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Immunologia

Appunti di Immunologia e patologia generale basati su appunti personali del publisher presi alle lezioni della prof. Granucci dell’università degli Studi di Milano - Unimi, facoltà di Scienze matematiche fisiche e naturali, Corso di laurea in scienze biologiche. Scarica il file in formato PDF!

Esame di Immunologia e patologia generale docente Prof. F. Granucci

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catena pesante che la catena leggera hanno 3 regioni CDR che rappresentano il sito di legame per

l’antigene. Ciascuna immunoglobulina presenti sulla superficie delle cellule B sono bivalenti.

La papaina e la pepsina sono state utilizzate per analizzare le immunoglobuline. La papaina taglia

sopra i punti di solfuro delle due catene pesanti e sotto i ponti di solfuro che tengono unite la catena

pesante e la catena leggera. Ne derivano due frammenti:

frammento cristallizzabile Fc: porzione di catene pesanti che si trova

1. al di sotto dei ponti di solfuro

frammento anticorpale Fab mono: porzione che contiene il sito di

2. legame per l’antigene.

Invece, la pepsina tagli sotto i ponti di solfuro e i frammenti Fab rimangono legati, formando F(ab) 2

Il complesso antigene-anticorpo si chiama

immunocomplesso. Le regioni interposte tra le

regioni ipervariabili sono dette framework.

Gli anticorpi riconoscono una superficie

dell’antigene molto ampia e la legano con una

superficie di complementarietà. La regione

dell’antigene riconosciuto dall’anticorpo si

chiama epitopo o determinate antigenico.

Le interazioni antigene anticorpo sono interazioni

non-covalenti ad altissima affinità ed è

difficilmente spiazzabile, se non scendendo a pH

molto acidi. Se due anticorpi sono specifici per la

stessa proteina, non significa che sono uguali, ma

potrebbero riconoscere epitopi diversi. L'interazione tra un antigene e un anticorpo può essere molto

forte e tuttavia tutte le forze coinvolte sono considerate relativamente deboli. Come possono legami

deboli ad idrogeno, attrazioni elettrostatiche, forze idrofobiche e interazioni di van der Waals

portano ad una elevata affinità? Il contatto tra antigene e anticorpo si verifica su un'ampia

superficie, consentendo interazioni multiple deboli che danno una forte affinità. I legami ad

idrogeno uniscono l'anticorpo all'antigene su un'ampia superficie. Altre forze deboli, comprese le

forze di van der Waals, le attrattive elettrostatiche e le forze idrofobiche, aumentano la forza e la

specificità dell'anticorpo / antigene

La maggior parte degli antigeni contiene epitopi diversi che vengono riconosciuti da anticorpi

policlonali. Gli anticorpi diretti contro un singolo epitopo sono detti monoclonali. Epitopi

determinati fa una sequenza amminoacidica si chiamano di sequenza, mentre se gli epitopi che

sono generati dall’assunzione da parte delle proteine della sua struttura secondaria o terziaria si

definiscono di conformazione; di questi, solo i primi sono in grado di permanere anche quando la

C’è da precisare che eventualmente, denaturando, possono generare altri

proteina viene denaturata.

epitopi, dal momento che vengono esposte zone che prima erano nascoste all’interno della proteina.

Un antigene che presenta ripetizioni multiple di uno stesso epitopo si dice multivalente.

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Affinità e avidità

Un anticorpo che è tanto affine per un antigene lo lega

fortemente. Pertanto l’affinità è la forza di legame tra antigene

e anticorpo. Un determinato effetto biologico si può ottenere

con una determinata affinità ma non solo. Si sono inventati un

altro parametro: l’avidità, che è la forza complessiva

dell’interazione tra l’antigene e l’anticorpo. Ci sono anticorpi che quando vengono secreti, vengono

secreti in forma pentamerica, presentando dieci siti di legame per l’antigene. L’avidità è la misura

della forza complessiva tra l’antigene e l'anticorpo che prende in considerazione l’affinità, che il

numero di interazioni. L’effetto biologico è determinato dall’avidità. I monomeri hanno un’affinità

superiore rispetto a quelli che vengono secreti come pentameri.

Specificità e cross-reattività

La specificità si riferisce alla capacità di un anticorpo di reagire con uno specifico antigene. Gli

anticorpi possono essere anche cross-reattivi, ossia riconoscere antigeni diversi (epitopi diversi su

antigeni diversi). In genere tali epitopi sono conservati.

I determinanti antigenici riconosciuti da un anticorpo sono spesso simili.

Classi di anticorpi

Esistono 5 classi di anticorpi (immunoglobuline):

• IgA: sono divide in due

sottoclassi (IgA1 e IgA2),

sono secreti sia come

monomeri sia come dimeri.

Sono la classe principale di

anticorpi secreti nella saliva,

nelle lacrime, nel latte, nel

tratto respiratorio e

nell’intestino.

• IgD: sono immunoglobuline di membrana, non sono secrete mai. Sono prodotti da cellula B

di riposo la loro funzione è sconosciuta.

• IgE: sono coinvolti nella difesa contro i parassiti multicellulari, sono monomeri ma si

associano ai mastociti. Legano antigeni che sono responsabili delle risposte allergiche.

• IgG: sono divide in 4 sottoclassi (IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4), sono secreti come monomeri.

Vengono prodotti durante la risposta immunitaria secondaria. È la classe maggiormente

secreta nel sangue e attiva il sistema del complemento. Si lega ai macrofagi e ai neutrofili

inducendo la fagocitosi. Sono gli unisci anticorpi in grado di passare dalla madre al feto

attraverso la placenta e vengono anche secreti nel latte materno.

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• IgM: sono secreti come pentameri. Sono i primi anticorpi prodotti dalle cellule B, sono

legati alle membrane e successivamente secreti nel circolo sanguigno durante la risposta

primaria. Sono attivati dal sistema del complemento.

Tutte le immunoglobuline possono esistere come recettori transmembrana dell’antigene o come

anticorpi secreti. è determinato dalla catena pesante dell’immunoglobulina. La classe viene

La classe dell’anticorpo

anche definita come isotipo. La porzione variabile è definita anche idiotipo, che è il sito di legame

per l’antigene.

Si ritiene che la polimerizzazione delle immunoglobuline sia

importante per il legame dell’anticorpo a epitopi ripetuti. Una

molecola di anticorpo ha almeno due siti di legame per l’antigene

identici, ognuno dei quali ha una data affinità, o forza di legame,

per l’antigene. Se l’anticorpo si lega ad epitopi identici multipli su

un bersaglio antigenico, si dissocerà solo quando tutti i siti di

legame saranno dissociati. La velocità di dissociazione dell’intero

anticorpo sarà quindi molto più lenta della velocità di dissociazione

di un singolo sito di legame; così molti siti di legame danno

all’anticorpo una forza di legame, o avidità, complessiva maggiore.

Quanto detto è importante soprattutto per le IgM pentameriche, che

possiedono 10 siti di legame per l’antigene. Spesso gli anticorpi

IgM riconoscono epitopi ripetuti come quelli sulla parete cellulare

polisaccaridica dei batteri, ma i singoli siti sono spesso di bassa affinità perché l’IgM sono

sintetizzate presto durante la risposta primaria, prima che avvenga l’ipermutazione somatica e

maturi l’affinità. A questo pongono rimedio i molti siti di legame, con i quali si ottiene un netto

aumento della forza di legame. 16

La generazione della diversità

Il repertorio anticorpale, o repertorio delle immunoglobuline, è dato da tutte le specificità

in un individuo; nell’uomo il loro numero totale è almeno di 10 11

anticorpali disponibili . La

variabilità delle immunoglobuline è altissima. Il numero delle possibili differenti specie (idiotipi) di

anticorpi è 100 miliardi. Cioè circa 5 volte superiore al numero delle basi nucleotidiche che

compongono il genoma umano. Pertanto è da escludere la presenza di 100 miliardi di geni. La

diversità è dovuta a meccanismi di ricombinazione interni al locus genico delle immunoglobuline.

I segmenti di DNA all’interno dei geni delle immunoglobuline sono riarrangiati nelle cellule B, ma

non in tutte le altre cellule. Questo tipo di riarrangiamento è detto ricombinazione somatica. Gli

idiotipi si generano attraverso eventi di ricombinazioni non-omologa di segmenti genici presenti nel

locus della catena pesante e della catena leggere delle immunoglobuline.

I segmenti genici delle immunoglobuline da cui derivano

ciascuna delle catene sono organizzati in tre gruppi o loci genici:

κ, λ e il locus per le catene pesanti, ciascuno dei quali può

assemblarsi a formare una sequenza completa codificanti per la

regione V. Ogni locus è su un cromosoma diverso e ha

un’organizzazione leggermente diversa. I segmenti dei geni

umani V possono essere raggruppati in famiglie; i componenti di

almeno l’80% della sequenza

ciascuna famiglia condividono

genica. Le regioni che vanno incontro a ricombinazione sono

lunghe centinaia di kilobasi; per quanto riguarda le catene

leggere sono composte da circa 40 segmenti V, 5 segmenti J la porzione che codifica per la porzione

costante; per quanto riguarda la catena pesante, invece, ho oltre alla quarantina di segmenti V, circa

25 segmenti D e 6 segmenti J, e a valle l regioni che codificano per le porzioni cotanti (per le IgM,

IgD, IgG, IgA, IgE).

L’intera sequenza della regione V, o dominio V, della catena pesante o leggera di una

immunoglobulina, è codificata in più segmenti genici. Il dominio V della catena leggera è codificato

da due segmenti separati di DNA. Il primo codifica i primi 95-101 aminoacidi ed è chiamato

segmento variabile, o segmento genico V. La parte rimanente (13 aminoacidi) è codificata dal

secondo segmento, detto segmento di legame o segmento genico J.

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L’unione dei segmenti genici V e J crea un esone che codifica per l’intera regione V della catena

leggera, nella sua porzione variabile. Nel DNA non riarrangiato i segmenti genici V sono localizzati

piuttosto lontani dalla regione C, i segmenti genici J sono invece vicini alla regione C, quindi

l’unione di un segmento V con un segmento genico J porta il segmento V vicino al segmento C. Il

segmento J della regione V riarrangiata è separato dalla sequenza C solo da un breve introne.

La sequenza della regione V della catena pesante è codificata da tre segmenti genici. Oltre ai

segmenti V e J vi è un terzo segmento detto segmento genico D, o della diversità, localizzato fra i

segmenti V e J. Non tutti i segmenti genici scoperti sono funzionali; alcuni hanno accumulato

mutazioni che non permettono loro di codificare delle proteine funzionali. Questi sono definiti

“pseudogeni”

Le regioni V si generano nell’individuo, non sono ereditabili.

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Riarrangiamento dei geni V, D e J

Per assicurare la completa espressione di una catena delle immunoglobuline è necessario che i

riarrangiamenti del DNA avvengano nei punti giusti rispetto alle sequenze codificanti dei geni V, D

o J. I riarrangiamenti del DNA sono guidati da sequenze conservate di DNA non codificante,

adiacenti al punto in cui avviene la ricombinazione: esse sono chiamate sequenze segnale di

ricombinazione RSS, che sono costituite da eptameri e nonameri, separati da uno spaziatore di 23

o 12 coppie di basi non conservati. Gli eptameri sono sempre vicini alle regioni codificanti. Nella

catena pesante, le sequenze segnale della ricombinazione sono sempre vicine alle sequenze V e J.

Di norma la ricombinazione avviene unicamente fra geni posti sullo stesso cromosoma.

Un gene, fiancheggiato da una RSS

con uno spaziatore di 12 paia di basi,

può di regola essere congiunto solo

con uno che sia fiancheggiato da una

RSS con uno spaziatore di 23 bp.

Questa è nota come la regola 12/23.

Quindi nella formazione di una

catena pesante, un gene D può essere

legato a un gene J e il segmento

genico V ad un segmento D, ma V

non può essere legato direttamente a

J, poiché entrambi i segmenti genici V e J sono fiancheggiati da spaziatori di 23 bp e il segmento

genico D ha, in entrambi i lati, degli spaziatori da 12bp.

Molto spesso, i due segmenti sottoposti a

riarrangiamento (in questo esempio i segmenti

genici V e J) presentano lo stesso orientamento

trascrizionale sul cromosoma e la

giustapposizione delle RSS fa in modo che il

DNA interposto formi un loop. La

ricombinazione fa in modo che le estremità

delle sequenze eptameriche delle RSS, la quale

crea la chiamata di unione del segnale e libera il

DNA interposto a forma di cerchio.

Successivamente, l’unione dei segmenti genici

V e J crea l’unione codificante nel DNA

cromosomico. In altri casi i segmenti genici V e

J inizialmente sono orientati in direzione

trascrizionalmente opposte. Unire le RSS, in

questo caso, richiede che il DNA formi un loop

più complesso. Unire le estremità delle due

sequenze eptameriche porta all’inversione e

all’integrazione del DNA interposto in una nuova posizione nel cromosoma. L’unione dei segmenti

V e J crea un esone della regione V funzionale. 19

Vi sono anche riarrangiamenti non produttivi, che creano codoni di stop, e che vanno eliminati,

non essendo funzionali; la ricombinazione prosegue finché non se ne trova una giusta, oppure se la

cellula non genera mai un riarrangiamento codificante essa muore.

Il meccanismo di riarrangiamento del DNA è simile per i loci delle catene pesanti leggere, anche se

per creare il gene per la catena leggera è necessario un solo evento di ricombinazione, mentre ne

servono due per il gene delle catene pesanti. Quando due

segmenti genici possiedono lo stesso orientamento nel DNA,

il riarrangiamento consiste nella distensione e nella delezione

del DNA compreso fra loro, ma se i segmenti genici hanno

orientamento opposto, rispetto alla sequenza trascritta,

questo DNA interposto va incontro a un destino diverso. Il

DNA interposto è trattenuto nel cromosoma con un

orientamento invertito. Questa modalità di ricombinazione è

meno frequente, sebbene rappresenti la modalità con cui

avvengono circa la metà di tutte le unioni V e J, perché

nell’uomo circa la metà dei segmenti dei geni V possiede un

orientamento opposto a quello dei segmenti genici J.

In ciascuna cellula B, dopo il riarrangiamento quel locus è

diverso.

Le sequenze RSS con gli spaziatori di 12 e 23 bp sono

congiunte grazie a delle proteine che riconoscono in modo

specifico la lunghezza degli spaziatori, a conferma della

regola 12/23 della ricombinazione. La molecola di DNA

viene quindi spezzata in due punti e ricongiunta in una

configurazione differente. Le parti terminali delle sequenze

eptameriche sono ricongiunte in modo preciso, testa a testa,

in modo da formare un segnale di giunzione; quando i

segmenti da ricongiungere possiedono lo stesso

orientamento, il segnale di giunzione rimane in frammento

circolare di DNA extracromosomico che verrà perso al

momento della divisione cellulare. I segmenti V e J rimasti

sul cromosoma si uniscono a formare quella che viene

definita la giunzione codificante. Nel caso del

riarrangiamento per inversione, anche il segnale di giunzione

è trattenuto nel cromosoma e la regione del DNA tra il

segmento V del gene e il RSS del segmento J del gene è

invertita per formare la giunzione codificante.

Il complesso enzimatico che è responsabile della

ricombinazione somatica V(D)J è chiamato V(D)J

ricombinasi. I componenti della ricombinasi specifici delle

cellule linfoidi sono chiamati RAG-1 e RAG-2.

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Due proteine, RAG1 e RAG2, si legano alle sequenze segnale della ricombinazione e portano vicini

due sequenze segnale della ricombinazione, un segmento V con un segmento J. Avviene un taglio a

doppio filamento, si forma una forcina e interverranno altri enzimi che apriranno altre forcine e

agiranno altri enzimi che ripareranno il DNA.

1. RAG1 e RAG2 si legano alle sequenze segnale della ricombinazione di un segmento V e di

un segmento J e li portano vicini. Ciò avviene in maniera casuale.

2. Il complesso RAG1 e RAG2 taglia il DNA, un taglio a doppio filamento e il DNA viene

richiuso portando alla formazione di una forcina (tramite un ponte fosfodiesterico).

3. La forcina viene aperta, si verificherà un taglio a singolo filamento che apre la forcina, sia a

livello del segmento D che a livello del segmento J. Si formano dei nucleotidi palindromici

P.

Si hanno dei 3’OH liberi

4. e interviene una polimerasi TdT (terminal deossi nucleositil

transferasi), la quale aggiunge nucleotidi in maniera casuale e allunga tali sequenze.

5. I due filamenti, se trovano nucleotidi complementari, si appaiano

L’apparato che ripara il DNA interviene: DNA

6. polimerasi proofreading agiscono e i

nucleotidi non appaiati vengono liberati e le polimerasi sintetizzeranno le basi che mancano.

Tale regione prende il nome di nucleotidi N.

Vi sono molte copie di segmenti genici V; D; e J, ognuna delle quali può contribuire alla

formazione di una regione V delle immunoglobuline. Quindi si possono generare molte regioni V

diverse scegliendo differenti combinazioni di questi segmenti

Il sito di legame per l’antigene sarà dato da un appaiamento della pesante con la leggera. Ci sono

diversi livelli di eventi variabili che generano la variabilità. Il trascritto primario avrà il

riarrangiamento VDJ e una serie di segmenti che non hanno riarrangiato e ci saranno gli esoni e

introni che codificano per la costante. Successivamente gli introni saranno eliminati in modo da

generare il messaggero che codifica per la catena pesante.

Nel locus della catena leggere possono avvenire riarrangiamenti successi fino a quando non si

ottengono dei riarrangiamenti produttivi.

catena pesante vi è solo un’unica possibilità di riarrangiamento, in quanto non si

Nel locus della

hanno più D a disposizione.

Forme transmembrana e secrete di immunoglobuline

Immunoglobuline di qualsiasi classe possono essere prodotte sia come recettori legati alle

membrane sia come anticorpi secreti. Tutte le cellule B esprimono inizialmente la forma

transmembrana delle IgM; dopo la stimolazione con l’antigene alcune di esse si differenziano in

plasmacellule che producono la forma secreta della IgM, mentre altre subiscono lo scambio di

classe per esprimere immunoglobuline transmembrana di una classe differente, seguito dalla

produzione di un anticorpo secreto dalla nuova classe.

