genomica funzionale - 230 pagine

POSSIBILI LIMITAZIONI ALL’UTILIZZO DEL SISTEMA CRISPR/Cas9:

• Necessaria presenza della SEQUENZA NGG PAM LIMITA i SITI GENOMICI su cui si può agire.

• OFF-TARGET EVENTS: sono meno frequenti nel caso di iniezione in zigoti, ma vanno comunque sempre considerati e

valutati, specie in famiglie geniche.

• I TOPI ottenuti sono FREQUENTEMENTE MOSAICI, questo problema può essere risolto con ACCOPPIAMENTI SUCCESSIVI,

ma va tenuto presente e possibilmente ridotto nel caso di specie di dimensioni maggiori e con costi di allevamento

elevati.

Sono stati riportati molti casi di off-target mutagenesis: sono quindi importanti il DISEGNO della sequenza e le MODALITÀ di

UTILIZZO

• Per la scelta della SEQUENZA ci sono molti siti web che permettono di:

o INDIVIDUARE le SEQUENZE PAM vicino al gene/zona del gene di interesse.

o COMPARARE tale sequenza con tutto il GENOMA della specie/ceppo che si vuole utilizzare.

• MODULANDO SPERIMENTALMENTE la QUANTITÀ di Cas9 e gRNA utilizzata si può ottenere OTTIMI RISULTATI di

mutagenesi, diminuendo gli off-target.

• Anche l’UTILIZZO di una nickase permette di abbassare off-target.

• Comunque bisogna sempre prevedere di CONTROLLARE sui MUTANTI OTTENUTI la SPECIFICITÀ di MUTAGENESI con

TEST SPECIFICI (PCR) o SEQUENZIAMENTO COMPLETO di geni omologhi o di tutto il genoma.

Molti genomi sono stati MUTAGENIZZATI con ALTA EFFICIENZA e superando le DIFFICOLTÀ finora incontrate quali:

• ASSENZA di CELLULE ES o almeno di cellule ES con CARATTERISTICHE COSTANTI e in grado di dare con EFFICIENZA

COLONIZZAZIONE di embrioni.

• Possibilità di MUTAZIONI MULTIPLE.

PARTE SPERIMENTALE

Applicazioni: I TOPI KNOCKOUT COME MODELLO DI MALATTIE

RUOLO DELLE MOLECOLE DELLA MATRICE EXTRACELLULARE IN MALATTIE E OMEOSTASI TISSUTALE

• Collagene VI e suo interattori (muscular dystrophies, PNS and CNS, cell survival).

• Famiglia gene Emilin (cardiovascular system, skeletal development, signaling).

TRANSGENESI TOPO

Un sommario delle nostre linee transgeniche di topo (1993-2016)

• 18 knockout/knockin targeted genes.

• Pronuclear injection of >70 DNA constructs.

• Perivitelline injection of 10 lentiviral siRNA constructs.

UN ESEMPIO DI TOPI KNOCKOUT DEL NOSTRO LABORATORIO

I topi knockout per il collagene VI: un modello di distrofie muscolari

Le distrofie muscolari sono un gruppo eterogeneo di rari disordini genetici, progressivi, degenerativi, che colpiscono

principalmente il muscolo scheletrico causando debolezza muscolare e per il quale non è attualmente disponibile una terapia

efficace.

• X-linked muscular dystrophies

• Limb-girdle muscular dystrophies

• Congenital muscular dystrophies

• Distal dystrophies/myopathies

• Other dystrophies

• Inclusion body myositis

Il collagene VI

• lega la superficie delle cellule alla matrice extracellulare dei muscoli e di altri organi.

• È composto da 3 catene α codificate da geni separati.

• È espresso in differenti tessuti, come pelle, nervi periferici, cartilagini e muscoli.

Tessuti di derivazione mesenchimale sono fortemente etichettati.

Differenti regioni regolatorie controllano espressione tessuto-specifica del gene Col6a1.

–0.6 kb enhancer: espressione in pelle e tendini

–4.0 kb enhancer: espressione in dischi intervertebrali

–4.0 enhancer: espressione in nervi periferici, attivati durante la differenziazione delle cellule di Schwan

Un enhancer (–6.8 kb) controlla l’espressione Col6a1 nei muscoli scheletrici

L’espressione e deposizione di collagene VI nei muscoli, è fornita dai fibroblasti interstiziali.

