Genomica Funzionale

MACCHINE UTILIZZATE

Illumina sequencing:

Le sequenze vengono denaturate e l’adattatore riconosce una sequenza particolare che è stata fissata

sulla piastra di sequenziamento, la fase successiva è quella che viene chiamata bridge amplification

che porta alla sintesi di cluster in cui la sequenza si piega e riconosce un altro adattatore sempre

posizionato sulla piastra, parte una reazione di PCR di questa sequenza che verrà quindi duplicata.

Vengono duplicate tutte le sequenze posizionate sulla piastra. Sulla piastra avremo delle aree di

densità maggiore dove abbiamo la stessa sequenza duplicata più volte. La reazione di

sequenziamento viene effettuata aggiungendo nucleotidi marcati con fluorofori che poi vengono

rilevati da una macchina che è in grado di verificare che tipo di nucleotide è stato inserito.

Il limite di questa macchina è quello di non riuscire a sequenziare più di 60 pb.

454 sequencing:

la logica è la stessa cioè di formare un cluster, quindi partire da una singola molecola e amplificarla

più volte, la differenza sta nel fatto che non si ha una piastra solida ma le molecole sono adese a

biglie. Le biglie poi vengono caricate all’interno della piastra di sequenziamento in modo che in

ogni pozzetto ci sia una biglia, si utilizza un primer situato all’estremità opposta della sequenza

rispetto alla biglia. Quando viene incorporata una base (in questa reazione non è prev isto che le

base siano inserite tutte insieme ma una alla volta, questo perché non si hano colori diversi per basi

diverse ma una sola). Con l’aggiunta di una base si ha il rilascio del pirofosfato che si illumina e

viene rilevato. La reazione di PCR avviene all’interno di una gocciolina, in questo modo quando la

sequenza che si è attaccata alla biglia che viene amplificata rimane intrappolata e quindi non rischia

di attaccarsi ad altre biglie.

ABI/SOLiD sequencing:

anche in questa tecnica vengono utilizzate delle biglie. In questo caso il primer utilizzato riconosce

la molecola adattatrice, e viene usata una ligasi che attaccherà soltanto l’ottamero (8 bp) al cui 3’ le

due basi riconoscono le 2 basi dopo la sequenza adattatrice, a questo punto dopo la ligation viene

tagliata una parte della sequenza con rilascio del fluoroforo e rilevazione dalla macchina. Con

questa tecnica riconosciamo 2 basi ogni 3. Per cui dopo il primo sequenziamento viene attaccato un

altro primer con un nucleotide in meno, e quindi procede la ligation ma in maniera sfalsata, quindi

dopo 5 sequenziamenti si riesce a rilevare anche i 3 nucleotidi che nel primo non è stato

sequenziato.

Helicos sequencing:

Incorporazione di singoli nucleotide al quale è legato un fluoroforo, questa tecnica è in grado di

rilevare una singola molecola e quindi non è necessario il passaggio di amplificazione.

Nanopore single molecule sequencing:

Si basa sull’utilizzo di una proteina di membrana (poro) che è in grado di far passare una singola

molecola di DNA e cambia conformazione in base al tipo di base che passa attraverso il poro.

Fondamentalmente il poro fa passare un tot numero di ioni, la presenza di una base altera questo

flusso riducendolo perché c’è un ingombro sterico da parte della base azotata.

PacBio sequencing:

Si basa su reazioni di PCR, l’unica differenza è che la macchina è in grado di sequenziare in real

time. Anche questo considerato sequenziamento a singola molecola e quindi non prevede

ampificazione.

QUALE PIATTAFORMA USIAMO:

La scegliamo in base all’obbiettivo che vogliamo raggiungere. Se abbiamo per esempio un

campione poco concentrato (per esempio in campo oncologico con estrazioni di linfociti) ci

dirigiamo verso una piattaforma che permette di gestire campioni poco abbondanti come Helicos.

La piattaforma helicos però ha un tasso di errore molto elevato e quindi se siamo nel caso di

sequenziamento di microRNA che sono piccoli, se ad esempio di 22bp ne cambi anche solo una

cambia tutta la molecola quindi ci dirigiamo verso piattaforme diverse tipo illumina o solid.

Oppure nel caso in cui dobbiamo ricostruire l’intera molecola senza voler impazzire con il

riallineamento usiamo piattaforme che sono in grado di sequenziare molecole lunghe.

Campioni che possiamo avere:

Intero genoma di un organismo

- Arriccimento degli esoni

- Ampliconi da PCR

- RNA

-

Analisi dei dati:

dobbiamo ricostruire le nostre sequenze e distinguere errori effettuati durante il sequenziamento e

differenze biologiche.

Trimming: eliminazione degli adattatori, operazione di filtraggio. A questo punto andiamo ad

allineare in punti di overlappaggio.

Dobbiamo valutare la qualità del sequenziamento. La macchina è in grado di vedere con quale

probabilità la base che legge è sbagliata.

Il problema principale è il costo del sequenziamento, un singolo sequenziamento costa anche 5000

euro quindi è difficile fare diversi studi per evitare errori.

Le sequenze ripetute essendo uguali, determinano una ricostruzione che non è univoca e quindi non

siamo in grado di ricostruire la sequenzialità delle sequenze. Tutte le sequenze ripetute in banca dati

non sono congruenti tra di loro, e si hanno molto differenze proprio per la difficolta di

sequenziamento e di riallineamento delle sequenze ripetute.

