Appunti genomica funzionale

METAGENOMICA

IL Sequenziamento NGS ha permesso di studiare in maniera massiva campioni di qualunque tipo ed

andare a identificare i batteri presenti nel campione. Prendo il mio campione ed estraggo il DNA e vado a

vedere il contenuto.

Per fare una analisi tassonomica del campione si può fare un analisi

dell’ RNA ribosomiale della subunità 16S (subunità minore) perché il

ribosoma è molto conservato però vi sono delle regioni variabili

- sufficientemente conservato per fare delle analisi su tutti i

ceppi

- sufficientemente diverso per poi poter distinguere tra i vari

ceppi

nel 16S vi sono delle regioni variabili da un ceppo all’altro.

Si può fare una PCR sulla regione V4, i primer sono complementari ad una regione conservata quindi potrò

amplificare tutti i ceppi. Poi però il trascritto finale ottenuto tramite PCR sarà diverso. deep seq



Posso calcolare un indice di biodiversità

che correla con uno stato di buona

campione ignoto a dei diversi profili

(maschio, femmina, forte bevitore,

sportivo…)

28/10/19

EPIGENETICA

Abbiamo visto che le proteine in grado di modificare la cromatina sono fondamentali per rendere più o

meno accessibile una regione del genoma alle machine trascrizionali.

Un classico promotore è formato da:

- sito di inizio della trascrizione

- core promoter solo il 30% dei geni trascritti



dalla pol II hanno un promotore classico con la

TATA BOX

questi promotori sono quelli usati dai geni con un’espressione altamente tessuto specifica, i promotori per i

geni housekeeping o con pathway complessi di espressione tendono ad avere CpG islands al posto del TATA

BOX.

TATA Sono delle piccole sequenze con senso che vengono riconosciute

I fattori di trascrizione riconoscono anche altre regioni lontane dal sito di binding della polimerasi, questi

siti distali sono i siti dove sono presenti enhancer o silencer, a queste sequenze si legano dei fattori:

- enhancer

- silencer

sono delle piccole sequenze uguali alle sequenze nel promotore prossimale, ma non coincidono a quelle

riconosciute dai fattori trascrizionali di base, spesso non contengono solo il riconoscimento per un fattore

trascrizionale, ma vi può essere la stessa sequenza ripetuta più volte.

Nei genomi degli eucarioti abbiamo sia enhancer che silencer, la regolazione non è spinta solamente, ma vi

può essere anche uno spegnimento

Vi è una trascrizione di base molto bassa e quindi se un prodotto è necessario la sua espressione viene

spinta.

La sequenza enhancer può legare degli attivatori, questo legame produce un ripiegamento della cromatina

coadiuvato da altre attività proteiche che permettono alle proteine enhancer di richiamare altre proteine

mediatrici (es. domini di acetilazione) che poi

favoriscono l’attacco del complesso di inizio e poi

della DNA polimerasi.

Le sequenze silencer sono meno abbondanti, queste

legano dei fattori che possono ridurre l’efficienza

della trascrizione (repressori).

Possono essere sequenze enhancer o silencer

separate anche migliaia di basi dai loro promotori,

oppure possono essere su cromosomi diversi, quindi è

fondamentale l’organizzazione tridimensionale

all’interno del nucleo che permette l’avvicinamento di

queste sequenze ai promotori nella regione del

nucleo dove vi è il macchinario della trascrizione.

Oltre alla relazione tra silencer, enhancer e i box classici vi è la presenza di sequenze insulator ovvero delle

corte sequenze che riconoscono una proteina regolativa che è in grado di bloccare il propagarsi del segnale

in cis lungo il cromosoma. Questi insulator hanno una affinità per proteine posizionate alla periferia del

nucleo interfasico dove sono presenti le regioni che non sono attive. Le sequenze tendono ad interagire tra

di loro formando delle anse ed agganciano queste sequenze verso regioni eterocromatiche o di

eucromatina chiusa.

Gli enhancer tendono a reagire insieme tra di loro e a spostare le regioni verso i macchinari di trascrizione.

Grazie all’interazione tra queste proteine vi è un contatto sia in cis che in trans.

A livello di DNA le sequenze regolatrici sono molto semplici, negli eucarioti sono più semplici di quanto si

ritrova nei batteri poiché questi hanno bisogno di una sequenza di riconoscimento più complessa che deve

essere unica, nei mammiferi succede che visto che promotori diversi possono avere lo stesso tipo di

espressione si usano delle corte sequenze ripetendole e mettendole insieme in patchwork diversi.

Una proteina attivatrice o repressore deve avere un dominio di

legame al DNA che può essere C-terminale, N-terminale o

all’interno della proteina, questo dominio è in grado di fare il

legame DNA-proteina, inoltre ha dei domini attivatori che sono

in grado ad esempio di interagire con le acetilasi se si parla di

un attivatore.

Sono dei fattori trascrizionali composti da domini che si

ritrovano nelle sequenze genomiche.

A livello molecolare un attivatore presenta una struttura ad alfa

elica, queste alfa eliche interagiscono con il solco del DNA.

Alla fine che sia un repressore piuttosto che un attivatore in

cogni caso il dominio di legame al DNA riconosce la sequenza.

Sono proteine modulari.