L’espressione del collagene VI dai fibroblasti muscolari richiede la presenza di linea cellulare miogenica.

Come possiamo comprendere il ruolo giocato dal collagene VI nel muscolo (e in termini più generali nell’intero corpo)?

I topi knockout sono un potente strumento di investigazione della funzione dei geni in vivo, come modello di malattie genetiche

umane.

1996: topi knockout per il collagene VI

Knockout del gene Col6a1 murino

→ L’inattivazione mirata del gene guida la completa ablazione del collagene VI nella matrice extracellulare

Collagen VI null (Col6a1–/–) mice

MUSCOLO SCHELETRICO: FENOTIPO MIOPATICO

Isolamento muscoli.

Colorante blu di Evans entra in cellule non intatte → cellule wild type non colorate, cellule Col6a1 -/- fibre muscolari con

membrana danneggiata, permeabili.

Cellule dimensioni simili e nucleo periferici

Nuclei centrali (fibre in rigenerazione), alcune cellule atrofiche. Aspetti di degenerazione e rigenerazione. Fibre di tessuto

connettivo.

Aspetto miopatico: alterazioni sia strutturali che funzionali.

Muscle weakness in Collagen VI null mice

Analisi più accurate sull’aspetto del muscolo.

Misurazione forza in vivo dei muscoli del topo: riduzione significativa.

Oltre a mostrare debolezza, possono avere anche contratture.

Isolamento gruppi di fibre, oppure stimolazione direttamente in vitro somministrando ATP e calcio.

Generazione topi per determinazione se i geni responsabili codificassero per collagene VI.

Identificate forme di distrofie muscolari, causate da mutazioni del collagene VI.

Anche nell’uomo.

Sia recessive che dominanti.

Mutazioni dominanti e recessive dei geni per collagene VI, causano disordini muscolari:

• MIOPATIA BETHLEM (1996)

• DISTROFIA MUSCOLARE CONGENITA ULLRICH (2001)

• MIOSCLEROSI (2008)

MIOPATIA BETHLEM

Mutazioni ereditate dei geni COL6, AD / AR.

− Debolezza muscolare media.

− contratture congenite.

− manifestazione precoce (già alla nascita).

− Lievemente progressiva.

− Generalmente benigna.

Miopatia perché non è così gravi come altre forme di distrofia.

DISTROFIA MUSCOLARE CONGENITA ULLRICH (UCMD)

Mutazioni ereditate dei geni COL6, AR / AD.

− Debolezza muscolare generalizzata (i bambini generalmente non acquisiscono mai la capacità di camminare).

− Contratture delle articolazioni prossimali.

− Ipermobilità delle articolazioni distali.

− Progressione rapida e severa (la maggior parte dei pazienti muoiono entro 10-20 anni per arresto respiratorio).

Mutazioni negli stessi geni, causano forme di distrofia molto diverse.

Importante localizzazione nei geni:

→ dipende da quanto collagene VI viene prodotto.

Nella Bethlem: riduzione, ma non totale assenza.

Ullrich: assente completamente, o in alcuni casi, il poco presente non è funzionale.

• Topi wild type +/+ non sono modello.

• Topi eterozigoti sono modello della Bethlem: quadro miopatico meno esteso, meno evidente, riduzione di collagene VI.

• Topi omozigoti -/- sono modello della Ullrich.

MIOSCLEROSI :

Mutazione non senso in omozigosi, nell’esone 27 del gene COL6A2.

Muscoli rigidi.

ANALISI ULTRASTRUTTURALE DEI MUSCOLI SCHELETRICI

Muscoli al microscopio elettronico:

KO: visibili sarcomeri, ma aspetto bucherellato.

Maggior ingrandimento:

WT: reticolo sarcoplasmatico aspetto a triadi, mitocondri con creste addensate (molto attivi).

KO: enormemente dilatate, mitocondri aspetto rigonfio, con creste tubulari.

POTENZIALE DI MEMBRANA MITOCONDRIALE (Δψm): FLUORESCENZA TMRM.

