genomica funzionale - 230 pagine

Antiga Alessia 2017 - Genomica funzionale

UniPD – prof. Bonaldo

Contenuti del corso e obiettivi formativi

La genomica funzionale riveste una particolare importanza nell’era postgenomica. Anziché una descrizione generale e puramente teorica dei vari campi di studio, per questo corso si è scelto un percorso didattico sperimentale principalmente focalizzato ad un importante organismo modello fra i mammiferi: il topo.

Nella parte teorica del corso sarà dato ampio risalto ai topi transgenici come modello per lo studio della funzione dei geni in condizioni normali e patologiche. Verranno trattati argomenti quali: principi ed applicazioni delle cellule staminali embrionali, metodi per la generazione di topi transgenici, l’inattivazione genica mirata (“gene knockout”), genome editing in vivo mediante CRISPR/Cas. Verranno inoltre descritte in dettaglio le tecnologie utilizzate, anche con l’ausilio di filmati.

Nella parte sperimentale del corso verranno presentati in dettaglio alcuni esempi di topi knockout per lo studio della funzione genica.

Programma

Parte applicativa e parte sperimentale

Le tecnologie per la produzione di topi transgenici

• Microiniezione di DNA in ovociti fecondati: procedura, caratteristiche, usi.
• Produzione di topi knockout da cellule ES: coltura e manipolazione di cellule ES. La selezione. Iniezione di cellule ES geneticamente modificate in blastocisti; i topi chimera.
• Altre procedure di derivazione di topi chimera da cellule ES. Fattori importanti per un efficiente utilizzo di cellule ES modificate geneticamente; il problema del cariotipo e della trasmissione germinale.

L’applicazione dei topi knockout per lo studio delle malattie

• Applicazione dei topi knockout come modello di malattie ereditarie umane; l’esempio dei topi knockout per il collagene VI, un modello di distrofie muscolari.

Parte teorica

Nozioni introduttive

L’era post-genomica. Gli organismi modello fra gli animali: invertebrati (Caenorhabditis elegans, Drosophila melanogaster), pesci (Danio rerio, Fugu rubripes), anfibi (Xenopus laevis), mammiferi (Rattus norvegicus, Mus musculus). Gli animali transgenici.

Transgenesi in topo: metodologie ed applicazioni

Vantaggi del topo per studi di genomica funzionale in mammifero. Caratteristiche generali del topo: genoma, ciclo vitale, sviluppo embrionale, ceppi. Transgenesi in topo: le diverse tecnologie per la produzione di topi transgenici. Microiniezione di DNA in ovociti fecondati: principi, metodologia, applicazioni. Applicazioni dei topi transgenici in biomedicina.

Le cellule staminali embrionali (ES)

Alcune nozioni generali sulle cellule staminali. Cellule pluripotenti indotte. Le applicazioni delle cellule staminali in biologia e medicina. Lo sviluppo embrionale precoce del topo. Caratteristiche della blastocisti: trofoblasto e ICM.

Cell lineages e derivazione delle cellule ES dalla blastocisti. Caratteristiche e proprietà delle cellule ES. Differenziamento programmato delle cellule ES in vitro; i corpi embrioidi. Campi di applicazione delle cellule ES: le applicazioni delle cellule ES nella transgenesi. Procedure per la produzione di topi mutanti da cellule ES. Iniezione di cellule ES in blastocisti: metodologia, applicazioni; i topi chimera.

“Gene targeting”: l’inattivazione genica mirata per lo studio della funzione genica in vivo

Caratteristiche generali ed applicazioni. La mutagenesi mirata mediante ricombinazione omologa in cellule ES. Tipi di costrutti e considerazioni per la preparazione dei costrutti; selezione positiva-negativa. Procedure per la produzione di topi knockout da cellule ES.

Potenziali problemi. L’interpretazione del fenotipo: dipendenza dal background genetico; “assenza di fenotipo”, ridondanza genetica e meccanismi compensatori; fenotipi letali.

Caratteristiche ed applicazioni dei sistemi di ricombinazione sito-specifica. La ricombinazione con il sistema Cre/loxP: introduzione di mutazioni fini con Cre/loxP; gene targeting condizionale: knockout inducibili e tessuto-specifici; knockout condizionale inducibile. Altre applicazioni del sistema Cre/loxP.

Recenti sviluppi e prospettive future. I consorzi internazionali e le risorse; i progetti KOMP, IKMC, IMPC e EUCOMM.

Le nuove tecnologie per genome editing e ingegneria genomica

I nuovi metodi per l’ingegneria genomica: zinc-finger nucleasi, TALEN, CRISPR/Cas9.