9 GENOMICA FUNZIONALE 24-11-15

Genoma umano:

quando si parla di genoma umano dobbiamo citare anche il genoma mitocondriale, molto diverso da

quello nucleare, con le seguenti caratteristiche:

Soltanto 37 geni:

- Di questi 13 fanno 13 degli 89 totali polipeptidi del sistema di fosforilazione (questo

o significa che gli altri devono arrivare dal genoma nucleare)

I rimanenti 24 geni sono RNA genes.

o

Nessun gene mitocondriale ha una struttura interrotta, ma è interamente codificante. Non

- esistono quindi sequenze introniche o ripetute.

Esistono geni sovrapposti nei due strand per ottimizzare lo spazio, quindi ci sono ORF sia

- sullo strand H (pesante) sia sullo strand leggero (L). si genera quindi un unico trascritto che

poi viene processato a formare i diversi peptidi e RNA.

Il mitocondrio è un organello con una autonomia limitata, e per compiere le azioni

- necessarie alla cellula eucariotica necessita di proteine sintetizzate a partire dal genoma

nucleare.

I componenti dell’apparato di sintesi proteica sono sintetizzati sia a partite dal genoma

- mitocondriale (24 RNA) sia dal genoma nucleare (79 proteine).

Il mistero delle sottili differenze tra le specie rimane, approssimativamente circa il 98,8% delle

sequenze sono identiche.

Si riesce però ad apprezzare una complessità non legata alla grandezza del genoma ma una

complessità di intreccio e di utilizzo delle informazioni, quindi in una maggior complessità nella

struttura e nell’utilizzo dei geni (geni sovrapposti, geni all’interno di introni ecc). Che cosa ci rende

umani? La capacità di pensiero, la capacità di opporre il pollice ecc. comunque sicuramente rimane

il fatto che tra l’uomo e lo scimpanzé si riscontra il 98,8% di identità.

Dichiarazione dei diritti del genoma umano:

scritta a seguito del progetto genoma, perché la prima cosa venuta in mente a compagnie dopo il

sequenziamento era che se io per primo sequenzio un tratto di genoma lo brevetto e tutto quello che

deriverà da quel tratto porterà un vantaggio, oppure utilizzo tratti dei genomi per discriminare gli

individui. Per evitare questo è stata scritta una carta dei diritti del genoma che prevede il fatto che il

genoma sia universale e non di qualcuno soltanto per essere utilizzato per vantaggi economici.

CROMATINA:

la struttura dei cromosomi è peculiare, negli organismi multicellulari complessi. In particolare nel

genoma umano sappiamo che il genoma non è un’unica molecola, ma consiste in 25 differenti

molecole che sono nel nucleo e nei mitocondri. Nel nucleo ci sono 23 o 24 differenti molecole di

DNA a seconda che parliamo di individui maschili o femminili.

Ci sono organismi più semplici con numero di cromosomi maggiori, quindi non è correlato ne alla

complessità ne alla lunghezza del genoma.

Nella cromatina non c’è solo DNA, anzi il DNA è la componente meno rappresentata della

cromatina, la max parte della cromatina, quindi del cromosoma è costituita da proteine. Fino a poco

tempo fa si pensava che queste proteine avessero solo un ruolo strutturale, ora sappiamo che hanno

un ruolo chiave anche nel funzionamento del genoma. Se rompiamo i cromosomi con agenti

chimici otteniamo un insieme delle componenti della cromatina, se poi aggiungiamo endonucleasi

che agiscono sulla componente di DNA e facciamo correre su un gel vediamo delle bande di cui il

più grosso è 205bp, otteniamo questo disegno perché quando si rompono le membrane e si libera

c’è che sta nel nucleo, in realtà non liberiamo solo il DNA, ma questo è riparato dall’azione delle

endonucleasi dalla presenza di istoni, queste nucleasi possono agire soltanto ogni 200 bp, ogni tanto

possono salta e formare quindi frammenti di 400 o 600 bp. Tra un nucleosoma e l’altro ho un

piccolo tratto di DNA nudo dove eventualmente le basi possono tagliare. Dopo che le nucleasi

hanno tagliato, devo eliminare le proteine, e divido la parte proteica dal filamento di DNA poi posso

fare la corsa elettroforetica. D’altra parte posso andare a studiare anche le proteine per scoprire che

sono costituite da più subunità.

Grazie a questa organizzazione a collana di perle otteniamo una struttura più corta ma con un

diametro gia di 10/11 nm. In realtà questa struttura viene ulteriormente impaccata a formare una

fibra con un diametro di 30 nm. Nel cromosoma mitotici arriviamo ad un diametro di 1400nm

(intero cromosoma non singolo braccio).

Questo impaccamento è un processo molto rischioso per il DNA che è una molecola molto fragile.

Quindi si era pensato subito che questa organizzazione fosse utile per organizzarlo meglio per poi

stoccarlo nel nucleo. Col tempo siè visto che questo non è l’unico motivo, ma si è visto che tutte

queste proteine non sono importanti solo per lo stoccaggio ma anche per il funzionamento del

genoma.

I nucleosomi sono ottameri proteici attorno al quale si avvolgono 147 bp in una super elica

sinistrorsa. Le proteine istoniche esistono in tutte le specie eucariotiche e hanno tutte una struttura

estremamente simile, pur avendo variazioni nella sequenza amminoacidica, questo conservazione

sottolinea l’importanza di queste proteine. In particolare una regione presente in tutti gli istoni

(regione chiamata histon fold) è costituita da 3 eliche che assumono sempre lo stesso orientamento,

è un particolare motivo proteico importante per la dimerizz