Appunti genomica funzionale

Compiti e presentazioni

9/10/19 Test a quiz + 2 domande aperte tra cui scegliere. Esposizione articolo scientifico permette di non sostenere l'orale. 7-8-11 novembre presentazioni. 5 dicembre compito finale.

Storia della genetica

La genetica nasce con Mendel che nella seconda metà dell'800 ha fondato le leggi base della genetica moderna. Il termine "gene" è comparso solo in decenni successivi, ma Mendel è comunque riuscito a stabilire le regole di base dell'ereditarietà dei caratteri nelle generazioni.

Nel 1900 i cromosomi come strutture fisiche erano noti grazie allo sviluppo della microscopia ottica. Con la teoria cromosomica si è riusciti a dare una base concreta alle regole sviluppate da Mendel e si è capito il meccanismo di segregazione di cromosomi. Morgan, tramite Drosophila, riuscì a definire le prime mappe genetiche. Nasce l'era neoclassica della genetica in cui si comincia a sezionare i geni attraverso la ricombinazione genetica che Morgan stava già sfruttando per le sue mappe genetiche.

Scoperte fondamentali e avanzamenti

Si era capito che all'interno della cellula i geni erano formati da una lunga molecola che dopo il 1950, dopo gli studi di Watson e Crick, è stato definito essere il DNA. Si è giunti poi al concetto di gene che è quello sviluppato sul lavoro di Monod: un gene, un RNA → messaggero, un polipeptide. Ad oggi sappiamo che un gene può far parte di più unità trascrizionali; in un gene vi possono essere più promotori differenti e vi può essere splicing alternativo. Malgrado queste conoscenze che si accumulano, il concetto di gene non è cambiato.

Metodi per lo studio del genoma

• Approccio genetico di Morgan che ha permesso di capire che alcuni loci sono posti sullo stesso cromosoma a una precisa distanza genetica.
• Approcci molecolari (sequenziamento Sanger, PCR, clonaggio, analisi di Southern).
• Tecniche di NGS.
• Metodiche omiche (trascrittomica, proteomica…).

Approcci genetici per mappare il genoma

Sono basati sul linkage tra due fenotipi (ad esempio mutato e wt) per operare un confronto. Le mappe genetiche dipendono dalla stima della frazione di ricombinanti tra due loci e per far questo si analizzano le famiglie per dei marcatori. Analizzando le generazioni si possono individuare gli individui ricombinanti (R) e non ricombinanti (NR); contando i ricombinanti e i non ricombinanti possiamo calcolare la frequenza e la distanza genetica (unità di mappa).

La frequenza di ricombinazione dipende dai crossing over e la frequenza non supera mai il 50%. La frequenza di crossing over non è identica in tutti i loci. Seguendo solo dei fenotipici e polimorfici le mappe genetiche sono povere di parenti; bisognava trovare dei caratteri mendeliani che fossero polimorfici, ovvero per i quali esistano più alleli, dei marcatori facili da trovare e da analizzare.

Scoperta dei polimorfismi

Il grosso salto che ha permesso la mappatura di genomi complessi è stata la scoperta dei primi polimorfismi a DNA:

• RFLPs: presenza o assenza di un sito di restrizione in un tratto del DNA, sono loci con solo 2 alleli (o il sito c'è o non c'è) però vi sono 10⁵ loci. Si analizzavano con analisi di restrizione e Southern blot.
• VNTRs: sequenze altamente ripetute ipervariabili e quindi altamente polimorfici. Si distinguono in Minisatelliti, Microsatelliti, e Satelliti troppo grossi e non usati. Hanno un numero di loci simile a quelli dell'RFLP, ma sono più polimorfici e quindi è più facile trovare ricombinanti.
• SNPs: polimorfismi di un singolo nucleotide con elevata frequenza (>1%), sono 10⁷, ma hanno solo 2 alleli, sono pochi polimorfici.

RFLP

Prendiamo in considerazione un locus con due alleli, uno presenta il sito di legame per un enzima di restrizione e l'altro non presenta il sito di restrizione per l'enzima EcoRI. Analizzando tramite PCR si vanno a verificare il numero e la lunghezza delle bande.

