I virus in dettaglio - Microbiologia

I virus

I virus sono delle entità acellulari, biologiche responsabili di malattie infettive. In particolare, sono parassiti endocellulari obbligati, infatti per la loro replicazione dipendono dalla cellula ospite, in quanto non possono produrre energia, sintetizzare proteine o replicarsi al di fuori della cellula ospite, e dunque sfruttano tutte le sostanze che gli servono di essa per attuare la replicazione. La parola virus, nel suo complesso, significa veleno. Questi hanno la capacità di conservare la loro infettività anche dopo il passaggio attraverso filtri che invece trattengono i batteri.

Per quanto riguarda il loro genoma, possono possedere solo un tipo di acido nucleico, dunque o DNA o RNA ma mai tutti e due insieme. L’unità di misura per le dimensioni del virione è il nanometro e dunque le conoscenze di base sulla sua morfologia e struttura sono state sviluppate principalmente solo in seguito all’invenzione del microscopio elettronico. Quando il virus si trova dentro la cellula può essere considerato vivente, mentre quando si trova al di fuori di essa, viene considerato solo come una sostanza chimica complessa. Hanno la capacità (a seconda del loro specifico tropismo) di infettare cellule vegetali, batteri e cellule animali.

Modalità di infezione e replicazione

Quindi, come abbiamo capito, per moltiplicarsi deve riuscire a penetrare dentro una cellula. Per entrare deve prima di tutto trovare una cellula sensibile, cioè che permette l’adesione e l’ingresso del virus. Ma questo non basta; quella cellula deve infatti anche essere permissiva, cioè deve permettere al virus di moltiplicarsi. Ci sono però alcune cellule che sono permissive ma non sensibili. Esiste pertanto quello che viene definito lo spettro d’ospite, cioè l’insieme di tipi di cellule, tessuti e specie che il virus può infettare e nelle quali può replicarsi.

Struttura del virus

Per quanto riguarda le componenti fondamentali di un virus, ovviamente oltre al genoma, abbiamo un rivestimento proteico formato da uguali subunità costituite da delle proteine che sono i capsomeri, i quali appunto si uniscono e formano il capside. Ovviamente, è formato da poche unità di proteine tutte uguali (i capsomeri), perché il numero di proteine codificabili dal genoma dei diversi virus è relativamente piccolo, e solo una parte di tali proteine sono strutturali.

L’insieme dell’acido nucleico e del capside prende il nome di nucleocapside. Inoltre, abbiamo delle componenti non sempre presenti, come un ulteriore rivestimento esterno formato da un doppio strato di fosfolipidi con inserite glicoproteine che viene definito pericapside o envelope. (I virus privi di envelope vengono definiti nudi). Oppure, possono essere presenti anche degli enzimi. La parte più interna del virus è definita core, che è appunto la zona dove si trova il materiale genetico del virus stesso, legato a proteine anch’esse proprie del virus, che possono essere strutturali e dunque aiutare nell’impacchettamento del genoma, oppure funzionali, cioè funzionare da polimerasi, proteasi, ecc.

Abbiamo poi il virione, che rappresenta il virus completamente formato ed infettante.

Proteine virali

• Delle proteine strutturali che cioè costituiscono la struttura del virus, come le componenti del capside, oppure le proteine che si vanno ad inserire nello strato di fosfolipidi, l’envelope, oppure ancora quelle che vanno a stabilizzare il genoma.
• Poi abbiamo delle proteine funzionali che in genere non sono presenti nel virione ma sono sintetizzate quando il virus è all’interno della cellula, per esempio sono quelle che permettono all’acido nucleico di replicarsi (ex RNA polimerasi), oppure proteine con una funzione importante, perché vanno ad agire sui meccanismi sintetici della cellula, orientandoli verso la produzione delle componenti virali.
• Infine, possono anche essere presenti proteine che alterano alcune funzioni e strutture della cellula ospite, proteine che sopprimono le difese dell’ospite, oppure (queste soltanto nei virus con envelope), delle proteine strutturali che si posizionano tra envelope e capside e vanno a costituire un gel, che si chiama matrice o tegumento. Queste appunto vengono definite proteine di matrice e nell’insieme formano il tegumento che rappresenta un rivestimento che può contribuire a rendere maggiormente rigido l’envelope e svolgono un ruolo importante di ancoraggio del nucleocapside durante la maturazione del virus nel processo di replicazione.

