è un inibitore di

IL-1.

La terza componente della manifestazione sistemica della risposta infiammatoria è la risposta di

fase acuta, quella porzione di manifestazione sistemica a carico del fegato: l'effettore principale di

questa risposta è IL-6 che attiva direttamente gli epatociti.

La risposta di fase acuta consiste in una riorganizzazione generale dell'attività trascrizionale

dell'epatocita; alcune proteine aumentano la loro concentrazione plasmatica di centinaia di volte ad

esempio siero amielina A e proteina C reattiva, molecole della superfamiglia della pentraxine che

hanno anche la funzione di agire come pattern recognition receptors (PRR); quindi il sistema

fornisce all'organismo un metodo per riconoscere il patogeno ed attivare per via alternativa la

cascata complementare. 36

Queste molecole suppliscono alla funzione dell'anticorpo nelle specie mancanti di risposta

adattativa per migliorare il riconoscimento e l'eliminazione del patogeno; per questo motivo questa

famiglia va sotto il nome di ante-antibody. Quindi il fegato sviluppa una risposta di tipo opsonico

perchè nelle specie primordiali la risposta è totalmente fagocita-dipendente.

Poiché queste proteine sono prodotte a livelli altissimi, vengono costantemente monitorate nei

pazienti per avere un'idea nell'andamento del processo di infiammazione.

Il fegato aumenta la produzione di anche altre proteine tra cui alcune che hanno a che fare con il

complemento (C1q, C3, C4) sempre per migliorare l'efficienza della risposta; in particolare aumenta

nel sangue la quota inattivata di C3 poiché essa viene consumata durante il processo.

Un'altra proteina che viene prodotta è aptoglobina in grado di legare eme: durante il danno

cellulare viene infatti rilasciato eme che oltre ad essere tossico è anche una fonte di ferro!

La risposta del fegato è una risposta alla produzione dei siderofori da parte dei batteri, poiché lo

scopo è evitare di mettere a disposizione ferro per i batteri, quindi il fegato ha un'azione

batteriostatica.

Lo stesso meccanismo avviene nei confronti di rame mediante la produzione di ceruloplasmina.

Vengono anche massicciamente prodotti fibronectina, fibrinogeno ed altre proteine coinvolte nella

cascata della coagulazione; la risposta pro-coagulante ed infiammatoria sono legate tra di loro

poiché la produzione di fibrina nella sede di infiammazione isola il patogeno impedendogli di

utilizzare i vasi circostanti e diffondere.

Per alcune proteine la produzione diminuisce: una in particolare è albumina, la cui sintesi in realtà

diminuisce solo perché aumenta quella delle altre.

Soggetti con funzione epatica compromessa hanno una significativa incidenza di infezione a carico

di batteri.

La risposta vascolare consiste in un'aumentata capacità di indurre coagulazione da parte delle

cellule che aumentano la vasodilatazione locale e l'adesione.

Vi è anche un'effetto di inibizione della contrattilità cardiaca mediato da TNF.

Quindi.. a dosi basse le citochine agiscono localmente, a dosi intermedie agiscono a livello

sistemico ma sempre in ambito fisio-patologico. -7

Se le concentrazioni salgono ulteriormente (>10 M) le citochine agiscono con un meccanismo

patogenetico stretto e causano uno shock settico ovvero uno shock dovuto ad un agente infettivo.

Con il termine shock si intende una situazione definita come una condizione di sbilanciamento tra

il volume ematico circolante e l'albero vascolare: in condizioni fisiologiche il volume ematico e la

capacità dell'albero vascolare determinano una certa pressione fisiologica, in condizioni di shock

invece la riduzione del volume ematico o l'aumento della capienza determinano una caduta di

pressione.

Le cause di shock possono essere varie: emorragia acuta, reazioni diarroiche, reazioni allergiche..

Lo shock settico è l'effetto della presenza in circolo di massicce concentrazioni di citochine;

esistono infatti due condizioni che portano al manifestarsi di una forma di shock settico:

1. sepsi → è presente in circolo agente infettivo; in condizioni normali l'ospite isola la risposta

infiammatoria ma se questo fallisce o se il patogeno ha direttamente accesso alla

circolazione sistemica, cariche molto alte di patogeno circolante provocano una infezione

37

sistemica che causa febbre, aumento della frequenza cardiaca e respiratoria ed alterazione

degli organi periferici

2. SIRS (Risposta Infiammatoria di tipo Sistemico) → è una risposta sterile, non è presente un

agente infettivo e si manifesta in soggetti politraumatizzati ovvero sottoposti a traumi

meccanici rilevanti con necrosi tissutale importante. Si manifesta con una T corporea alta e

poi bassa, un aumento delle frequenze cardiaca e respiratoria ed una concentrazione dei

neutrofili alta o bassa.

Quindi la sepsi è causata da PAMPs e la SIRS da DAMPs.

L'effetto è che qualunque sia lo stimolo che ha attivato il sistema, la produzione di citochine pro-

infiammatorie non è locale e legata alla quota di cellule reclutata nella sede della lesione, ma

avviene in tutte le cellule dell'organismo poiché l'agente patogeno è in circolo quindi si ha la

trasformazione di un effetto sistemico di un effetto locale.

Questa condizione esaspera la risposta locale dal punto di vista patogenetico: ad elevate

concentrazioni il sistema agisce su scala sistemica invece che su scala locale, ovvero se TNF, IL-1

ed IL-6 normalmente agiscono sull'endotelio, in scala sistemica l'aumento dell'albero vascolare

porta a shock, inoltre l'effetto di TNF sul cuore determina una ridotta forza di contrazione che

compromette ulteriormente la pressione; IL-1 invece ha un effetto cronotropo positivo e quindi

aumenta la frequenza di contrazione: questo effetto è nella prima fase positivo (fino a 120 battiti al

minuto) poiché contribuisce a mantenere la pressione normale, sopra i 120battiti/min però la

frequenza di contrazione non correla più con l'aumento di volume eiettato dal cuore poiché al di

sopra di questa velocità il tempo di diastole non è sufficiente ad avere un riempimento ottimale del

cuore.

Inoltre in questi soggetti oltre alla risposta del fegato si ha anche un aumento della coagulabilità a

livello dell'endotelio che porta alla formazione di trombi in tutto l'organismo con compromissione

della perfusione di organi che aggrava la già ridotta perfusione su base pressoria.

Tra gli organi più suscettibili c'è il cuore: se il cuore ha problemi di funzionamento lo shock

peggiora perché non viene compensata la riduzione di pressione.

Durante questo processo si ha inoltre una massiccia attivazione della risposta immunitaria che

determina la sepsi stessa; i meccanismi sono tutti attivati a livello massimale e l'effetto successivo

nel tempo è che la maggior parte dei sistemi vanno incontro ad esaurimento.

Questi soggetti paradossalmente vanno incontro ad emorragie perchè trombizzano consumando

fibrinogeno che quindi viene meno in altri distretti corporei e causa propensione alle emorragie.

Quindi se nella prima fase dello shock si ha un'abbondante risposta immunitaria, segue poi una sua

compromissione dovuta al consumo dei fattori adeguati per lo sviluppo di una risposta: ad esempio

il sistema del complemento è annullato.

La situazione clinica dei pazienti che vanno in sepsi ha una fase reversibile ed una fase di

disfunzione multiorgano.

All'inizio si ha una fase compensatoria in cui viene fornito tempo al sistema per eliminare il

patogeno, se questi processi non riescono a dare tempo sufficiente il quadro va fuori controllo ed i

meccanismi di compenso sono esauriti e diventano a loro volta parte della patogenesi. 23 Marzo

Risoluzione della risposta infiammatoria

Il passaggio da uno stato infiammatorio acuto ad uno spegnimento non è un evento passivo bensì è

un fenomeno attivo che richiede mediatori cellulari e molecolari; l'altra evoluzione possibile è verso

una cronicizzazione della risposta con formazione di tessuto fibroso.

38

Se in un tessuto infiammato i granulociti neutrofili non vengono rimossi la risposta infiammatoria

acuta non si spegne e questo avviene anche se la noxa è già stata eliminata, questo indicata che non

è sufficiente la rimozione dell'agente infettivo per spegnere il processo.

Inoltre per rimuovere i neutrofili morti nel sito di infiammazione sono necessari i macrofagi il cui

funzionamento è necessario per lo spegnimento.

Due categorie di mediatori sono importanti per questo processo:

- glucocorticoidi → azione pro-risoluzione

- resolvine, protectine, maresine → derivano dal pathway di COX-2 ed hanno funzione pro-

risoluzione a differenza degi altri mediatori che derivano dall'acido arachidonico

(prostaglandine e leucotrieni) che sono mediatori pro-infiammatori

Il processo di risoluzione va interpretato sulla base di due parametri:

1. spazio → i mediatori possono agire localmente o avere azioni di carattere sistemico

2. tempo → i mediatori pro-risoluzione (come quelli pro-infiammatori) hanno cinetiche

differenti; in realtà per i mediatori tardivi l'induzione della loro sintesi è avviata in epoca

precoce: le citochine pro-infiammatorie primarie sono prodotte tra 8-24ore, IL-10 è invece

detectabile dopo 24h ma gli mRNA di queste compaiono dopo 6h: quando si accende la

risposta quindi si avvia anche il meccanismo che la porterà a spegnersi. Nelle risposte

croniche dove la noxa non può essere eliminato, mentre alcune cellule risolvono altre cellule

continuano il processo di infiammazione.

Mediatori locali

Mediatori di tipo lipidico: a partire dall'acido arachidonico parte un terzo pathway biochimico (oltre

prostaglandine e leucotrieni) da una 15-lipossigenasi che media la produzione di lipoxine di cui

esistono due varianti. La 15-LO media un primo step a produrre un precursore che poi porta alla

produzione delle due diverse lipoxine.

La 15-LO è indotta nelle stesse cellule che mediano la produzione di prostaglandine e leucotrieni

quindi macrofagi, cellule dendritiche, neutrofili.. questo diverso pathway biochimico è detto lipid

class-switch.