Introduzione

Con il completamento del progetto del genoma umano, uno dei principali obiettivi della ricerca biomedica diventa ora la comprensione della funzione di ogni singolo gene e del suo contributo allo sviluppo delle malattie.

Organismi modello per la ricerca biomedica

• Batterio E. coli.
• Lievito S. cerevisiae.
• Verme C. elegans.
• Insetto D. melanogaster.
• Pesce D. rerio.
• Topo M. musculus.

Modello animale

• Un animale sufficientemente simile all’uomo nella sua anatomia, fisiologia o risposta ai patogeni, per essere usato nella ricerca medica in modo da ottenere risultati che possono essere estrapolati alla medicina umana.
• Una condizione fisiologica o patologica che ricorre nell’animale in modo simile a quella che avviene negli umani.
• Un modello animale è un animale vivente, non umano, usato durante la ricerca e l’investigazione delle malattie umane, con lo scopo di capire meglio le malattie o i segnali di sviluppo.
• L’animale scelto spesso incontra una determinata equivalenza tassonomica con gli umani, in modo da reagire alle malattie, o ai trattamenti in un modo che assomiglia alla fisiologia umana.

Perché si utilizzano gli animali:

• Buon modello per capire come funzionano i tessuti viventi e la biologia alla base delle malattie.
• Solo comprendendo come le malattie affliggano gli organismi viventi, si possono sviluppare trattamenti o cure.
• I modelli animali sono usati per:
  • Aiutare i ricercatori a capire le vie fondamentali in cui le malattie affliggono i tessuti viventi.
  • Sviluppare e testare trattamenti.
  • Allenare futuri scienziati e fisici.

Possono i modelli computazionali e culture cellulari (organoidi e colture 3D) sostituire la ricerca animale:

• Buoni per screening e usati frequentemente.
• Non possono replicare fedelmente le interazioni complesse nel sistema intero.
• I test finali dipendono comunque da studi sugli animali, spesso è richiesto dalla legge.
• Modelli animali e non animali usati in congiunzione, forniscono la miglior risposta.

I risultati ottenuti dagli studi sugli animali possono essere applicati agli umani:

• Ci sono molte similarità tra animali e uomo:
  • Funzioni immunitarie nel topo.
  • Funzione cardiovascolare nel cane.
• Gli animali forniscono un indice di sicurezza:
  • Studi animali precedono e supportano gli studi sull’uomo (Nuremberg Code).
  • La ricerca medica sugli umani deve essere preceduta da ricerca animale (Declaration of Helsinki).
• Quasi tutte le anticipazioni mediche dello scorso secolo hanno iniziato con la ricerca sugli animali.

Cosa è stato imparato dalla ricerca sugli animali:

• Ha giocato un ruolo fondamentale in quasi tutte le anticipazioni mediche sia per umani che per altri animali.
• Includono, ma non sono limitati a:
  • Angiogramma.
  • Raggi-x.
  • Scansione CAT.
  • Misurazione della pressione sanguigna.
  • Pacemaker cardiaci.
  • Farmaci per l’ipertensione.
  • Insulina per diabetici.
  • MRI.
  • Numerosi vaccini.
  • Cateteri cardiaci.
  • Dialisi per reni.
  • Chirurgia della cataratta.
  • Trattamenti delle ustioni.
  • Sostituzione valvole cardiache.
  • Anche artificiali.

Esempi:

• Polio:
  • Provata l’infezione, la capacità di trasmissione alle scimmie.
  • Sviluppo vaccino attraverso lavoro con polli e scimmie.
• Diabete:
  • Importanza dell’insulina nei cani.
• Ipertensione:
  • Correlazione con reni in topi, gatti e cani.
  • Diuretici e angiotensina convertono gli enzimi inibitori, per trattare l’ipertensione.
  • Correlazione con cervello in cani.
  • Comprensione che il sistema nervoso simpatico influenza la pressione e farmaci per trattarla.

Agli scienziati importa degli animali:

• Buona scienza e benessere degli animali vanno di pari passo.
• È nell’interesse dei ricercatori e della scienza che gli animali siano sani e trattati bene:
  • Animali malati o maltrattati non danno buoni risultati nella ricerca.
  • La ricerca animale è molto costosa perciò gli animali da laboratorio sono molto preziosi per gli scienziati. Sono utilizzati solo quando necessario, e sono trattati con molta cura.
• La AAALAC (associazione per l’assestamento e l’accreditazione della cura degli animali da laboratorio) è stata originariamente fondata da scienziati e veterinari, che volevano essere sicuri che tutto fosse fatto assicurando una buona cura degli animali.

La ricerca biomedica beneficia solo gli animali?