Nella forma associata alla membrana, la catena pesante dell’immunoglobulina possiede un dominio

transmembrana idrofobico nella porzione carbossi-terminale, tramite il quale è ancorata alla

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superficie del linfocita B. Questo dominio transmembrana è assente nella forma secreta il cui

terminale carbossilico è costituito da una coda secretoria idrofila. Le due differenti porzioni carbossi

terminai delle forme transmembrana e secrete delle catene pesanti delle immunoglobuline sono

codificati in due modi differenti e la produzione delle due forme è ottenuta mediante processi di

Se il trascritto primario è tagliato e poliadenilato in un sito posto a

maturazione alterativi dell’RNA.

valle di questi esoni, la sequenza codificante la coda carbossi-terminale della forma secreta è

rimossa mediante splicing ed è prodotta la forma di immunoglobulina che risiede sulla superficie

cellulare. Alternativamente, se il trascritto primario è tagliato in prossimità del sito di

poliadenilazione localizzato prima degli ultimi due esoni, può essere prodotta unicamente la forma

secreta.

Nelle cellule B attivate che si differenziano per diventare plasmacellula secernenti anticorpi, la

maggior parte dei trascritti matura verso la forma secreta piuttosto che transmembrana,

indipendentemente dall’isotipo che la cellula B si appresta ad esprimere.

Fenomeno dell’esclusione allelica: il riarrangiamento produttivo della catena pesante su un

cromosoma blocca il riarrangiamento sull’altro cromosoma. Si verifica nel 70% dei casi. Nel 30%

dei casi la catena pesante può riarrangiare sia sul cromosoma paterno che sul cromosoma materno,

di conseguenza sulla superficie della cellula B potranno essere espressi due anticorpi diversi con

specificità diverse. 22

Diversificazione secondaria del repertorio degli anticorpi

In questa fase secondaria della diversificazione, che avviene a livello delle cellule B attivate, sono

imputati a maggior parte degli antigeni. La diversificazione si attua mediante tre meccanismi:

• Ipermutazione somatica: prende in

considerazione la regione V, dove vengono

inserite mutazioni puntiformi nella regione V di

entrambe le catene

• Conversione genica: diversifica il repertorio di

anticorpi primari di alcuni animali; rimpiazza i

blocchi di sequenze di regioni V per sequenze che

derivano da psudogeni.

• Cambio di classe o switch di classe: in questo

caso viene implicata solo la regione C, dove la

regione C della catena pesante Cμ originale per

una regione C alternativa, che aumenta la diversità funzionale del repertorio delle

immunoglobuline.

Tutti questi processi iniziano mediante un enzima chiamato AID, che procede alla deaminazione

delle citosine trasformandole in uracile, che espressa in maniera specifica nelle cellule B

La prima immunoglobulina che viene prodotta è sempre IgM nella risposta immunitaria. Più avanti

e portare all’espressione di

con la risposta immunitaria la stessa regione V può riassemblarsi

anticorpi IgG, IgA o IgE.

Il riarrangiamento VDJ viene a trovarsi nella regione vicina che codifica per le IgM.

Una volta che è avvenuto il riarrangiamento VDJ, si genererà il trascritto primario che andrà

incontro a maturazione e a splicing alternativi diversi, in quanto, si può notare, che i segnali di

poliadenialzione sono due. IgM e IgD sono le uniche immunoglobuline che possono essere

coespresse sulla superficie delle cellule B, poiché derivano da splicing alternativo primario. Il

trascritto primario che viene prodotto contiene sempre la regione che codifica per la regione delle

IgM e per le IgD. IgD è solo di membrana. 23 Il cambio di classe delle IgM si

verifica dopo che le cellule B

hanno stimolato l’antigene.

Questo tipo di ricombinazione

del cambio di classe, è un tipo di

ricombinazione del DNA non

omologa. Vicino alle regioni che

codificano per le costanti, ci

sono delle sequenze che si

chiamano regioni di switch. La

regione di switch delle IgM

viene portata vicina alla parte

che codifica per le IgA; viene

tagliato il DNA. La cellula non

potrà esprimere nessuna immunoglobulina se non IgA. La specificità non cambia perché VDJ

rimane lo stesso, quello che cambia è l’isotipo. Questi switch di classe sono indirizzati da segnali

esterni come citochine liberate dalle cellule T o segnali mitogeni somministrati dagli agenti

patogeni. Il fenomeno di switch isotipico (switch di classe) è un fenomeno irreversibile. Lo switch

per l’antigene però con diverse capacità effettrici.

di classe genera anticorpi con la stessa specificità

L’ipermutazione somatica non è mai stata osservata nei recettori funzionali delle cellule T. Processi

specifici delle cellule B, come la ricombinazione che porta allo scambio di isotipo, consentono alla

stessa regione V di attaccarsi a regioni C delle catene pesanti con diversa funzione e quindi creano

una diversità funzionale irreversibile. Al contrario, l’espressione di IgM o di IgD, o della forma

legata alla membrana rispetto a quella secreta per tutti i tipi di immunoglobulina, è teoricamente

regolata in maniera reversibile. 24

Specie diverse generano

la diversità

immunoglobulinica in

modi diversi

La maggior parte degli invertebrati che

conosciamo genera una gran parte della

dell’antigene

loro diversità di recettore

nello stesso modo dei topi e degli esseri

umani, mettendo insieme segmenti

genici in combinazioni diverse.

Tuttavia ci sono eccezioni anche tra i

mammiferi. Alcuni animali usano

all’inizio il riarrangiamento genico per

unire insieme sempre lo stesso

segmento genico V e J e poi

diversificano questa regione V

ricombinata. Il riarrangiamento della

linea germinale del locus della catena

pesante del pollo è un singolo gruppo

di segmenti genici V, J, D, e C che si riarrangiano e di copie multiple di pseudogeni del segmento V.

La diversità in questo sistema è creata dalla conversione genica, nella quale sequenze degli

pseudogeni V sono copiate nel singolo gene V riarrangiato. Nei cammelli invece gli anticorpi sono

fatti da una sola catena pesante, mantenendo comunque la variabilità, proprio perché sono molto

semplici, gli anticorpi dei cammelli sono anche moto utilizzati in biologia molecolari.

25

La distribuzione e le funzioni delle

classi immunoglobuliniche

• Idiotipo: regione che riconosce l’antigene (regioni variabili delle catene pesanti e leggere)

• Isotipo: dato dalla porzione costante delle catene pesanti

• Allotipo: polimorfismi che si trovano a livello della regione costante della catena pesante.

Gli anticorpi proteggono le superfici mucose dell’organismo, tessuti profondi e il sangue da tali

infezioni; questi anticorpi neutralizzano il patogeno e ne promuovono l'eliminazione prima che

possa indurre un'infezione importante. Anticorpi di differente classe isotipica sono adattati alla

funzione che devono svolgere nei diversi compartimenti corporei.

I primi anticorpi prodotti durante la risposta immunitaria umorale sono sempre le IgM, perché le

IgM posso essere espresse senza cambio di classe. Questi anticorpi IgM precoci sono prodotti prima

B subiscano l’ipermutazione somatica e quindi sono di bassa affinità. A causa delle

che le cellule

grandi dimensioni del pentamero, le IgM sono solitamente confinate nel sangue, e in misura minore

potenti nell’attivare il

nella linfa. La struttura pentamerica fa sì che le IgM siano particolarmente

complemento.

Le classi di immunoglobuline sono 5; vi sono anche sottoclassi: 4 per le IgG, 2 per le IgA. Le

catene leggere sono due, di tipo κ e λ (da 1 a 4), anche esse con sottoclassi. Classi e sottoclassi

hanno una localizzazione diversa e funzioni diverse. I diversi isotipi delle immunoglobuline hanno

funzione diverse.

Nel sistema immunitario

delle mucose, le

plasmacellule secernenti

le IgA si trovano

prevalentemente nella

lamina propria, che è

situata immediatamente

sotto la membrana

basale di molti epiteli.

Di qui gli anticorpi IgA

devono essere trasportati

attraverso l’epitelio sulla

superficie esterna, per

esempio nel lume

dell’intestino o dei

bronchi. Le IgA

sintetizzate nella lamina

propria sono secrete

come dimeri ai quali è associata una catena J singola. Questa forma polimerica di IgA si lega

specificamente a un recettore denominato recettore polimerico dell’immunoglobulina (pIgR),

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espresso sulla superficie basolaterale delle cellule epiteliali. Dopo il legame fra il pIgR e la IgA

dimerica, il complesso è internalizzato e trasportato attraverso il citoplasma della cellula epiteliale

all’interno di una vescicola fino alla superficie apicale. Il processo è chiamato transcitosi.

Il dominio extracellulare tagliato del pIgR è conosciuto come componente secretorio. Il componente

secretorio è legato alla parte della regione Fc di IgA che contiene il sito di legame per il recettore

Fcɑ, e per questo motivo la IgA secretoria non si lega a questo recettore.

I siti principali di sintesi e secrezione

dell’IgA sono: l’intestino, l’epitelio

respiratorio, la ghiandola mammaria

durante l’allattamento ed altre

ghiandole esocrine, quali le salivari e

le lacrimali. Legando batteri,

particelle virali e tossine, gli anticorpi

l’attacco dei batteri o

IgA prevengono

delle tossine alle cellule epiteliali e

l’assorbimento di tossine; quindi

costituiscono una linea di difesa

contro una grande varietà di patogeni.

I neonati sono particolarmente vulnerabili dalle infezioni, non

essendo stati precedentemente esposti ai microbi durante la vita

intrauterina. Le IgA secrete nel lume materno giungono nel lume

intestinale del neonato dove svolgono un ruolo protettivo verso i

batteri che il bambino incontra per la prima volta fino a che

crescendo, sintetizza le proprie IgA. Le IgA non sono le sole

immunoglobuline trasferite dalla madre al bambino. Le IgG

materne sono trasportate attraverso la placenta direttamente nel

circolo ematico del feto durante la vita extraeuterina. I neonati

hanno concentrazioni plasmatiche di IgG comparabili a quelle della

madre e gli anticorpi sono di specificità identica. Il trasporto

selettivo delle IgG dalla madre al feto è dovuto alla presenza nella

placenta di una proteina trasportatrice specifica, FcRn (recettore Fc

neonatale), che è strettamente correlata strutturalmente alle

molecole MHC di classe I. due molecole di FcRn legano una IgG e

la trasportano attraverso la placenta. Le IgG materne sono anche ingerite dal neonato attraverso il

è un fluido ricco di proteine secrete precocemente dalla

latte o il colostro materno, quest’ultimo

ghiandola mammaria. FcRn è presente anche negli adulti e la sua funzione è quella di mantenere i

livelli di IgG nel plasma; questa funzione è svolta legando gli anticorpi, catturando per endocitosi, e

in seguito riciclandoli nel sangue, quindi prevenendone l’escrezione dal corpo.

Funzioni intrinseche degli anticorpi

Molti batteri inducono effetti patologici tramite la secrezione di molecole denominate tossine

batteriche, che danneggiano la funzione delle cellule somatiche. Per indurre questi effetti, le tossine

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devono interagire con una

molecola specifica che

funge da recettore sulla

superficie della cellula

bersaglio. In molte

tossine il dominio che

lega il recettore è su una

catena peptidica, ma la

funzione tossica è portata da una seconda catena. Gli anticorpi che si legano al sito che lega il

recettore sulla molecola della tossina possono evitare che la tossina si leghi alle cellule e così

proteggono la cellula dall’attacco. Gli anticorpi che operano in questo modo per neutralizzare le

tossine sono definiti anticorpi neutralizzanti.

La maggior parte delle tossine agisce a dosi di nanomoli una sola molecola di tossina difterica può

uccidere una cellula. Per neutralizzare le tossine, quindi gli anticorpi devono poter diffondere nei

tessuti e legare rapidamente con alta affinità la tossina.

Molti anticorpi che neutralizzano i virus agiscono grazie alla loro capacità di inibire il legame del

virus con i recettori di superficie. Tuttavia, la neutralizzazione del virus si osserva anche nel caso

che una singola molecola di anticorpo leghi la particella virale che possiede molte proteine che

legano i recettori cellulari. In questi casi si pensa che l’anticorpo causi qualche cambiamento che

altera la struttura del virus, e previene la penetrazione, o interferisce nella fusione della membrana

virale con quella della cellula dopo che il virus è venuto a contatto con la cellula bersaglio.

Molti batteri possiedono specifiche molecole di superficie, denominate adesine, che ne permettono

‘adesione alla superficie delle cellule dell’organismo.

28

Un altro modo per mezzo del

quale gli anticorpi possono

proteggere dalle infezioni è

attraverso l’attivazione del

l’attivazione

complemento.

del complemento procede

attraverso una cascata di

reazioni di tagli proteolitico,

nelle quali le proteine

inattive del complemento,

presenti nel plasma, sono

tagliate in modo da formare

proteasi che poi tagliano e

attivano l’enzima successivo

nella serie. Tre processi di

attivazione del complemento

convergono per rivestire le

superfici del patogeno o i

complessi antigene:anticorpi

con il frammento C3b del complemento.

L’attivazione della via classica del complemento è indotta dal legame di C1q all’anticorpo su una

superficie come una superficie batterica. Quando una molecola di IgM lega parecchi epitopi identici

sulla superficie di una patogeno, è piegata nella conformazione “a staffa! Che permette alle teste

globulari di C1q di legarsi ai suo frammenti Fc. Molecole multiple di IgG legate sulla superficie di

un patogeno permettono il legame di una singola molecole di C1q a due o più frammenti di Fc In

entrambi i casi, il legame C1q attiva il C1r associato, che diventa un enzima attivo che taglia il

proenzima C1s, generando una serina proteasi e attiva la cascata classica del complemento.

Gli anticorpi hanno funzioni intrinseche, sono in grado di riconoscere tossine e isolarle, e attivare la

fagocitosi per eliminazione della tossina. lo stesso avviene se è presente un patogeno: questo viene

coperto, opsonizzazione, e quindi isolato. Il complemento può avvenire attivato nel sangue e

permettere la eliminazione di tossine. Ci sono tanti microorganismi che sono definiti patogeni

perché producono patogeni: tetano, difterite, cancrena, antrace e botulino.

La loro capacità specifica è di riconoscere gli antigeni specifici. Gli anticorpi sono in grado di

isolare le tossine. Le tossine sono in grado di legarsi a dei recettori i quali permettono l’entrata nella

cellula. L’anticorpo è in grado di separare le tossine dall’organismo. Buona parte dei vaccini che

vengono fatti sono contro la tossina e non contro il patogeno.

Funzioni effettrici degli anticorpi

Gli anticorpi non solo devono riconoscere l'antigene, ma devono anche invocare delle risposte -

funzioni effettrici- che rimuoveranno l'antigene e uccideranno il patogeno. Le regioni variabili

29

degli anticorpi sono gli unici agenti di legame all'antigene. La regione costante (CH) della catena

pesante è responsabile delle interazioni con altre proteine (ad es. quelle del Complemento), cellule

(elementi del sistema immunitario innato) e tessuti che determinano le funzioni effettrici della

risposta umorale. FcR riconosce la porzione Fc degli anticorpi non antigeni. FcR interagiscono con i

CH3 dell’immunoglobuline.

domini CH2 e Tra le varie proteine del complemento vi

è la C3b. In condizioni di piccoli antigeni

è necessario che si formino dei complessi

ossia immunocomplessi, che possono

venir riconosciuti dalle proteine del

complemento C1q. Il riconoscimento

della C1q permette l’attivazione di tutte

le proteine del complemento, tra queste

la C3b. Le proteine C3b vengono

riconosciute dal recettore CR1 presente

sugli eritrociti, permettendo così di

raggiungere la milza e il fegato. In questi

tessuti i fagociti rimuovono gli

immunocomplessi tramite gli FcR.

Il batterio, quando viene oxonizzato,

attiva il complemento, il quale si lega

al patogeno e la cellula è in grado di

riconoscere tutto il complesso tramite

le FcR e si attiva la fagocitosi. Nel

processo di fagocitosi vengono

attivati i lisosomi e che procedono

alla degradazione del batterio.

Il legame tra la Ig e l’FcR è quello

che determinata la funzione effettrice

dell’anticorpo. Il recettore si lega a

CH2 CH3. La componente Fc è la

dell’anticorpo.

componente costante

Esistono diverse classi di recettori: esistono le FcRgamma, le FcRespsilon, FcRalfa e le FcRalfamu.

Diversi recettori in grado di riconoscere Ig diverse, sono espressi in tipi cellulari diversi.

L’FcR non lega gli anticorpi liberi, soltanto delle aggregazioni delle Ig son in grado di essere

riconosciuti da cluster di recettori.

Le natural killer hanno la funzione di uccidere le cellule del nostro organismo, come nel caso di

cellule infettate da virus. Gli anticorpi riconoscono degli antigeni sulla superficie cellulare, le NK,

tramite dei recettori specifici, riconoscono l’antigene sulla superficie, la NK si attiva e uccide la

cellula. 30

IgM vita media di 5-10 giorni

• 10% nel siero

• sono la classe che principalmente è in grado di attivare il complemento

• sono in grado di interagire con le altre cellule, ma soltanto tramite i recettori C3b

• sono in grado di attraversare gli epiteli, ma non sono in grado di attraversare la placenta

• hanno due forme: una monomerica e una pentamerica che è quella più efficiente.

IgD vita media di qualche giorno

• meno dell’1% nel siero

• interagiscono con le cellule T

• non sono in grado di passare la placenta

IgA non sono in grado passare la placenta

• presentano hinge region

• non sono in grado si attivare infiammazione, attivano cross-linking

• riconoscono le cellule epiteliali e per questo riescono ad andare nel lume degli organi cavi

• vanno nel latte.

• Le IgA vengono secrete come dimeri, i quali vengono riconosciuti dai recettori che ne

promuove l’internalizzazione e la fuoriuscita nel lume.