VNTR

Possono essere minisatelliti che si ripetono un numero di volte variabile in un locus. Per analizzare questi minisatelliti, se la distanza massima delle ripetizioni non è enorme, posso usare una PCR con primer su sequenze identiche in tutti gli alleli per verificare la lunghezza degli alleli. Questa stessa operazione può essere fatta su un microsatellite ovvero dei satelliti la cui unità di ripetizione è formata da 1, 2, 3 o 4 nucleotidi.

SNPs

Sono le variazioni più comuni e le più utili insieme ai microsatelliti. Il polimorfismo viene definito quando una mutazione è presente in più dell'1% della popolazione. Sono densamente distribuiti lungo tutto il genoma. Gli SNP vengono identificati tramite sequenziamento. Se si vuole studiare un locus ad esempio per studiare un allele patologico, si scelgono dei marcatori presenti nel locus, si vuole studiare in una famiglia se questi marcatori sono informativi o meno.

Mappe genetiche

La prima mappa genetica è del 1987 ed era basata su 400 loci RFLP. Le mappe genetiche di seconda generazione sui microsatelliti hanno utilizzato 814 marcatori, si aveva una densità di un marcatore per ogni 3,5 Mb. Nel '94 si compie la prima mappa integrata tra i diversi marcatori. La mappa più recente ha utilizzato tutti gli SNPs e ve n'è uno ogni kb. I dati suggeriscono che l'allele 2 del marcatore sta segregando con la malattia (locus F) e che i due loci sono distanti 20 cM.

Mappa fisica

Non vi era ancora la possibilità di pensare al sequenziamento del genoma, ma si poteva fare un mappaggio fisico con risultati migliori del mappaggio genetico. È stato di estrema importanza l'allestimento delle librerie genomiche inserendo dei frammenti in vettori in grado di tenere grandi frammenti riducendo il numero di cloni necessario per comprendere tutto il genoma. È stato il primo metodo per ottenere un grande numero di copie di un frammento del genoma per studiarne le caratteristiche, utilizzando vettori di espressione era in grado di ottenere grandi quantità anche di proteina.

Libreria genomica

Per essere sicuri di non perdere nessun pezzo, il DNA genomico deve essere tagliato con enzimi di restrizione che tagliano più o meno raramente e la digestione deve essere fatta in modo che i frammenti siano sovrapponibili; le digestioni non devono essere complete. Questi frammenti sono poi clonati in vettori adeguati che dipendono dalla grandezza dei frammenti, questi verranno poi inseriti in E. coli o lievito a seconda del tipo di vettore.

• Plasmidi genomi procariotici molto piccoli (<10 kb), sono usati per sub-clonare tratti di DNA di interesse.
• Fago lambda 20-25kb non sono ottimali, sono stati usati per la costruzione di librerie di cDNA.
• Cosmidi sono un vettore artificiale che derivano dalla fusione del genoma del fago lambda con un genoma plasmidico, 30-45 kb sono ritenuti ancora troppo piccoli.
• PAC, BAC, YAC: mantenendo le regioni fondamentali del genoma di lievito (origine di replicazione, sequenze telomeriche), si è pensato di usare un cromosoma di lievito, togliere le sequenze non essenziali e al loro posto inserire delle sequenze che si volevano studiare, si possono clonare frammenti di 2Mb. I cromosomi di lievito sono dei cromosomi lineari nel vettore, i due telomeri sono uniti da un tratto di DNA che può essere eliminato da un enzima di restrizione. Viene mantenuta sia l'origine di replicazione batterica che quella di lievito, presenta le resistenze tipiche degli antibiotici sia le complementazioni amminoacidiche per poter far crescere lievito in terreni adeguati. Il DNA di interesse viene tagliato in modo da avere dei frammenti overlapping, il vettore pYAC viene tagliato e vengono inseriti i frammenti. La libreria viene poi piastrata. Dopo un po' ci si è accorti che i risultati non erano omogenei, gli YAC ricombinano molto facilmente, si ricombinavano i frammenti umani, quindi si è dovuto ricominciare da capo. BAC, cromosomi artificiali batterici, hanno permesso di clonare dei frammenti più piccoli di quelli clonati nello YAC, ma risultavano stabili. È un grosso plasmide batterico.

Una volta generata la libreria, si è pensato di fare un continuo di questi cloni, un modo per ordinare i frammenti è utilizzare il sequenziamento Sanger. Partendo dalle sequenze note del BAC, si sequenzia un piccolo tratto di inserto continuando fino a trovare delle sovrapposizioni tra BAC diversi, la cosa migliore è utilizzare i marcatori genetici polimorfici. Bisognava identificare la posizione di questi marcatori nei BAC, questo aiutava a fare una mappa. I marcatori genetici hanno una bassa risoluzione quindi vi sono dei limiti.