• Gli stessi metodi che sono stati per prevenire e trattare le malattie umane, hanno incrementato la vita di un gran numero di animali.
• Più di 80 medicine e vaccini sviluppati per l’uomo sono utilizzati per trattare gli animali. La ricerca animale ha aiutato lo sviluppo di molti vaccini per combattere disturbi come rabbia e cimurro in cani e gatti, leucemia felina, epatite, tetano ed ha assistito allo sviluppo di trattamenti per la filaria.

Perché gli animali sono necessari nella ricerca biomedica:

• Sono biologicamente simili agli umani.
• Gli scimpanzé condividono circa 99% del DNA con gli umani e i topi più del 98%.
• Gli animali sono suscettibili a molte degli stessi problemi di salute degli umani.
• Gli animali hanno un ciclo di vita più corto e possono essere studiati attraverso la loro intera vita e attraverso diverse generazioni.
• Inoltre gli scienziati possono facilmente controllare l’ambiente circostante agli animali (dieta, temperatura, luce), cosa difficile da fare con gli umani.

Perché i metodi alternativi non possono sostituire gli animali nella ricerca:

• Quando possibile, i ricercatori utilizzano modelli non animali.
• Modelli computazionali, colture cellulari e tissutali e un numero di metodi correlati a modelli non animali sono al giorno d’oggi utilizzati.
• I test sugli animali rimangono una necessità.
• Il sistema vivente è estremamente complesso, il sistema nervoso, la chimica del cervello e del sangue, le secrezioni ghiandolari e degli organi, la risposta immunitaria, sono tutti correlati, rendendo impossibile esplorare, spiegare o predire il decorso delle malattie o gli effetti di possibili trattamenti, senza l’osservazione e il testare l’intero sistema vivente di un animale.

I modelli animali sono realmente importanti:

Dall’inizio del 20simo secolo, 95 dei 107 premi Nobel consegnati alla fisiologia o alla medicina, furono dipendenti dalla ricerca con utilizzo di animali; invece ogni premio Nobel negli ultimi 30 anni.

• 1901 Emil von Behring: terapia sierica, specialmente applicazione contro difterite.
• 1986 Stanley Cohen, Rita Levi Montalcini: fattore di crescita nervosa e fattore di crescita epidermica.
• 1987 Susumu Tonegawa: scoperta del principio genetico per la diversità antigenica.
• 1993 Richard J. Roberts, Phillip A. Sharp: scoperte dei geni split.
• 1997 Stanley B. Prusiner: scoperta e caratterizzazione dei prioni.
• 1994 A. G. Gilman, M. Rodbell: scoperta delle proteine G e del loro ruolo nella trasduzione del segnale cellulare.
• 2006 A. Fire, C. Mello: RNA interference.
• 2007 M. Capecchi, M. Evans, O. Smithies: topi knockout e gene targeting.
• 2009 E. H. Blackburn, C. W. Greider and J. W. Szostak: protezione dei cromosomi da parte di telomeri e telomerasi.
• 2012 J. Gurdon, S. Yamanaka: cellule mature possono essere riprogrammate per diventare pluripotenti.
• 2013 J. E. Rothman, R. W. Schekman and T. C. Sudhof: scoperte del macchinario che regola il traffico vescicolare.
• 2016: Y. Ohsumi: meccanismi dell’autofagia.

Quali tipi di animali sono utilizzati:

• Una grande varietà di animali come topi, ratti, conigli, porcellini della Guinea, uccelli, pecore, pesci, rane, maiali, cani, gatti, primati.
• Ogni animale ha particolari caratteristiche ed è utilizzato per specifici scopi.

Modelli sperimentali

• Uomo: Analisi dell'espressione e del ruolo di geni in casi di malattia. Accesso limitato.
• Altri mammiferi: poca importanza in campo medico.
  • Ovini.
  • Bovini.
  • Maiale.
  • Ratto.
  • Topo.
• Altri vertebrati: transgenesio Uccelli (Gallus).
  • Anfibi (Xenopus).
  • Pesci (Zebrafish).
• Invertebrati:
  • Insetti (Drosophila).
  • Vermi (C. elegans).

Animali transgenici

Animali mutanti che portano elementi genetici esogeni introdotti sperimentalmente nelle loro cellule, inclusa la linea germinale.

I genomi interamente sequenziati fino ad oggi (2016)

• Procarioti:
  • >300 Batteri.
  • 111 Archea.
• Eucarioti:
  • 48 Protisti.
  • 139 Funghi.
  • 102 Piante.
  • 162 Animali (di cui 39 mammiferi).
• Alcuni genomi sequenziati:
  • Piante:
    • Arabidopsis thaliana.
    • Oryza sativa.
  • Pesci:
    • Danio rerio.
    • Fugu fubripes.
  • Invertebrati:
    • Caenorhabditis elegans.
    • Drosophila melanogaster.
  • Mammiferi:
    • Mus musculus.
    • Rattus norvegicus.
    • Homo sapiens.