IgE emivita di qualche giorno

• non sono in grado di attivare il complemento

• sono in grado di legarsi ai recettori presenti sulle cellule mast, eosinofili e sono in grado

di legarsi a bassa affinità nelle cellule B

• non vanno al feto

• sono completamente assorbite dai recettori ad alta affinità nelle cellule effettrici.

IgG Emivita lunga

• 60-70% nel siero

• attivano il complemento

• attivano macrofagi

• attraversano la placenta 31 • Neutralizzazione: legarsi

al patogeno e isolarlo. Le

IgM sono deboli nella

funzione di neutralizzazion

(perché sono a bassa

affinità, mentre sarebbe

opportuno aver un’alta

affinità per far si che il

legame non sia

spiazzabile), che è

essenzialmente dovuta alle IgG più efficienti; anche le IgA sono in grado di neutralizzare.

• Opsonizzazione: IgG, risposta infiammatoria. Anche in questa funzione le IgM non sono

anticorpi particolarmente efficaci; le IgG invece sono in grado di oposonizzare in maniera

efficiente

• Sensitizzazione cellule mast: IgE

• Attivazione del complemento: IgG e IgM

• Sensitizzazione per uccidere cellule NK: operata dalle IgG, per cui la porzione costante le

Nk hanno recettori.

Anticorpi monoclonali

Per ottenere un anticorpo monoclonale, che identifichi uno specifico epitopo, occorre separare le

cellule e fonderle con cellule di mieloma, in modo da renderle immortali. Con successiva diluizione

clonare si deve cercare di ottenere singole cellule.

Gli anticorpi monoclonali sono anticorpi di estrema purezza, provengono da un unico clone

iniziale di plasmacellule, perché tutti gli anticorpi andranno a riconoscere un unico specifico

epitopo. Sono prodotte dal sistema immunitario e sono in grado di riconoscere un unico specifico

epitopo del mio antigene di interesse. Essi vengono utilizzati in molte applicazioni: clinica, terapia,

ricerca.

• Capacità di poterli utilizzare come strumento per misurare livelli proteici di farmaci o

droghe in campioni di siero.

• Possono essere utilizzati per typing di tessuti o campioni sanguigni a livello di istologia o

istopatologia.

• Test per identificare agenti infettivi

• Possono servire per identificare determinati tipi cellulari (es. come le CD)

• Possono essere usati per identificare cellule tumorali o altri anticorpi.

• Definire e determinare le varie cellule del sistema immunitario

• quantificare i livelli ormonali 32

• Magic bullets

Gli anticorpi monoclonali furono scoperti nel 1975 da Kohler e Milstein. Fusero due leucociti, che

fossero in grado di essere immortali e producessero specifici anticorpi. La loro scoperta fu messa in

atto solo anni dopo, quando iniziarono a produrre in quantità industriali anticorpi monoclonali nella

ricerca. Immunizzare animale da laboratorio (topo, coniglio,

1. ratto)

2. in seguito ad immunizzazione si ha una risposta

anticorpale nell’animale

l’animale con un’ulteriore dose di

3. si ri-immunizza

vaccini

si preleva la milza dall’animale e si prelevano i

4. linfociti

5. i linfociti vengono fusi con una linea di mieloma

(cellule B che in seguito a mutazioni genetiche sono

diventate tumorali e non producono anticorpi, inoltre

tali cellule sono KO per un gene ipoxantina guanina

fosfotransferasi, enzima per la biosintesi di salvataggio

delle basi azotate)

si crea l’ibridoma (fusione tra plasmacellule e

6. mieloma)

7. si procede con diluizioni clonale in modo da ottenere

una cellula per ogni pozzetto (è una questione

statistica)

prima iniezione dell’antigene: creazione di un pool di cellule

B che producono anticorpi d’interesse. Si procedono con varie

iniezioni in modo da aumentare il titolo anticorpale (il numero

di anticorpi presenti nell’animale).

Ibridoma

sono linfociti B mutati in oncogene in modo tale da essere

immortali, non andando in contro ad apoptosi. Si sfruttano le

cellule di mieloma, fondendo le cellule spleniche con quelle

di mieloma tramite PEG che permeabilizza e rende più lassa la membrana cellulare delle cellule

oppure attraverso metodi fisici attraverso una stimolazione elettrofisica. Si otterranno tutte le

combinazioni del caso. Per ottenere esclusivamente l’ibridoma si fanno cresce in un terreno HAT e

cresceranno solo le cellule che manca HPCRT. Quando si è sicuri di avere in cultura solo cellule di

ibridoma, si procede con un saggio funzionale per vedere dove viene prodotto l’anticorpo.

Procedendo con una diluizione clonale si dovrebbe ottenere una cellula per pozzetto in modo da

identificare cellule di ibridoma. 33

Terreno HAT

è un terreno in cui sono presenti:

1. ipoxantina

2. aminopterina: blocca la sintesi sia delle purine che della timidina

3. timidina

L’amminopterina blocca la biosintesi delle purine e la formazione della timina e le cellule B

muoiono perché hanno una vita limitata; le cellule di mieloma muoiono perché l’aminopterina

blocca il pathway di biosintesi degli acidi nucleici. HGPRT è il gene che serve per il salvataggio

delle purine che parte dall’ipoxantina. Per continuare con la biosintesi della timina si aggiunge

timidina

La presenza di queste 3 sostanze permette di far morire le cellule di mieloma e rimangono in vita

solo le cellule di ibridoma e le cellule B.

• Immunogeno: qualunque sostanza in grado di scatenare una risposta immunitaria, che non

per forza deve essere riconosciuto dall’anticorpo.

◦ proteine solubili

◦ proteine insolubili

◦ peptidi sintetici

◦ carboidrati

◦ cellule interessanti

◦ acidi nucleici

• Antigene: qualsiasi sostanza che può legare uno specifico anticorpo (proteine, carboidrati,

acidi nucleici, molecole organiche). l’anticorpo lega l’epitopo dell’antigene. Anche se

praticamente ogni struttura può essere riconosciuta da un anticorpo come antigene,

normalmente solo le proteine sono in grado di indurre una risposta immunitaria completa.

• Determinanti antigenici: epitopi

prima iniezione dell’antigene

• Priming: somministrazione ripetuta dell’antigene

• Boosting:

• immunizzazione (vaccinazione): induzione di una risposta immunitaria

una volta riconosciuto l’antigene subiscono una

• cellule della memoria: cellule T che

mutazione e vivono più a lungo.

Anche se praticamente ogni struttura può essere riconosciuta da un anticorpo come antigene,

normalmente solo le proteine sono in grado di indurre una risposta immunitaria completa.

Immunofluorescenza: anticorpo che nella porzione Fc presenta un fluorocoromo.

34

Saggio ELISA

Elisa è un tipo di analisi di unione diretta di un anticorpo (o antigene). Solitamente si usa per

diagnosi di tipo virale. Si richiede un preparato di antigene o anticorpo puro. Un enzima lega

l’anticorpo e la parate non marcata, cioè l’antigene, si fissa ad un supporto solido che assorbe una

certa quantità di qualsiasi proteina. Si lascia unire l’anticorpo marcato con l’antigene non marcato

qualsiasi anticorpo e proteina non uniti con un lavaggio. L’unione viene

in modo da poter eliminare

verificata grazie ad una reazione che converte un substrato incolore in un prodotto di reazione

colorato.

• elysa a sadwitch diretto: piastro con un anticorpo monoclonale che va ad identificare

l’antigene di interesse. Metto il campione nella piastra e l’antigene di interesse verrà legato

dall’anticorpo. Si aggiunge un altro anticorpo che riconosce un epitopo differente di

quell’antigene

• che si lega all’antigene e utilizzo un altro

elysa indiretto: si aggiunge anticorpo monoclonale

anticorpo che lega la porzione Fc del primo anticorpo.

La tossina difterica, come meccanismo d’azione va a bloccare l’elongation factor, che serve per la

sintesi proteica, a livello ribosomiale. Si può legare un anticorpo con la tossina difterica e lo si

inietta, in modo che andrà a legarsi con le cellule che esprimono l’antigene di interesse. La tossina

libera nel citoplasma libera EF2 e blocca la traduzione di mRNA a proteina, si potrà uccidere solo le

che esprimono l’antigene (tumorale).

cellule

Linfoma

Cellule T che crescono in modo spropositato e si formano aggregati a livello linfonodale o splenico.

Per eliminare tali cellule, si prelevano talli cellule e fonderle con cellule di mieloma e selezionare

gli ibridomi. Si immunizza un topo con gli anticorpi prodotti dall’ibridoma, si avrà la produzione di

un repertorio policlonale di anticorpi che verranno inseriti nel paziente. Si eliminano gli ibridomi

che producono anticorpi contro l’isotipo, in quanto si vogliono selezionare gli anticorpi contro

l’idiotipo, che sono gli anticorpi che riconoscono l’epitopo.

HER-2

è un recettore di membrana che lega le EGF e ne induce la proliferazione. 1/3 dei tumori alla

mammella sono dovuti ad una over espressione di HER-2. Utilizzando un anticorpo monoclonale, si

riconosce HER-2 bloccando la sua attivazione da EGF.

Anticorpi monoclonali chimerici

le cellule del linfoma hodgkin

• immunizzo animale con cellule B che esprimono CD20

• produzione di ibridomi che producono CD20

• isolo i geni per le immunoglobuline

• prelevo ecdr e clono a livello dei frammenti genici umani

• clono i geni della catena pesante e leggera con geni murini CD20

35

• produzione di un plasmide

• si otterranno anticorpi con catena pesante e leggera umani, mentre le zone che riconoscono

l’epitopo provengono dall’ibridoma murino

Produzione di Xenomouse

• prelevare le cellule staminali embrionali di topo KO, senza i geni per i miniloci delle catene

pesanti e leggere delle Ig

• aggiungo i miniloci umani

• transfetto

• re-inietto le cellule in blastocistiz che andranno a comporre sia la linea somatica che

germinale della chimera

• nasce topo chimerico

• si procede ad incroci fino a quando non si ottiene un topo con solo il patrimonio genetico

completo 36

Il recettore per l’antigene dei linfociti T

(TCR)

Il recettore dell’antigene per le cellule T è formato da una catena α e da una catena β, e sia la catena

alfa che la catena beta hanno una regione variabile e una regione costante. La regione di legame per

l’antigene risiede nella porzione variabile. Il recettore α/ β riconosce dei frammenti di proteine

associati a delle molecole che si chiamano molecole del complesso maggiore di istocompatibilità

(sono quelle che principalmente che rigettano i trapianti), si chiamano anche molecole MHC.

Il TCR è simile ad un

frammento F di un

ab

anticorpo, ma hanno affinità

molto minore di questi:

pochissimi residui sono rivolti

nell’interazione con il peptide,

riconoscono perlopiù la forma

3D dell’associazione peptide-

MHC. Il TCR non riconosce

l’antigene nella forma nativa a

differenza del recettore per

l’antigene delle cellule B che

è dato dagli anticorpi, che riconoscono l’antigene nella sua forma nativa, quando esso si trova al di

fuori dalla cellula, cioè sulla superficie delle cellule, in circolo, in spai interstiziale. La generazione

dell’antigene,

dei peptidi da proteine native è comunemente definito come processamento mentre

l’esposizione sulla superficie cellulare deli peptidi legati alle molecole MHC è conosciuta come

dell’antigene.

presentazione

Informazioni strutturali

• entrambe le catene sono costituite da un dominio immunoglobulinico

• non sono mai secreti

• sono eterodimerici, le catene sono tenute insieme da ponti disolfuro

• presentano delle code intracitoplasmatiche molto corte

• hanno amminoacidi carichi positivamente nella regione transmembrana

Le regioni variabili si generano con fenomeni di ricombinazione VJ e VDJ come succede per le

immunoglobuline.

Generazione della diversità in TCR

• diversità combinatoriale: segmenti V riarrangiano in maniera casuale con segmenti J

37

• diversità giunzionale: che si crea a livello delle giunzioni tra i segmenti VJ e VDJ. Dovuta

ai nucleotidi N generati dalla TdT e ai nucleotidi palindromici P generati dall’apertura delle

forcine. Al contrario di quanto avviene per gli anticorpi i TCR non vanno incontro al

fenomeno dell’ipermutazione somatica

Organizzazione dei loci

Anche i loci sono molto simili a quelli delle Ig.

Nel locus di alfa si trovano 70-80 segmenti V,

60 segmenti J e la porzione che codifica per la

costante alfa.

Nel locus di beta si trovano 50 segmenti V, un

primo segmento D, sei segmenti J e

successivamente una costante beta1, un secondo

segmento D e altri 7 segmenti J e una regione

che codifica per un’altra costante beta2.

I segmenti del gene per il recettore delle cellule T si riarrangiano durante la maturazione dei

linfociti T, in modo da formare l’intero esone per il dominio V. Questo riarrangiamento avviene nel

timo

Ricombinazioni somatiche

Riarrangiamento del TcR alfa

Si verifica tra i segmenti V e i segmenti J in modo casuale. Un segmento V si unisce al segmento J

in modo da formare il segmento VJ e se il segmento è produttivo si genererà il trascritto primario e

tutti i J saranno eliminati. Nel locus di alfa si possono avere riarrangiamenti successivi fino a

quando non si ottiene quello produttivo o esauriscono i J a disposizione.

38

Riarrangiamento del gene beta del TCR

Per beta iniziano invece prima il riarrangiamento VJ e poi avviene il VDJ

Se il riarrangiamento non è produttivo: Dbeta2 può riarrangiare a sua volta con un altro J,

producendo il segmento DJ, e il segmento V rimato a monte potrà riarrangiare con DJ.

Può succedere che una cellula T esprima due tipi di recettori diversi: una stessa catena β, ma due

catene α diverse. La catena β va incontro al principio di esclusione allelica (un riarrangiamento

produttivo su un cromosoma blocca quello

sull’altro). Una cellula T può esprimere

solo un tipo di catena β, una sola variabile.

Per α il fenomeno dell’esclusione allelica

non è stringente. Se la cellula non riesce a

39

fare un riarrangiamento produttivo per un TCR muore.

Vicino ai segmenti VDJ si trovano le sequenze segnale della ricombinazione RSS per VDJ:

ettamero (sempre vicino alla regione

codificante), spaziatore di 23, nonamero

ed ettamero, spaziatore di 12 e nonamero.

Nella catena beta, le sequenze segnale con

lo spaziatore di 12 sono sempre vicine ai

segmenti D, mentre quelle con lo

spaziatore di 23 sono vicine ai segmenti V

e J, così V non potrà riarrangiare con J.

Ciò non può avvenire per una questione di ingombro

sterico. Quando le sequenze segnale della

ricombinazione si appaiano, e vanno nella stessa

direzione, fanno in modo che lo spaziatore V23 possa

appaiarsi con lo spaziatore V12. Questo perché lo

spaziatore di 23 corrisponde a due giri di elica, quello

di 12 ad un giro

La ricombinazione procede esattamente come procede

per le immunoglobuline. Le differenze più importanti

fra i geni delle Ig e quelli che codificano i recettori

delle cellule T rispecchiano il fatto che tutte le funzioni

effettrici delle cellule B dipendono dagli anticorpi

secreti, i cui meccanismi effettori sono da attribuire ai

differenti isotipi della regione C della catena pesante.

Al contrario, le funzioni effettrici delle cellule T

dipendono dal contatto cellula-cellula e non sono

mediate direttamente dal recettore, che serve unicamente per riconoscere l’antigene. Quindi le

regioni C nei loci TCRalfa e TCRbeta sono molto più semplici di quelle nel locus per le catene

pesanti delle Ig. C’è un solo gene Cα e, sebbene vi siano due geni Cβ, essi sono largamente

omologhi e non vi è nessuna differenza funzionale fra i loro prodotti. I geni per la regione C del

recettore delle cellule T codificano solo polipeptidi transmembrana.

Vi è anche un tipo di ricombinazione dove non vi è delezione, affinché i segmenti V e DJ(o J)

possano andare nella stessa direzione, il DNA deve ripiegarsi. Una volta uniti, V e DJ hanno lo

stesso senso di lettura. Il genoma viene modificato ma non vengono excisi pezzi di DNA.

40

La ricombinazione poi avviene nello stesso modo: RAG1 e RAG2 si legano alle sequenze segnale

della ricombinazione ed operano il taglio a livello di esse. Il taglio può avere un certo livello di

imprecisione, ed è a doppio filamento in entrambi i punti; si forma la forcina, che viene aperta, da

un complesso molecolare che si attacca a RAG e alla forcina, tramite un taglio a singolo filamento,

con la formazione dei nucleotidi palindromici; la TdT a questo punto aggiunge dei nucleotidi in

maniera del tutto casuale. Dopodiché una ligasi lega.

Recettore delle cellule T e il complesso maggiore di

istocompatibilità MHC

è formato da una catena alfa e da una catena beta e sono sempre transmembrana, sempre sulla

l’antigene nella forma nativa,

superficie delle cellule T, e si chiama TCR. Il TCR non riconoscere

ma riconosce frammenti proteici dell’antigene legati ai frammenti del complesso maggiore di

istocompatibilità MHC

A livello delle regioni CDR si trovano le regioni giunzionali.

sia per la loro struttura sia nell’espressione nei

Esistono due tipi di molecole MHC che differiscono

diversi tessuti dell’organismo

formata da un’unica catena associata alla beta2 microglobulina

MHC di classe I:

1. MHC di classe II: fatte da una catena alfa e da una catena beta.

2. In entrambe le classi, i due domini della proteina

accoppiati e più vicini alla membrana sono simili

ai domini dell’Ig, mentre i due domini più lontani

dalla membrana si piegano insieme per formare

una lunga tasca, o solco, che è il sito al quale si

lega un peptide.

Il TCR è sempre associato ad un co-recettore. I

due co-recettori a cui può essere associato il TCR

si chiamano CD8 o CD4. Le cellule T esprimono o

la molecola CD8 o CD4, chiamandosi cellule T

CD4 positive o cellule T CD8 positive. Il CD8

41

interagisce con la subunità α , mentre il CD4 interagisce con la β ; sia α che β sono regioni non

3 2 3 2

polimorfiche delle regioni MHC.