Si è iniziato a cercare dei nuovi marcatori. Sequenziando le estremità si ottenevano delle sequenze STS, queste sequenze possono essere dei marcatori se sono delle sequenze uniche. Una volta ottenuta la sequenza, si costruiscono dei primer per vedere se queste sono sequenze singole o multiple. I due primer usati per amplificare la sequenza li posso usare su tutta la libreria per vedere quali altri BAC la contengono. In questo modo posso identificare dei frammenti che fanno parte della stessa regione genetica. Sono dei marcatori molecolari e non genetici. Una cosa simile è possibile farla dalle librerie di espressione. Si sequenziano le estremità di cloni di cDNA e si ripete la stessa operazione. Una volta che ogni clone è stato analizzato si può fare un overlapping per ottenere una mappa continua di cloni. A questo punto ho delle segnalazioni sia per quanto riguarda i marcatori genetici che quelli molecolari. Ogni clone è stato segnato con una posizione nella mappa degli STS.

Metodi di sequenziamento

Maxam-Gilbert metodo di sequenziamento chimico. Sanger: serve un templato da copiare che doveva essere a singolo filamento (si clonava il M13 in modo da ottenere un filamento singolo), si utilizza un primer per l'innesco della polimerasi, l'idea è di aggiungere dNTP e ddNTP che non permettono la continuazione della polimerizzazione (manca 3' OH). Venivano inizialmente usati dei ddNTP marcati con S35, adesso si usano dei ddNTP fluorescenti. L'analisi dei prodotti avveniva su gel. Nella seconda generazione si compie un cycle sequencing, si è messo insieme la PCR al sequenziamento. Sono stati creati dei sequenziatori automatici che rilevavano la lunghezza d'onda di emissione del fluoroforo, in questo modo la lettura è automatica.

Interpretazione delle sequenze

Bisognava dare un senso alle sequenze trovate.

• Genes
  • Protein-coding: Dove sono i frame di lettura aperti (ORFs)? A cosa sono più simili gli ORFs? (Qual è la funzione/struttura/storia evolutiva?)
  • RNA
• Non-genes
  • Regulation: promoters and factor-binding sites
  • Transactions: replication, repair, and segregation, DNA packaging (nucleosomes)

Bisognava trovare in altre specie se vi sono delle corrispondenze tra i geni trovati; più un gene è importante per la funzionalità dell'organismo, più è probabile che un gene sia importante e che sia codificante. Una volta individuato il gene, si potevano cercare delle mutazioni per correlare il gene a determinati fenotipi.

Metodi classici di identificazione della funzione di un gene

• Mutare il gene, caratterizzare il fenotipo per individuare la funzione.
• Purificare la proteina e caratterizzarla in vitro.

Ad oggi è possibile operare un confronto con geni precedentemente caratterizzati:

• Geni che hanno una similarità elevata di sequenza, spesso hanno la stessa funzione.

Risorse e banche dati

• Pubmed: search tool for literature—search by author, subject, title words, etc.
• All databases: "A retrieval system for searching several linked databases."
• BLAST: Basic Local Alignment Sequence Tool. Searches chosen sequence database and identifies sequences with similarity to test sequence. Ranks similar sequences by degree of homology (E value). Illustrates alignment between test sequence and similar sequences.
• OMIM: Online Mendelian Inheritance in Man.
• Books: many online textbooks available.
• Tax Browser: A taxonomic organization of organisms and their genomes.

Allineamento di sequenze

Due sequenze omologhe derivano da una sequenza ancestrale comune quindi la loro omologia è tanto distante a seconda di quando si sono separate dalla sequenza ancestrale. La frazione di amminoacidi identici è chiamata percentuale di identità. Alcuni amminoacidi hanno delle proprietà chimico-fisiche simili, queste mi forniscono un punteggio nell'allineamento, poiché l'amminoacido è cambiato, ma in modo conservativo, invece i GAP forniscono delle penalità nell'allineamento.

