Biologia generale e genetica - clonazione di un gene

Come si clona un gene

Corso di genetica per la facoltà di medicina e chirurgia dell'Università di Torino

Alberto Piazza

Base biochimica del clonaggio

Gene localizzazione nota per posizione cromosomica ignota. Nota prodotto test idea patogenesi genico funzionale modelli animali.

Clonaggio per posizione e funzionale

Clonaggio funzionale

• Purificazione parziale di un prodotto genico
• Saggio di complementazione (test funzionale)

Clonaggio funzionale

Purificazione parziale di un prodotto genico

A) Frammenti di geni (oligonucleotidi) ottenuti mediante sequenziamento proteico dopo isolamento di consistenti quantità di proteina. Esempio: clonaggio del gene dell’Emofilia A (FVIII).

B) Anticorpi specifici. Esempio: clonaggio del gene fenilalanina idrossilasi (fenilchetonuria, 1982).

Clonaggio funzionale

Saggio di complementazione (test funzionale)

Complementazione di un fenotipo cellulare patologico con frammenti di DNA o di cromosomi umani normale. Esempio: Anemia di Fanconi (1992), AR-1/350000.

Saggio di complementazione FA-A FA-A FA-B Fusione Fusione FA wt fenotipo fenotipo.

Clonaggio funzionale

Libreria di Trasfezione cDNA. Selezione con Mitomicina C. Cellule FA-C. Isolamento del cDNA che complementa gene FAC, 9q22.3.

Clonaggio per posizione

Localizzazione iniziale. Analisi di linkage. Perdita di eterozigosità. Anomalie cromosomiche.

Clonaggio per posizione

Analisi di linkage

Definizione della regione critica. Saturazione della regione con nuovi marcatori. Identificazione dei ricombinanti (cross-over). Linkage disequilibrium.

• cMD10S548 1.415
• D10S595 1413 5.612 11.2
• D10S572 0.1
• D10S197 2.2
• D10S1775 0.2
• D10S593 0.2
• D10S1639 2.8
• D10S1732 0.9
• D10S213 3.3
• D10S208 Trombocitopenia

Clonaggio per posizione

Identificazione dei geni nella regione critica

• Mappe di trascrizione
• Isole CpG
• Zoo Blotting
• Progetto Genoma
• cDNA selection e relativi database
• Exon trapping
• Sequenziamento del DNA
• Assemblaggio di EST

Clonaggio per posizione

Anomalie cromosomiche: traslocazioni e inversioni, duplicazioni e delezioni.

Clonaggio per posizione

Anomalie cromosomiche

Traslocazioni e inversioni. Clonaggio del punto di rottura. Fluorescent In Situ Hybridization.