Le cellule che esprimono le CD8 vedono l’antigene in asso

• ciane con le molecole MHC di

classe I.

• Le cellule che esprimono le CD4 vedono l’antigene in associane con le molecole MHC di

classe II.

CD4 è una molecola a catena singola composta di 4 domini simili a quelli immunoglobulinici. I

primi due domini della molecola CD4 sono strettamente impaccati insieme, a formare un

bastoncello rigido unito da una cerniera flessibile ad un altro bastoncello simile formato dal terzo e

dal quarto dominio. La regione che lega MHC su CD4 è localizzata principalmente sopra una faccia

laterale del dominio D1, e CD4 si lega a una fessura formata all’unione dei domini α β

e della

2 2

molecola MHC di classe II.

La molecola CD8 è un dimero costituito da due catene diverse, chiamate α e β, legate tra loro da

ponti disolfuro, e ciascuno con un singolo dominio simile a quello immunoglobulinico legato alla

membrana da un lungo segmento polipeptidico. CD8 si lega debolmente a un sito costante nel

dominio α delle molecole MHC di classe I.

3 in quanto svolgono un’azione

• Le cellule T CD8 sono chiamate anche cellule T citotossiche,

citotossica diretta. aiutano l’attivazione delle cellule T

• Le cellule T CD4 sono anche chiamate cellule T helper,

CD8 o la produzione degli anticorpi interazione tra il TcR e il complesso MCH più peptide,

aumentando di più di 100 volte la probabilità.

I co-recettori sono importanti per stabilizzare la cellula T in modo che si attivi. Essi lasciano la

superficie superiore della molecola MHC esposta e libera di interagire con il recettore dei linfociti

T. Le cellule T non si attivano da sole, ma hanno bisogno di cellule accessorie che presentino

l’antigene e devono

esprimere le molecole

MHC e si chiamano

cellule che presentano

l’antigene APC

( antigen presenting

Il processamento dell’antigene è la frammentazione della proteina in peptidi che possono

cell). dell’antigene.

essere legati sulle molecole MHC, tale processo viene detto processamento

Se non vie è un’infezione in corso le molecole MHC sono caricate con peptidi self.

Ricapitolando:

• Le cellule B possono riconoscere antigeni con le Ig, qualunque molecola, nella sua forma

natia

• antigeni in associazione all’MHC.

Le cellule T possono solo riconoscere 42

MHC di classe I

• sono formate da due catene di polipeptidi: una catena, la

α,

catena è codificata nel MHC ed è associata non

β

covalentemente con una catena più piccola, la 2

microglobulina, che non è polimorfa ed è codificata su

un cromosoma diverso. Solo la catena α di classe I

attraversa la membrana. La molecola completa ha 4

domini, tre formati dalla catena α MHC, ed uno con il

contributo della β microglobulina. I domini ripiegati α e

2 1

α formano le pareti di una fessura sulla superficie della

2

molecola; questo è il sito dove il peptide si lega ed è

conosciuto come tasca di legame per il peptide o solco

di legame per il peptide

• presentano peptidi self prodotti dalle cellule oppure peptidi virali.

• Sono espresse da tutte le cellule nucleate (esclusi i globuli rossi e le piastrine)

• lega peptidi di 8-10 aa ed è completamente contenuto nel solco. Possiedono degli

amminoacidi conservati in specifiche posizioni, che si chiamano amminoacidi ancora o

questi residui ancora che si legano al solco. L’N-terminale

residui di ancoraggio. Sono e il

C-terminale stabilizzano il contatto con il solco.

• Il dominio alfa 3 è invariante e lega il CD8, mentre alfa 1 e 2 formano il solco che lega il

peptide che è costituito da foglietti beta con andamenti antiparallelo, mentre le pareti del

solco sono formati da alfa eliche.

MHC di classe II

• due catene α e β,

è un complesso non covalente di che

attraversano entrambe la membrana. Entrambe le catene

sono codificate entro l’MHC.

• presentano peptidi di proteine esogene, immunocomplessi o

microorganismi che vengono endocitati. Inoltre è espresso

anche dalle cellule epiteliali del timo

• Espressa da macrofagi, da cellule dendritiche e dalle cellule

B, tali cellule vengono definite cellule che presentano

l’antigene professioniste.

• Il dominio beta 2 è invariante e lega il CD4

• il solco che si crea tra alfa1 e beta 1 è costituito da foglietti beta (il pavimento) e da alfa

eliche (le pareti) e rappresenta il sito di maggior polimorfismo

• i peptidi non hanno una lunghezza precisa dai 15 ai 30 aa ed escono dal solco. I peptidi

legano il solco con degli amminoacidi ancora, che non sono mai nelle stesse condizioni e

non sono conservati come accade per la classe I. Il peptide è trattenuto da legami tra le

43

dei suoi aminoacidi che si inseriscono in tasche e cavità all’interno del solco,

catene laterali

delineate dai residui polimorfi della molecola MHC di classe II.

L’espressione di entrambe le classi di MHC è regolata dalle citochine, in particolare dagli

interferoni, rilasciati nel corso della risposta immunitaria. Sia le MHC di classe I che le MHC di

classe II sono estremamente variabili. I polimorfismi di queste molecole si trovano nel solco che

6 nell’uomo.

lega i peptidi. Sono codificate dal locus MHC sul cromosoma

Poligenia dell’MHC

Le molecole MHC sono

poligeniche: esistono più geni

che codificano per più molecole

di classe I, e più geni che

codificano per più molecole di

classe II. Di conseguenza ogni

individuo possiede un ampio

insieme di molecole MHC in

grado di presentare un ampio

spettro di peptidi con

caratteristiche diverse.

Nell’uomo vi sono 3 geni che codificano per le catene α e β della classe II e sono chiamati antigeni

leucocitari umani o geni HLA:

• DP o HLA-DP

• DQ o HLA-DQ

• DR o HLA-DR

Questo significa che le tre coppie di geni possono dare origine a 4 tipi di molecole MHC II

Vi sono 3 geni che codificano per MHC di classe I

• A o HLA-A

• B o HLA-B 44

• C o HLA-C

Nel topo, i geni che codificano per le molecole di classe I sono

• K

• D

• L

mentre i geni che codificano per le molecole MHC di classe II

• I-A

• I-E

MHC: polimorfismo

Le molecole MHC sono polimorfe: in una popolazione vi sono molteplici varianti, o alleli, dello

stesso gene. Di alcuni geni delle molecole MHC I e MHC II vi sono più di 800 alleli, moti di più del

numero degli alleli di altri geni trovati nel locus MHC. Ogni allele MHC di classe I e di classe II è

relativamente frequente nella popolazione, cosicché vi è solo una piccola probabilità che lo stesso

allele di un locus MHC sia presente su entrambi i cromosomi omologhi di un individuo. La maggior

parte degli individui è dunque eterozigote per i geni che codificano le molecole MHC di classe I e

di classe II. La particolare combinazione di alleli MHC che si trova su un singolo cromosoma è

L’espressione degli alleli MHC è codominante: entrambi i

conosciuta come aplotipo MHC.

prodotti degli alleli di ogni locus sono espressi ugualmente sulla superficie cellulare, ed entrambi i

prodotti genici sono in grado di presentare gli antigeni alle cellule T.

La maggior parte dei residui polimorfici delle MHC di classi I si trovano tra α e α , mentre i

1 2

polimorfismi della classe II si trovano in α e β . Gli individui compatibili, per i trapianti di midollo,

1 1

o sono all’interno della famiglia (due fratelli hanno una probabilità del 25% di averlo uguale) o

devo screenare almeno 250 mila persone. I trapianti di organi si fanno tra individui che non sono

compatibili, in quanto si fanno da cadaveri.

Ciascuno di noi ha una combinazione diversa di molecole MHC. Il polimorfismo delle MHC hanno

dato un vantaggio evolutivo a livello della popolazione, in quanto ciascuno di noi risponde a livello

individuale alle infezioni, garantendo la sopravvivenza di alcuni individui.

45 Se consideriamo le antigene professioniste

(macrofagi, dendritiche) esprimono sia casse I

che classe II. Nell’uomo si avranno

l’espressione di 6 molecole MHC e almeno 12

di classe II. Sono tutte coespresse sulla

superficie dell’antigene di cellule

professioniste. I topi che hanno tutte le

molecole MHC nella variante allelica A

vengono definiti di aplotipo A. Negli anni sono

stati ottenuti numerosi varianti di animali con

varianti alleliche MHC definite.

Gli animali imbreed sono animali il cui

patrimonio genico è noto.

Fenomeno della

restrizione MHC: le

cellule T di un individuo

riconoscno i peptidi in

associazione con le

molecole MHC nelle

varianti alleliche di

quell’individuo.

Zinkernagel e Doerthy

avevano infettato un

animale con un virus e

avevano espanso le cellule

T specifiche del virus. Le

CD8, dopo che si sono

attivate le espanse, si

attivano e uccidono le cellule che sono state infettate. Ricavarono le cellule T CD8 da questo topo, e

in vitro, misero queste cellule (di aplotipo A) con cellule infettate e ne risultò che tali cellule

morivano. Se mettevano le cellule CD8 di aplotipo B non morivano.

46

Molecole del complesso del CD3

Il TCR vede solamente il complesso MHC + peptide, l’attivazione

della cellula T avviene grazie alla trasduzione del segnale ad opera

del complesso del CD3, poiché il TCR non è in grado di trasdurre

il segnale. Il complesso CD3 è costituito da due eteroridimeri:

epsilon-delta e gamma-epsilon e un omodimero: zeta-zeta.

Ciascuna cellula T riconosce particolari varianti alleliche

dell’MHC, non riconosce tutte le varianti alleliche. Le cellule T

riconoscono l’antigene in maniere MHC ristretta. Tale fenomeno

viene definito come restrizione MHC.

Il TCR è un normale recettore che interagisce con il suo ligando: lo fa quindi con affinità molto più

bassa rispetto all’anticorpo. Inoltre perché una cellula T possa essere attivata l’interazione deve

durare spesso ore, ed essa non coinvolge solo il TCR ma anche altre molecole.

La presentazione dell’antigene alle

cellule del sistema immunitario

Captazione, processamento e presentazione dell’antigene

è il meccanismo attraverso il quale avviene l’attivazione dei linfociti T da parte di cellule

• accessorie dette Antigen Presenting Cells (APC).

L’attivazione dei linfociti T naive si svolge in un microambiente complesso, gli organi

• linfoidi secondari, dove i movimenti delle APC e dei linfociti T sono governati da

limitazioni anatomiche

Le APC professioniste più efficienti nell’attivazione dei linfociti T naive sono le cellule

• arrivano dell’area

dendritiche DC. Le cellule dendritiche entrano nei vasi linfatici afferenti,

Captano l’antigene e lo internalizzano,

delle cellule T dei linfonodi, gli attivano e maturano.

lo processano (tutte le proteine vengono ridotti in peptidi e portati sulla superficie delle

molecole MHC) 47

Captazione dell’antigene

L’antigene può avere diverse vie di ingresso: la pelle, il tratto gastrointestinale e il tratto

respiratorio. Entrano nei vasi linfatici afferenti, arrivano nei linfonodi e presentano l’antigene alle

cellule T dei linfonodi. Se l’antigene è presente nel sangue, arriverà alla milza, processato e

presentato alle cellule T.

Esistono due vie di processamento dell’antigene:

• via endogena: prevede la formazione di peptidi da proteine che vengono sintetizzate nel

citosol. Le proteine prodotte all’interno della cellula vengono processati e i loro peptidi

vengono caricati sulla classe prima e caricati sulla superficie della cellula. È ubiquitaria,

tutte le cellule esprimono le molecole MHC di classe I. Nel proteasoma, la proteina viene

digerita e ridotta in peptidi.

Le molecole MHC di classe I vengono sintetizzate a livello del reticolo, mentre i peptidi

risultati dalla digestione della proteasi si trovano all’interno del citosol: per questo esistono a

livello del reticolo delle proteine traportatrici (TAP 1 e 2) che prendono questi peptidi e li

trasportano all’interno del reticolo, dove trovano le molecole MHV. Le molecole di classe I

che hanno legato questi peptidi sono a questo punto stabili e vengono trasportate sulla

superficie della cellula tramite vescicole nella via del Golgi.

Quando è presente un’infezione e le cellule professioniste incontrano l’antigene, il loro

proteasoma cambia alcune sue subunità diventando immunoproteasoma, che ha

un’efficacia centinaia di volte superiore nella digestione ed è specializzato nella generazione

di peptidi in grado di legare la classe I (che devono essere 9-10 aa + amminoacidi ancora).

TAP 1 e 2 sono abbastanza selettivi per peptidi di 9-10 aa. In caso di infezione aumenta

l’efficienza della sintesi di molecole di classe I.

• via esogena: porta alla formazione dei peptidi che saranno poi presentati sulla classe II, cioè

guarda il processamento di proteine che vengono a trovarsi nel compartimento endosomiale,

quindi o di membrana o che vengono endocitate; queste proteine on si trovano mai nel

citosol, rimangono sempre all’interno di vescicole.

Le molecole MHC di classe II, come quelle della I, vengono sintetizzate all’interno del

reticolo, ma qui dentro esse non sono libere, bensì legate alla catena invariante, che ha un

peptide clip a chiudere il solco e funge inoltre da chaperonina; si forma un grosso complesso

per cui tre molecole di classe II legano tre molecole di catena invariante. Grazie all’attività

di chaperon le molecole vengono trasportate in vescicole attraverso l’apparato di Golgi. Il

materiale endocitato è inizialmente contenuto in un endosoma precoce, che col passare del

tempo diventa tardivo, si acidifica e si fonde con un lisosoma (il quale ha all’interno enzimi

proteolitici) a dare l’endolisosoma: nel pH acido del compartimento così formato le proteasi

(tra cui le catepsine) sono attive e digeriscono le proteine a dare peptidi. Le vescicole di

classe II si fondono con l’endolisosoma, e avviene la digestione anche della catena

invariante; rimane però il peptide clip ad occupare il solco. Questo particolare

compartimento (chiamato MIIC) è presente solo nelle cellule che presentano l’antigene

professioniste, e contiene anche una terza molecola (oltre a MHC e peptidi) che nell’uomo è

chiamata HLA DM, la quale spiazza il peptide clip favorendo il trasferimento al suo posto di

48

un peptide che si trova nel compatimento come risultato di proetolisi. La classe II a questo

punto carica con il peptide, viene trasportata sulla superficie della cellula.

In caso di infezione non sono sintetizzate e nuove molecole di classe II, che sono già

presenti conservate nel compartimento, ma diventa molto più efficiente il processo di

endocitosi, di processamento dell’antigene e l’efficienza con cui il complesso classe II-

peptide passa sulla superficie della cellula: questo è un processo normalmente molto lento.

• Cross presentazione: fenomeno per cui antigeni esogeni alla cellula vengo presentati sulla

classe I.

Processamento di antigeni endocitati e presentati via MHC II

Come tutte le proteine di membrana, le molecole MHC II sono prima rilasciate nella membrana del

reticolo endoplasmatico, e sono trasportate in avanti come parte delle vescicole racchiuse nella

membrana che gemmano fuori dal reticolo endoplasmatico. I complessi di peptidi e le molecole

MHC II sono poi trasportati sulla superficie della cellula dove sono riconosciuti dai linfociti T CD4.

Le proteine che entrano nella cellula tramite endocitosi sono incluse negli endosomi, il cui pH

diventa progressivamente più acido a mano a mano che si addentrano nella cellula, fino a fondersi

con i lisosomi. Gli endosomi ed i lisosomi contengono proteasi acide che attivate da un pH acido

degradano le proteine contenute all’interno delle vescicole.

La funzione immunologica delle molecole MHC II è quella di legare i peptidi generati nelle

vescicole endosomiche dei macrofagi, delle cellule dendritiche immature, dei linfociti B e di altre

cellule che presentano l’antigene. In tal modo i peptidi sono esposti sulla superficie delle cellule

dove sono riconosciuti dai linfociti T CD4. La biosintesi delle molecole MHC II inizia con la loro

traslocazione nel RE. Durante questo processo è necessario evitare che le molecole MHC II si

leghino prematuramente ai peptidi trasportati nel lume del RE, o si leghino ai polipeptidi appena

sintetizzati dalla cellula. Il reticolo endoplasmatico è affollato da catene polipeptidiche che non

hanno ancora assunto un ripiegamento conformazionale definitivo, e per questo è necessario un

meccanismo che prevenga il legame di questi polipeptidi con le tasche delle molecole MHC II. Per

impedire questo legame, le molecole MHC II appena sintetizzate sono assemblate con una proteina

di membrana nota come catena invariante (li) associata alle molecole MHC II. La catena

invariante si aggrega in trimeri, ed ogni subbunità del trimero lega in modo non covalente un

eterodimero α:β delle molecole MHC II. Per tutto il tempo in cui sono assemblate con la catena li,

le tasche delle molecole MHC II non possono legare né le proteine non ripiegate né i peptidi

presenti nel RE, cosicché i peptidi presenti nel RE di solito non sono presentati da molecole MHC

II. La catena invariante ha anche una seconda funzione, che è quella di dirigere le molecole MHC II

verso il compartimento delle vescicole endosomiali a basso pH, dove ha luogo il legame con i

peptidi. In seguito ad una successiva digestione la molecola MHC II si stacca dal frammento della

catena li associato alla membrana e, ancora legato alla tasca della molecola MHC II, rimane solo un

piccolo frammento della catena invariante chiamato peptide della catena invariante associato alla

molecola MHC II o CLIP. Le molecole MHC II con attaccato CLIP non possono legare altri

peptidi. La catena invariante svolge anche un ruolo di chaperonina.

alla catena invariante passa attraverso l’apparato di Golgi e attraverso il

La classe II legata

compartimento lisosomiale. Qui si incontra con il lisosoma.

49

Nel compartimento MIIC, la catena invariante viene degradata, tranne il peptide clip che viene

legato dalla classe II. HLA-DM lega e stabilizza le molecole MHC II vuote e catalizza sia il rilascio

del frammento CLIP dal complesso MHC II:CLIP, sia il legame dei peptidi con le molecole MHC II

vuote. Le molecole HDLA-DM catalizzano anche il rilascio di peptidi legati in modo instabile alle

molecole MHC II.

