I virus in dettaglio - Microbiologia

DIAGNOSI DIRETTA:

Il virus viene cercato dove ci può essere stata la maggior parte della replicazione, come per

esempio nelle feci, nel liquido vescicolare, nella saliva, nel sangue, nelle urine, ecc. Ovviamente i

campioni devono essere prelevati dal sito reale dell’infezione, nel momento giusto e prima

dell’inizio della terapia. Una volta prelevati devono essere conservati adeguatamente in relazione

al metodo usato per la ricerca. (I virus sono molto labili nell’ambiente)

Se vogliamo ricercare il virus tramite la coltivazione e l’isolamento dobbiamo prima di tutto trovare

un essere vivente in cui si possa riprodurre. Come per esempio un’animale, solo che ora viene

usato prevalentemente per studiare la patogenesi, oppure nelle uova embrionate, metodo anche

usato poco ora per la diagnostica ma più per i vaccini. Ora si usano invece le colture cellulari: dove

viene fatto l’isolamento del virus, prendendo il materiale patologico e si mette sul tappeto cellulare,

si mette ad incubare e poi si guarda al microscopio ottico se hanno subito dei danni le cellule.

Dunque l’effetto citopatico, che è poco specifico. Possiamo avere diversi tipi di effetti citopatici tra

cui: La morte cellulare che si mostra per arrotondamento, degenerazione, aggregazione, perdita di

adesione al substrato; Cambiamenti istologici caratteristici come inclusioni cellulari o

citoplasmatiche; formazioni di sincizi o cambiamenti della superficie cellulare. Perciò servono dei

test per l’identificazione del virus tramite Neutralizzazione e l’IF.

Ci sono dei virus che però non danno effetti citopatici e quindi vanno identificati con

l’Emoassorbimento, utilizzando dei globuli rossi che si attaccano al pavimento cellulare. Un

esempio tipico è quello del virus dell’influenza.

Neutralizzazione: Anticorpi specifici aggiunti alla coltura cellulare prevengono CPE.

IF: Anticorpi specifici marcati con un marcatore fluorescente si legano all’antigene e appaiono

fluorescenti se osservati al microscopio a fluorescenza. (Ovviamente questa è la tecnica diretta)

I problemi per utilizzo delle colture cellulari sono diversi, prima di tutto sono difficili da coltivare,

servono tempi lunghi per la comparsa di CPE, bisogna che il virus sia vivo, possono esserci

sostanze tossiche nel campione che distruggono le colture, ecc.

Per quanto riguarda la ricerca di componenti del virus nel campione clinico invece, si possono

ricercare:

Antigeni Virali: Nel siero quelli solubili e nelle cellule quelli di superfice o intracellulari.

Acido nucleico virale: Con le tecniche di ibridazione o di amplificazione.

NEL SIERO: Si possono adottare diverse tecniche:

-IMMUNOPRECIPITAZIONE: Cerco l’antigene in un fluido biologico con una kappa, inserisco il

siero in cui sto cercando l’antigene. Poi inserisco gli anticorpi noti e quando le proporzioni sono

ottimali, si formerà un reticolo ed un precipitato visibile ad occhio nudo. Si può fare anche in gel

con una piastra petri. Si metterà al centro l’anticorpo e ai lati della circonferenza il siero. Si formerà

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poi se positivo il reticolo ed il precipitato che si vede come una linietta opaca. In particolare sono

stati messi a punto dei sistemi appositi per determinati virus che indicano quando è positivo con la

presenza di una striscia di precipitato colorata. (Immagina apparecchi simili a quelli della

gravidanza)

NELLE CELLULE: Si possono adottare anche qui diverse tecniche:

-MICROSCOPIO ELETTRONICO: Che però è poco specifico

-AGGLUTINAZIONE AL LATTICE

-EMOAGGLUTINAZIONE

RICERCA ACIDO NUCLEICO: Si ricerca per i virus che sono difficilmente coltivabili, a lento

sviluppo, pericolosi da coltivare, oppure che ancora non si conoscono. Non si possono cercare in

infezioni latenti, ma solo attive. Solo durante il “periodo finestra” che è il tempo che intercorre fra

contagio e comparsa. I metodi più usati come ho già detto sono l’ibridazione e l’amplificazione.

DIAGNOSI INDIRETTA: Consiste nella ricerca di anticorpi nel siero e serve per dimostrare che è in

atto una risposta immune all’agente infettivo. (RIVEDERE QUADERNO COSA CAMBIA SE

TROVIAMO IGM E IGG)

Possiamo mettere in evidenza la presenza di anticorpi con la sierologia: che rivela la reazione

antigene-anticorpo e dunque permettono di rivelare direttamente o indirettamente la formazione di

un immunocomplesso. Richiede inoltre la presenza di due reagenti, un siero il cui contenga

presumibilmente l’anticorpo e l’antigene. (Uno dei due deve essere noto)

Il metodo più usato è il TEST ELISA:

(Rivedere ed aggiungere che, ci dice anche specificatamente se sono presenti IgG o IgM, perché

le antimmunoglobuline devono essere specifiche.)

Oltre però il TEST ELISA, esiste LA FISSAZIONE DEL COMPLEMENTO:

Come funziona: Stiamo cercando gli anticorpi nel siero del paziente, dove ci sono delle proteine

del complemento la cui quantità è variabile. Quindi: 1) Prima fase, scaldiamo a 56 gradi il siero,

inattivando il complemento. Inserisco prima il siero riscaldato nella kappa e poi l’antigene. Se

l’anticorpo è presente avverrà la fissazione, il particolare l’anticorpo si lega all’antigene ed il

complemento si fisserà e si attiverà all’anticorpo. Se non c’è invece, non si fissa e non si attiva il

complemento. 2) Nella seconda fase invece, aggiungiamo dei globuli rossi di montone e

successivamente anche e anticorpi anti-globuli rossi di montone. Se l’anticorpo non è presente,

l’anticorpo anti-globulirossi di montone si fissano alla superfice dei globuli rossi e all’anticorpo si

lega l’anticorpo e questo determina l’attivazione del MAC e dunque lisi del globulo rosso, che fa

uscire l’emoglobina e dunque la provetta diventa rossa.