Tipologie di simmetria

I virus li possiamo suddividere in 2 gruppi in base alla morfologia della simmetria che può assumere il nucleocapside:

• A simmetria icosaedrica (cubica)
• A simmetria elicoidale

Quelli a simmetria icosaedrica presentano una specie di guscio, in particolare i capsomeri sono distribuiti a formare un solido regolare a 20 facce ciascuna costituita da un triangolo equilatero, dunque ha 30 spigoli e 12 vertici. I virus con questa simmetria si differenziano per quanti capsomeri hanno, per come si posizionano, ecc. Nei capsidi di maggiori dimensioni, ogni capsomero che occupa un vertice dell’icosaedro è formato da 5 monomeri formando una struttura pentagonale chiamata pentone. I capsomeri disposti sulle facce dell’icosaedro invece sono formati da sei catene polipeptidiche che vengono chiamati esoni che a loro volta si collegano ad altri 6 capsomeri.

In quella elicoidale, i capsomeri (protomeri) si dispongono come in gradini di una scala a chiocciola nel quale è presente il genoma. Ed è proprio il genoma a determinare la lunghezza finale del capside che avrà una forma a bastoncino rigido nei virus vegetali e flessibile nei virus animali. Poi ci sono virus che hanno una simmetria complessa, come ad esempio i batteriofagi che presentano appunto tutte e due le simmetrie. Anche i poxvirus, che sono i più complessi virus che interessano la patologia umana.

Formazione del capside

Nella cellula infettata vengono sintetizzate le componenti proteiche che dovranno costituire il capside, grazie alle informazioni del genoma del virus ed ai meccanismi per la sintesi proteica della cellula. Dopo di che le componenti proteiche si raggruppano spontaneamente per formare il capside, secondo le regole della cristallizzazione e senza bisogno di altre informazioni estranee. A questo punto la particella virale si trova in uno stato energetico minimo e quindi formano una struttura molto stabile. Le forze che determinano l’assemblaggio dei capsidi non sono di tipo covalente, solo raramente, ma bensì sono di tipo idrofobico ed elettrostatico.

Il pericapside

È costituito da uno strato fosfolipidico nel quale sono inserite delle proteine, simile dunque ad una vera e propria membrana cellulare. In particolare, la parte lipidica deriva da membrane della cellula ospite mentre la parte proteica è codificata dal genoma virale. Queste in genere vengono formate alla fine della formazione del virus e vengono definite le cosiddette spikes che però prima di essere inserite, vengono glicosilate e sono evidenziabili come proiezioni superficiali, denominate peplomeri. Hanno delle funzioni molto importanti, come ad esempio hanno la capacità di riconoscere i recettori cellulari di alcune cellule per quelli con envelope, oppure hanno funzioni enzimatiche.

I virus che infettano le cellule della specie umana con simmetria elicoidale hanno tutti il capside. Quelli con simmetria icosaedrica possono averlo oppure no.

Formazione del pericapside

La formazione del pericapside avviene quando il virus formato esce dalla cellula e viene acquisito o dalla membrana nucleare, da quella citoplasmatica, oppure dall’apparato di Golgi o dal reticolo endoplasmatico rugoso (RER). Le proteine che vanno a costituire le spikes si inseriscono nella membrana plasmatica e quando il virus va incontro a gemmazioni poi si forma dunque questo pericapside. (Non tutti vanno incontro a gemmazione quando escono. HIV per esempio si.)

Funzioni dei rivestimenti esterni

• Protezione del genoma da danni fisici, chimici o enzimatici (come le nucleasi).
• Conferimento della capacità di riconoscimento col il recettore cellulare.
• Permettono al genoma virale di penetrare nella cellula con una conformazione tale da poter interagire con le strutture cellulari ed iniziare il processo infettivo.

I virus, diciamo che in generale, non sopravvivono a temperature molto alte, ed inoltre la conseguenza della presenza dell’involucro lipoproteico del pericapside è rappresentata dalla sensibilità del virus al trattamento con solventi dei lipidi, esempio l’alcool.