Una seconda via biochimica mediante cui si ottengono molecole pro-risoluzione: una via mediata

dalla COX2 quando è acetilata e porta alla produzione di epi-lipoxine; la loro produzione è molto

abbondante quando l'acetilazione di COX2 è determinata da acido-acetil-salicilico (aspirina) la

quale quindi non solo spegne la produzione di prostaglandine ma sposta il pathway verso la

produzione di epi-lipossine ovvero mediatori con attività biologica opposta!

Oltre ai mediatori che derivano da acido arachidonico il sistema usa altri due substrati:

- acido eicosapentenoico → porta alla produzione di resolvine della serie E

- acido docosaeinoico → porta alla produzione di resolvine della serie D e di protectine

(per azione di 5 LO e epossigenasi)

Queste molecole hanno delle attività biologiche: inibire la migrazione delle cellule dendritiche,

sullo stroma inibiscono la produzione di enzimi che rimodellano la matrice (es. metallo proteasi) e

sulle cellule della risposta infiammatoria (neutrofili, macrofagi) inibiscono la sintesi di citochine

pro-infiammatorie primarie.

Queste cellule hanno dei recettori a sette domini transmembrana FPRL1/FPRL2 che sono

strutturalmente analoghi a FPR (il recettore che riconosce i peptidi formilati) e sono accoppiati a

una via di segnalazione G (mentre l'altro G ).

q alfai

Citochine

Due citochine in particolare agiscono localmente pro-risoluzione:

IL-10 → ha solo questa funzione, agisce ingaggiando un recettore a due catene che si trova

• 39

sulle stesse cellule che producono i mediatori infiammatori e lo attiva in modo da attivare

una via di segnalazione STAT3-dipendente che usa poi come mediatori intracellulari le

proteine Socs (Suppressor of Citokyne Signaling) e che funzionano come soppressori del

segnale delle citochine pro-infiammatorie.

Esiste anche una via di inibizione Socs-indipendente associata agli AIR gene che non

spengono la segnalazione della citochina bensì direttamente la trascrizione di molecole che

fanno parte della risposta pro-infiammatoria

TGFβ → è una citochina anti-infiammatoria ibrida: da un lato ha attività anti-infiammatoria

• (riduce l'espressione delle molecole di adesione, reprime citochine e chemochine, spegne i

macrofagi), dall'altro lato ha una funzione pro-fibrosante ovvero agisce sui fibroblasti nei

quali induce una risposta attivatori aumentando la sintesi delle proteine della matrice

extracellulare ed induce il differenziamento del fibroblasto. Il risultato è che nel distretto

locale l'infiammazione si spegne ma invece di andare verso risoluzione va verso riparo

ovvero fibrosi (insieme a IL-13).

Quindi se a dominare è IL-10 si ha una risoluzione che porta alla rigenerazione del tessuto, se

domina TNFβ si ha una risoluzione verso riparo e non verso rigenerazione. A determinare

l'equilibrio tra queste risposte sono i livelli tra le due citochine: queste provengono dai macrofagi

che intervengono dopo la risposta acuta.

I macrofagi presentano un'attivazione classica da parte di IFN-γ e LPS che rappresenta un rinforzo

dell'attivazione innata (quindi pro-infiammatoria), ma possiedono anche un'attivazione alternativa

da parte di IL-4 o IL-13 e quindi porta a fibrosi. I macrofagi possiedono poi i sensori per IL-10 e

TGF-β e quando vengono attivati da queste molecole reagiscono producendo a loro volta queste

molecole.

Tra gli stimoli che rappresentano un messaggio di risoluzione per i macrofagi c'è l'ingaggio di corpi

apoptotici: i macrofagi presentano un intero pannello di recettori che riconoscono corpi apoptotici

in quanto essi costituiscono un segnale (diverso rispetto alla morte per necrosi di una cellula che

porta all'infiammazione) che viene letto dai macrofagi attraverso i loro recettori a funzione

scavenger. Questi recettori hanno una via di segnalazione opposta ai TLR che parte da SIC (una

chinasi) e arriva a IL-10.

Quando un macrofago ingaggia una cellula in apoptosi, favorisce la risoluzione del processo

mediante produzione di IL-10; la cellula apoptotica può essere una cellula che ha subito un danno

ma soprattutto sono i neutrofili che devono essere eliminati dal tessuto infiammato e che vengono

interpretati come un processo di risoluzione del tessuto. Dopo aver ingaggiato il neutrofilo, il

macrofago produce localmente IL-10 e TGFβ e poi se ne va.

Se il patogeno è ancora presente mentre un macrofago ingaggia un neutrofilo morto, un altro

macrofago rileva il patogeno e si ha l'instaurarsi di un quadro misto che determina la risposta

cronica.

L'equilibrio tra IL-10 e TGF-β dipende dalla presenza o meno di segnali di pericolo: se la cellula

riceve segnali solo da recettori scavenger produce IL-10, se riceve segnali anche da PRR produce

anche TGFβ.

Sia i macrofagi che inducono l'infiammazione sia quelli pro-risoluzione svolgono una funzione

comune: aumentano la produzione di MHC di classe 2 localmente e lasciano il distretto anatomico

mediante i vasi linfatici.

Mediatori di carattere sistemico

- glucocorticoidi → bloccano tutte le risposte pro-infiammatorie (COX, citochine pro-

40

infiammatorie, NFKB..)

- asse neuro-mediato → pathway anti-infiammatorio colinergico mediato dal nervo vago che

innerva i distretti e presenta un arco afferente ed un efferente: la porzione afferente possiede

dei sensori che percepiscono danno; quindi la percezione neuro-mediata del danno viaggia

insieme alla percezione nocicettiva. A questo segnale il sistema del vago risponde con un

ramo efferente che innerva in particolare i macrofagi e stimola attraverso acetilcolina un

recettore che presenta una subunità alfa7: il recettore di Ach spegne le vie si segnalazione

che portano alla produzione di citochine pro-infiammatorie, in particolare TNF.

Esiste anche un pathway mediato da catecolammine che ha invece un'attività pro-

infiammatoria che sostiene la produzione di mediatori pro-infiammatori non in modo neuro-

mediato ma ormonale (risposte da stress).

Sistema immunitario adattativo

La risposta di tipo adattativo si organizza volta per volta in maniera differente e permette una

risposta ottimale a seguito dell'esposizione al patogeno.

Differisce dall'immunità innata in diversi aspetti: i recettori sono specifici per ogni cellula che lo

9 2

esprime, quindi il numero di determinanti (antigeni) riconosciuti è di circa 10 (contro i 10

dell'immunità innata); il set di in grado di discriminare i determinanti è detto repertorio. La specie

11

possiede circa 10 determinanti molecolari: significa che l'individuo esprime 1/100 dei determinanti

presenti nella specie, quindi la risposta adattativa è in realtà individuale (80') e la risposta è quindi

diversa.

Questo sistema è il modo migliore per garantire sopravvivenza alla specie.

Il sistema adattativo prima costituisce i recettori e poi valuta se sono conformi al determinante

molecolare, quindi quando vengono costruiti il determinante molecolare non è presente al momento.

Quei recettori costruiti per un determinante molecolare che esiste sono potenzialmente in grado di

riconoscere un determinante sia endogeno (self) che esogeno (non-self), quindi talvolta possono

scatenarsi patologie autoimmuni.

La possibilità di costruire recettori alla cieca è l'unico processo che garantisce il fatto di non essere

vincolati da recettori pre-esistenti e questo permette la sopravvivenza di qualche individuo nella

specie in seguito all'esposizione di patogeni poiché presenta il recettore specifico per quell'antigene

nel suo repertorio.

La stessa risposta avviene quando coinvolge recettori per antigeni self.

Poiché il sistema si attiva al decimo giorno di infiammazione quando la carica batterica è altissima,

la prima cosa che avviene non appena viene individuato il linfocita giusto è di espanderlo

clonalmente (cosa che non avviene nell'immunità innata poiché le cellule sono tutte uguali); se la

risposta è self invece il linfocita viene spento (diventa anergico, inattivabile): la maggior parte dei

linfociti T sono anergici.

Per espandere il clone agisce una citochina (corrispondente dei CSF) detta IL-2; per disattivare i

leucociti invece intervengono dei meccanismi checkpoint: l'ingaggio su checkpoint è un sistema di

escape dei tumori che si spacciano per self, bloccando i checkpoint viene bloccato il meccanismo

che rende anergici quei linfociti T in grado di riconoscere le cellule tumorali.

Nella definizione del repertorio è fondamentale la capacità del sistema di costruire cellule e poi

educarle (cosa che non avviene nel sistema immunitario innato): i linfociti vengono valutate per la

loro capacità di riconoscere l'antigene e di non riconoscere un antigene self; la selezione

positiva/negativa avviene nel timo e deve avvenire prima che le cellule escano dal timo stesso per

evitare che aggrediscano strutture self. 41 24 Marzo

Risposta specifica

L'avvio della risposta specifica prevede la rilevazione dell'antigene.

Un antigene è definito funzionalmente come un determinante molecolare che il SI specifico è in

grado di riconoscere; è un peptide di lunghezza limitata (10-12aa) con sequenza random e tende ad

avere preferenzialmente alcune posizioni nella sequenza in cui sono per lo più presenti aa che

funzionano come presidi ancora e consentono al peptide di agganciarsi e di interagire con la

struttura di presentazione dell'antigene; in realtà qualsiasi peptide ha valenza antigenica: nella

maggior parte dei casi i peptidi che il SI riconosce sono peptidi self, quindi la gran parte dei linfociti

è impegnata a tollerale peptidi self. Uno dei problemi del sistema adattativo è prevenire

l'autoimmunità.

Complesso maggiore di istocompatibilità

MHC (Major Histocompatibiity Complex) viene così chiamato poiché è stato scoperto come il

principale complesso che definisce istocompatibilità ovvero il rigetto o il mancato rigetto in seguito

ad un trapianto di cute; la ragione della tolleranza o meno tra un donatore e ricevente è strettamente

determinata su base genetica: se i due sono geneticamente identici il trapianto di cute non dà

problemi, se invece gli animali sono geneticamente differenti si ha un rigetto d'organo in due

settimane.

Se il frammento di cute rigettato viene espiantato e si ritrapianta cute proveniente dallo stesso

donatore di prima, l'animale che ha rigettato rigetta molto più velocemente; se si ritrapianta cute

proveniente da un terzo ceppo l'animale rigetta ancora in due settimane; questo significa che il

meccanismo ha memoria e discrimina il donatore su base genetica.

