Il gene come unità funzionale, i batteri, i difetti a base genetica del metabolismo

Trascrizione e regolazione della trascrizione genica

GT.Eucarioti:RNA polimerasi I: rRNA 28S, 18S, 5,8S.o RNA polimerasi II: mRNA, snRNA.o RNA polimerasi III: tRNA, rRNA 5S, snRNA.oNel promotore ci sono almeno tresequenze consenso, chiamati elementiregolatori o del nucleo o core (regioneentro -50bp). In questa regione si indica ilpunto di inizio per l’assemblamento delcomplesso di inizio.Elementi prossimali (regione tra -50 e -200 bp) determinano l’efficienza (intensità) della trascrizione e delpromotore, hanno un ruolo nel determinare come, quando e dove un gene viene espresso: CAAT box e GCbox.Ci sono poi altre combinazioni di sequenze regolatrici: es.: enhancer (+) o silencer (-), situate a monte(alcune trovate anche a valle), specifiche per determinati geni e funzionano per tutti e due gli orientamenti,legano proteine di tipo regolativo (TF) e regolano il livello di espressione.(approfondire su mediatore).→Si trovano tutti sullo stesso filamento in cis.→Fattori di trascrizione (TF): proteine che si

legano alle sequenze regolatrici. Agiscono in trans.Geni ‘‘housekeeping’’. Sempre espressi durante lo sviluppo di un organismo e in tutte le cellule,o necessari per funzioni cellulari di base (es.: actina, glucosio-6-fosfato deidrogenasi);Geni espressi in alcuni tessuti e solo in alcune fasi del ciclo vitale (es.: emoglobina).o TFIID composto da TAF e TBP (TATAbox binding protein) si lega alla TATAbox.Altri TF si legano secondo un ordine benpreciso: TFIIA e TFIIB.Struttura mRNA:COLINEARITA’: Procarioti: tra sequenza del gene e trascritto;eucarioti: tra sequenza del gene e trascritto primario.Eucarioti: trascritto subisce modificazioni all’interno del nucleo, una volta maturo va nel citoplasma:5’ capping: aggiunta cap di 7-metil guanosina, necessario per attacco ribosomi;o 3’ poli adenilazione mRNA poli (A) , conferisce stabilità;+→o Rimozione introni: sequenza codificante di un gene contiene introni ed esoni (portano

informazioni pero la sintesi del polipeptide).Dimostrazione presenza introni:→Il trascritto del gene β globina in topo localizzato nel citoplasma, è lungo 0,7 kb, mentre il pre-mRNA, chesi trova solo nel nucleo è lungo 1.5 kb.Ibridazione DNA-RNA: tra sequenza del gene della β globina in topo:trascritto primario (colinearità);→ RNA maturo.→GENI INTERROTTI o DISCONTINUI: geni degli eucarioti che→contengono introni (poi rimossi) ed esoni.LEZIONE 9. Proteine.Proteina: molecola formata da uno o più polipeptidi (inizio N terminale, fine C terminale).Aminoacidi: unità dei polipeptidi, sono 20 quelli usati nella sintesi proteica;struttura in comune: C centrale, gruppo amminico e carbossilico, gruppo Rspecifico.Due aminoacidi sono legati da un legame peptidico tra un legamecarbossilico e un amminico.Le proteine hanno quattro livelli di organizzazione:struttura primaria: catena lineare di aminoacidi che formano il polipeptide;o

secondaria: ripiegamento con legami deboli-idrogeno o elettrostatici tra gruppi COOH e NH vicinio per formare strutture ad alfa-elica o beta-foglietto;

terziaria: struttura tridimensionale di un singolo polipeptide (folding), distribuzione dei gruppi R eo formazione legami idrogeno, interazioni ioniche, ponti disolfuro;

quaternaria: comprende più catene polipeptidiche, perciò detta multimerica.

Il ripiegamento dipende:

1. dalla struttura primaria (che determina le successive), avviene già durante la traduzione;
2. le chaperonine interagiscono per permetterlo.

Per dimostrare la traduzione, vennero condotti lavori per capire il passaggio tra mRNA e proteine e si evinse che:

1. il codice è a triplette (lavori Francis Crick, 1961) 4 = 64 possibili combinazioni;
2. Lavori sulla decifrazione del codice (anni 60/70) tavola del codice genetico.

Unità del codice: codone o tripletta;

Ciascun codone specifica per un aminoacido;

Il codice è

degenerato (stesso➢ aa codificato da più codoni;

Non è ambiguo;➢ Ci sono dei segnali di inizio➢ (AUG) e di stop o nonsenso(UAA, UAG, UGA);

Non ci sono segni di➢ interpunzione o sovrapposizioni;

È (quasi) universale.➢COLINEARITA’ tra la sequenza delle basi dell’mRNA e la sequenza degli amminoacidi della proteina.

Traduzione.Sintesi catena polipeptidica a partire dall’ mRNA. L’informazione presente sull’mRNA viene tradotta in un→altro linguaggio.

La trascrizione avviene a livello dei ribosomi (rRNA e proteine) e prendono parte componenti tra i quali tRNA.

Avviene per aggiunta di un aminoacido alla volta, seguendo la direzione 5’ 3’ (N terminale C terminale→ →sulla catena polipeptidica). I tRNA sono mediatori tra il messaggero e gliaminoacidi. Trasportano aminoacidi al complessoformato dal ribosoma e gli mRNA.