Identificare dei geni per malattia

Sono state usate 2 strategie:

• Clonaggio funzionale si basa su conoscenze sulla funzione del gene.
  • Approcci biochimici
  • Approcci del gene candidato
  • Modelli animali
• Clonaggio posizionale vi è una malattia che segrega nelle famiglie, la sfrutto per identificare la posizione del gene. Vari geni sono stati clonati singolarmente con questi due metodi.

Functional cloning

Il functional cloning prevede il clonaggio di geni di funzione nota, senza badare a nessuna nozione sulla loro posizione sulla mappa. Ho una malattia metabolica e riesco ad isolare la proteina, questa poteva essere caratterizzata. Si ottiene un pezzo di sequenza della proteina, all'interno di questo pezzo devo cercare la regione di minore degenerazione ovvero la regione dove vi sono aa codificati da meno codoni possibili. Creo oligonucleotidi degenerati, li marco e vado su una libreria di cDNA, questo permette di trovare i cDNA.

Per identificare uno dei geni responsabili di una forma di sordità nell'uomo esisteva un modello animale che sembrava mimare la patologia umana. Questi topi (sh2) sono stati incrociati con dei wt. Esistevano dei marcatori da seguire e alla fine con studi genetici si è riuscito a mappare il gene in una regione grande 1 centimorgan sul cromosoma 11 del topo, questa regione corrisponde alla banda 11.2 del cromosoma 17 nell'uomo. Questa è stata definita la regione candidata per il gene della sordità DFNB3. Si sono cercati con i marcatori i cloni BAC che coprivano quella regione del cromosoma murino; questi cloni erano multipli, a questo punto sono stati presi dei topi omozigoti per la patologia, le uova di questi topi sono state fertilizzate per creare topi transgenici, in ciascuna linea è stato inserito un clone BAC nella regione. Si è andati a vedere quale clone BAC complementava il gene mutato, si è capito che era il BAC 425 p24 a correggere il difetto. Il clone è stato sequenziato ed è stato identificato un gene myo15 che risultava mutato nel topo con la patologia. A questo punto, avendo la sequenza del gene murino, è stato possibile trovare la sequenza del corrispondente gene umano.

Positional cloning

Ho una patologia di interesse, riesco a conoscerne la posizione approssimativa analizzando la segregazione del fenotipo nelle famiglie e quindi all'interno della regione cerco il gene candidato. Devo sempre poi tornare ad uno screening sui soggetti malati nelle famiglie. La clonazione posizionale è il metodo per trovare un gene senza alcuna conoscenza della proteina che codifica. Il primo gene della malattia umana identificato dalla clonazione posizionale è stato uno per la malattia cronica granulomatosa (CGD).

Le perturbazioni in più di un gene possono causare il fenotipo CGD, caratterizzato dalla presenza di lesioni infiammate contenenti cellule immunitarie fagocitiche. Un gruppo del Boston Children's Hospital ha isolato il gene CGD su Xp21. I geni per la distrofia muscolare di Duchenne e il retinoblastoma seguirono rapidamente. Esistono, tuttavia, diverse strategie alternative che consentono l'identificazione di un gene causale, a partire da modelli animali o da approcci proteomici e che sono oggi considerati parte integrante della clonazione posizionale. Essi costituiscono la cosiddetta "genetica inversa", un termine che indica come l'identificazione del genotipo sia seguita dalla caratterizzazione del fenotipo, in contrasto con la "genetica in avanti", in cui lo studio del fenotipo porta all'identificazione del genotipo. La genetica inversa sta guadagnando sempre più popolarità, grazie al completamento del sequenziamento del genoma, al miglioramento delle banche dati e all'uso di moderne tecniche proteomiche che consentono di rilevare anche piccole differenze nei proteomi dei pazienti rispetto ai campioni di controllo.

Collegamento tra genetica e mappa fisica

La mappa fisica mi permette di costruire una mappa di sequenze, ma non mi permette di trovare un gene candidato di un particolare fenotipo, quindi una metodica non esclude l'altra. La mappa genetica è importante per l'identificazione di geni che segregano nelle famiglie e mi permettono di risalire a una posizione fisica. Ancora oggi, marcatori polimorfici e lo studio delle famiglie sono fondamentali per risalire a dei tratti fenotipici.

Clonare il gene HD - positional cloning

Il mappaggio e il clonaggio di HD è stato fatto attraverso una procedura di chromosome walking ovvero un mappaggio prima genetico e poi a... [testo tronco]