Se prendo un animale che è stato trapiantato con cute di un donatore e l'ha rigettata e trasferisco i

linfociti T dell'animale che ha già rigettato, in un animale ricevente del suo stesso ceppo genetico e

poi trapianto il secondo animale con la cute che il primo animale aveva rigettato, ottengo un rigetto

in tre giorni. Quindi la memoria che si esprime con un'aumentata velocità nel rigetto si trasmette

con i linfociti T, il cui trasferimento permette il trasferimento di memoria.

Il rigetto di trapianti è quindi un fenomeno immuno-mediato, specifico, ha memoria ed è trasferito

con i linfociti T.

Perché c'è rigetto? L'incrocio di donatori e riceventi progressivamente simili geneticamente e il

mappaggio di loci che definiscono incompatibilità ha permesso di capire dove gli animali devono

essere geneticamente differenti perchè la risposta di rigetto si sviluppi.

Sono stati messi a fuoco loci di istocompatibilità minori, ovvero che mediano rigetto ma non sono

particolarmente aggressivi, distribuiti un po' ovunque nel genoma.

Esiste però un locus che da solo è il determinante della maggior parte della istocompatibilità ed è il

MHC!

MHC nell'uomo è un complesso grosso e ospita tre famiglie di geni che codificano per tre gruppi di

proteine dette classi (1, 2 e 3).

Il locus di classe 1 ospita tre regioni dette HLA (Human Leucocite Antigene) che esistono nelle

forme A, B e C: sono presenti sul locus dell'allele in singola copia (un HLA-A, un HLA-B e un

HLA-C) per ogni allele. La maggior parte degli individui della specie ospita un HLA-A diverso

dagli altri individui, quindi esiste una spiccata eterogeneità del locus HLA-A, così come per HLA-B

42

e HLA-C; poiché vengono acquisiti su base ereditaria gli individui sono in genere eterozigoti per i

due HLA sui due alleli.

Tutti gli HLA sono codominanti quindi in generale ogni individuo ha 6 tipi di HLA diversi di classe

I, le cui funzioni sono identiche.

Lo stesso discorso vale per le molecole che si trovano nel locus di classe II dove le molecole si

chiamano DP, DQ e DR e sono composti però da due catene ciascuno; anche tutte le molecole di

MHC di classe II sono codominanti.

Questo sistema determina la istocompatibilità: se due individui hanno lo stesso MHC di classe I ed

MHC di classe II possono scambiarsi organi; la funzione del SI del ricevente è legata alla omologia

tra donatore e ricevente delle molecole di MHC di classe I e II.

Queste molecole costituiscono un sistema di restrizione, un antigene MHC-ristretto è un antigene

che viene percepito solo attraverso quel particolare MHC.

MHC di classe I

È costituito da un'unica catena in cui la porzione intracellulare C-terminale non ha attività di

segnalazione diretta, mentre la porzione N-terminale è costituita da due domini (α1 ed α2) che

rappresentano le zone in cui i diversi MHC di classe I differiscono; la porzione N-terminale si

organizza secondo una struttura a forma di tasca formata da un pavimento di foglietti β e due pareti

laterali di α-eliche che chiudono la tasca.

MHC presenta poi un dominio α3 uguale per tutti; per tenere insieme l'intera proteina il dominio

immunoglobulinico α3 viene accoppiato con una proteina β2 invariante per tutti gli MHC di classe

I.

Tutte le cellule di un individuo sono MHC di classe I positive ad eccezione degli eritrociti.

Gli MHC di classe I hanno la funzione di ospitare nella tasca peptidi, sono molecole di

presentazione di peptidi con potenziale valenza antigenica, così come MHC di classe II.

Tra i due peptidi presentati dai due MHC non vi è una differenza nella sequenza bensì nella

sorgente da cui essi derivano: la presentazione per gli MHC di classe I si ottiene solo per peptidi che

hanno subito una via di processazione endogena ovvero per quei peptidi che derivano da una

proteina prodotta da una cellula dell'individuo, dalla cellula stessa che li sta presentando.

In questi casi il peptide è il prodotto di degradazione da parte di un proteasoma di una proteina

citosolica, viene trasportato dalle proteine TAP nel reticolo endoplasmico (TAP1 e TAP2 si trovano

nel locus del complesso MHC di classe II) dove viene sintetizzato MHC di classe I e l'insieme

caricato viaggia per esocitosi e finisce sulla membrana plasmatica della cellula.

I peptidi presentati sulle cellule da MHC di classe I vengono riconosciuti dai linfociti T CD8+ a

funzione citotossica.

I linfociti T si dividono in due grandi categorie: CD4+ e CD8+; ad eccezione di quelli che si

trovano nel timo, un linfocita T presenta o CD4 o CD8.

I linfociti T CD8+ sono cellule killer: l'ingaggio da parte del linfocita T CD8+ sulla cellula che sta

esprimendo il peptide è legato ad una doppia interazione:

1. tra il complesso MHC-peptide presentato ed il T cell receptor del linfocita (segnale 1)

2. il recettore CD8 riconosce MHC sul dominio α3 (uguale per tutti gli MHC-I) → tutti i

linfociti T CD8+ possono ingaggiare MHC-I ma solo uno specifico linfocita T che possiede

il T cell receptor giusto ingaggia quello specifico peptide.

Se l'interazione tra il linfocita T e la cellula che presenta il peptide si limita a questi due ingaggi, ed

è quello che avviene nel 99,99% dei casi, si ha uno spegnimento del linfocita T.

L'anergia a cui vengono portati i linfociti è alla base del meccanismo di tolleranza periferica; il SI

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però svolge tutti questi processi per identificare proteine sintetizzate nella cellula che non sono

proteine self, il che avviene in due casi: infezione da virus o fagocitosi di una cellula infettata.

Il risultato è l'uccisione della cellula che ha presentato il peptide: ad informare il linfocita che il

peptide presentato deriva da una proteina non self è il segnale 2 che porta il linfocita ad uccidere.

Questo meccanismo è attivo su tutte le cellule poiché sono tutte potenzialmente infettabili da virus.

Gli interferoni aumentano l'espressione di MHC-I ed in questo modo interferiscono con l'infezione

virale.

Per bloccare il SI il virus possono mettere in atto diversi fenomeni di escape: bloccare TAP in modo

che le proteine non self vengano prodotte ma non presentate sulla membrana, bloccare la sintesi di

microglobulina β2 o bloccare il trasporto sulla membrana.

MHC di classe II

MHC-II è composto da una catena α ed una catena β: i due domini N-terminali α1 e β1 si affacciano

e compongono strutturalmente la tasca in cui alloggiare l'antigene, così come fanno α1 e α2 in

MHC-I; la struttura prosegue poi con due domini α2 e β2 identici per tutti gli MHC-II ripiegati in

domini Ig-like.

La differenza rispetto ad MHC-I è la sorgente del peptide che esso presenta: in MHC-II infatti il

peptide segue la via esogena, quindi è un sistema di presentazione ristretto a peptidi che non sono

stati sintetizzati dalla cellula ma sono entrati nella cellula per fagocitosi.

Gli MHC-II si trovano infatti solo sulle cellule APC (Antigene Presenting Cells) che comprendono

i fagociti (macrofagi, monociti, cellule dendritiche).

Le strutture esogene che vengono internalizzate e degradate portano alla conversione del patogeno

in una collezione di peptidi, ovvero in un codice immunologico, che possono essere presentati

dall'MHC-II.

Anche per questi peptidi però se la presentazione avviene in assenza di una risposta infiammatoria,

ovvero se si ha solo un segnale 1, il linfocita viene indotto ad anergia; se invece il fagocita ingloba

una struttura in presenza di una risposta infiammatoria si innesca il segnale 2: il linfocita T viene

ingaggiato ed ingaggia il co-stimolo che lo attiva.

Quindi per interrompere la tolleranza è necessario un segnale di tipo 2 indotto dal sistema innato.

Ad ingaggiare MHC-II sono i linfociti T CD4+ poiché CD4 ingaggia MHC-II sui due domini

costanti (α2 e β2); i linfociti CD4+ sono detti helper (e non citotossici come i CD8+ che se attivati

rispondono uccidendo la cellula): la presentazione dei peptidi al linfocita T CD4+ serve a restituire

alla cellula che ha presentato il peptide un help sotto forma di citochine.

Non avrebbe infatti senso uccidere la cellula poiché l'agente patogeno si trova nell'ambiente esterno

quindi la funzione del linfocita T CD4+ è di migliorare la capacità del macrofago di killing: fornisce

al macrofago segnali di aumento della sua attività citotossica mediante un interferone di classe I (in

genere IFNγ).

Il pathway di presentazione del peptide sulla membrana è diverso rispetto ad MHC-I e presenta un

problema: poiché MHC-II è sintetizzato nel RE ed ha una tasca ampia, se tale tasca non viene

bloccata potrebbe catturare proteine che vengono prodotte nel RE contestualmente all'MHC-II; se

ciò avvenisse verrebbero presentati peptidi self anziché peptidi non self.

Per bloccare la tasca di MHC-II il sistema utilizza una catena invariante che possiede una porzione

N-terminale che si accomoda in tutte le tasche degli MHC-II ed inoltre funziona da trasportatore e

veicola MHC-II alla vescicola MIIC. Tale vescicola contiene tutti gli elementi necessari per

l'associazione peptide-MHC-II.

Una volta che MHC-II si trova nella vescicola la catena invariante viene clivata, lasciando un corto

frammento (CLIP) nella tasca dell'MHC; a questo punto qualsiasi peptide derivante da proteine non

self compete con CLIP per l'accesso alla tasca: se è presente un peptide con affinità maggiore per la

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tasca, la proteina HLA-DM sgancia CLIP ed inserisce il peptide derivante dal fagolisosoma.

Esistono patologie umane in cui tale meccanismo edi carica peptidi self su MCH-II è difettivo e

causa patologie autoimmuni.

Le molecole MHC-I (HLA-A, HLA-B e HLA-C) esistono in circa 700 varianti, per MHC-II sono

meno: questo significa che ogni individuo può presentare ottimamente alcuni peptidi ma ha

difficoltà a presentarne altri poiché a variare è la tasca, quindi ogni individuo è immuno-ristretto per

certi peptidi.