I tRNA leggono la sequenza delle basi dell’mRNA,leggendo il codone per

complementarietà tra le basi nell'anticodone. Il fatto che ci sono 61 codoni per specificare 20 aminoacidi e non esistono 61 tRNA diversi, porta alla teoria del vacillamento: La terza base del codone durante l'appaiamento con l'anticodone non è sottoposta a restrizioni dal punto di vista tridimensionale (per esempio G si può appaiare con C o U, o U con A o G).

LEZIONE 10. Genetica dei microrganismi. I batteri.

Scoperte importanti per la ricerca di base e applicata:

• Frederick Griffith (1928);
• Avery e collaboratori (anni 40) Scoperta del "principio trasformante" e del DNA come principio trasformante in Streptococcus pneumoniae;
• Hershey e Chase (1953) Scoperta del DNA come "materiale genetico" con esperimenti in E.coli e batteriofagi;
• Francois Jacob e Jaques Monod (1961) Descrivono l'operone lattosio in E.coli, un modello per lo studio della regolazione dell'espressione genica nei procarioti;
• Herb Boyer

E Stanley Cohen (1973) Il primo esperimento di clonaggio in E.coli con l'impiego.

Due esempi di prodotti dell'ingegneria genetica in E.coli:

• Ormone insulina (1981) - Sostituisce quella estratta dalle ghiandole pancreatiche di bovini e maiali;
• Ormone della crescita (1985) - Sostituisce la molecola che veniva estratta dai cadaveri.

Cromosoma batterico. Escherichia Coli è un batterio di riferimento. Ha una forma a bastoncello con diametro di circa 0,5 μm, all'interno ha una regione più chiara che contiene il cromosoma batterico, il nucleoide. Circolare, DNA a doppia elica. Si trova nel nucleoide. La lunghezza è 1460 μm, quindi circa 1000 volte superiore di quella della cellula batterica super avvolto. Se la cellula viene sottoposta ad una lisiblanda rilascia il DNA in forma altamente ripiegata. La replicazione è bidirezionale, le due forche replicative sono divergenti, opposte. Così si forma la molecola parentale.

E quella di neosintesi. → Forma a theta. La replicazione avviene in circa 45 minuti, al termine, la cellula si divide in corrispondenza di un setto che iniziava a prodursi quando le due molecole ancora unite divisione per scissione → binaria.

I geni (4288) di E. Coli sono classificati in 22 gruppi funzionali.

Plasmidi. Plasmidi sono cromosomi piccoli circolari non indispensabili per la crescita, non contengono informazioni essenziali per metabolismo; replicano autonomamente utilizzando i componenti del batterio; hanno sequenze geniche che possono codificare funzioni differenti, quali: resistenza ad antibiotici, capacità di utilizzare fonti di C complesse, fattori di patogenicità.

Crescita in laboratorio. E. Coli necessita un terreno di cultura (liquido o solido) a 37°C con sali minerali, una fonte di carbonio (il più semplice è glucosio), vitamina (stimolatore della crescita, in genere è la biotina) minimo. → Un terreno completo contiene tutti gli

Elementi del terreno minimo e, in più, molecole complesse (amminoacidi e basi azotate). La crescita delle cellule in un terreno liquido è mediante scissione binaria, la curva di crescita di conseguenza ha un andamento esponenziale. La cultura in un terreno solido, quindi una piastratura, ha composizione come il liquido, ma con un elemento gelificante (agar). In questo caso la crescita è in colonie gruppi di cellule visibili ad occhio nudo sulla piastra, ciascuna colonia origina da una cellula.

Fenotipi mutanti nei batteri. Mutanti per fonte di carbonio: i ceppi di E. Coli wild-type (Lac+) usano il lattosio, sono in grado di scinderlo e usare il glucosio ricavato. Alcuni mutanti (Lac-) non sono in grado di utilizzarlo, quindi se presente solo lattosio come fonte di carbonio non possono crescere.

Lac+ lac-

Il fenotipo è Lac+, il genotipo si indica con Lac-

Mutanti di resistenza: il fenotipo wild-type non cresce in presenza particolari virus, sostanze chimiche e antibiotici.

Il fenotipo mutante, invece, acquisisce la capacità di crescita in presenza di inibitori (resistenza). L'isolamento di questi avviene con l'uso di un terreno selettivo, un terreno minimo con l'aggiunta di uninibitore. Mutanti nutrizionali: Ceppi selvatici prototrofi: sono in grado di sintetizzare le sostanze organiche necessarie per la crescita (aminoacidi, vitamine, precursori dell'RNA e DNA) necessitano solo del terreno minimo; la sintesi dipende dal funzionamento di una via metabolica (catena di reazioni enzimatiche successive che a partire da una molecola semplice la trasforma in una complessa); una catena di reazioni successive che a partire da una molecola di glucosio lo trasforma in una specifica molecola; posseggono i geni necessari per completare le vie metaboliche. Ceppo mutante auxotrofo (nutrizionale): altera la capacità di un organismo di sintetizzare una particolare molecola essenziale per la crescita. Non cresce sul terreno.rreno completo su un terreno selettivo che manca del fattore nutritivo necessario per il mutante di interesse;4. Le colonie che crescono sulla piastra madre ma non sul terreno selettivo sono identificate come mutanti auxotrofi per quel particolare fattore nutritivo.