Processamento di antigeni citosolici presentati via MHC-I

Gli antigeni che provengono da agenti infettivi entrano nei compartimenti citosolico o vescicolare

attraverso varie vie. Gli agenti microbici entrano nel compatimento vescicolare in due modi. Certi

batteri patogeni e protozoi parassiti sopravvivono all’ingestione da parte dei macrofagi e si

replicano all’interno delle vescicole intracellulari del sistema endosomiale-lisosomiale. Altri batteri

della cellula, dove causano un danno tissutale secernendo tossine e

patogeni proliferano all’esterno

altre proteine. Questi batteri e i loro prodotti tossici possono essere internalizzati con la fagocitosi,

l’edocitosi mediata da recettori, o la macropinocitosi negli endosmomi e nei lisosomi, dove sono

demoliti da enzimi digestivi.

Per iniziare una risposta immunitaria acquisita, tuttavia, l’antigene deve essere presentato a cellule

T naive da cellule specializzate nella presentazione dell’antigene, principalmente le cellule

dendritiche convenzionali. Le cellule dendritiche sono altamente specializzate per questo compito e

attivano le cellule T naive CD8 e CD4. Anche i macrofagi e le cellule B possono operare come

cellule che presentano l’antigene, ma in modo più limitato.

Le catene polipeptidiche delle proteine destinate alla superficie cellulare, incluse le catene delle

molecole MHC, sono trasportate durante la sintesi nel lume del RE. Qui le due catene di ogni

molecole MHC si ripiegano correttamente e si assemblano tra loro. Questo significa che la parte

della molecola MHC I che lega il peptide antigenico assume la sua corretta conformazione nel lume

del RE, e non viene mai direttamente a contatto con il citosol. I peptidi sono continuamente

trasportati dal citosol nel RE. Varie prove sperimentali indicano che è il proteasoma la struttura che

produce i peptidi ligandi per le molecole MHC I. Legando sperimentalmente le proteine

all’ubiquitina si ottiene una più efficiente presentazione dei loro peptidi da parte delle molecole

MHC I. Il proteasoma può esistere in due forme: proteasoma costitutivo presente in tutte le cellule,

50

e immunoproteasoma, presente nelle cellule stimolate con interferoni. Il proteasoma produce

peptidi che sono pronti per essere trasportati nel reticolo endoplasmatico. In questo stadio, gli

chaperon cellulari proteggono i peptidi dalla degradazione completa nel citoplasma. Questi peptidi

sono, tuttavia, troppo lunghi per essere legati da molecole MHC I e nel RE vengono tagliati da

specifici enzimi.

I peptidi vengono trasportati nel reticolo ad opera di TAP1 e TAP2 che sono selettive per i peptidi di

classe I.

Cross-presentazione

avviene solo nelle cellule dendritiche. È la possibilità di presentare peptidi di proteine esogene sulla

classe I. Una volta arrivati nel citosol potranno prendere la via endogena. Recentemente è stato

dimostrato che la classe I può arrivare agli endosomi. Questo fenomeno avviene essenzialmente

nelle cellule dendritiche. Le cellule T CD8 per svolgere la loro funzione citotossica devono essere

autorizzate, e questa loro attività viene indotta dalle cellule dendritiche. Le cellule T CD8

citotossiche andranno ad uccidere le cellule somatiche infettate dal virus. Una cellula bersaglio è

una qualunque cellula che presenta i complessi MHC:peptide.

Affinché le molecole MHC siano in grado di svolgere il loro ruolo essenziale, che consiste nel

segnalare la presenza di un’infezione all’interno della cellula, è necessario che il complesso

MHC:peptide sulla superficie della cellula sia stabile. Se il complesso si dissocia troppo

rapidamente il moo potrebbe sfuggire alla sorveglianza delle cellule T. La cross presentatio può

portare alla generazione di risposte T citotossiche contro virus che non infettano le DC stesse.

La licenza di uccidere viene data dalle CD8

• MHC II prevalentemente da APC professioniste (interazione con T CD4)

51

Le cellule T CD4 attivate producono dei fattori che serviranno per attivare l’infiammazione, ad

esempio producono dei fattori che sostengono l’attivazione dei macrofagi; oppure aiutano

l’attivazione delle cellule B e l’attivazione degli anticorpi, o portano all’attivazione delle cellule T

CD8, per questo vengono definite anche cellule T CD4 helper.

Solo le cellule antigene specifiche legano l’antigene, lo internalizzano e lo processano.

I peptidi immunodominanti sono quelli che si generano più facilmente dal processamento delle

proteine e hanno le ancora per legare le classi I e classi II.

52

Attivazione dei linfociti T e B

Le cellule del sistema immunitario usano diversi recettori della superficie cellulare per sentire il

loro ambiente e per comunicare con le altre cellule.

La cellula dovrà esprimere proteine adeguate al tipo di infezione, e dovrà anche esprimere fattori

che le consentiranno di proliferare. Lo scopo della trasduzione del segnale è quello di portare

l’informazione dall’esterno della cellula al nucleo.

1. Il recettore sulla superficie vede il suo ligando

2. il recettore si attiva

all’interno della cellula avvengono una cascata di eventi che porterà all’attivazione di fattori

3. di trascrizione

Il recettore dell’antigene della cellula B (BCR) e il recettore dell’antigene della cellula T (TCR)

sono costituiti da catene che legano l’antigene le catene pesanti e leggere dell’Ig nel recettore della

cellula B, e le catene TCRα e TCRβ nel recettore della cellula T. Queste catene variabili che legano

l’antigene hanno una specificità fine per l’antigene, ma non una capacità intrinseca di trasmissione

del segnale. Nel complesso antigene-recettore pienamente funzionale sono associate con proteine

accessorie invarianti, che iniziano la trasmissione del segnale quando i recettori legano l’antigene

extracellulare Nel caso delle cellule B, il ligando è un antigene nella sua forma nativa, mentre nel

caso delle cellule T il ligando, è un complesso MHC più peptide.

I recettori si attivano solo se avviene il fenomeno di

crosslinking, ossia se più recettori vengono

coinvolti nell’attivazione.

Sono coinvolte proteine chinasi (fosforilano),

fosfatasi (defosforilano). Ci sono due tipi di

proteine chinasi: ci sono quelle che fosforilano in

tirosina e quelle che fosforilano residui di serina-

treonina in regioni conservate.

I fosfolipidi di membrana rappresentano i secondi

messaggeri. Fosfatidil glicerolo 3-P viene scisso e

l’inositolo 3-P viene rilasciato nel citosol che attiva

dei canali del calcio sul RE e permette la liberazione

del calcio. É necessario anche l’ingresso di calcio

dall’esterno per permettere la trasduzione del

segnale. 53

Trasduzione del segnale nelle cellule T

Le porzioni α β non sono in grado di trasdurre. Il TCR è associato

al complesso del CD3 e CD4 o CD8. Il complesso del CD3 è

quello che inizialmente porterà alla trasduzione del segnale. Nelle

regioni citoplasmatiche, del complesso CD3, si trovano le regioni

dell’immunorecettore basato su

ITAMS (motivi di attivazione

tirosina) con tirosine che possono essere fosforilate. La

trasduzione del segnale parte dalle zattere lipidiche, che sono

zone ricche in colesterolo, dove le molecole non hanno grossa

libertà di movimento. Se il TCR non si trova nei lipid raft,

vengono spostati in tale zona.

Il primo segnale intracellulare generato dopo che la cellula T ha individuato il suo antigene

specifico è la fosforilazione di entrambe le tirosine negli ITAM del recettore della cellula T. Sono i

corecettori CD4 e CD8, che si legano rispettivamente alle molecole MHC di classe I e di classe II,

che aiutano a iniziare la trasmissione del segnale dal recettore della cellula T per mezzo della loro

associazione con chinasi non recettore. La

chinasi Lck della famiglia Scr è

costitutivamente associata con i domini

citoplasmatici di CD4 e di CD8. Lck è

importante per la trasmissione del segnale

del recettore della cellula T nelle cellule T

naive e nelle cellule T effettrici, ma meno

importante per l’attivazione o il

mantenimento delle cellule T CD8 della

memoria da parte del loro antigene specifico

Una volta che il TCR ha visto il complesso

MHC più peptide, intervengo le Scr chinasi.

Esse presentano un dominio chinasico e

normalmente si trovano in una forma

inattiva e vengono attivate tramite un

processo di fosforilazione. Delle Scr già

all’interno della

attivate sono pre-costituite

cellula.

ITAM è un sito di legame per una proteina di

trasmissione del segnale con due domini SH2.

Nel caso della cellula T vi è associata una

tirosina chinasi ZAP-70, che porta avanti il

segnale. ZAP-70 ha due domini SH2 abbinati

che possono essere impiegati

contemporaneamente da due tirosine fosforilate

in un ITAM. Una volta che ZAP-70 è stata

reclutata al complesso del recettore e attivata, la 54

sua vicinanza alla membrana della cellula le permette di fosforilare la proteina ponte LAT

(collegatore di cellule T attivate), una proteina transmembrana con un grande dominio

fosforila anche un’altra proteina

citoplasmatico. ZAP-70 adattatrice, SLP-76. La fase successiva nel

processo è l’attivazione della fosfolipasi C-γ, la proteina chiave di trasmissione del segnale alla

è portata sulla faccia interna della membrana

membrana. Per prima cosa, la fosfolipasi C-γ

plasmatica dal legame del suo dominio PH a PIP che è stato formato dalla fosforilazione di PIP da

3 2

parte della PI 3-chinasi; poi si lega a LAT e SLP-76 fosforilare, dove può essere attivata dalla

tirosina chinasi Itk associata alla membrana. Le azioni della fosfolipasi C-γ producono tre secondi

messaggeri diversi che attivano tre branche terminali distinte della via del recettore della cellula T

PIP è generato dalle azioni della PI3-chinasi, tuttavia, non è chiaro che il recettore della cellula T

3

attivi direttamente la PI 3-chinasi. Un segnale stimolatorio aggiuntivo richiesto per attivare la PI 3-

è rilasciato attraverso il recettore CD28 della superficie cellulare.

chinasi, e così la fosfolipasi C-γ

Questo processo è chiamato co-stimolazione. Le cellule T naive hanno bisogno di segnali

costimolatori come pure di segnali trasmessi tramite il recettore dell’antigene per diventare

pienamente attivati e differenziarsi in cellule T effettrici.

è stata richiamata sulla faccia interna della membrana

Una volta che la fosfolipasi C-γ plasmatica ed

è stata attivata, può catalizzare la demolizione della membrana lipidica di PIP per generare due

2

prodotti, il diacilglicerolo DAG della membrana plasmatica e il secondo messaggero diffusibile

inositolo 1,4,5-trifosfato IP . DAG è confinato alla membrana, ma diffonde nel piano della

3

membrana e serve come bersaglio molecolare che richiama altre molecole segnale alla membrana.

IP diffonde nel citosol e si lega ai recettori di IP sulla membrana del RE. Questi recettori sono

3 3

2+

canali di Ca , che si aprono a liberano nel citosol tutto il calcio immagazzinato nel RE. I bassi

livelli di calcio che ne conseguono nel RE, causano il raggruppamento di una proteina

transmembrana dentro la membrana del RE. Il raggrupparsi di queste proteine innesca l’apertura dei

canali del calcio nella membrana plasmatica della cellula; questi sono conosciuti come canali

CRAC (canali del calcio attivati dal rilascio di calcio), e permettono al calcio extracellulare di fluire

dentro a cellula per attivare ulteriormente le vie di trasmissione del senale per riempire i depositi di

calcio del RE.

Un risultato importante dell’aumento del Ca 2+ citosolico, causato dalla trasmissione del segnale del

recettore della cellula T, è l’attivazione di una famiglia di fattori di trascrizione chiamati NFAT

2+

(fattore nucleare delle cellule T attivate). Il Ca citoplasmatico che deriva dalla trasmissione del

segnale del recettore della cellula T si lega a una proteina chiamata calmodulina e induce un

che le permette di legarsi a un’ampia gamma di

cambiamento conformazionale in questa proteina

enzimi bersaglio diversi e di attivarli. Nelle cellule T un bersaglio importante della calmodulina è la

calcineurina, una proteina fosfatasi che agisce su NFAT. La defosforilazione di NFAT da parte della

calcineurina permette il riconoscimento della sequenza di localizzazione nucleare da parte dei

trasportatori nucleari, e NFAT entra nel nucleo. Qui esso funziona attivando molti dei geni

fondamentali per l’attivazione della cellula T, come il gene per la citochina interleuchina-2.

diffonde nella membrana plasmatica e attiva una varietà di

Il DAG generato dalla fosfolipasi C-γ

proteine, una di queste è la proteina RasGRP; che è un fattore di scambio guanina-nucleotide che

innesca poi un relè a tre chinasi che finisce con l’attivazione

attiva specificamente Ras. Ras attivata

di una chinasi serina/ treonina conosciuta come proteina chinasi attivata dal mitogeno o MAP

55

chinasi (MAPK). Nel caso della trasmissione del segnale del recettore dell’antigene, il primo

membro del relè è una MAPK chinasi chinasi (MAP3K) chiamata Raf. Raf è una serina/treonina

chinasi che fosforila il membro successivo della serie, una MAPK chinasi (MAP2K) chiamata

MEK1.

Una funzione importante della MAPK è di fosforilare e attivare fattori di trascrizione che possono

poi indurre nuovi fattori di espressione genica. determina

Il terzo processo di trasmissione del segnale che proviene dalla fosfolipasi C-γ

l’attivazione di PKC-θ, un’isoforma della proteina chinasi C che è limitata alle cellule T e ai

ha un dominio C1 ed è reclutata alla membrana plasmatica quando DAG è generato

muscoli. PKC-θ In questa sede, l’attività di chinasi di PKC-θ fosforila la grande proteina ponte

dalla fosfolipasi C-γ.

localizzata sula membrana, causando la sua oligomerizzazione e formando con altre proteine un

complesso con molte subunità.

Le cellule che presentano l’antigene che possono attivare le cellule T naive portano delle proteine di

superficie conosciute come molecole costimolatorie. Esse interagiscono con recettori della

superficie della cellula, conosciuti come recettori costimolatori, sulla cellula T naive per trasmettere

un segnale che è necessario, insieme con la stimolazione dell’antigene, per l’attivazione della

cellula. Il più conosciuto di questi recettori costimolatori è la proteina della superficie cellulare

CD28. zona di contatto tra le cellule che presentano l’antigene e la cellula T. la

Sinapsi immunologica:

CD45 fosfatasi, quando si forma la sinapsi immunologica, viene allontanata e non sarà in grado di

defosforilare.

In maniera del tutto casuale, può succedere che le chinasi fosforilino le regioni ITMAS e la fosfatasi

defosforili. Quando si forma la sinapsi immunologica, questi movimenti casuali non si verificano

più.

Sono necessari almeno questi tre fattori (NFAT, NFkB e AP-1) affinché la cellula si attivi.

L’attivazione di una cellula T passa sempre per una proliferazione, ossia per la produzione di cloni.

I recettori antigeni specifici avranno distribuzione clonale.

56

Trasduzione del segnale nelle cellule B

Ci sono molte somiglianza tra la trasmissione del segnale da parte dei recettori delle cellule T e dei

recettori delle cellule B. Il recettore delle cellule B è composto da catene antigene specifiche

che contengono ITAM, in questo caso Igα e Igβ. Nelle

associate a catene di trasmissione del segnale

cellule B si pensa che siano responsabili della fosforilazione degli ITAM tre proteine tirosina

chinasi della famiglia Src. Queste chinasi sono associate con recettori a riposo attraverso

un’interazione a bassa affinità con ITAM non fosforilati in Igα e Igβ. Dopo che i recettori legano un

antigene polivalente, che li unisce con legami crociati, le chinasi associate al recettore sono attivate

e fosforilano i residui di tirosina negli ITAM. Le cellule B non esprimo ZAP-70, invece una tirosina

chinasi strettamente correlata, Syk, che è attivato semplicemente dal suo legarsi al sito fosforilato.

L’equivalente della cellula B ai co-recettori CD4 e CD8 è un complesso di proteine della superficie

cellulare (CD19, CD21, CD81) che è conosciuto come co-recettore della cellula B. La

trasmissione del segnale antigene-dipendente dal recettore della cellula B è aumentata se il

corecettore della cellula B è legato contemporaneamente dal suo ligando e si riunisce con il

recettore dell’antigene.

Una volta attiva, la Syk fosforila la proteina ponte BLNK, che ha siti multipli per la fosforilazione

della tirosina e recluta varie proteine ed enzimi per formare parecchi complessi diversi mutilproteici

di trasmissione del segnale che possono agire di concerto. La proteina chiave di trasmissione del

segnale è l’enzima fosfolipasi C-γ che è attiva con l’aiuto della Tec chinasi tirosina chinasi di

Bruton (Btk) e idrolizza PIP per formare DAG e IP . La trasmissione del segnale da parte del

2 3

calcio e del DAG porta all’attivazione dei fattori di trascrizione a valle.

57

Citochine

sono piccole proteine rilasciate da varie cellule dell’organismo, di solito in seguito a uno stimolo

attivatore, e inducono risposte attraverso il legame a recettori specifici

Sono delle molecole attraverso le quali le cellule del s. immunitario comunicano tra di loro.

Regolano lo sviluppo, la sopravvivenza.

Caratteristiche generale:

Regolano e mediano le funzioni del sistema immunitario e sono secrete in seguito a uno stimolo. La

loro secrezione è molto limitata nel tempo perché hanno un effetto infiammatorio (quindi

pericolose)

possono agire su più tipi cellulari

• Le citochine possono agire in maniera autocrina:

vengono secrete da una cellula e la cellula stessa

ha il recettore per le citochine e quindi agiscono

sulla cellula stessa che le ha prodotte. La funzione

dello stimolo che hanno ricevu→to si esplica

anche attraverso le citochine che hanno prodotto.

Le citochine possono avere un’azione

• paracrine,

ossia agiscono su cellule vicine. Una cellula

produce uno stimolo, produce citochine e le

citochine agiscono sulle cellule vicine.