Per ad esempio un peptide derivante da un virus la presentazione avverrà in maniera diversa per

ciascun individuo, quindi se quel peptide è l'unico determinante molecolare per vedere quel virus, i

soggetti che non possiedono la tasca adatta sono svantaggiati!

Questo avviene poiché non tutti i peptidi sono in grado di entrare nelle tasche di MHC ma è

necessario che abbiano dei residui obbligatori, detti residui àncora, nei punti in cui il peptide si

ancora sul fondo della tasca che li dovrà presentare. I residui àncora sono differenti per i diversi

HLA: a seconda della combinazione ogni particolare peptide finisce in un HLA diverso; e a seconda

delle posizioni àncora gli MHC tollerano alcuni amminoacidi e non altri.

Quindi da ogni singola proteina del patogeno ognuno di noi genera numerosi peptidi di cui solo

alcuni possono essere presentati e vengono detti determinanti antigenici maggiori; tali determinanti

sono il target, ovvero gli effettivi peptidi che il sistema immunitario può targettare, ma per poterlo

fare deve poterli presentare.

A causa dei diversi HLA presenti nelle varie popolazioni, è possibile che un vaccino per l'epatite B

sviluppato per la popolazione europea non funzioni in Africa e viceversa, in quanto i diversi HLA

presentano determinanti antigenici diversi! 26 Marzo

Cellule che presentano l'antigene

Perché la risposta adattativa si avvii il processo di processazione e presentazione dell'antigene è

essenziale, infatti in assenza di una struttura che presenta l'antigene di per sé non induce alcuna

risposta immunitaria.

La funzione della cellula che presenta l'antigene non è limitata alla processazione, ovvero il fatto

che l'antigene debba essere presentato per essere efficace non è limitato al suo inserimento

nell'MHC, ma la cellula svolge anche altre funzioni importanti che rappresentano il punto di avvio

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del processo, ad esempio dove e come attivare la risposta immunitaria.

Le cellule che presentano l'antigene sono le cellule dendritiche che derivano da precursori

ematopoietici CD34+ che danno precursori circolanti che vanno a popolare tessuti periferici, dove

si trovano con una densità significativa e prendono nomi differenti da tessuto a tessuto.

La loro funzione è quella di catturare gli stimoli infiammatori derivanti da patogeni o da danni

tissutali (PAMP/DAMP).

Nella fase di omeostasi, in assenza di patogeno, la cellule risiede nel tessuto periferico, ha un

fenotipo immaturo e svolge una funzione di sentinella: la principale caratteristica funzionale delle

cellule dendritiche immature è la fagocitosi, o più in generale l'uptake di materiale che deriva

dall'ambiente esterno, funzione che svolgono con un 'elevata efficienza anche grazie alla morfologia

(superficie di membrana elevata).

Quando la cellula cattura, qualsiasi cosa abbia catturato, migra attraverso la circolazione linfatica

verso i linfonodi e durante la migrazione matura; questo processo è la controparte anatomica della

presentazione: una cellula dendritica immatura in periferia presenta male, una cellula dendritica

matura nei linfonodi presenta molto bene l'antigene e cattura invece male.

La biologia di queste cellule prevede quindi 3 fasi:

1. periferia → immature

2. transito nella circolazione linfatica → in fase di maturazione

3. linfonodo → mature

Durante queste tre fasi svolgono funzioni diverse.

Il processo di maturazione e migrazione anatomica è essenziale per la risposta: se per qualche

ragione il processo di maturazione e migrazione viene bloccato, la risposta si blocca o ha comunque

un'efficienza 100/1000 volte inferiore.

Meccanismi di cattura dell'antigene

Le cellule dendritiche catturano l'antigene mediante due meccanismi:

recettore-mediato → entrano in gioco i recettori che riconoscono i PAMP, ovvero i recettori

• PRR. Di questi, sia i recettori che riconoscono direttamente il patogeno (es. recettori per il

mannosio), sia quelli che lo riconoscono indirettamente (es. recettori per Fc dell'anticorpo,

riconoscimento anticorpo-mediato) vengono definiti recettori opsonici in quanto

migliorano la capacità di fagocitosi; gli altri recettori PRR, come i TLR, riconoscono il

patogeno ma non hanno effetto sulla fagocitosi e vengono quindi definiti recettori non

opsonici. La cattura dell'antigene recettore-mediata è un fenomeno ristretto ai recettori di

tipo opsonico.

non recettore-mediato → dipende dalla capacità della cellula di catturare elementi

• dall'ambiente esterno mediante più processi molecolarmente differenti tra loro che catturano

strutture corpuscolate di dimensioni variabili: la fagocitosi cattura particelle di grosse

dimensioni ed è un processo ristretto alle cellule dendritiche, mentre la pinocitosi è un

processo in grado di catturare particelle di dimensioni variabili e che possiedono anche altre

cellule.

Questi processi comunque prevedono il coinvolgimento di un macchinario molecolare e

sono quindi modulabili ed inibibili: molti patogeni infatti sono in grado di bloccarli (es.

meccanismi di escape dei batteri).

Questi meccanismi si trovano nella cellula a riposo, quando si trova nei tessuti periferici.

Gli altri recettori PRR non opsonici (TLR, Fas, IL-1R..) hanno la funzione di attivare la cellula

dendritica e di indurne la maturazione: finchè la cellula cattura in assenza di un ingaggio da parte

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di un ligando su un recettore di tipo attivatorio, cattura ma rimane immatura, quando invece viene

ingaggiata da un ligando su un recettore attivatorio la cellula matura.

Il ligando di questi recettori rappresenta uno stimolo che segnala la presenza di un patogeno, di un

danno o di un contesto infiammatorio che esprime l'effetto di un danno al tessuto.

La capacità della cellula di processare e inserire in membrana è legato alla cattura di ciò che sta

nell'ambiente esterno ed è innato, ovvero tutto ciò che viene catturato dall'esterno entra in MHC e

rappresenta il segnale 1 per il linfocita T; il linfocita necessita però di un secondo segnale per

attivarsi: il secondo segnale è in funzione dei recettori non opsonici che rappresentano una risposta

al contesto infiammatorio/infettivo nella sede in cui l'antigene è stato catturato.

Dal punto di vista molecolare, il secondo segnale dal lato della cellula che presenta l'antigene si

esprime con i corecettori, molecole che la cellula esprime solo dopo che è stato attivato il recettore

a funzione attivatoria (non opsonica).

La cellula dendritica può quindi ritrovarsi con l'MHC caricato con il peptide in due contesti:

- assenza di danno/infiammazione → la cellula presenta solo con l'MHC I o II

- presenza di danno/infiammazione → la cellula upregola i corecettori.

I corecettori si possono funzionalmente distinguere in due grosse categorie:

a funzione adesiva → hanno la funzione di mediare l'adesione tra la cellula dendritica

• attivata e qualsiasi altra cellula che esprime i controrecettori (linfocita T). Comprendono

ICAM-1 o LFA-3, le stesse molecole coinvolte nell'adesione all'endotelio del leucocita

durante il processo di extravasazione

a funzione di segnalazione → riconoscono il controrecettore sul linfocita; comprendono la

• famiglia di B7 (il cui controrecettore è CD28).

Quindi una cellula che presenta in assenza di attivazione legata all'ingaggio di recettori di tipo

attivatorio, presenta solo MHC, mentre una cellula attivata presenta anche molecole che la rendono

più capace di interagire in maniera stabile con il linfocita T e molecole che la rendono in grado di

attivare il linfocita T attraverso una famiglia di controrecettori.

La risposta del linfocita T all'ingaggio dipende prima di tutto dall'eventuale riconoscimento

dell'antigene e in caso di riconoscimento dell'antigene sono possibili due esiti:

1. i corecettori garantiscono un'interazione stabile tra APC e linfocita T che si traduce in un

aumento del tempo in cui la cellula APC può inviare segnali al linfocita ed attivarlo. I

segnali che attivano il linfocita giungono dalla seconda famiglia di corecettori

segnalatori.

Dai corecettori con funzione di segnalazione dipende anche il tipo di attivazione che il

linfocita T svilupperà, poiché a decidere quale tipo di risposta immunitaria si svilupperà

è la cellula dendritica che lo fa scegliendo il tipo di corecettori che decide non solo se

attivare il linfocita T ma anche come attivarlo: non solo è l'interruttore della risposta ma

la orienta in maniera specifica per gestire il patogeno.

Questo meccanismo è da un lato sorprendente perchè la cellula APC non ha specificità per

l'antigene, ma in realtà tra i recettori attivatori da cui dipende l'attivazione della APC esiste una

capacità di discriminazione tra i diversi tipi di patogeni: ad es. se il patogeno che ingaggia il TLR-4

è un batterio, la cellula APC indurrà una risposta di tipo Th1.

Quindi la decisione del tipo di risposta finale a livello dell'immunità adattativa è comunque gestito

dall'immunità di tipo innato!

2. Quando invece non è presente un contributo innato a definire il tipo di processo, ovvero

in assenza di un antigene esogeno ed in presenza di un antigene self, la presentazione in

MHC I o II porta ad anergia o delezione del corrispettivo linfocita T secondo un

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meccanismo definito di tolleranza periferica.

Quindi se la cellula non presenta i costimoli e in assenza dell'ingaggio dei TLR il

contesto citochinico dominante è anti-infiammatorio e la maturazione e la migrazione al

linfonodo vengono bloccate.

Se però la cellula dendritica in un tessuto periferico presenta in antigene self ma contestualmente in

tale tessuto vi è un patogeno la cui presenza è segnalata dall'attivazione di un recettore (per es.)

TLR il sistema compie un errore: questo sistema infatti assume che ogni volta che la APC catturi

qualcosa sia da leggersi in base alla presenza/assenza di un secondo segnale di tipo infiammatorio

in situ. In questi casi viene presentato un peptide che normalmente sarebbe sottoposto la tolleranza

periferica ma in un contesto di danno: il linfocita T non è in grado di discriminare tra se un peptide

è self o non self, se questo viene rilevato in un contesto infiammatorio; il linfocita interpreta quindi

il peptide self con un peptide non self e si instaura la rottura della tolleranza periferica. La

maggioranza delle patologie autoimmuni ha questa origine, ovvero deriva dall'erronea lettura di un

peptide self dovuto ad un agente infettivo che sposta il frame di lettura.

