Genomica ed epigenomica

Genomica ed epigenomica

Una mutazione identifica la modificazione di un gene. La genomica nasce dalla possibilità di sequenziare il DNA in maniera automatica. La genetica nasce nel 1866 con la scoperta da parte di Mendel delle leggi dell’ereditarietà. Nel ‘900 ci furono altre scoperte come la teoria cromosomica dell’eredità, ovvero la scoperta che i geni sono sui cromosomi. Un’altra scoperta è che all’interno dei cromosomi il materiale genetico è fatto da DNA e non da RNA e proteine.

Una grande scoperta è quella di Watson e Crick nel 1953 con la struttura a doppia elica del DNA, che dava ragione al meccanismo di trasmissione dei caratteri ereditari, al meccanismo di replicazione dei caratteri ereditari e di mutazione. Negli anni ’70 si iniziò a sequenziare il DNA scoprendo le sequenze di base, la scoperta fatta da Sanger, il quale tempo prima sequenziò anche le proteine. Furono scoperte tecniche come la PCR, microarrays, si riuscì poi a sequenziare il genoma e poi il genoma umano con le ultime tecniche, dette next generation sequency (di terza generazione), NGS; queste tecniche permettono di non lavorare più con il metodo di Sanger e di ottenere il sequenziamento di DNA rapidissimo.

Fino ad adesso, per studiare un gene serviva avere una mutazione, infatti i geni si chiamavano dal nome delle mutazioni EX (il gene X, il colore dell’occhio in Drosophila si chiama white, ma l’occhio normale è rosso, e la mutazione è white). Quindi per identificare un gene non serviva sapere la sequenza, ma solo la sua mutazione. La genetica inversa, invece, parte dal gene (sequenza) per arrivare alla funzione.

Epigenetica

L’epigenetica è quella branca della genetica che si occupa di quei fenomeni ereditari che non dipendono dalla sequenza del DNA, ma da qualche cosa che è sovraimpresso sulla sequenza. Epi- in greco significa sopra, infatti epigenetica indica qualcosa che sta sopra alla genetica, cioè sopra alla sequenza del DNA. Vedremo che ci sono dei fenomeni ereditari che sono governati da segnali molecolari sovraimpressi alla sequenza.

DNA ricombinante

Vede l’utilizzo degli enzimi di restrizione (tagliano il DNA), la ligasi (lega il DNA, risalda) e la polimerasi (copia DNA o RNA). Le reazioni biochimiche che si usano sono le ibridazioni tra filamenti di acidi nucleici DNA-DNA, DNA-RNA ed RNA-RNA. Si sfrutta la tendenza che hanno due sequenze di acidi nucleici complementari a rinaturare formando dei legami idrogeno tra le basi.

Enzimi di restrizione

Sono stati scoperti per caso durante uno studio sui batteriofagi, i quali entrano nella cellula batterica e la distruggono. Questi enzimi sono molto importanti per manipolare il DNA. Lo studio sui batteriofagi si sofferma su quelle cellule che erano in grado di resistere a queste strutture. Un esempio è il ceppo di Escherichia coli (K12) che era resistente all’infezione dei batteriofagi, come era possibile? Si accorsero che quando il DNA del batteriofago era introdotto nel K12, il batterio ha una serie di enzimi che distrugge il genoma del fago, sopravvivendo all’attacco. Quindi gli enzimi di restrizione sono una sorta di sistema immunitario. Ogni enzima di restrizione ha una sua specifica sequenza di taglio. Infatti ogni batterio ha 1, 2 o 3 enzimi di restrizione che tagliano a casaccio, ma seguono una sequenza specifica (non tagliano a caso il DNA, altrimenti per sbaglio potrebbero tagliare anche il proprio DNA). Tuttavia il taglio del proprio DNA è impedito da altri enzimi, detti enzimi di modifica, che vanno a metilare la sequenza specifica nel caso che questa si trovi sul genoma del batterio in modo che non sia danneggiato. Perciò associato ad un enzima di restrizione ce n’è uno di modifica.

Enzima di restrizione di Escherichia coli

Un enzima è EcoR1, dove Eco sta per E. coli e 1 perché è il primo che è stato scoperto. Il sito di riconoscimento di questo enzima è GAATTC, questo sito ha la sua sequenza complementare che è CTTAAG. E. coli ha anche un enzima di modifica che metila questa sequenza in modo da renderla (nel suo DNA) immune dal taglio, a differenza del DNA del fago che verrà frammentato.

5’ GAATTC 3’
3’ CTTAAG 5’

È una sequenza palindroma, ovvero che se viene letta in una direzione su un filamento e letta nella stessa direzione sull’altro filamento è identica, per stessa direzione si intende 5’ 3’. Esistono due tipi di enzimi di restrizione:

• Hanno le estremità di taglio nette.
• Hanno le estremità di taglio coesive, ovvero le estremità sporgenti che si formano dopo il taglio con uno stesso enzima di restrizione, sono compatibili tra loro, ad esempio una sequenza tagliata con EcoR7 può appaiarsi con un’altra sequenza tagliata con EcoR1, in questo modo è possibile creare DNA ricombinante rispetto alla sequenza originale.

Nome degli enzimi di restrizione

Deriva dal batterio sul quale sono stati isolati questi enzimi, EX. EcoR1 = Escherichia coli. Perciò deriva dal batterio che li ha prodotti. Attualmente è possibile comprare gli enzimi dalle case farmaceutiche.