• Le citochine possono funzionare

come ormoni: essere prodotti da

una cellula, entrare nel circolo e

agire a distanza, coma ad esempio

quelle impiegate nell’azione

infiammatoria. Le citochine

possono funzionare in maniera

endocrina.

Funzioni delle citochine

• Le citochine possono avere

funzione pleiotropica: una

citochina agisce su cellule

bersaglio diverse inducendo una

stessa funzione o funzioni

diverse. 58 più citochine possono indurre su un’unica

• Le citochine possono anche essere ridondanti:

cellula bersaglio la stessa funzione.

• Le citochine possono avere una funzione sinergica: (sinergia= due molecole da sole non

hanno un effetto sulla cellula bersaglio, ma insieme danno un effetto visibile). Ciascuna

citochina potrebbe dare un effetto misurabile con una cellula bersaglio, ma due citochine

sinergiche danno un effetto maggiorato. Due citochine danno un effetto additivo su una

cellula bersaglio; se ne eliminiamo una si ha comunque lo stesso effetto ma diminuito.

dove una antagonizza l’effetto

• Due citochine possono avere un effetto antagonista,

dell’altra.

Classificazione delle citochine

• linfochine: citochine secrete dai linfociti

• monochine: citochine secrete dai monociti

• interleuchine: citochine secrete da leucociti e agiscono sui leucociti

• interferoni: vi sono 3 tipi di interferoni

◦ α-β (interferoni di tipo I)

◦ γ (interferono di tipo II)

◦ λ (interferoni di tipo III)

• TNF: tumor necrosis factors, sono proteine transmembrana, anche se in qualche circostanza

alcune possono essere rilasciate dalla membrana.

• chemochine: citochine che hanno attività chemotattica, i loro geni non hanno introni

Funzioni generali delle citochine

• regolatori della risposta immunitaria

• fattori di crescita, di sopravvivenza o di differenziamento

• attivatori dell’infiammazione, come la famiglia degli interferoni o dei TNF

Recettori delle citochine

esistono 4 tipi di recettori per citochine:

recettori che fanno parte della famiglia delle Ig, fati cioè da una serie di domini

1. immunoglobulinici, ed hanno meccanismi recettoriali diversi da quelli degli altri.

recettori di classe I (recettori per le ematopoietine) che si caratterizzano per avere 4

2. residui di cisteina conservati su un dominio extracellulare e una sequenza conservata. Sono

dei dimeri, che trasducono il segnale attraverso i domini intracellulari. Presentano la

sequenza WSXWS conservata 59

Recettori di classe II (recettori per gli interferoni): hanno 4 residui di cisteina e un

3. domino extracellulare ma non hanno la sequenza WSXWS conservata. Sono dimerici e sono

recettori che hanno tutti domini Ig.

recettori per le TNF: hanno domini immunoglobulinici e solitamente trasducono un

4. segnale apoptotico.

recettori per le chemochine: presentano 7 domini transmembrana che sono accoppiati a

5. proteine G.

I recettori di classe I e di classe II trasducono il

segnale con un meccanismo denominato Jak-stuck.

La subunità che trasduce il segnale è presente su

citochine diverse.

Alcune cellule esprimono il dimero, altre il trimero.

La subunità gamma è molto comune per citochine

diverse. Si chiama commond gamma chain. La catena beta assieme alla catena gamma trasducono

il segnale.

Traduzione del segnale

Le catene di trasmissione del segnale dei recettori della citochina sono associate non

covalentemente con proteine tirosin chinasi della famiglia della Janus chinasi (JAK). La

dimerizzazione o il raggruppamento delle catene di trasmissione del segnale permette tra le JAK

crociate l’una con l’altra sulla tirosina che stimolano la loro attività chinasica.

delle fosforilazioni

Queste JAK attivate fosforilano recettori a loro associati su residui di tirosina specifici, per generare

siti di legame per proteine con domini SH2. Alcuni dei siti tirosina-fosforilati richiamano fattori

latenti di trascrizione che contengono SH2, conosciuti come trasduttori del segnale e attivatori

della trascrizione STAT, che risiedono nel citoplasma in una forma inattiva fino a quando è attivata

da recettori della citochina. I dimeri STAT fosforilati si dissociano dal recettore ed entrano nel

nucleo, dove essi operano come fattori di trascrizione per iniziare l’espressione di geni selezionati. I

geni regolati da STAT comprendono geni che contribuiscono alla crescita ed alla differenziazione

La citochina lega la subunità α e la subunità α si appaia con la subunità β. Il recettore in seguito al

legame per la citochina si assembla. A queste subunità sono associate delle tirosin chinasi che

fosforilano. Più recettori vengono coinvolti con l'interazione con la citochina, le tirosin chinasi

(jack) si fosforilano. Costituiscono un dominio di legame per le STAT che vengono a loro volta

fosforilati e dimerizzano. Come dimeri subiscono altri processi di fosforilazione, passano nei nucleo

e favoriscono la trascrizione di geni.

Le risposte che vengono stimolate dai virus attivano gli interferoni. I TNF vengono sempre attivati

in qualsiasi risposta infiammatoria. Gli interferoni sono stati chiamati in queste modo perché erano

stati identificati come molecole che interferivano come i virus. Gli interferoni di tipo III hanno

un’azione protettiva nei confronti del tessuto.

e TNF α sono le citochine infiammatorie e attivano una serie di risposte infiammatorie a

IL-1 IL-6

seguito ad una infezione. Sono prodotti dai fagociti e sono definite come pro infiammatoria.

60

IL-1 incrementa la temperatura agendo a livello ipotalamico.

Agiscono sul fegato, inducendo la produzione di alcune proteine, che verranno chiamate proteine

è un aumento della proteina C reattiva, vi è un’infezione. Le citochine

della fase acuta. Se vi

determinano anche l’attivazione dei linfociti T e B.

Gli interfoni di tipo α/β e le citochine di tipo gamma sono citochine di tipo virale e anche

anche le cellule NK e promuovono l’attivazione della

antibatteriche e antifunginee. Attivano

risposta immunitaria innata. Indirizzano le risposte immunitarie verso quelle di tipo I.

L’interleuchina ha una funzione antagonista su quelle di tipo II.

Le chemochine

sono citochine che hanno funzione chemotattica e regolano i movimenti delle cellule del sistema

immunitario. Il loro nome è determinato in base al residuo di Cys nella sequenza. IL8 è una

chemochina che serve a richiamare i neutrofili nel tessuto infiammatorio. Le chemochine possono

per promuovere un’infiammazione a livello locale, o per

essere prodotte in maniera inducibile:

promuovere la riparazione dei tessuti. Vi sono anche chemochine che sono prodotte in maniera

costitutiva per regolare il normale traffico leucocitario.

Le chemochine sono divise in due gruppi distinti ma correlati:

• le CC chemochine hanno due residui adiacenti di cisteina vicino all’estremità amino

terminale. Queste favoriscono la migrazione di monociti, linfociti e altri tipi di cellule

• le CXC chemochine i due residui corrispondenti di cisteina sono separati da un singolo

aminoacido. Guida la migrazione dei neutrofili

La loro funzione principale è quella di regolare il traffico dei leucociti.

• Gradiente chemotattico

• extravasazione delle cellule

• migrazione a livello timico

Il ruolo delle chemochine nel reclutamento delle cellule è duplice. Innanzitutto agiscono sui

leucociti quando questi rotolano lungo le cellule endoteliali verso le sedi di infiammazione,

trasformando questo rotolamento in un legame stabile che innesca un cambiamento

conformazionale nelle molecole di adesione conosciute come integrine leucocitarie, che rende i

leucociti capaci di legarsi saldamente al loro ligando sulle cellule endoteliali. Questo a sua volta

permette al leucocita di passare attraverso la parete del vaso sanguigno schiacciandosi tra le cellule

endoteliali. Inoltre le chemochine dirigono la migrazione del leucocita lungo un gradiente di

molecole di chemochine legate alla matrice extracellulare e alle superfici delle cellule endoteliali.

Questo gradiente aumenta in concentrazione verso il sito di infezione.

Le chemochine sono prodotte da un’ampia varietà di tipi di cellule come risposta a prodotti

batterici, virus e agenti che causano danno cellulare, come il silicio, l’allume, o i cristalli di urati

che si formano nella gotta. 61

I recettori per le chemochine sono delle proteine che attraversano la membrana 7 volte accoppiate a

proteine G. La chemochina lega il recettore, la proteina G si accoppia al recettore per la chemochina

il GDP si trasforma in GTP consentendo il legame con la terza proteina e la dissociazione tra la

subunità α e β.

La via di trasmissione del segnale stimolata dalle chemochine causa cambiamenti dell’adesività

delle cellule e cambiamenti nel citoscheletro della cellula che portano alla migrazione orientata

Il CCR5 è il recettore per il virus dell’HIV che è quello più diffuso che causa la malattia, assieme

alla molecola CD4 delle cellule T e ne causa la morte. Esistono degli individui che hanno una

delezione nel recettore CCR5 e risultano essere resistenti al virus. Questa delezione non causa

alcuna immunodeficienza e non si infettano con il virus. Questa mutazione è relativamente diffusa

nella popolazione nera.

Il CXCR4 è il recettore per un altro virus che usa anche questo il CD4.

Il virus entra, e a livello locale, infetta le CD4 in loco o può essere captato dalle cellule dendritiche,

che hanno la capacità di migrare entrando nei vasi linfatici afferenti, arrivano ai linfonodi e i virus

arrivano alle cellule T infettando le CD4. Le categorie a rischio erano i tossicodipendenti

(eroinomani), omosessuali e il personale sanitario.

62

Immunità innata

• Paul Ehrlich scoprì il siero antitossico contro la difterite. Sosteneva l'esistenza degli

anticorpi e che l’antigene era riconosciuto in maniera specifica.→ immunità adattativa

• Alie Metchnikoff: teorizzò l’esistenza dell’immunità innata, con dei fagociti che

costituivano la prima linea di difesa.

A partire dal 1997 ci sono stati notevoli scoperte riguardanti l’immunità innata.

Le prime linee di difesa ad opera dell'immunità innata comprendono diverse classi di molecole

solubili presenti nel sangue, nel liquido extracellulare e nelle secrezioni epiteliali che possono

uccidere il patogeno o indebolire i suoi effetti.

• Enzimi antimicrobici: digeriscono le pareti delle cellule batteriche

• peptidi antimicrobici: lisano direttamente le membrane della cellula batterica

• sistema del complemento: indicano come bersaglio i patogeni per la lisi e per la fagocitosi

da parte di macrofagi.

Le cellule immunitarie innate sentono la presenza di un patogeno riconoscendo le molecole tipiche

di un microbo e non condivise dalle cellule dell’ospite, ossia i profili molecolari associati al

patogeno, PAMP (pathogen associated molecolare patterns pattern molecolari associati al

patogeno), attraverso i pattern recognition receptors PRR e diventano attivate sviluppando

parecchi meccanismi effettori diversi per eliminare l’infezione.

I recettori dell’immunità innata sono dei recettori codificati nel genoma e non hanno una

distribuzione clonale e riconoscono caratteristiche che sono comuni a molti patogeni. I recettori per

l’antigene dell’immunità adattativa si originano con fenomeni di adattamento, con andamento

clonale. L’immunità adattativa è più tardiva rispetto a quella innata. I riconoscimenti dell’antigene

dell’immunità innata non è strettamente specifico, a differenza di quella adattativa.

Le cellule dell’immunità adattativa si attivano in maniera antigeno specifica, mentre quelle

dell’immunità innata si attivano in maniera indipendente e processano e presentano l’antigene alle

cellule dell’immunità adattativa. Vi è la necessità anche di un secondo segnale (co-segnalazione)

che è dato dalle cellule dell’immunità innata. Sono le cellule dell’immunità innata che dicono alle

cellule T se si devono attivare o meno. Una cellula T non è in grado di stabilire quando un peptide è

self o meno, è grazie all’interazione con le cellule dell'immunità innata che le cellule T ricevono

l’informazione per attivarsi.

• sono le cellule dell’immunità innata che attivano il sistema

1989 Charles Janeway:

immunitario. Egli propose la teoria dei pattern recognition receptors (PRR), sosteneva che le

cellule dendritiche e i macrofagi presentassero dei recettori PRR che riconoscono delle

molecolari presenti nei moo (PAMPs), i quali trasducono un segnale all’interno

strutture

della cellula e attivano le cellule dell’immunità innata in modo tale che queste cellule

possano poi attivare le cellule dell’immunità adattativa. Janeway ipotizzò che questo

meccanismo di riconoscimento fosse conservato in tutti gli organismi viventi, dalle piante

all’uomo. 63

• 1985 era stato identificato un gene chiamato Toll che significa “weird” che era responsabile

della formazione tubo neurale. Tale recettore aveva una porzione intercellurare molto simili

ad un gene infiammatorio nell’uomo.

• 1996 mutante di Toll (senza gene Toll): drosophila non era più in grado di contrastare moo.

Drosophila non ha immunità adattativa essendo invertebrato. Per omologia di sequenze si

identificare nell’uomo il gene omologo a Toll. Tale gene venne definito come

giunse ad Toll

like receptor (TLR4). Se la proteina veniva espresse e cross linkata, induceva un segnale e

dava la cosegnalazioene.

• Qualche anno dopo si scoprì che il TLR era il recettore PRR che era in grado di riconoscere

un PAMP.

• 1994 Polly Matzinger: secondo lei il sistema

immunitario si attivava ogni qualvolta

l’organismo si trovasse in una situazione di

pericolo “danger model”. Secondo lei una cellula

in condizioni di pericolo rilascia segnali di

pericolo/ stress che vengono chiamati DAMPs. In

questo caso il sistema immunitario si può attivare

anche contro i self. I DAMP sono segnali di

pericolo endogeni, rilasciati dalle cellule e

riconosciuti da recettori (ne sono stati identificati 2-3, nessuno però in grado di attivare

autonomamente la risposta immunitaria), mentre i PAMP sono strutture molecolari associate

ai moo.

Non sono molti questi recettori, circa un centinaio, ma controllano l’immunità adattativa. I recettori

sulla superficie cellulare, sui compartimenti endosomiali e portano all’attivazione

Toll si trovano

della cellula. Oltre ai TLR sono stati identificati altri recettori che riconoscono altre categorie di

PAMP:

• CLR: sono coinvolti nel riconoscimento dei funghi e sono presenti sulla membrana. Il

capostipite è la lectina1 che riconosce i betaglucani sulla parete dei funghi; essa è una

lectina di tipo C, quindi questa famiglia è chiama C-type lectin receptors.

• NLR: si trovano nel citosol, con capostipite NOD1 e NOD2

• RLR: coinvolti nel riconoscimento di acidi nucleici virali. Si trovano nel citosol.

Questi recettori attivano l’immunità di tipo I, i recettori dell’immunità innata di tipo II non si

conoscono. A seconda del tipo di ligando posso avere patter di attivazione diversi. Il fatto che questi

recettori legano in maniera non-specifica vuol dire che, ad esempio. TLR4 lega LPS di Salmonella,

di E.coli, di alcuni virus, insomma molteplici molecole diverse, di origine batterica.

In sintesi, le cellule dell’immunità innata (macrofagi, cellule dendritiche) esprimono i PRR;

arrivano nel sito infiammatorio, i PRR legandosi al loro ligando trasducono un segnale: come prima

cosa producono citochine infiammatorie, che attiveranno a valle tutto il processo infiammatorio. Le

cellule attivate tramite PRR sono poi in grado di attivare la risposta adattativa.

64

• Segnale 1 (di riconoscimento): la cellula T con il suo recettore, interagisce con il complesso

MHC + peptide.

• Segnale 2 (di attivazione): la costimolazione, che decide se la risposta si deve attiare omeno

• Segnale 3 (di differenziamento): dal tipo di citochine prodotte dipenderà il differenziamento

della risposta T → a seconda del moo, attivo un differente PRR, produco una differente

citochina, attivo una differente cellula T

TLR

I TLR di mammifero riconoscono forme molecolari caratteristiche di batteri G+ e G-, di funghi e di

virus. Le pareti e le membrane delle cellule batteriche sono composte di insieme ripetuti di proteine,

carboidrati e lipidi, molti dei quali non si trovano nelle cellule animali. Tra questi, gli acidi

lipoteicoici delle pareti cellulari dei batteri G+ e il lipolisaccaride LPS della membrana esterna dei

batteri G- sono particolarmente importanti nel riconoscimento dei batteri da parte del sistema

dell'immunità innata, e sono riconosciuti dai TLR. Alcuni TLR dei mammiferi sono recettori della

superficie cellulare simili ai Toll della Drosophila, ma altri sono localizzati dentro la cellula nelle

membrane degli endosomi, dove essi scoprono i patogeni che sono stati portati dentro la cellula

dalla fagocitosi. Essi sono proteine che attraversano la membrana solo una volta con una regione

extracellulare composta da una ripetizione ricca di leucina LRR. Queste LRR multiple creano una

proteina ponte a forma di ferro di cavallo che è adattabile per legare e per riconoscere il ligando sia

sulla superficie esterna sia su quella interna. I TLR dei mammiferi sono attivati quando il legame di

un ligando li induce a formare dimeri o oligomeri. Tutte le proteine TLR dei mammiferi hanno un

dominio TIR (per recettore Toll-IL-1) nella loro coda citoplasmatica, che interagisce con altri

domini tipo TIR.

• TLR-1, TLR-2 e TLR-6 sono recettori della superficie cellulare che sono attivati da ligandi

diversi che comprendono l’acido lipotecoico e le lipoproteine. Essi sono stati trovati su

macrofagi, cellule dendritiche, eosinofili, basofili e mastociti.

• TLR-5 è espresso sulla superficie cellulare di macrofagi, cellule dendritiche e cellule

epiteliali intestinali; esso riconosce la flagellina, la subunità della proteina dei flagelli dei

batteri

• TLR9 e TLR7 sono presenti a livello del compartimento lisosomiale. Vengono sintetizzati a

livello del RE e possono essere trasferiti direttamente all’endosoma, ma prima devono

subire un taglio proteolitico in modo da poter attivarsi. Tali recettori sono coinvolti nel

riconoscimento di acidi nucleici virali. Il TLR9 trasdurrà il segnale usando my88.