Quando viene riconosciuto un antigene self la cellula T reattiva non viene eliminata perchè se così

fosse eliminata non sarebbe in grado di mediare l'attacco ma non sarebbe nemmeno utilizzabile

come regolatore: la cellula APC infatti è in grado di scegliere se attivare il linfocita T (secondo un

certo bias) oppure trasformarla in una cellula regolatoria.

Quindi se il linfocita T ingaggia un antigene self ma non è presente un contesto infiammatorio, il

linfocita T viene trasformato in una cellula regolatoria la cui funzione è produrre IL-10. L'induzione

di tolleranza è un fenomeno attivo così come l'induzione della risposta immunitaria attiva! Il

sistema immunitario è più spesso impegnato ad indurre tolleranza piuttosto che ad attaccare

patogeni.

Una volta che il linfocita è stato trasformato in un Tr rimane nel sistema; se il peptide self

riconosciuto da quel Tr viene presentato in un contesto infiammatorio possono avvenire due eventi:

- se è presente un Tr, esso riconosce l'antigene e produce IL-10 sopprimendo la risposta;

quindi nonostante il TCR riconosca il peptide self, la risposta è negativa.

- se non è presente alcun Tr nel sistema, ogni volta che un peptide self viene presentato e nel

tessuto c'è un agente infettivo la tolleranza periferica salta.

Quindi il rischio che la tolleranza periferica salti c'è ma solo quando il peptide self incontra T

naive.

Il primo fenomeno legato all'attivazione dell'APC è quindi la decisione di esprimere o non

esprimere corecettori e anche che tipo di corecettori esprimere in funzione del tipo di risposta che

vuole dare. Il secondo fenomeno è la migrazione: se il riconoscimento avviene in periferia, la

presentazione avviene nei linfonodi dove la cellula APC giunge matura ed in grado di presentare

bene (ed ha alti costimoli).

Per arrivare in periferia la cellula APC deve cambiare i recettori che ne controllano il traffico: la

presenza in periferia è legata alla presenza sulle APC di recettori per chemochine che si trovano

solo sulle cellule immature; durante la maturazione della cellula, questi recettori vengono

downregolati e viene upregolato invece il recettore CCR7.

CCR7 percepisce le chemochine CCL19 e CCL21 che vengono espresse nel linfonodo: quindi la

cellula lascia il tessuto e si sposta al linfonodo perché cambia i recettori per chemochine.

Il segnale che induce lo switch del recettore è legato a segnali infiammatori o derivati dal patogeno

(TNF, IL-1, CD40L) ed è invece contrastato da IL-10 che segnala l'assenza di contesti infiammatori.

CCR7 è quindi fondamentale per avere una risposta immunitaria specifica.

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Esiste un farmaco in grado di bloccare CCR7 che viene utilizzato nei trapianti per abbattere la

presentazione di antigeni dell'organo trapiantato.

Quando un tessuto si infiamma una buona parte delle cellule APC presenti nel tessuto, catturano

materiale esterno e si spostano al linfonodo per presentarlo, quindi il tessuto si svuota di cellule

dendritiche. A permettere l'arrivo di nuove cellule dendritiche immature nel tessuto infiammato

sono i recettori CCR1, CCR5 e CCR6 che sentono i contesti infiammatori.

Linfonodi

Il sistema immunitario è un sistema organizzato con una rete di vasi linfatici che drenano diversi

distretti a diverse stazioni linfonodali; la linfa passa attraverso il linfonodo e viene raccolta dal vaso

efferente e passa quindi diverse stazione linfonodali finché non giunge al dotto toracico che

raccoglie la linfa e la ributta nella succlavia sinistra.

La linfa porta al linfonodo sia le cellule dendritiche sia gli antigeni solubili, che vengono poi

catturati a livello del linfonodo, la risposta immunitaria che poi ne deriva è leggermente diversa.

Il linfonodo è costituito da una porzione T cellulare popolata da linfociti T ed una porzione B

cellulare popolata da linfociti B e detta follicolo.

Il linfonodo è inoltre ricoperto da una capsula sotto la quale si trova il seno sub-capsulare a livello

del quale il vaso linfatico afferente scarica la linfa; l'antigene quindi arriva a livello del seno sub-

capsulare e perfonde attraverso l'organo fino ad incontrare i sinusoidi che si trovano nella zona

midollare. I linfociti T e B invece giungono al linfonodo attraverso i vasi con endotelio alto.

Il linfonodo è quindi un organo pensato per far scontrare i due sistemi: i linfociti T arrivano da sotto

e vanno sopra, mentre l'antigene compie il movimento opposto! Durante questo processo,

l'immunità specifica e l'immunità innata hanno un tot di tempo per verificare se c'è o meno affinità

elettiva, ovvero un momento in cui il sistema innato passa il segnale al sistema adattativo.

Durante il transito dalla capsula alla midollare infatti la cellula dendritica contatta migliaia di

linfociti T con contatti brevi: il tempo di contatto è di qualche secondo, il minimo sufficiente alla

cellula dendritica per capire se quel particolare TCR ha il recettore T giusto; se non trova il recettore

corretto passa al contatto successivo e se non trova un contatto efficace durante questo percorso,

lacellula APC con l'antigene caricato lascia il sistema.

Se invece la cellula APC incontra il linfocita T giusto ed è una cellula dendritica matura, che ha

avuto il segnale di attivazione ed ha i costimoli a funzione adesiva, l'ingaggio tra linfocita T e la

APC da transiente diventa stabile ovvero le due cellule rimangono attaccate per ore, il tempo

necessario affinché il linfocita T naive riceva un segnale sufficiente a sbloccarlo.

In assenza di una presentazione nel linfonodo la densità delle cellule dendritiche e l'intensità del

contatto non è sufficiente per attivare il linfocita: se un linfocita T naive viaggia al di fuori del

linfonodo è impossibile attivarlo. I linfociti T naive quindi viaggiano attraverso le arterie ed escono

dalle arterie a endotelio alto e fanno homing nel linfonodo.

Quindi se un soggetto ha un'infezione (es. pancreatite) l'unico linfocita T utile si va a localizzare a

livello del linfonodo mesenterico, non nel pancreas.

Se i linfociti vengono ingaggiati ed attivati l'effetto funzionale è una proliferazione. Il tempo

necessario perché la cellula APC arrivi, i linfociti facciano homing e vengano ingaggiati nel

follicolo e poi proliferino è dell'ordine di un paio di settimane.

La risposta primaria è quindi una risposta che avviene nel linfonodo e la ragione è la necessità di un

segnale intenso che attivi i linfociti.

Quando la risposta primaria si è sviluppata, ovvero quando il linfocita è stato attivato, la sua

espansione determina la comparsa di due popolazioni di cellule (sia T che B):

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effettrici → lasciano il linfonodo e attraverso la circolazione migrano ai tessuti periferici

• nella cui stazione linfonodale è avvenuta l'attivazione; quindi l'infiltrato linfocitario

specifico arriva nell'organo bersaglio solo due settimane dopo l'ingaggio dell'antigene

memoria → sono cellule T attivate in precedenza che effettuano il patrolling, ovvero

• circolano nel sangue e ogni tanto si portano all'organo periferico in cui sono state attivate

originariamente: i patogeni infatti per passare le strutture di barriera utilizzano diverse vie di

accesso che sono ristrette a determinati distretti anatomici, quindi anche i linfociti sono

ristretti, ovvero controllano gli organi periferici da cui è più probabile che un determinato

patogeno arrivi.

Per arrivare agli organi periferici le cellule T memoria usano dei recettori diversi rispetto a

quelli che le portano al linfonodo: quindi anche la cellula T memoria effettua uno switch,

infatti le cellule memoria devono evitare il linfonodo poiché se ci andassero verrebbero

attivate ma il patogeno non si trova nel linfonodo bensì in periferia! Le cellule T memoria

dunque devono presentare recettori specifici per gli stimoli infiammatori.

Quindi mentre nelle cellule dendritiche immature sono presenti recettori per chemochine

infiammatorie che le portano verso l'organo “svuotato” di APC e quando maturano si

portano al linfonodo, i linfociti effettuano uno switch opposto: quando sono immaturi

upregolano CCR7 che li porta al linfonodo, quando maturano invece upregolano i recettori

per le chemochine infiammatorie che li portano ai tessuti.

Non solo la cellula effettrice si porta in periferia e per andarci utilizza dei recettori per chemochine

infiammatorie (e quindi ci va di più se l'organo che deve controllare è in corso di patologia) ma per

migrare selettivamente verso organi diversi usa recettori per chemochine diverse, alcune

chemochine infatti sono omeostatiche e spesso tessuto-ristrette: ad esempio a livello della cute

viene prodotta la chemochina CCL20, mentre nel canale gastroenterico viene prodotta CCL25.

I linfociti T memoria, che sono stati attivati in un linfonodo drenante dalla cute, perdono CCR7 e

per poter ricircolare nella cute upregolano CCR6 che riconosce CCL20, quindi il Tmemoria farà

spontaneamente patrolling a livello della cute. Il linfocita mantiene comunque anche recettori per

chemochine infiammatorie, quindi se il tessuto si infiamma la migrazione aumenta notevolemente.

I linfociti T memoria non rimangono stabili nell'organo ma circolano al suo interno e se non trovano

l'antigene se ne vanno (a differenza delle cellule dell'immunità innata); questo avviene perché i

linfociti memoria sono ristretti per l'antigene: infatti tutti i linfociti memoria che rappresentano la

memoria di patogeni entrati a livello di un determinato organo ricircolano in quell'organo dove è più

probabile che i patogeni rientrino, poiché però questa non è una garanzia è necessario che i T

memoria circolino anche a livello dell'intero organismo.

Quindi nella linfa afferente che parte dal tessuto e va verso il linfonodo ci sono:

- il 10% di fluido che rappresenta la discrepanza di fluido tra capo arteriolare e venulare e

quindi una sorta di “campione del tessuto” dove si trovano proteine self o non self

- cellule dendritiche che portano ciò che hanno mangiato al linfonodo drenante, e possono

essere mature, se sono state attivate, o immature

- linfociti T memoria specifici per quegli organi.