Spesso le sequenze di DNA che sono importanti per

la regolazione dell’espressione genica si trovano in

regioni con una più bassa occupazione nucleosomica,

la distanza tra i nucleosomi in queste regioni è

maggiore.

La TATA box inizialmente è nascosta, quindi è

l’azione delle proteine che permette un rilassamento

anche di questa regione e quindi l’esposizione del

TATA box.

Le sequenze CpG metilate sono riconosciute dalle

proteine, a queste sequenza si legano le proteine con il

bromodomain che possono poi interagire con le

deacetilasi, questa è una via di repressione, ma non

funziona sempre così.

CONTROLLO COORDINATO DI GENI NEGLI EUCARIOTI

Per come sono organizzati i genomi

complessi geni anche se su cromosomi

diversi possono essere riconosciuti insieme.

I due cluster dell’alfa e della beta globina

sono uno sul cromosoma 16 e uno sul

cromosoma 11. Ogni gene ha il proprio

promotore, ma questo viene spinto

dall’azione delle Locus control region. I geni

sono disposti in modo da rispettare il loro

momento di espressione i geni più vicini



sono quelli che vengono espressi prima

questo perché nel ripiegamento vi è un

silenziamento due geni nella porzione

ripiegata della cromatina

nella control region del gene beta vi sono una

serie di corte sequenze in grado di legare

fattori di trascrizione, queste sequenze sono

ripetute molte volte sia al 5’ che al 3’. GATA1

si lega a queste regioni.

Nella LCR la stessa sequenza è capace di legare

dei fattori trascrizionali specifici che sono

prodotti a livello embrionale e che poi sono affini

per i promotori del gene epsilon, siccome in

epoca fetale l’espressione dell’emoglobina è a

livello del fegato, viene prodotto un altro set di

proteine sempre in grado di riconoscere le stesse

sequenze della LCR, queste diventano affini per il

promotore del gene gamma. In età adulta si ha l’espressione dell’emoglobina a livello del midollo, vengono

prodotti dei fattori di trascrizione ancora diversi che si legano sempre alla LCR, ma sono in grado di attivare

i geni beta.

I geni HOX sono geni fondamentali per lo sviluppo antero-

posteriore degli animali, questi sono arrangiati in cluster, i

geni nel cluster sono posizionati a seconda del loro momento

di espressione, i più vicini sono i primi a doversi esprimere. I

geni HOX sono inizialmente bloccati nell’eterocromatina e

sono in questo modo silenziati, vengono poi sequenzialmente

attivati durante lo sviluppo quando l’eterocromatina si

converte in eucromatina

Man mano che i geni si devono esprimere alla regione di

controllo si legano determinati fattori enhancer che riescono a

riconoscere i promotori dei geni che si devono esprimere e trascinano verso l’esterno del dominio

cromosomico e verso il macchinario di trascrizione la regione che deve essere espressa premettendo la

trascrizione.

IMPRINTING

Con imprinting genomico si intende l’espressione monoallelica di un gene che non avviene casualmente,

ma a seconda della derivazione materna o paterna.

Noi abbiamo un genoma diploide e l’espressione dei nostri geni è sempre bi-allelica, vi è tuttavia una certa

quota di geni che non funzionano così hanno l’espressione di un unico allele.



Vi sono vari tipi di evidenza:

- trapianti pronucleari in topo

- Patologie umane (teratoma e mola idatiforme)

- Triploidi umani

- Disomie cromosomiche uniparentali

TRAPIANTI PORONUCLEARI

Se si producono due zigoti con due pronuclei derivati dalla stessa cellula uovo (zigoti ginogenetici), in

questo caso si forma un embrione quasi normale che non arriva a termine perché placenta e sacco vitellino

sono assenti

Al contrario se produciamo zigoti androgenetici con due pronuclei derivati da spermatozoo abbiamo gli

annessi embrionali che sono regolari, mentre si ha un embrione che si sviluppa pochissimo.

Questo ci dice che entrambi i genomi portano un contributo fondamentale per la formazione del nuovo

individui, i due corredi sono modificati in modo differente in base all’origine parentale.

PATOLOGIE UMANE

Il teratoma è un tumore formato da tessuti embrionali senza tessuto placentale associato che sono dovuti a

una diploidia uniparentale materna, se si ha un uovo con due nuclei questo incomincia a formare uno

zigote, ma forma poi questo tumore per cui si formano i primi tessuti embrionali senza i tessuti annessi

La mole idatiforme è una malformazione della placenta in gravidanze prive di embrioni, queste sono dovute

ad una diploidia uniparentale paterna.

TRIPLOIDI

Sono derivati dal raddoppio del normale contributo cromosomico di uno dei genitori, ma hanno una

patologia diversa a seconda dell’origine del materiale supplementare

- Due materni e uno paterno sviluppo placentale ridotto



- Due paterni e uno materno placenta normale e feto con malformazioni



Queste sono situazioni estreme

DISOMIE UNIPARENTALI

Sono delle condizioni per cui una coppia di cromosomi omologhi o anche un solo tratto ha la stessa origine

parentale, si forma un embrione che ha due cromosomi, ma ad esempio per la coppia del cromosoma 11

sono entrambi di derivazione materna o paterna.

Normalmente accade a causa di errori a livello della divisione meiotica pre cui si formano delle trisomie

ovvero degli embrioni che hanno tre copie

- Due di derivazione del genitor