Immunologia - mielomi

Mielomi sensibili al mezzo HAT: generazione e applicazioni

Il mieloma è una proliferazione neoplastica di plasmacellule. Le cellule di mieloma, come le plasmacellule neoplastiche, presentano tre caratteristiche fondamentali: sono HGPRT-, Ig- e "immortali". Una cellula di mieloma si può fondere con un linfocita B antigene reattivo (HGPRT+, Ig+, "mortale") dando origine a un ibrido noto come ibridoma.

Caratteristiche degli ibridomi

L'ibridoma acquisisce due importanti proprietà dalle cellule parentali: la crescita immortale dalla cellula di mieloma e la capacità di secernere anticorpi (Ab) dal linfocita B. Pertanto, gli ibridomi secernono grandi quantità di Ab e possono essere mantenuti in coltura illimitatamente.

Processo di ibridizzazione e selezione mediante HAT

Alla base del processo di ibridizzazione c'è il principio di selezione mediante HAT. Nella pratica, non tutte le cellule si fondono, per cui la fusione produce un miscuglio di cellule di mieloma non fuse e di cellule B non fuse (cellule parentali) e di cellule fuse. Tra queste ultime, si possono riscontrare tre casi: fusioni non desiderate di cellule di mieloma con altre cellule di mieloma, fusioni di cellule B con altre cellule B e fusioni desiderate di cellule di mieloma con cellule B (ibridomi). Le condizioni di coltura devono permettere la selezione solo degli ibridi!

Vie metaboliche e selezione in terreno HAT

La selezione mediante HAT dipende dal fatto che nelle cellule di mammifero la sintesi di nucleotidi avviene attraverso due principali vie metaboliche: la via de novo e la via di salvataggio.

• Via de novo: consente di sintetizzare dNTPs a partire da aspartato (→ dATP, dGTP) e glutammato (→ dCTP, dTTP) in presenza di fosfato attivato. Diverse reazioni che portano alla formazione dei dNTP possono essere bloccate in presenza di aminopterina, un analogo del diidrofolato.
• Via di salvataggio: la prima converte l'ipoxantina in IMP tramite l'enzima ipoxantina-guanina-fosforibosil transferasi (HGPRT); la seconda converte la timidina in dTMP tramite l'enzima timidina chinasi (TK).

Comportamento delle cellule in terreno HAT

In un terreno di coltura HAT (così chiamato per i suoi tre componenti H= ipoxantina, A= aminopterina, T= timidina), le cellule di mieloma (HGPRT- e TK-) muoiono in quanto prive dei geni per gli enzimi HGPRT e TK, e quindi impossibilitate a utilizzare la via di salvataggio.

Le cellule B sarebbero in grado di sopravvivere in terreno HAT (in quanto HGPRT+ e TK+), ma non possono sopravvivere a lungo in vitro poiché sono "mortali". Pertanto, vengono perdute nel corso della coltura. Le uniche cellule in grado di sopravvivere sono quelle che derivano dalla fusione tra una cellula di mieloma e una cellula B, in quanto possono utilizzare i normali geni.