Se il linfocita T memoria quando torna nel tessuto trova l'antigene per cui è ristretto, non si porta al

linfonodo (come farebbe il T naive) ma è estremamente reattivo: si riattiva anche in assenza di

stimoli elevati e dà subito una risposta secondaria!

50 27 Marzo

Sviluppo dei linfociti e generazione dei recettori per gli antigeni

Esistono diversi tipi di classi linfocitarie:

- linfociti T helper CD4+

- linfociti T citotossici (CTL) CD8+

- linfociti B → sono la sorgente degli anticorpi

- cellule NK → sono linfociti innati ovvero cellule che si trovano a ponte tra l'immunità

innata e quella adattativa. Sono generate lungo il lineage di tipo linfoide ma non hanno

recettori per l'antigene, non sono ristrette per l'antigene bensì per MHC: quindi non sono

condizionate nella loro attività dal riconoscimento del peptide dentro MHC (come i linfociti

T e B che riconoscono il peptide nel complesso MHC) ma riconoscono solo MHC.

Le cellule NK possono uccidere o ignorare le cellule in funzione del riconoscimento o meno

di MHC sulla cellula in base allo stato di salute della cellula stessa.

Tutte queste cellule derivano da un precursore linfoide comune ovvero dalla cellula pluripotente

staminale HSC che sotto stimolo di citochine ambientali (nel midollo) e per effetto di alcuni fattori

trascrizionali differenzia verso precursori orientati a lineage diversi:

proB → stimolata da EBF, E2A e Pax5; genera diversi tipi di linfociti B che presentano

• caratteristiche distintive diverse. Il lineage B completa tutta la maturazione nel midollo

osseo.

precursore T, NK → può dare origine a sua volta a due lineage:

• - proT → sotto stimolo di Notch1 e GATA3; è una cellula nuda che viene poi dotata di un

recettore per l'antigene che può essere αβ o γδ

- NK

Il lineage T completa la maturazione e la selezione nel timo.

Per controllare questo processo intervengono una serie di fattori trascrizionali, IL-7 che è essenziale

per tutto il lineage, ma anche molecole regolatorie come microRNA.

Le immunodeficienze che sono prevalentemente a carico della componente adattativa sono legate al

51

fatto che uno o più dei punti di maturazione dei linfociti vengono bloccati a causa di difetti genetici

(citochine, recettori, fattori trascrizionali..). A seconda di dove interviene il difetto le

immunodeficienze possono essere: selettivamente a carico del lineage B o T ma anche combinate.

Maturazione dei linfociti

Il primo concetto comune è il fatto che durante lo sviluppo di queste cellule è fondamentale passare

da una cellula nuda ad una cellula che possiede un recettore per l'antigene e sia in grado di

riconoscere potenzialmente l'antigene esterno; ciò che si cerca di evitare sono le cellule che non

sono in grado di riconoscere l'antigene o che sono in grado di riconoscere antigeni self.

L'acquisizione della cellula di un recettore per l'antigene funzionale e selettivo per non self avviene

attraverso tappe che portano progressivamente la cellula a svolgere una parte del proprio compito

alla cui fine va incontro ad un processo di checkpoint: per ogni passaggio la cellula ha un

meccanismo che verifica se ha raggiunto l'obiettivo che il checkpoint controlla.

Se l'obiettivo è raggiunto il checkpoint viene superato e la cellula passa allo step di maturazione

successivo; se il checkpoint non viene superato la cellula viene eliminata. L'efficienza di questo

processo è di 1/100, ovvero 99 cellule su 100 che avviano il processo non arrivano a maturazione!

Quando il checkpoint è fallito la cellula viene eliminata per apoptosi che può essere di due diversi

tipi:

1. by neglect → la cellula non riceve un segnale di crescita, viene ignorata

2. indotta → la cellula riceve segnali di morte pro-apoptotici

Inoltre ogni qualvolta che il checkpoint viene superato dalla cellula, questa viene espansa e dà

origine ad un clone. Quindi tra tutti i linfociti T circolanti alcune cellule hanno caratteristiche

comuni e altre no, ovvero alla fine della maturazione ciascuna cellula avrà uno specifico recettore

per l'antigene ma se alcune di queste cellule sono frutto della stessa espansione clonale hanno la

stessa affinità.

Questo processo se va incontro a patologia può dare due problemi: o si blocca perché i fattori

trascrizionali/citochine sono difettivi oppure essendo il sistema pensato per espandersi, il processo

genera frequentemente trasformanti ovvero tumori (→ leucemie). Le leucemie sono tumori che

derivano da un mancato controllo di questo processo, sono il frutto dell'espansione di uno dei

sottocloni anomalo che è andato incontro ad espansione anziché essere eliminato.

Quindi partendo da un precursore per tappe intermedie mediante un processo che alterna selezione,

checkpoint ed espansione, si arriva ad avere una cellula matura.

Un altro punto importante soprattutto per lineage T è il fatto che il processo è intrinsecamente

collegato dalla capacità di ogni cellula di interagire con l'antigene: ci sono fasi in cui l'antigene è

self e fasi in cui l'antigene è invece non self. Durante il processo in una prima fase l'esito è

dipendente dall'antigene che è self, e poi una volta che le cellule hanno maturato e sono pronte, la

loro storia naturale dipende da un antigene non self.

È fondamentale capire il rapporto tra la cellula che sta maturando e la sua capacità di detectare il

tipo di antigene in funzione della fase della storia naturale della cellula.

Il processo porta alla fine ad avere il recettore per l'antigene. I recettori per l'antigene sono di due

tipi: B Cell Receptor → recettore dei linfociti B.

• È costituito da due catene pesanti e due catene leggere: entrambe le coppie sono due copie

della stessa catena, quindi il recettore è un doppio eterodimero ed è simmetrico.

La catena leggera di ognuno dei due emirecettori presenta due domini:

- V (variabile) → N-terminale

L

- C (costante) → C-terminale

L 52

La catena leggera dei recettori B può essere il prodotto di due geni diversi: κ o λ, ma in ogni

singolo linfocita è il prodotto di solo uno dei due; quindi la catena leggera può essere di due

tipi: V /C o V /C .

λ λ K K

La catena pesante è costituta da:

- V → dominio variabile all'N-terminale affacciato al dominio variabile V

H L

- C → dominio costante affacciato al dominio C .

H L

Quindi ogni emirecettore è composto da due domini variabili tra loro appaiati che

appartengono a due proteine diverse e sono tra loro diversi, e subito sotto da due domini

costanti che si agganciano attraverso una regione cerniera a una struttura di base data dai

domini costanti sottostanti.

T Cell Receptor (TCR) → è più semplificato rispetto a quello dei B ed è infatti un

• eterodimero singolo costituito da una catena α ed una β. Questo recettore corrisponde alla

sola parte di domini variabili e costanti che si affacciano e che si trova nei recettori B, senza

la struttura sottostante: anch'esso è quindi costituito da due domini variabili α/β o γ/δ (che

corrispondono alle catene pesanti/leggere) e due domini costanti sotto.

Quindi l'unica differenza tra i due recettori è il fatto che il recettore per l'antigene T è finito, ovvero

sotto questi domini presenta una piccoli α-elica che gli consente di reclutare CD3 che gli serve per

segnalare; il recettore del linfocita B invece presenta la cerniera ed un'ulteriore struttura di supporto

costituita da 3 o 4 domini costanti che si agganciano poi transmembrana.

Entrambi i recettori sono però due proteine di membrana che mancano del dominio intracellulare,

quindi non trasducono segnale nella cellula ma hanno capacità di sensing. L'attività di segnalazione

del recettore è delegata ad un complesso di segnalazione che al contrario non presenta domini

extracellulari ma solo intracellulari. Quindi le due funzioni, di riconoscimento e segnalazione, sono

separate.

Il complesso di segnalazione è uguale in tutte le cellule T o B, a differenza del recettore che è

differente da cellula a cellula.

Il risultato è che il recettore per l'antigene del linfocita T vede a livello dei domini variabili un

antigene, e la struttura legge la somma di MHC+antigene.

Anche per il linfocita B il riconoscimento avviene a livello dei domini variabili, ma oltre a questo il

linfocita B è in grado di cambiare la porzione C-terminale mediante un fenomeno di splicing

alternativo e quindi può scegliere se produrre la struttura in versione transmembrana o in versione

solubile: la versione solubile viene definita anticorpo. Il recettore per il linfocita B è

sostanzialmente un anticorpo fissato in membrana.

Dunque il linfocita T usa il recettore come un recettore, il linfocita B usa il recettore prima come un

recettore e poi come un effettore: il linfocita B che viene selezionato perché ha un recettore giusto,

lo usa in versione solubile per agire.

TCR

Il loci che producono il recettore per il linfocita T sono 4 e le cellule possono scegliere di usare o β

a cui possono agganciare solo α, oppure possono usare δ a cui agganciano γ; i recettori possibili

sono quindi α/β (90% negli uomini) o γ/δ (10%).

Per la catena β, la porzione V che si trova all'N-terminale è il prodotto di una riorganizzazione a cui

contribuiscono i segmenti V, D e J. Questo gene quindi è costruito a pezzi che vengono scelti man

mano: la porzione del recettore per cui questo meccanismo di ricombinazione somatica è rilevante,

è quella dei domini V. Il locus porta quindi ad un trascritto solo dopo essere andato incontro ad una

53

selezione di segmenti distribuiti sul genoma che sono utilizzabili in modo mutualmente esclusivo:

viene scelto un dominio V (variabile) tra 50 alternative, ognuna delle quale è utilizzabile in

combinazione con uno o più domini D (di diversità), infine viene scelto un dominio J (di

giunzione). Quindi la porzione N-terminale della catena β ovvero il dominio V è la somma di pezzi

V+D+J variabili, la porzione che viene sotto è poi costante.

La catena α che si trova su un altro cromosoma, ha un'organizzazione simile ma manca dei domini

D, presenta solo V e J.

BCR

Il locus che codifica per il recettore B è anch'esso costituito da una porzione che codifica per il

dominio N-terminale variabile V della catena pesante ed anch'esso è formato dalla somma di un

H

dominio V, un dominio D e un dominio J: la combinazione di questi tre domini dà origine ad una

certa struttura.