Funzionalità dei mitocondri:

Paolo Bernardi (padova).

Isolando fibre muscolari, coltura adeguata + sostanza fluorescente al rosso (Cationica e lipofila → si accumula nella matrice) per

misura potenziale di membrana (separazione di carica).

FIBRE MUSCOLARI:

I mitocondri funzionano in condizioni normali in entrambi i topi, ma in condizioni di stress (oligomicina blocca ATP sintetasi) il

muscolo normale è in grado di mantenere il potenziale, mentre i KO no.

Veloce depolarizzazione mitocondriale in miofibre deficienti di collagene VI.

Dipende dalla presenza del collagene:

fornendo il collagene VI, si recupera il potenziale → dimostrazione collagene responsabile e deficit reversibile.

Se si fornisce laminina (altra proteina extracellulare) non avviene lo stesso recupero.

Ciclosporina: inibizione via di produzione dei linfociti → immunosoppressione.

Lega ciclofilina che sta nel mitocondrio (complesso PTP: poro nelle membrane): desensibilizza all’apertura esagerata del poro, no

rilascio citocromo C → no apoptosi.

Ciclosporina A protegge le fibre Col6a1–/–: apertura PTP è affetta da deficienza di collagene VI.

Fornendo CsA, non avviene apertura eccessiva, recuperano depolarizzazione → questa apertura è responsabile della non

funzionalità.

In fibre di coltura, la disfunzione è reversibile.

APOPTOSI (TUNEL)

Apoptosi spontanea delle miofibre.

APOPTOSI IN COLTURE PRIMARIE DI MUSCOLO DA TOPI:

TRATTAMENTO IN VIVO CON CICLOSPORINA A, LA QUALE È UN FARMACO:

→ Prova che meccanismo patogenico avviene anche in vivo.

→ Possibile terapia in pazienti.

5 mg/kg per 4-12 giorni, i.p. injection every 12 hr

TRATTAMENTO IN VIVO CON CsA: muscle EM

Topi iniettati senza CsA.

Trattamento con CsA anche per solo 4 giorni: recupero significativo.

somministrazione di ciclosporina recupera i difetti ultrastrutturali del muscolo in topi deficienti di collagene VI.

Recupero anche dell’apoptosi.

Lavoro molto rilavante nella comunità scientifica: apertura strada studio meccanismi distrofia e terapie.

Domanda chiave:

La patogenesi dei disordini umani del collagene VI coincide con quella dei topi Col6a1 -/-?

Coltura di cellule umane miogeniche per stimolazione a formare miotubi.

UCMD patients Bethlem patients

↓

Muscle biopsy

↓

Primary muscle cell cultures

PAZIENTE FENOTIPO CLINICO DEFICIT COLLAGENE VI MUTAZIONE GENICA

P.1 UCMD medio Diminuzione parziale in muscolo e fibroblasti. COL6A3 omozigote

P.2 UCMD moderato Diminuzione marcata in muscolo. COL6A1 eterozigote

P.3 UCMD moderato Diminuzione marcata in muscolo Non conosciuta

P.4 UCMD moderato Diminuzione parziale in muscolo e fibroblasti. COL6A1 eterozigote

P.5 UCMD grave Assente. COL6A1 omozigote

Alterazioni degli organelli in pazienti affetti da miopatie del collagene VI:

APOPTOSI (BIOPSIA DEL MUSCOLO QUADRICIPITE):

Incidenza aumentata in tutti i pazienti, dipende anche dalla gravità della forma.

COLTURA MUSCOLO IN VITRO: POTENZIALE DI MEMBRANA MITOCONDRIALE (Δψm):

Sia fornendo collagene VI, sia CsA: recupero disfunzione e apoptosi anche nell’uomo.

COLTURA DI MUSCOLO IN VITRO: APOPTOSI

Richiesta autorizzazione per fare trial clinico con CsA nei pazienti:

2007: Ethics Committee approva i trial clinici con CsA in miopatie ColVI.

2008: trial clinico pilota con CsA in 5 pazienti.

TRIAL DESIGN

Clinical trial with CsA

(trial supervisor: Dr. Luciano Merlini)

• Open Pilot Trial (no control group).

• Primo tr