Genoma dei virus che infettano la specie umana

La maggior parte (70%) sono virus ad RNA, con una sequenza abbastanza breve. Quindi codificano per un numero limitato di proteine. Questo genoma può essere a singolo filamento, oppure a doppio, oppure ancora a singolo filamento segmentato come nel virus dell’influenza. Comunque, tutti i virus che infettano l’uomo ad RNA sono sempre a singolo filamento tranne nei Reoviridae. Il 30% dei restanti virus invece presentano un genoma a DNA che è più grande dell’RNA e quindi può codificare per un po' di più proteine. Questo è sempre a doppio filamento tranne nei Parvovirus dove è a singolo filamento e gli Hepadnavirus (quelli dell’epatite B) dove è parzialmente a singolo filamento e circolare.

Altre entità biologiche infettive

I viroidi, virusoidi ed i prioni

I viroidi sono molecole di RNA a singolo filamento circolare senza rivestimento proteico ed infettano le piante. I virusoidi sono simili ai viroidi ma hanno anche un rivestimento proteico, dunque un capside molto simile a quello del virus helper (significa che dunque è codificato da esso) e sono anche chiamati RNA satelliti. Non sono capaci di replicarsi autonomamente ma hanno bisogno che la cellula sia coinfettata da un altro virus. Infettano anch’essi le piante.

I prioni: Pr= proteina; I=infettiva; One=particella. Sono dunque particelle infettive proteiche (dunque l’unica componente strutturale virale è proprio la proteina) prive di acidi nucleici, che causano malattie degenerative del sistema nervoso centrale dovute all’accumulo di queste proteine anomale. Sono estremamente resistenti agli agenti fisico-chimici e dunque per questo in particolari condizioni, sono facilmente trasmissibili dal soggetto malato a quello sano.

Tra le malattie più importanti abbiamo:

• Le scrapie degli ovini
• Kuru
• BSE
• CJD
• v CJD (Nuova variante umana della BSE)
• La GSS
• L’insonnia familiare fatale

La BSE è anche definita come morbo della mucca pazza. La patogenesi di questo agente non è ancora stata chiarita con certezza, sappiamo però che la responsabilità della malattia è dovuta ad un isoforma della solita PrP. La PrP normale, viene rapidamente prodotta ed in seguito ad un processo di maturazione viene metabolizzata ad opera di proteasi (come dei lisosomi), e per questo è definita PrP sensibile alle proteasi.

Morfologicamente, diciamo che è rappresentata per la maggior parte da una struttura ad α-elica, ed una piccola porzione a foglietti β-pieghettato. Nel cervello di uomini ed animali con malattie prioniche è costantemente però presente una specifica isoforma della PrP denominata PrP RES o PrP SC (Resistente alle proteasi), la quale è la responsabile dello sviluppo delle lesioni degenerative. Questa è dunque resistente alla degradazione da parte degli enzimi lisosomiali e si accumula all’interno della cellula fino a provocarne la morte. In seguito si deposita nello spazio intercellulare e può dare luogo a delle placche amiloidi, e conferendo all’encefalo una struttura simile ad una spugna, variandone anche la morfologia. Queste proteine sono talmente resistenti che è diventato difficile eliminarle e controllarne l’infettività.

Il modo in cui le PrP normali si trasformino in resistenti non è ancora certo. Sappiamo però che questo comporta la trasformazione della struttura prevalentemente ad α-elica ad una struttura prevalentemente β-foglietto pieghettato con caratteristiche fisico-chimiche diverse. Nell’uomo è stata riconosciuta la nuova variante della BSE della mucca pazza, come V-CJD, dovuta all’assunzione per via alimentare di sostanze contenenti PrP SC, derivanti da questi bovini infetti, le quali si vanno a legare alle PrP normali e questo determina la trasformazione. La durata dell’incubazione prima di presentare delle sintomatologie è veramente lunga.

Classificazione dei virus

La classificazione può variare in base:

• Al tipo di genoma che contengono (DNA; RNA; Singolo, doppio, segmentato filamento)
• In base alla morfologia
• Alla presenza dell’envelope
• Alle strategie di replicazione
• Alle relazioni sierologiche (cioè come sono antigenicamente) ed infine in base all’analisi molecolare

Per quanto riguarda il genoma, se presenta un genoma con DNA può essere a singolo o doppio filamento, stessa cosa se presenta un genoma con RNA. In particolare, se presenta un genoma ad RNA a singolo filamento, questo può essere positivo o negativo. Se è positivo significa che può funzionare direttamente da mRNA messaggero, perché va nella direzione 5’→ 3’. Invece quello a polarità negativa va in direzione 3’→ 5’, quindi deve andare prima incontro ad una trascrizione ad RNA a polarità positiva.