I domini costanti sottostanti sono appunto costanti. Nel caso del locus per la catena pesante dei

recettori per i linfociti B c'è un ulteriore grado di complessità poiché i domini costanti sono diversi

Cα/δ/ε/γ/μ e corrispondono agli anticorpi A, E, G, D ed M; ogni recettore B presenta una sola di

queste porzioni costanti.

Le 5 differenti porzioni costanti sono tra loro diverse ma tutti gli anticorpi che appartengono allo

stesso isotipo (A) presentano la stessa catena costante (C ).

α

Il locus per la catena leggera si riorganizza allo stesso modo: nel caso dei linfociti B le catene

leggere possibili sono K e λ ed anch'esse presentano un dominio costante C ed un dominio variabile

V che è dato dalla ricombinazione somatica di uno dei domini V con uno dei domini J. Ogni

linfocita B riorganizza un locus H ed un locus κ o λ generando un prodotto utile dal locus H ed un

prodotto utile da uno dei due loci κ o λ.

Poiché ogni cellula presenta due copie per ogni locus (due cromosomi) il prodotto del locus H

deriva da uno solo dei due alleli e l'altro non funziona, mentre il locus κ/λ deriva da una sola copia

di uno dei due alleli, e gli altre 3 alleli non funzionano.

L'appaiamento delle due catene determina poi che forma avrà il recettore per l'antigene.

Analogamente avviene per i linfociti T.

Se il linfocita costruisse due diverse catene leggere il recettore avrebbe due specificità recettoriali

diverse; è fondamentale che questo non avvenga poiché in funzione della specificità recettoriale che

il linfocita è in grado di organizzare viene discriminato il suo destino. Se il linfocita avesse due

recettori per l'antigene ed uno di questi venisse selezionato positivamente la cellula riceverebbe un

segnale di sopravvivenza, ma se l'altro recettore fosse autoreattivo verrebbe rilasciata come

checkpoint-positiva un cellula che in realtà avrebbe dovuto essere eliminata.

Un doppio recettore però può essere utilizzato dal punto di vista biotecnologico: generando un

linfocita B, che darà origine ad un anticorpo, con due specificità recettoriali è possibile utilizzare

l'anticorpo come ponte in grado di avvicinare le due molecole per cui ha specificità. Esistono

farmaci con questa funzione che hanno specificità per un antigene tumorale ed un farmaco che può

quindi agire sul tumore.

Il recettore per l'antigene inoltre deve mantenersi costante nel tempo: se la cellula va incontro a

selezione durante la maturazione in funzione del recettore, il processo sarebbe inutile! Per questo

motivo il processo di rimaneggiamento che porta alla produzione di un unico recettore non avviene

a livello dei trascritti, mediante splicing alternativo, ma avviene a livello del DNA: il linfocita è

l'unica cellula che fisiologicamente scinde il suo genoma; è infatti essenziale che qualunque sia il

prodotto recettoriale finale, il processo non sia reversibile.

54

La cellula quindi sceglie quali blocchi utilizzare ed elimina gli altri mediante un processo detto

ricombinazione V(D)J: questo processo è il punto di partenza della formazione dei recettori B/T ed

avviene sia per le catene pesante che per quelle leggere.

La ricombinazione avviene mediante un meccanismo basato sul riconoscimento di sequenze

palindromiche che si trovano nell'intorno dei domini che si vogliono ricombinare: supponendo di

voler agganciare un qualsiasi dominio V ad uno J, il riconoscimento passa dalla presenza di

eptameri e nonameri (sequenze di 7 e 9 nt) che si trovano a destra e sinistra delle due sequenze V e

J che devono essere ricombinate.

Quando i due eptameri si legano tra di loro e anche i due nonameri si viene a creare un harpin con

due loop: uno da 12 ed uno da 23nt (regola 12-23).

Affinché il sistema funzioni, eptameri e nonameri devono avere antiorientamento e devono essere

separati rispettivamente da 12 e da 23nt (la sequenza di nucleotidi è: 7-12-9..-9-23-7).

Se la regola è rispettata significa che i due domini V ed J sono tra loro ricombinabili (e non sono

due J o due D!).

Il loop che si forma può essere anche molto grande (la frequenza di ricombinazione è influenzata

dalla distanza) ed una volta formato intervengono due enzimi Rag-1/Rag-2 che tagliano il DNA.

La porzione interposta viene persa e poiché i due terminali che si formano sono ad hairpin e non

possono essere uniti, interviene l'enzima Artemis che apre l'hairpin permettendo al sistema di riparo

(NHEJ) del DNA di unirli.

L'enzima Artemis però riapre l'hairpin ma non nello stesso punto in cui Rag aveva tagliato: si

generano quindi dei terminali differenti sfalsati, in cui alcune basi che si trovavano su un'elica si

ritroveranno sull'altra!

La singola elica di DNA più corta viene quindi allungata utilizzando quella più lunga come stampo,

mediante l'inserzione di nucleotidi P.

Il DNA finale non è lo stesso iniziale però! Una volta che i due terminali sono stati completati,

prima di essere uniti l'enzima terminal-desossinucleotidil-transferasi (TDT) inserisce tra i due

terminali dei nucleotidi N in maniera totalmente casuale sia come sequenza che come numero,

contribuendo quindi ad una ulteriore variabilità dei recettori..

Quindi..

- per la catena α (che non ha i segmenti D) sono possibili: 45 segmenti V, 55 segmenti J

ovvero 45 x 55 = 1475 possibilità

- per la catena β sono possibili: 50 V, 2 D e 12 J per un totale di 1200 possibilità

La ricombinazione VDJ per il T cell receptor ha quindi 1200 x 1475 = 3milioni di possibilità; ma il

12

repertorio umano di TCR è di 10 , quindi il sistema in sé non è sufficiente a generare tutti i T cell

receptor diversi: è fondamentale quindi anche il processo di inserimento dei nucleotidi P ed N!

Il repertorio quindi è il frutto della somma di un processo combinatorio V(D)J e di un processo

volontariamente casuale.

Questo determina alcune implicazioni:

1. la probabilità che il sistema produca un prodotto che dal punto di vista nucleotidico porti

alla formazione di un prodotto proteico è bassa perché l'inserimento dei nucleotidi può

causare un frameshift (2/3 degli inserimenti genera codoni di stop)

2. tra le porzioni variabili dei recettori per l'antigene ci sono porzioni ipervariabili, ovvero tutti

i recettori formati da V1D2 sono diversi tra tutti i V3D4, ma tra tutti quelli che hanno scelto

V1D2 le zone più diverse sono le zone di giunzione perché formate da nucleotidi inseriti

random!

Le zone di giunzione dei domini variabili sono quindi zone di ipervariabilità e vengono

definite regioni che determinano la complementarietà (CDRs): sono proprio queste zone

infatti quelle in cui si inserisce l'antigene. 55

Il processo di ricombinazione somatica porta all'eliminazione di una parte del DNA e quindi ad un

accorciamento del locus, che consente all'enhancer che si trova a valle del dominio costante C di

posizionarsi vicino al promotore che si trova invece a monte del dominio variabile V: questo

determina la possibile trascrizione del gene, che altrimenti sarebbe impossibile.

La proteina che ne deriva inoltre diventa la proteina più abbondante prodotta dal linfocita

(soprattutto nei T).

Inoltre poiché il processo di ricombinazione è irreversibile, determina una sorta di signature della

cellula che si può quindi identificare mediante Southern Blot; poiché tutte le cellule che derivano da

un medesimo clone hanno lo stesso tipo di ricombinazione somatica, saranno tutte uguali a livello di

bandeggio mediante Southern Blot: è quindi possibile verificare se in un soggetto che ha un elevato

numero di linfociti questi sono monoclonali o policlonali, se i linfociti sono monoclonali è molto

probabile che il soggetto stia sviluppando una leucemia.

Sviluppo dei linfociti T ed attivazione

La generazione del linfocita T avviene prevalentemente nel timo, ad esclusione di una primissima

fase in cui la cellula espande nel midollo: la cellula proT che lascia il midollo e si porta al timo,

deriva da una staminale pluripotente e ancora non ha nessuna struttura recettoriale.

In circolo si trovano quindi pochissimi linfociti T prematuri che non hanno il recettore e sono in

transito dal midollo al timo.

Queste cellule nel timo vanno incontro al processo di educazione timica, durante il quale devono

produrre le catene β ed α: se questo processo va a buon fine, il linfocita viene rilasciato come

linfocita T naive ed entra in circolo.

Per generare i proT il midollo dunque genera numerose cellule (poiché il processo è inefficace al

99%), dopodiché le fasi che caratterizzano la storia del linfocita T è un'alternanza di step di

selezione ai checkpoint e step di proliferazione.

Il passaggio da proT a preT è determinato dalla comparsa in membrana di due strutture:

- catena β

- catena preTα

Il linfocita preT è un linfocita in cui il processo di ricombinazione somatica è avvenuto in maniera

efficiente a carico della catena β; il locus α invece non è ancora stato modificato.

Il complesso preTα - β viene definito preTCR (preT Cell Receptor) e non è ancora un recettore per

l'antigene ma è in grado di agganciare il complesso di segnalazione CD3 e di funzionare come se

fosse un recettore: la presenza di un preTCR infatti segnala che la catena β è stata costruita in

maniera efficiente!

Il preTCR svolge diverse funzioni:

1. inibisce il processo di ricombinazione somatica dell'altra catena β (quella proveniente dal

locus sull'altro allele!)

2. porta all'espansione di quel clone → poiché la cellula deve ancora effettuare la

ricombinazione di α, un altro processo inefficiente: quindi il sistema garantisce che la cellula

che è riuscita a ricombinare β espanda, tanto le cellule saranno comunque diverse tra di loro

(i linfociti T sono spesso “parenti per la catena β”)

3. sblocca il locus α → prima sblocca un allele e se questo ricombina in modo efficiente blocca

il secondo allele, se invece il primo non ricombina in maniera efficiente sblocca anche il

secondo

4. induce il passaggio da un preT CD4-/CD8- ad un doppio positivo CD4+/CD8+ → questo

avviene perché non appena sarà avvenuta la ricombinazione somatica di α, il linfocita sarà

dotato dell'intero TCR e quindi dovrà essere ristretto a CD4+ o CD8+ (quindi prima li deve

avere entrambi i recettori!).