Alcune pietre miliari della genomica comparata negli eucarioti

Comparative genomics: phyla, classes, model organism, chromosome, genome size, genome sequencing.

Vertebrates

• Mammals
  • Human (Homo sapiens) 23 3000 Complete
  • Mouse (Mus musculus) 20 2600 Complete
  • Rat (Rattus norvegicus) 21 2600 Complete
• Bird
  • Chicken (Gallus gallus) 40 1200 Assembled
• Amphibians
  • Xenopus laevis 18 3100 -
  • Silurana tropicalis 10 1700 In progress
• Teleostea
  • Zebrafish (Dario rerio) 25 1700 Assembled
  • Pufferfish (Fugu rubripes) 22 400 Complete

Invertebrates, Chordata

• Urochordata
  • Ascidia (Ciona intestinalis) 14 180 Assembled

Invertebrates

• Insects
  • Drosophila melanogaster 4 152 Complete
• Nematoda
  • Canaerhabditis elegans 6 100 Complete

Evoluzione e relazioni tra metazoans

Evolutionary relationship between metazoans that are sequenced or due for sequencing.

The simplified phylogenetic relationships between the metazoans for which the complete, or nearly complete, genome sequences are available or will be available soon. Evolutionary distances (in million years)and genome sizes are indicated.

Il topo è un eccellente modello per lo studio delle malattie umane

Topo: Esistono diversi ceppi (razze) → applicazioni diverse. Importante modello di malattie umane. Incontro ceppi alterati, una volta era difficile l’identificazione del gene responsabile. ob/ob (mutanti per leptin) Modello di obesità Col6a1–/– (knockout per collagen VI) Modello di distrofia muscolare Emilin1–/– (knockout per EMILIN-1) Modello di ipertensione.

Vantaggi del topo come organismo modello

• Ha in comune diverse caratteristiche anatomiche e fisiologiche con l’uomo.
• Quasi ogni gene umano ha la sua controparte nel topo.
• In molti casi il fenotipo di un difetto genetico è molto simile fra uomo e topo → dedurre quale sia la funzione del gene anche nell’uomo.
• La biologia della specie è stata molto studiata.
• Il tempo di generazione è breve (3 mesi): da quando comincia lo sviluppo embrionale a quando raggiunge maturità sessuale.
• Sono disponibili diversi ceppi geneticamente puri, hanno anche supplicazioni differenti.
• La sequenza del genoma è nota: studio gene per gene tramite delezioni.
• I costi di mantenimento sono relativamente bassi rispetto ad altri mammiferi (più facile da allevare dello scimpanzé).
• Sono disponibili tecnologie sofisticate di manipolazione del genoma, incluse le cellule ES: inattivazione genetica mirata (knockout), prima nel topo.

I vantaggi elencati rendono il topo l’organismo modello migliore per lo studio della funzione dei geni nelle malattie di interesse medico e nello sviluppo dei mammiferi. Inoltre, è l’unico mammifero adatto per studi di funzione genica su grande scala.

Limiti del topo come organismo modello

• La produzione ed il mantenimento degli animali richiede una struttura ben attrezzata e costosa: ad esempio gabbie, in ambienti con aria non ambientale per evitare contaminazioni, ciclo luce-buio adatto al topo.
• La regolazione della trascrizione è molto più complessa che negli eucarioti inferiori e negli invertebrati (ciò limita la possibilità di esprimere transgeni in modo efficiente e selettivo da un punto di vista spaziale e temporale).

Applicazioni dei topi transgenici

I topi transgenici sono spesso utilizzati per capire il ruolo di un gene in processi biologici a livello dell’intero organismo:

• Per studiare gli effetti di una mutazione genica.
• Per comprendere i meccanismi molecolari che controllano l’espressione genica, anche regioni regolatorie ed elementi regolatori.
• Per confermare in vivo i meccanismi biochimici che stanno alla base di malattie: es. gene che non funziona correttamente, provoca cascate di meccanismi che non funzionano correttamente, applicare una terapia genica è complesso, quindi posso indentificare nuovi bersagli, lunga la via, su cui agire, anche a valle.
• Per sviluppare un modello animale sul quale sperimentare nuove terapie.

Produzione di topi transgenici per microiniezione in ovociti fecondati

Integrazione casuale del costrutto.

• Ovocita fecondato a 12 ore dalla fecondazione (stadio di due pronuclei): microiniezione di transgene che si può integrare nel genoma (integrazione casuale).
• Sviluppo in coltura (stadio di blastocisti).
• Impianto nell’utero di madre adottiva.