Per quanto riguarda la morfologia abbiamo già visto che può presentare una simmetria icosaedrica o elicoidale senza pericapside o con, oppure può presentare una simmetria complessa. Possiamo classificarli anche in base alla nomenclatura, però a differenza dei batteri non presentano una nomenclatura binomiale. La nomenclatura viene infatti conferita in base ai dati presenti al momento della scoperta come la malattia alla quale è associato, il luogo dove è stato scoperto, le caratteristiche biochimiche, ecc.

Metodi di studio dei virus

Ci sono diverse caratteristiche dei virus che bisogna sfruttare per studiarli:

Visibilità

Infatti possono essere osservati grazie ad un microscopio elettrico a trasmissione o a tensione. Il microscopio elettrico è caratterizzato dal fatto che per visualizzare il preparato invece della luce visibile, utilizzano un fascio di elettroni, la cui lunghezza d’onda è molto piccola e per questo presenta un potere di risoluzione di 0,2 nm quello TEM e 10 nm il SEM, dunque fornisce degli ingrandimenti maggiori rispetto a quello ottico. Fondamentalmente è formata da una colonna sottovuoto in cui è presente una sorgente di elettroni ed emette questi elettroni quando viene fatta passare la corrente elettrica. Non ci sono delle lenti ma ci sono dei campi magnetici per compattare gli elettroni. È importante che sia sottovuoto perché se è così, le particelle d’aria non hanno interazioni con gli elettroni e dunque non li deviano.

Per quanto riguarda il TEM, le particelle passano direttamente attraverso il campione. Invece il SEM, nonostante abbia un potere di risoluzione minore, per lo meno ci dà un’immagine del nostro campione, questo perché un fascio di elettroni scannerizza la superficie del campione e gli elettroni che poi vengono emessi dal campione producono un’immagine tridimensionale.

Siccome il preparato biologico non trattiene gli elettroni ma si lascia tranquillamente attraversare da essi, questo deve essere trattato per poter essere visualizzato e studiato. Perciò si usano trattamenti con sali di metalli pesanti come l’osmio che si vanno a legare agli elettroni e così il campione risulta “elettrodenso” così che si possa vedere. La parte dove è presente il materiale biologico apparirà più scura. Questa viene definita: colorazione negativa di virus in sospensione.

Per il SEM, si può essere anche fatta la colorazione negativa per evaporazione con metalli pesanti come oro, ecc. e si depositano sulla superficie, mentre l’altro dava invece si coloravano le diverse strutture. Nelle parti che concave ci sarà più materiale, quindi si vedrà meglio la struttura della superficie di questo materiale biologico. È importante però che non ci sia troppo metallo sopra altrimenti i particolari poi si perdono. Le immagini che vediamo saranno sempre in bianco e nero.

Si possono anche fare dei preparati e studiare i virus direttamente nella cellula infettata: in particolare vengono fatti dei frammenti di tessuti in fettine sottilissime ed inclusi in resina. Dopo di che vengono colorate con un colorante all’osmio rendendoli elettrodensi, vengono poi depositate su griglie di microscopi elettrici e poi osservate con essi. Diciamo che ci sono diversi pro e contro per l’utilizzo del microscopio elettronico: per quanto riguarda i pro, la preparazione del campione è più semplice, rapida e si vede tutto. Mentre per quanto riguarda i contro, abbiamo una bassa sensibilità, che è il limite al di sotto del quale non si può rilevare il campione e visto che è basso, significa che c’è bisogno che ci sia molto virus nel mio preparato perché io lo possa vedere, inoltre ha una bassa specificità perché non riesce a distinguere tra i virus con uguale morfologia, ed infine ha alti costi.

Caratteristica di essere viventi

La seconda caratteristica è che sono viventi, cioè si replicano: possiamo osservare i viroplasmi, che sono i punti del citoplasma o nucleo dove si accumulano le proteine e gli acidi nucleici virali, direttamente dei tessuti con il microscopio ottico. Possiamo usare diverse tecniche fra cui: le tecniche di istochemica che prevede l’utilizzo di sostanze chimiche che reagiscono specificatamente con queste macromolecole e colorandole si possono osservare.