A decidere il fenotipo del linfocita sarà il tipo di MHC presentante l'antigene self che nel

contesto del timo ingaggerà il TCR. 56

Queste funzioni rappresentano lo snodo da una fase iniziale della maturazione alla fase finale e

dipendono tutte dal preTCR, che si organizza quando β si accoppia con preTα.

Il processo di maturazione porta infine alla formazione di una cellula matura con un TCR

funzionante, CD4+ o CD8+ e che è pronta a rispondere.

Dal momento in cui viene sbloccato il locus α e si crea un TCR completo al rilascio, il linfocita T

maturo il sistema deve selezionare il linfocita in base alla specificità del TCR: questo passaggio

avviene mediante selezione. 31 Marzo

Selezione timica

Come vengono selezionati i linfociti che hanno una specificità antigenica ottimale? Ovvero quei

linfociti T che:

- siano in grado di riconoscere il peptide antigenico presentato nel contesto di un MHC I o II

ma non in entrambi. Poiché l'esito funzionale dell'eventuale riconoscimento in periferia del

peptide antigenico è influenzato dal punto di vista della funzionalità della cellula dal tipo di

restrizione MHC, è necessario quindi discriminare se il riconoscimento avviene in un MHC

I o II, ovvero le cellule rilasciate non possono avere una doppia restrizione perché

porterebbe a un effetto ambiguo e non gestibile dal SI

- presentino un recettore in grado di riconoscere un peptide rappresentativo dell'ambiente

esterno e non dell'ambiente self, approvato durante il processo di educazione timica. La

specificità per il non-self avviene in un contesto in cui nessuno dei due mondi è in realtà

completamente rappresentato: il mondo non self non si trova nel timo, dove non si trova

nemmeno tutto il mondo self, poiché una percentuale variabile di circa il 15% delle proteine

dell'organismo sono tessuto-ristrette quindi non sono espresse nel timo.

Le cellule che entrano nel lato della corticale del timo sono cellule ancora prive di recettori; nel

passaggio dalla corticale alla midollare acquisiscono le catene β ed α ed esprimono entrambi i

possibili corecettori CD4 e CD8 diventando doppio positive.

Né le doppio positive, né le doppio negative sono cellule che si ritrovano normalmente in circolo.

Allo stadio di doppio positivo la cellula va incontro ad un primo fenomeno di selezione positiva

legata alla capacità della cellula di riconoscere MHC: se il linfocita T doppio positivo ingaggia un

MHC qualsiasi viene positivamente selezionata; l'ingaggio può avvenire sia per MHC I che per

MHC II perché la cellula è doppio positiva.

Affinché il riconoscimento di MHC avvenga si devono verificare due situazioni:

1. deve esistere un recettore TCR

2. il recettore deve legare un MHC contenente il peptide: quindi nella selezione positiva

vengono selezionate cellule che riconoscono il self poiché se riconoscono MHC contenente

un peptide, il peptide deve essere per forza self perché il timo è un organo che non riceve

dall'ambiente esterno (il drenaggio dai tessuti periferici va al linfonodo non al timo!!).

Il mantenimento di queste cellule nell'età adulta, se dovessero diventare mature, richiede che

di tanto in tanto ottengano un segnale dal self: ovvero c'è un tonico riconoscimento a bassa

affinità delle cellule T sul self. Poiché ogni individuo ha un determinato pool di linfociti T

mantenuto sul proprio self, quei linfociti T trasferiti su un altro individuo hanno difficoltà ad

essere mantenuti in termini di sopravvivenza: infatti trasferendo il repertorio immunologico

da un donatore ad un ricevente, il ricevente ricostituisce ma non mantiene in sopravvivenza

le cellule mature che riceve dal donatore, poiché non ricevono più segnali di sopravvivenza.

L'ingaggio da parte dei doppi positivi dell'MHC avviene su cellule che si trovano al limite tra la

57

corticale e la midollare e può avvenire solo se l'MHC con il peptide ha affinità per il TCR di quello

specifico linfocita T.

In funzione del tipo di MHC che ha presentato al TCR del linfocita doppio positivo, la cellula viene

selezionata positivamente e ristretta ovvero mantiene il corecettore associato all'MHC che gli ha

presentato il peptide: se a presentare è MHC II la cellula mantiene CD4, se invece a presentare è

MHC I la cellula mantiene CD8 e perde CD4; la restrizione è quindi legata a quale MHC ha

presentato il peptide.

Le cellule che non superano la selezione positiva, ovvero che hanno costruito un TCR che non è in

grado di ingaggiare MHC muoiono per apoptosi by neglect: l'ingaggio del TCR infatti segnala

sopravvivenza, segnale che non parte se il TCR non viene ingaggiato.

Se la cellula ingaggia l'MHC invece viene selezionata positivamente riceve segnali antiapoptotici,

upregola CCR7 e si sposta nella midollare, dove vengono infatti espresse le chemochine CCR19 e

CCR21 (ligandi di CCR7).

La seconda tappa avviene nella midollare, dove il linfocita ristretto è quindi in grado di riconoscere

MHC e a bassa affinità anche il peptide self; ma se la cellula riconosce il self il sistema deve

escludere che lo faccia in modo potenzialmente reattivo, poiché se fosse autoreattiva verrebbe

selezionata una cellula che rilasciata in periferia potrebbe determinare una perdita di tolleranza. Per

evitare che questo avvenga i linfociti vanno incontro ad una selezione negativa:

- se l'affinità è molto alta, ovvero l'energia di interazione tra il TCR e l'MHC con il peptide è

elevata, parte un segnale che induce morte

- se l'affinità non è elevata, la cellula viene selezionata perché non riceve un segnale di

morte.

Quindi nella selezione positiva deve esserci un minimo di energia di interazione per RICEVERE il

segnale di sopravvivenza, nella selezione negativa l'energia di interazione NON deve essere elevata

per NON RICEVERE il segnale di morte.

Fondamentale è quindi il parametro quantitativo dell'energia di interazione tra i due recettori,

ovvero quanto è forte.

La cellula che non riceve il segnale di morte è quindi un T naive che viene lasciato libero, ed

essendo guidata da CCR7, va verso i linfonodi.

In realtà si ritiene che esista un terzo livello di energia di interazione intermedio correlato ad un

linfocita T che ha riconosciuto il self con un'energia sufficientemente elevata da essere selezionato

negativamente senza essere ucciso, con il risultato di un'attivazione fittizia: ovvero è come se il

recettore avesse riconosciuto un antigene (come avviene in periferia); il linfocita T in questo caso

acquisisce un marcatore di membrana CD25 che è la catena α del recettore per IL-2.

Questo tipo di cellule che si genera mediante un'attivazione fittizia (come se avessero riconosciuto

un peptide estraneo che in realtà è self) vengono convertite al fenotipo di linfocita T regolatorio di

derivazione timica. Concettualmente questa conversione ha senso: se avessimo la possibilità di

selezionare dei linfociti T potenzialmente autoreattivi, le cose che dovremmo fare sono due:

1. eliminarli

2. istruirli a tollerare anziché indurre immunità → i linfociti diventerebbero degli effettori

attivi di tipo negativo (anziché positivo) ed in teoria potrebbero spegnere cellule che

lasciano il timo a seguito della selezione negativa che per errore non sono state eliminate e

quindi diventerebbero aggressive in periferia (cosa che capita ogni minuto).

Quindi la possibilità di generare cellule con funzione negativa invece che positiva fornisce un

ulteriore modo per spegnere il sistema in caso di errori; per questo ciò che viene riconosciuto come

potenzialmente autoreattivo viene convertito in T regolatorio di derivazione timica in modo che

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DESCRIZIONE APPUNTO

Appunti completi e chiari di immunologia e immunopatologia.
Voto 30/30

Programma
Risposte cellulari e tissutali allo stress.
Processi di morte cellulare: necrosi, apoptosi.
Processi degenerativi da accumulo.
Barriere fisiche e biologiche dell’immunità innata.
Origine e funzione delle cellule dell’immunità innata.
L’endotelio e il reclutamento leucocitario.
Meccanismi di riconoscimento dei patogeni: struttura e signalling dei recettori TLR.
Meccanismi di killing dei patogeni: la fagocitosi e gli intermedi reattivi dell’ossigeno.
Mediatori solubili dell’immunità innata.
Il sistema del complemento.
L’infiammazione cronica polarizzata e i granulomi.
Riparo del danno e il tessuto di granulazione.
Fibrosi e sclerosi.
Patogenesi e fattori di rischio dell’aterosclerosi
Meccanismi di generazione di in stabilizzazione della placca e complicanze dell’aterosclerosi
La cascata coagulativa.
Patogenesi e manifestazioni cliniche delle malattie emorragiche.
Patogenesi e manifestazioni cliniche delle malattie trombotiche.

Caratteristiche e fasi dell’immunità acquisita: specificità, memoria, tolleranza.
Tessuti linfoidi primari e secondari.
Le cellule APC.
Processazione e presentazione dell’antigene.
Struttura e funzione del complesso maggiore di istocompatibilità di classe I e II.
Sviluppo intratimico: selezione positiva e negativa.
Generazione, struttura e trasduzione del segnale del TCR.
Differenziamento, attivazione e maturazione dei linfociti T citotossici e helper.
Differenziamento, attivazione e maturazione dei linfociti B.
Generazione, struttura e trasduzione del segnale del BCR.
Gli anticorpi.
Meccanismi di rottura della tolleranza centrale e periferica.
Immunodeficienze congenite e acquisite.
Reazioni di ipersensibilità di I, II, III e IV tipo.
Tolleranza e rigetto dei trapianti d’organo


DETTAGLI
Corso di laurea: Corso di laurea in biotecnologie mediche
SSD:
Università: Milano - Unimi
A.A.: 2017-2018

I contenuti di questa pagina costituiscono rielaborazioni personali del Publisher _ariiel di informazioni apprese con la frequenza delle lezioni di Immunologia e immunopatologia e studio autonomo di eventuali libri di riferimento in preparazione dell'esame finale o della tesi. Non devono intendersi come materiale ufficiale dell'università Milano - Unimi o del prof Locati Massimo.

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