Se c’è invece, il complemento non è più disponibile e quindi non si ha la lisi dei globuli rossi.

NEGATIVA  Provetta rossa; POSITIVA  Provetta normale

La diagnosi indiretta però presenta dei limiti, non ci dà un’indicazione su cosa sta succedendo, per

esempio se è una fase latente o persistente. Poi nei pazienti immunodepressi la produzione di

anticorpi è scarsa o eccessiva. Ed infine servono diversi campioni per poterla attuare. 20

I FARMACI ANTIVIRALI

Esistono poche sostanze antivirali che possono essere usate, perché la maggior parte sono

tossiche visto che un antivirale efficace dovrebbe:

-Interferire con funzioni specifiche del virus che sono poche

-Oppure interferire con funzioni cellulari indispensabili per la replicazione del virus

E’ importante però che non interferiscano contro le cellule del nostro organismo, ma bensì che

abbiano un’azione selettiva.

I farmaci antivirali sono attivi soltanto nella fase replicativa del virus, altrimenti in altre situazioni

non possono agire. Inoltre, sono tutti virus-statici (o quasi) cioè impediscono la moltiplicazione

virale.

Teoricamente (ma solo teoricamente) tutte le fasi del ciclo di replicazione possono rappresentare

un bersaglio per i farmaci antivirali.

Possiamo suddividerli in classi secondo la loro struttura chimica e la modalità d’azione:

-Inibitori della sintesi degli acidi nucleici, che possono essere  Analoghi dei nucleotidi, dei

nucleosidi, oppure inibitori non nucleosidici della trascrittasi inversa.

-Inibitori della proteasi

-Altri con bersagli più che altro cellulari

GLI INIBITORI DELL’ATTACCO DEL VIRUS:

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Non c’è ne sono tanti, ci sono solo quelli che inibiscono la penetrazione dei Picornaviridae e sono

chiamati FARMACI WIN, tra i quali ricordiamo il PLECONARIL. Come fanno: Interagiscono con il

sito di riconoscimento del recettore cellulare, costituito da una depressione (delle concavità)

chiamate canyon dove sono situate le VAP che si legano ai recettori cellulari ICAM. Dunque la loro

azione è di impedire il legame con l’ICAM. Sono efficaci in vitro ed in corso di studi per l’utilizzo

nella terapia umana.

GLI INIBITORI DELLA FUSIONE DI HIV

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Un farmaco si chiama ENFUVIRTIDE (Detto anche T20). Esso inibisce l’azione della gp41

fusogena dell’HIV. In particolare si lega ad essa così ne impedisce l’ingresso del virus nella cellula.

Ma non esiste solo questo, esiste anche il MARAVIC che è attivo solo per i virus che usano come

corecettore il CCR5 (Dopo il legame con CD4 si legano ad esso). Questo farmaco si lega al

corecettore umano CCR5 che è importante per la produzione di citochine. Si lega in modo

selettivo, impedendo al virus dell’HIV CCR5-TROPICO di entrare nelle cellule.

GLI INIBITORI DELLA SCAPSIDAZIONE

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I farmaci che agiscono su questa tappa, sono attivi sui virus influenzali di tipo A e sono

L’AMANTADINA E LA RIMANTADINA. Questo virus entra per endocitosi seguito da fusione

interna. Quando si trova nell’endosoma, grazie a delle particolari proteine inizia l’acidificazione di

esso, queste proteine sono le proteine M2 che formano dei veri e propri canali ionici, attraverso il

quale passano ioni H+ e questo provoca l’acidificazione. Questa acidificazione attiva le proteine

fusogene del virus dell’influenza e così avviene la fusione. Questi due farmaci vanno proprio ad

intervenire bloccando il canale ionica della proteina M2 virale, inibendo dunque l’acidificazione

dell’endosoma, la fusione e la scapsidazione dell’RNA.

In particolare l’AMANTADINA è tossica per il sistema nervoso centrale, perché riesce a superare la

barriera. Inoltre questi farmaci agiscono come profilassi, perché agiscono proprio sulle prime

tappe. Vogliono prevenire l’insorgenza della malattia. 21

FARMACI CHE AGISCONO SULLA REPLICAZIONE DEGLI ACIDI NUCLEICI

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In particolare possono essere per esempio analoghi dei nucleosidi, con delle modificazioni per

esempio alla base purinica o pirimidinica, modificati allo zucchero, oppure può essere modificato il

legame fra le due componenti. Possono agire in diversi modi.

Abbiamo: GLI INIBITORI DELLE POLIMERASI VIRALI

Sono analoghi della Timidina, in cui il gruppo metile è stato sostituito con degli atomi. Vanno in

particolare ad inibire la DNA polimerasi. Ne conosciamo di diversi tipi, però non vengono usati

perché molto tossici, infatti non fanno distinzione tra la DNA polimerasi cellulare e quella virale.

Tra tutti solo le IDOXURIDINE sono usate, e sono formate dalla sostituzione con atomi di iodio.

Oltre a bloccare la DNA polimerasi, hanno la capacità di inserirsi nella catena come terminatori di

catena. Da questi farmaci ne sono stati sviluppati altri.

Uno dei maggiori farmaci di successo, che è analogo alla guanosina (manca lo zucchero ciclico

(per questo acyclovir) ed il gruppo ossidrile in posizione 3&rsq