TLR4

TLR-4 è espresso da parecchi tipi di cellule del sistema immunitario, compresi i macrofagi. TLR-4

riconosce il lipolisaccaride batterico con un meccanismo che è in parte diretto e in parte indiretto.

L’infezione sistemica di LPS causa un collasso dei sistemi circolatori e respiratorio, una condizione

conosciuta come shock. Questi drammatici effetti del LPS si vedono negli esseri umani nello shock

che è causato da un’infezione batterica non controllata, o

settico, sepsi.

65

Utilizza tutte e 4 le molecole richieste per la trasduzione del segnale. Presenta una porzione

extracellulare del recettore che è comune a tutti i TLR (regione a ferro di cavallo) che è coinvolta

nel legame con l’antigene. Presentano numerose ripetizioni di leucine che sono quelle che

determinano la forma a ferro di cavallo. La porzione che trasduce il segnale è la porzione TIR che è

simile alla porzione intracellulare di Torr.

Riconoscimento del lipopolisaccaride

LPS: porzione lipidica idrofobica e porzione ricca di

disaccaridi. A seconda dell’LPS che si usa, si hanno trasduzioni

del segnale diverse. LPS non viene riconosciuto come tale, è

la presenza di un’altra proteina

necessaria LBP (LPS binding

protein). Tale proteine può accoglie, nella sua parte interna, il

lipopolisaccaride. Il TLR4 per riconosce l’LPS ha bisogno

dell’MD2. Quando LPS è legato al complesso MD2 e TLR4, il

recettore dimerizza e inizia la trasduzione del segnale.

CD14 presenta LPS al MD2 e al TLR4. Anche CD14 ha una struttura a ferro di cavallo ed è inserito

nella membrana con una coda di fosfoatildilinositolo. CD14 è localizzato prevalentemente a livello

dei lipid rafts.

Un primo segnale parte dalla membrana che richiede MyD88 e vi è una prima attivazione del

pathway. L’intero complesso recettoriale viene internalizzato nell’endosoma in modo da poter

attivare i fattori di trascrizione (IRF o NFkB) che portano alla produzione di interleuchina 6,

interferoni di tipo I. Tutti i recettori segnalano in maniera MyD88 dipendente tranne TLR3 che

segnalano in maniera TRIF-dipendente.

Due domini proteici di MyD88 sono responsabili della sua funzione come adattatore: un dominio

TIR al terminale carbossilico e un dominio di morte al terminale amminico. I domio TIR di MyD88

interagisce con il dominio TIR del TLR, mentre il dominio di morte recluta e attiva due proteina

chinasi serina-treonina (IRAK4 e RAK1)

La trasduzione del segnale porta:

• aumento di MHC II (segnale I)

• produzione di citochine infiammatorie (segnale 3) e stabilisce il differenziamento

• regolazione della costimolazione (segnale 2) e stabilisce l’attivazione della cellula T

In caso di infezione: a livello tissutale viene attivata la risposta infiammatoria. Le cellule

dendritiche migrano e giungono ai linfonodi. Nei linfonodi esprimono alti livelli di MHC di classe I

e classe II, citochine.

I recettori del Danger

Nel modello Danger non solo le strutture molecolari associate agli organismi sono in grado di

attivare il sistema immunitario, ma questo sarebbe in grado di distinguere ciò che è pericoloso da

ciò che non lo è. La teoria del danger non è ancora stata pienamente dimostrata. CLEC9 (recettore

che fa parte della famiglia del timo) è in grado di riconoscere cellule necrofile. Non è un recettore in

66

grado di indurre le cellule dendritiche attive, non è in grado di svolgere funzioni della risposta

innata, svolgere funzione esclusivamente della co-presentazione.

RLH e NLR: il riconoscimento citoplasmatico del pericolo

Le cellule hanno dei meccanismi intrinseci del riconoscimento dei recettori, che sono in grado di

interferire con la replicazione virale. Ci sono altre proteine che vengono indotte e servono ad

impedire la replicazione dei virus. Vi sono altri meccanismi di riconoscimento virale che dipendono

dai PRR. I virus possono essere riconosciuti dai TLR che si trovano nei compartimenti lisosomiali,

e dai NRL che si trovano nel citosol, in quanto vengono riconosciuti gli acidi nucleici virali.

L’attivazione dei PRR in seguito ad infezione virale porta all’attivazione di citochine infiammatorie,

ma anche alla produzione di interferoni di tipo I. Nell’uomo ci sono cellule specializzate che

producono interferoni di tipo I e sono definite come cellule dendritiche plasmocitoidi.

Ci sono due sottotipi di tipo I:

• interferone beta

• interferone alfa: ci sono 13 tipi diversi

Gli interferoni possono essere prodotti da tutte le cellule nucleate in risposta a infezione virale. Il

bersaglio degli interferoni di tipo I sono tutte le cellule che esprimono i recettori per gli interferoni

di tipo I, ma soprattutto le cellule NK. Gli interferoni istruiscono le cellule dendritiche in modo di

dar luogo la risposta adattativa. Gli interferoni prendono questo nome in quanto erano state

identificate come molecole che interferivano con la risposta virale. Gli interferoni di tipo I possono

anche promuovere l’apoptosi in modo tale che le cellule non si replichino.

1. Virus infetta la cellula

2. infezione virale può essere captata da TLR o NLR

3. tramite fattori IRF e NFkB si attivano la produzione degli interferoni di tipo I

4. gli interferoni di tipo I possono aumentare la loro produzione attraverso un feedback

positivo.

I recettori NLR prendono questo nome da NOD, NOD like receptor.

• NOD: recettore citosolico, riconosce frammenti di peptidoglicano, sia dei batteri gram

positivi che dei batteri gram negativi. Il peptidoglicano può far parte della parete esterna. Il

riconoscimento potrà essere diretto e i frammenti di peptidoglicano si possono liberare nel

citosol e i recettori NOD possono riconoscerli direttamente nel citosol. Vi può essere un

riconoscimento indiretto mediato da dei corecettori che prendono il ligando e lo portano nel

citosol (es. CD14)

◦ NOD1

◦ NOD2 richiesti per la formazione dell’inflamosoma. Questi recettori non

• NALP: recettori

riconoscono in maniera diretta il ligando. Sono in grado di avvertire gli stress cellulari

(alterazioni della membrana, alterazioni delle correnti di membrana) e per questo sono anche

67

chiamati sensori del pericolo. Presentano il dominio CARD (dominio di reclutamento della

caspasi) che serve per la trasduzione del segnale, il dominio NATCH di oligomerizzazione e

una regione ricca di leucine a ferro di cavallo. Lo scopo dell’attivazione dell’inflamosoma è

arrivare alla produzione dell’interleuchina 1-beta funzionale IL-1beta che ha un ruolo

fondamentale nel reclutamento cellulare, e nell’innalzamento della temperatura. La sua

produzione è regolata a più livelli, perché la produzione prolungata è patologica e porta a

danno tissutale. L’infiammazione cronica può portare ad uno shock di eccessiva produzione

di citochine infiammatorie. Ci sono due segnali per la produzione di IL-1beta:

◦ segnale 1: per la produzione del messaggero che porta alla produzione di proIL-1beta,

questo segnale è dato da qualunque attivazione di PRR

◦ segnale 2: taglio proteolitico di proIL-1beta in modo tale che passi dalla forma inattiva

alla forma attiva. Affinché tutto questo si verifichi c’è bisogno dell’attivazione

dell’inflamosoma.

Uno stress cellulare attiva l’inflamosoma e i recettori NAL oligomerizzano attraverso NATCH e

richiamano un adattatore che si chiama ASC che ha un dominio CARD, il quale a sua volta

richiama la procaspasi 1, che diventa caspasi 1 attiva, che chiama la proiL-1beta che la fa diventare

IL-1beta che può essere liberata dalla cellula e svolgere le sue funzioni infiammatorie. Le caspasi

che vengono attivate dall’inflamosoma sono chiamate caspasi infiammatorie. Un altro gruppo di

apoptosi. Un’elevata concentrazione di ATP intracellulare attiva l’inflamosoma; i

caspasi inducono

cristalli di acido urico vengono rilasciati da cellule che sono andati incontro a morte, danno origine

alla gotta, dovuta ad un’attivazione cronica dell’inflamosoma. Aggregati di betamiloidi provoca

l’Alzhaimer, in quanto attiva l’inflamosoma. La polvere di amianto (asbestos) provoca

un’attivazione cronica del processo infiammatorio (attivazione cronica dell’inflamosoma)

predispone ai tumori. Nel caso di infiammazione cronica, il danno e il riparo tissutale coesistono e il

riparo è difficilmente controllabile poiché è costantemente attiva e porta ad un ambiente in cui il

tumore si origina. l’allume, che si usa nei vaccini, porta all’attivazione dell’inflamosoma.

Le caspasi sono state quindi suddivise in due gruppi:

portano all’apoptosi: sono prodotte generalmente all’interno della cellula come

quelle che

1. enzimi inattivi (zimonogeni) che si attivano per un taglio proteolitico; divenuti attivi

attivano a loro volta proteine a valle sempre tramite taglio proteolitico. Esempio della 3, la 6

la 7. Uno dei recettori del TNF attiva la procaspasi 8, la quale viene attivata ed attiverà poi

le caspasi effettrici (come ad esempio la 3), che attiva delle DNAasi a valle, che entrano nel

nucleo e mandano la cellula in apoptosi tramite taglio di DNA. Il dominio intracellulare

viene detto “dominio di morte”.

ad esempio la 11 la 1, che portano alla produzione dell’IL-1beta

Le caspasi infiammatorie:

2. attiva. Vengono attivate dall’inflamosoma. Diversi stimoli possono indurre

l’oligomerizzazione dei recettori NALF, che porta al richiamo di ASC, la quale richiama

caspasi 1, che tramite taglio proteolitico dello zimogeno diventa attiva; a questo punto tagli

la proIL-1beta, che diventa IL-1beta e va a legarsi ai suoi recettori. Gli stimoli possono

essere microbi, che legano gli NLR all’interno della cellula (più raro) oppure altri tipi di

stimoli che perturbano la membrana, che sono cioè di stress per la cellula: gli inflammasomi

68

sono dei segnali di stress per la cellula ( patogeni, che possono non legare direttamente

l’inflammasoma ma molecole intermedie che lo attivano + ATP extracellulare + cristalli di

acido urico, che vengono prodotti da cellule danneggiate, come nel caso della gotta +

amianto + allume, anche se è oggetto di controversia e sono stati pubblicati articoli

contrastanti). Tutti questi segnali di pericolo o proteine batteriche sono in grado di attivare

l’inflammasoma direttamente, o indirettamente generando danni alla membrana o

cambiamento degli scambio osmotici a livello della membrana, in particolare un efflusso di

+

K

L’inflamosoma si attiva a causa di stress cellulari che possono essere causati da:

• ATP extracellulare

• acido urico

• silicio e amianto

• alluminio un’attivazione cronica dell’inflamosoma. Stimoli acuti attivano il

l diabete senile è dovuto ad

sistema immunitario.

Nel citosol esistono altri recettori degli acidi nucleici virali e sono i recettori della famiglia degli

RLR (il primo recettore ad essere identificato è stato RIG-I e si chiamano RIG like receptor)

• RIG-I: è costituito da due domini CARD a cui si possono legare altre molecole; un dominio

elastico, che lega l’RNA e un dominio repressore. I ligandi possono essere: RNA genomico

virale, trascritti che si generano in seguito a infezione virale. Normalmente RIG-I è presente

nella cellula in una forma inattiva, dove il dominio CARD è bloccato dalla regione

inibitoria. In seguito all’interazione con l’RNA virale, RIG-I cambia conformazione, si apre,

e libera il dominio CARD che potrà legare delle proteine a valle che servono per la

segnalazione. Saranno trascritte le citochine infiammatorie e gli interferoni di tipo I.

• MDA-5: sente il dsRNA. Mutazioni che inattivano MDA-5 umano portano a una

diminuzione del rischio di sviluppare il diabete di tipo 1 (malattia autoimmune)

• LGP-2

Gli RNA virali possono essere riconosciuti anche dai TLR all’interno dei lisosomi, nel caso in cui

un virus venga endocitato come immunocomplesso. I sintomi dell’influenza sono dovuti

all’attivazione delle citochine infiammatorie. 69

Cellule dell’immunità innata

La maggior parte delle cellule dell’immunità innata è in grado di rispondere anche alle Ig, agendo

da cellule accessorie nell’eliminazione dei patogeni mediata da Abs:

• Opsonizzazione (macrofagi e neutrofili)

• ADCC (antibody dependent cellular citotoxicity): NK

• IgE cross-linking: MC e Basofili

Cellule dendritiche

Prendono questo nome perché presentano dei prolungamenti

che ricordano dei dendriti. Le cellule dendritiche sanno che

tipo di infezione è avvenuta grazie ai PRR. Hanno una

localizzazione ubiquitaria e sono molto concentrate a livello

della cute e delle mucose, vale a dire in tutti i siti di ingresso

dei moo. Hanno dei recettori con i quali possono interagire

con i moo e indurre la risposta immunitaria. In seguito

all’interazione con i moo producono citochine e chemochine

per l’attivazione dell’immunità adattativa.

e molecole co-stimolatorie

Le cellule dendritiche sono in grado di fagocitare i moo, in modo da poter presentare l’antigene e

attivano le cellule T appropriate al tipo di infezione.

Le cellule dendritiche derivano da precursori del midollo osseo e la maggior parte sono di origine

mieloide. Soltanto alcune di quelle che si trovano nella cute si sa che on sono di ordine mieloide né

linfoide, quindi derivano probabilmente dal sacco vitellino. Perlopiù le cellule dendritiche

convenzionali derivano da un precursore comune mieloide, che nel midollo osseo da origine ad un

progenitore, che entra nel sangue e raggiunge tessuti e organi linfoidi secondari dove andrà incontro

ad un processo di maturazione in seguito all’interazione con i PAMP. Una volta maturate lasciano il

tessuto alla volta dei linfonodi, dove attivano la risposta adattativa Dai precursori originano dei

progenitori che si distribuiscono a tutti i vari tessuti. È nei tessuti che terminerà il processo di

maturazione. Le cellule dendritiche nei tessuti, che non hanno ricevuto stimoli infiammatori,

vengono definite cellule dendritiche immature.

Esistono due grosse classi di cellule dendritiche:

• cellule dendritiche convenzionali o classiche: sono di origine mieloide e derivano dal

precursore mieloide del midollo osseo e sono presenti in tutti i tessuti. Sono specializzate

nella presentazione dell’antigene e si distinguono in due sottogruppi:

◦ cellule dendritiche migratorie: localizzate nei tessuti di organi non linfoidi (es. cute,

cellule di Langherans)

◦ cellule dendritiche residenti negli organi linfoidi: cellule dendritiche immature che si

trovano negli organi linfoidi secondari.

70

Per molti anni è stato complicato studiare queste cellule perché sono poco presenti nel circolo e

perché purificarle dai tessuti era un processo che portava ad attivazione di quelle cellule che

diventavano mature. Gli studi sulla biologia di queste cellule, sono iniziati quando si sono messi a

punto dei protocolli per il differenziamento in vitro di cellule dendritiche immature per poi indurne

la maturazione. Tutti gli studi sulla presentazione dell’antigene sono stati condotti a partire da

queste cellule. Nella loro forma immatura sono in grado di sopravvivere in presenza di fattori di

crescita. Il loro fattore di crescita principale si chiama GM-CSF. Queste cellule vengono

continuamente rinnovate fino a quando rimangano immature. Quando ricevono degli stimoli di

maturazione (es. vengono in contatto con dei moo) vanno incontro a maturazione, svolgono le loro

funzioni e muoiono per apoptosi.

• cellule dendritiche plasmacitoidi: sono di origine linfoide, specializzate nella produzione

esprimono i PRR che portano all’attivazione dei fattori

degli interferoni di tipo I. Nell’umo

di trascrizione IRFe quindi alla produzione degli interferoni di tipo I. Esprimono tutti i TRL

che sono importanti nel riconoscimento degli acidi nucleici. Gli interferoni di tipo I saranno

per l’attivazione delle cellule NK. Le cellule NK sono in genere la prima sorgente

richiesti

di cellule gamma e sono la sorgente principale per attivare l’immunità di tipo I.

Le cellule dendritiche captano l’antigene in modi diversi:

• estroflessione di pseudopodi,

• pinocitosi

• macropinocitosi: internalizzano vescicole che contengono sostanza particolate e molta

acqua.

Lo scopo di tali processi è di captare l’antigene per poter attivare l’immunità adattativa. Esprimono

una serie di recettori dell’immunità innata: PRR che servono per la loro attivazione e altri recettori

che servono per l’internalizzazione dell’antigene.

Maturazione

Nei tessuti ci sono cellule dendritiche immature che vengono in contatto con gli antigeni e vanno in

contro al processo di maturazione. Con il processo di maturazione, le cellule dendritiche assumono

capacità migratorie e presentano sulla superficie molecole MHC e molecole co-stimolatorie.

Migrazione: le cellule dendritiche

entrano nei vasi linfatici afferenti e

raggiungono i linfonodi che drenano

il tessuto dove è avvenuta

l’infezione. Nei linfonodi

attiveranno le cellule T e

contribuiranno all’attivazione delle

cellule B. Tutto il traffico costitutivo

è regolato dalle chemochine. Finché

le cellule dendritiche sono

immature, esprimono una serie di

recettori per chemochine che le

71

mantengono ancorate al tessuto. In seguito ad attivazione, vengono stimolate con il

lipopolisaccaride e il recettore per le chemochine tissutali vengono down regolati e up regola il

CCR7, che è un recettore che vene attivato in tutte le cellule dendritiche che devono arrivare ai

linfonodi.

La frequenza delle cellule T antigene specifica è molto bassa, perché i recettori vengono espressi in

maniera casuale, pertanto vi è la necessità di trovarsi in un luogo dove i contatti siano favoriti e per

questo che le cellule dendritiche migrano nei linfonodi per attivare la risposta T. La polpa bianca

della milza come il linfonodo sono regioni dove vengono favori i contatti con le cellule T.

I movimenti sono indotti da modificazioni del citoscheletro. La maturazione le trasforma in cellule

che presentano l’antigene e basta. Nel giro di 24-48h arriva ai linfonodi ed è una cellula adibita

esclusivamente alla presentazione dell’antigene. Modificando il proprio citoscheletro diventano

cellule polarizzate. Nel tragitto dal tessuto al linfonodo maturano.

• Segnale I: espressione di alti livelli di complesso MHC + peptide

• segnale II: espressione di alti livelli di molecole co-stimolatorie CD80

Quando la cellula dendritica e la cellula T si trovano, si forma la sinapsi immunologica. Della

sinapsi immunologica fanno parte:

• complessi MHC+peptide

• molecole co-stimolatorie di cui le più rappresentative sono B71 e B72

• molecole di adesione che servono per un primo contatto tra le cellule

Alcune cellule T forniscono 3 segnali: complesso MHC+peptide, co-stimolazione, citochine

infiammatorie. Aumenta l’efficienza di processamento e presentazione dell’antigene e c’è

upregolazione delle molecole co-stimolatorie. La classe di molecole che interviene prima

nell’interazione cellula dendritica-cellula T è quella delle molecole di adesione; se non è presente

l’antigene il contatto dura pochi secondi (touch and go) altrimenti il contatto si stabilizza /segnale

1): intervengono una serie di molecole co-stimolatorie, le più famose delle quali sono B7-1 e 2 dalla

parte delle cellule dendritiche e CD28 sulle cellule T. l’interazione tra queste molecole è il segnale

2. Un’altra molecola co-stimolatoria importante è CD40 sulla cellula dendritica, ligando di CD40

sulla cellula T. le cellule T prendono inizialmente contatto con le dendritiche attraverso le molecole

di adesione; se avviene il riconoscimento dell’antigene il contatto si stabilizza, poi, se è presente la

co-stimolazione (che non è costitutiva, ma inducibile dai PRR) ci sarà il segnale di attivazione. Una

cellula si attiva se vede i segnali 1 e 2 e differenzia in maniera opportuna se vede il segnale 3

(sempre indotto dai PRR e rappresentato dalle citochine). Il processo di maturazione è definitivo, la

cellula non tornerà più indietro, a differenza dei macrofagi.

Cross presentation dell’antigene da parte delle cellule dendritiche:

• La cross-presentation è la capacità delle cellule dendritiche di fornire antigeni esogeni al

processo di elaborazione e presentazione MHC di classe I per l'attivazione delle cellule T

CD8.

• Il processo è rapido, che si verifica entro 3 - 4 ore dopo l'assunzione di antigene.

72

• Il processo richiede un percorso endocitico funzionale - richiede altresì un complesso

funzionale TAP, una funzione proteosomiale e un normale trasporto da ER-Golgi alla

superficie cellulare.

• Il processo è inibito se le attività fagocitiche e macropinocitiche della DC sono inibite.

• Suggerisce che la DC degrada l'antigene esogeno in un compartimento lisosomico e quindi

rilascia peptidi relativamente lunghi nel citoplasma, dove vengono ubiquinati, ulteriormente

ceduti dal proteosoma e poi consegnati alla ER da TAP.

Nel caso dalla presentazione dell’antigene aumenta, l’efficienza di generazione dei peptidi:

• I si forma l’immunoproteasoma. Inoltre le molecole MHC di classe I vengono

per la classe

sintetizzate più efficientemente ed aumenta l’efficienza della persistenza del complesso

MHC + peptide.

• Per quanto riguarda la classe I aumenta l’efficienza di generazione di peptidi all’interno di

un compartimento endolisosomiale.. le molecole MHC di classe II sono nel compartimento

quest’ultima e la classe II non vengono sintetizzate

NIIC, insieme alla proteina HLA-DM:

nuovamente ma aumenta efficientemente il loro trasporto sulla superficie della cellula.

L’aumento dell’efficienza dell’interazione MHC+peptide avviene anche per la classe II.

Processo infiammatorio

L’attivazione delle cellule del sistema immunitario innato causa l’induzione del processo

infiammatorio macrofagi, cellule dendritiche, …”sentono” la presenza del patogeno

• Neutrofili,

• Segue l’attivazione del processo di fagocitosi e il rilascio di citochine e chemochine che

causano l’infiammazione: calor, rubor, tumor, dolor

è un processo che deve essere precoce e durare poco nel tempo, altrimenti

Il processo infiammatorio

saranno maggiori i danni tissutali. Inizia entro poche ore un’infezione o una ferita. L’infiammazione

svolge tre ruoli essenziali nel combattere le infezioni:

1. inviare molecole e cellule effettrici dal sangue ai siti di infezione, per aumentare così la

distruzione dei moo invasori

2. indurre una coagulazione locale, che fornisce una barriera fisica alla diffusione

dell’infezione nel circolo sanguigno

3. favorire la riparazione del tessuto danneggiato.

segni cardinali dell’infiammazione sono

I quattro

1. rossore

2. gonfiore

3. calore

4. dolore 73

Gli aspetti dell’infiammazione sono:

1. vasodilatazione

2. permeabilità vascolare e edema

3. migrazione leucociti (maggiormente PMNs)

L’infiammazione è una risposta ad un insulto di origine fisica, chimica o microbioloigca. È una

risposta immediata. I ca mbiamenti che avvengono nell’endotelio, come conseguenza

dell’infiammazione sono generalmente conosciuti come attivazione endoteliale.

all’essudato o al trasudato.

• Edema: accumulo di liquidi nel tessuto e può essere dovuto

liquidi con basso contenuto proteico (>albuina) → alterazione pressoria ma

◦ Trasudato:

non della permeabilità endoteliale

◦ Essudato: passaggio di liquidi, cellule e proteine da vasi a tessuti interstiziali (essudato

purulento= ricco di neutrofili).

In condizioni fisiologiche: il sangue passa attraverso i vasi e i capillari e parte del liquido sanguigno

viene rilasciato nello spazio interstiziale e parte di questo liquido passerà attraverso le vene post

capillari e verrà riassorbito. Ciò che non verrà riassorbito andrà ai vasi linfatici e ai linfonodi. In

presenza di stimoli meccanici, fisici, microbiologici, a livello tissutale vengono rilasciati dei segnali

i quali contengono mediatori vaso attivi, che agiscono sui vasi e determinano attivazione dei vasi

sanguigni. Questi mediatori che vengono rilasciati a livello tissutale, sono rilasciati dalle cellule del

sistema immunitario innato e determinano l’attivazione dei vasi. Alcuni di questi stimoli sono ad

TNF. In seguito all’attivazione, vi è una vasodilatazione dei vasi

esempio le citochine infiammatorie

sanguigni precapillari in modo da aumentare il flusso e diminuire la velocità. Il sangue si fa più

viscoso e la velocità diminuisce. Ciò determina un aumento della pressione idrostatica sui capillari e

ciò porta alla fuoriuscita del liquido. In questa prima fase vi è un aumento della permeabilità ai

liquidi e alle proteine plasmatiche. Il passaggio delle proteine plasmatiche dal sangue ai tessuti, fa

del sangue. Il liquido si accumula a formare l’edema.

diminuire la pressione osmotica

Successivamente inizierà il reclutamento delle cellule infiammatorie locali (neutrofili). L’aumento

del flusso determina calore e rossore, il rilascio del liquido determina gonfiore.

Le citochine che vengono prodotte a livello locale, attivano i vasi. Vengono prodotte anche

chemochine che consentono il reclutamento di cellule infiammatorie. Questa prima fase prelude al

riparo (l’infiammazione è anche necessaria per il riparo tissutale).

74

L’extravasazione si compone di 4 fasi:

1. rotolamento

2. fase di attivazione

fase di arresto e di adesione all’endotelio

3. fase di trasnmigrazione attraverso l’endotelio

4.

Le molecole importanti per il reclutamento dal sangue al tessuto per

l’estravasazione sono molecole d’adesione CAM (cell adhesion molecules).

Quando l’endotelio viene attivato, esprime sulla sua superficie delle

molecole che servono per l’adesione dei leucociti. Vi sono 4 famiglie di

molecole di adesione:

selettine: glucoproteine di memebrana

1.

2. mucine

integrine LFA-1: si legano a molecole di adesione cellulare e alla

3. matrice extracellulare. Forte aderenza.

ICAM (itercellular adhesion molecules): sono delle CAM con

4. domini immunoglobulinici. Sono il ligando per le integrine.

Inizialmente vi è un’interazione tra le molecole si adesione espresse

dall’endotelio e le molecole di adesione espresse dall’endocita. I neutrofili e

i monociti vengono spinti sulle pareti e aderiscono con le integrine presenti

sulla superficie dell’endotelio attivato in maniera lassa. Queste interazioni si

formano e si staccano e la cellula rotola sull’endotelio. Successivamente,

grazie all’azione mediata da chemochine, questa interazione si stabilizza e

una volta che c’è stato l’arresto della cellula, la cellula può passare. In un

endotelio attivato si fanno ancora più lasse le giunzioni strette tra le cellule.

Le cellule endoteliali aprono il passaggio e le cellule infiammatorie possono

transmigrare.

Un endotelio attivato esprime le E-selettine, il neutrofilo può aderire con le

mucine alle selettine. Tale interazione è molto lassa e la cellula rotola

sull’endotelio. Le chemochine sono riconosciute dai recettori per chemochine espresse sulle cellule.

Si trasduce il segnale, e le integrine cambiano conformazione. Le integrine saranno di interagire in

maniera molto elevata con le ICAM. Le cellule si muovono seguendo un fattore chemotattico.

Le P-selettine vengono espresse sulla membrana delle cellule endoteliali in seguito

1. all’esposizione con un leucotriene B4, o con il frammento C5 a del complemento o con

a

istamina che si libera a partire dalle cellule ghiandolari in risposta a C5 . La comparsa delle

può essere dovuta anche all’esposizione a TNF-alfa

P-selettine o LPS, che provocano la

sintesi della E-selettina, che viene esposta sulla superficie endoteliale più tardivamente.

L’interazione delle P-selettine e delle E-selettine con le glucoproteine su monociti e

neutrofili consente l’adesione reversibile alla parete del vaso, che permette il “rotolamento”

sull’endotelio. 75

L’esposizione delle integrine

2. dei leucociti, che legano molecole come ICAM, avviene ad

Le integrine si legano debolmente, ma grazie all’azione di chemochine,

opera di TNF-alfa.

si uniscono al recettore per chemochine sui leucociti e innescano una cascata del segnale per

conformazione alle integrine, in modo d’aumentare la loro capacità adesiva. Ne

far cambiare

consegue che il leucocita smette di ruotare.

L’interazione tra integrine, PECM (molecole collegate a immunoglobuline) permette al

3. fagocita di migrare tra le cellule endoteliali. Successivamente penetra nella membrana

basale grazie all’azione di enzimi che la degradano. Tale fenomeno viene definito come

diapedesi e permette ai fagociti di entrare nel tessuto sottoendoteliale.

Le chemochine prodotte dal sito di infezione si uniscono ai proteoglicani della matrice

4. extracellulare e su molecole simili sulla superficie delle cellule endoteliali. Ciò genera un

gradiente di concentrazione di chemochine in relazione con la matrice su una superficie

solida, sulla quale il leucocita può migrare fino al sito di infezione

• Movimenti per apotassi:

gradiente di chemoattraenti

immobilizzati rilasciati da

cellule morenti, batteri, cells

stromali e peiteliali legate alla

matrice extracellulare da

cariche negative.

76

Mediatori dell’infiammazione

• chemochine: es. interleuchina 8 per il reclutamento dei neutrofili. Sono delle citochine con

attività chemotattica. Agiscono sulle cellule che hanno recettori per chemochine, che sono

recettori che attraversano la membrana 7 volte e sono accoppiate a proteine G. A seconda

delle chemochine che saranno prodotte dall’infiammazione, saranno attivate cellule diverse.

I neutrofili vengono reclutati sempre e vengono reclutati perché esprimono il recettore per

l’interleuchina 8. I monociti che raggiungono il tessuto diventeranno macrofagi e

contribuiranno assieme ad essi per debellare l’infiammazione. Cellule diverse esprimono

recettori per chemochine diverse. In caso di infezioni da funghi e batteri saranno reclutati i

neutrofili e i monociti.

• mediatori enzimatici presenti nel plasma: sono di varia natura. Vi sono le proteine del

sistema di coagulazione (sistema fibrinolitco) o quelle del sistema del complemento.

mediatori lipidici dell’infiammazione (lecucotrieni, prostaglandine):

• sono derivati dalla

componente della membrana plasmatica (acido arachidonico). Sono prodotti dalle cellule

dell’immunità innata che sono presenti nel tessuto, in seguito all’attivazione dei loro PRR.

L’acido arachidonico viene internalizzato attraverso il pathway. La prostaglandina E2 è un

potente vasodilatatore e induce un aumento della permeabilità vascolare. Deriva dal pathway

delle ciclo-ossigenasi. le citochine che hanno un effetto sui vasi sono l’interleuchina

• citochine infiammatorie:

beta, il TNF alfa. L’interleuchina 8 serve per il reclutamento dei neutrofili. Il 1beta agisce

anche in maniera endocrina e a livello dell’ipotalamo induce un aumento della temperatura

corporea; agisce anche sulle cellule del fegato, inducendo la produzione di cellule

antimicrobiche. IL6 induce la fase acuta delle proteine di secrezione. Il-1, Il6 e TNF alfa

agiscono anche a livello sistemico.

Programmi di stop endogeni:

• Eliminazione del patogeno per fagocitosi

• Diminuzione del recruitment (citochine antiinfiammatorie, ritorno alla normalità

dell’endotelio, inattivazione dei chemioattraenti da enzimi)

• Apoptosi e clearance dei leucociti (citochine antiinfiammatorie, es: IL-10, Fas-FasL,…)

Macrofagi

Sono richiamati precocemente, sono fra le prime cellule a rispondere ad un’infezione, possono

al sito dell’infezione. I macrofagi sono dotati di numerosi recetorri per

essere già presenti

l’internalizzazione dei moo, sono in frado di rilasciare citochine/chemochine e di degradare i moo

ingeriti. Anch’essi possono produrre ROS e derivati di NO (NO viene prodotto a partire dalla sintesi

77

della iNOS sintasi inducibile, che serve a produrre radicali stabili ed instabili di N; suoi potenti

induttori sono LPS e IFNgamma.

Mastociti

sono cellule che nell’evoluzione compaiono molto tardivamente rispetto a tutte le altre. Svolgono

diversi ruoli fondamentali nell’infiammazione. Sono localizzati nella cute e nelle mucose e possono

essere reclutati durante il processo infiammatorio, come cellule immature che poi termineranno il

loro processo di maturazione nella cute o nelle mucose. Si trovano anche a ridosso dei vasi. Queste

cellule esprimono qualsiasi recettore: recettori Toll, recettori per i funghi, CLR, recettore ad alta

affinità per le IgE e il recettore per la porzione costante delle IgG, esprimono anche dei recettori per

la porzione del complemento consentendo l’attivazione dei mastociti.

Sono delle cellule di grosse dimensioni e presentano al loro interno una serie di granuli. All’interno

dei granuli vi sono dei mediatori chiamati pre-formati: istamina (induce vasodilatazione e

contrazione della muscolatura liscia), eparina (anticoagulante e aumenta angiogenesi), proteasi

(importati per digerire la matrice e favorire l’espulsione dei moo o degli organismi pluricellulari),

citochine infiammatorie come Tnf.

rapidamente e secernono mediatori dell’immunità innata: i mediatori prefromati

• Producono

e presenti nei granuli, mediatori lipidici neorformati, citochine e chemochine. Le Mast cells

possono riconoscere PAMP di batteri e parassiti. Il TNFalfa è fondamentale nel richiamare i

neutrofili

Aumentano fortemente il richiamo di altre cellula dell’immunità innata grazie alla loro

• localizzazione a ridosso dei vasi.

• Modificano le risposte adattative successive: richiamano le cellule dendritiche al sito

infiammatorio; attivano le cellule dendritiche mediante il rilascio di TNF IL1beta, istamina

• Indirizzano la risposta Th1/Th2 con la produzione di IL12/IL4

I mastociti possono produrre nuove sostanze infiammatorie che vengono definite di nuova sintesi,

Arachidonico (leucotrieni e prostaglandine) e citochine di

come ad esempio i derivati dell’acido

vario genere, a seconda del tipo di infezione. Possono proliferar nei siti di infezione ma anche

essere richiamate da stimoli chemotattici a partire dal sangue.

I mastociti hanno diversi modi per attivarsi:

• Interazione dei PAM con i TLR, questo tipo di attivazione non porta a degranulazione, in

quanto non vengono rilasciati e mediatori pre-formati, ma vengo rilasciati i mediatori di

nuova sintesi.

• Cross-linking dei recettori della porzione costante delle immunoglobuline. In caso di

esposizione ad un antigene polivalente i recettori per le IgE vengono cross-linkati. Il cross-

linkng dei recettori è un modo molto efficace dell’attivazione dei mastociti. La

degranulazione dei mastociti porta al rilascio dei mediatori pre-formati (istamina, proteasi,

citochine infiammatorie) e successivamente ci sarà la produzione dei mediatori di nuova

sintesi. La contrazione della muscolatura liscia favorisce l’espulsione del parassita anche

con l’eliminazione di muco. Queste cellule degranulano in risposta a veleni di alcune piante

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145

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6.08 MB

AUTORE

yetapia

PUBBLICATO

6 mesi fa


DETTAGLI
Corso di laurea: Corso di laurea in scienze biologiche
SSD:
A.A.: 2018-2019

I contenuti di questa pagina costituiscono rielaborazioni personali del Publisher yetapia di informazioni apprese con la frequenza delle lezioni di Immunologia e patologia generale e studio autonomo di eventuali libri di riferimento in preparazione dell'esame finale o della tesi. Non devono intendersi come materiale ufficiale dell'università Milano Bicocca - Unimib o del prof Granucci Francesca.

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