Elettroforesi su gel

Un’altra tecnica importante prevede la costruzione di un gel, agarosio o poliammide, facendolo solidificare con dentro un pettinino, poi quando il tutto sarà solido si leva il pettine e si formano dei pozzetti dove carico il DNA e applicando un campo elettrico, il DNA, che è carico negativamente, migrerà verso il polo positivo. Alla fine il DNA smetterà di migrare e in basso ci saranno le sequenze più veloci e in alto le più pesanti. Nell’elettroforesi si formeranno tanti frammenti di DNA perché dopo la sua estrazione lo andiamo a frammentare almeno di 50 Kbas.

DNA ricombinante (clonaggio)

È stata quella di inserire una sequenza di DNA in un vettore per amplificarla. Prima della scoperta della PCR, per amplificare si utilizzava il vettore, che si inseriva in E. coli, che ogni volta che si duplicava portava anche la duplicazione del nostro vettore e del frammento di DNA. Si utilizzava il Coli perché si duplica ogni 20 minuti. Per inserire il frammento di DNA si taglia inizialmente il DNA ed il vettore con lo stesso enzima di restrizione, quando le estremità coesive si uniscono, si può inserire il vettore nel batterio. I vettori variano in base alla diversa quantità di DNA esogeno che possono contenere.

• EX YAC = cromosomi artificiali del lievito che contengono fino a 2000 Kb, sono stati usati per studiare i genomi.
• PLASMIDI = contengono poco DNA, circa 15 Kb, questi sono usati per studiare singoli geni.

Il plasmide deve avere una sequenza di resistenza agli antibiotici, quando dobbiamo replicare per molte volte una parte di sequenza del DNA umano. Il plasmide deve avere un’origine di replicazione, la resistenza all’ampicillina e il sito di taglio. Un plasmide ha tanti siti, ma ogni volta si va a tagliare un solo sito. Il plasmide tipico ha una regione detta poli-linker, ovvero un legatore in cui ci sono siti per tanti enzimi di restrizione. Oltre ai poli-linker, c’è l’origine di replicazione, poi ha un gene che dà al plasmide la capacità di sintetizzare la resistenza ad un antibiotico (ex ampicillina). Quando abbiamo unito il nostro DNA al plasmide, formando molecole ibride nella migliore ipotesi, perché altrimenti il plasmide potrebbe richiudersi su se stesso, oppure si possono unire insieme due frammenti di DNA umano. A noi interessa solo il DNA ricombinante.

Noi abbiamo perciò il nostro plasmide con resistenza all’ampicillina e con origine di replicazione, e anche un gene LacZ che fa la β-galattosidasi. Quando si inserisce il DNA, questo si posiziona in mezzo al LacZ, perciò dove è inserito il frammento umano, LacZ è rotto. Di seguito il plasmide va messo a contatto con le cellule di Coli che sono state rese competenti ad assorbire il DNA esogeno. Alla fine vanno selezionate tutte le cellule che hanno preso il plasmide, queste resistenti all’ampicillina, perciò mettendo i batteri sul terreno di ampicillina, quelli che non hanno preso il plasmide muoiono.

Nel batterio possono entrare anche due plasmidi che, come dicevamo prima, possono ricombinarsi, questi non contengono la sequenza di DNA, ma hanno la resistenza all’ampicillina, perciò quei batteri sopravviveranno comunque sul terreno. Come lo riconosciamo il plasmide non ricombinante? Si riconosce perché in presenza di una sostanza chiamata X-GAL, LacZ produce da un pigmento blu, perciò là dove LacZ dà un colore blu significa che non è stato rotto dall’inserzione del frammento umano, e quindi quei batteri che hanno incorporato questi plasmidi per noi non sono interessanti.

Le genoteche

Le biblioteche genomiche sono una collezione stabile di cloni cellulari che contengono le copie di ogni sequenza di un intero genoma. Ogni cromosoma di YAC o di plasmide, può replicarsi in maniera indefinita, può formare dei cloni cellulari di quel pezzo di DNA clonato. Per essere analizzati richiedono il sub-clonato, all’interno di plasmidi che contengono frammenti di DNA piccolo. Queste sono genoteche a cDNA, vengono così costruite per avere tutto il genoma dell’organismo. Il cDNA è il DNA complementare all’RNA, contiene un sottoinsieme del genoma che viene espresso. Non partono dal genoma di una specie, ma dal loro RNA messaggero. Questo mRNA rappresentativo di quel tipo di cellule, non ci stanno tutte le sequenze espresse, i geni sono diversi (housekeeping sono in comune), sono geni perché sono diverse le funzioni, sono tessuto-specifici, cioè i geni del sangue sono diversi nell’mRNA da quelli muscolari. Contengono un sottoinsieme del genoma ed è un sottoinsieme dei geni espressi da quelle cellule.

Si parte dall’mRNA, si sfrutta la coda di poliA di questo ultimo, alla fine, che ci serve per retrotrascrivere mRNA, il primer deossi-poliT, per mezzo di una trascrittasi inversa (copia di DNA a partire da RNA) e si può copiare l’RNA. Questo è l’unico processo che parte in maniera inversa. La trascrittasi inversa va sempre in direzione 5’ 3’ e copia l’RNA, quando si forma questa doppia elica di RNA-DNA, possiamo denaturare il frammento e degradare mRNA.

Si formano delle piegature (in direzione 3’), che si possono utilizzare per copiare e formare la seconda elica, poi si degrada la piegatura. Con una doppia elica di DNA da mRNA si ottiene cDNA e poi lo si inserisce in un vettore. Se si vanno a confrontare le due librerie tra cDNA e DNA genomico, ad esempio un frammento lungo 1000 Kb, all’interno della libreria si hanno dei cloni con inserti di 200 Kb.

Il genoma si può tagliare attraverso enzimi di restrizione o altro per fare una libreria. Questi tagli non sempre fanno gli stessi tagli. Questi enzimi tagliano non in tutti i siti, perché lo si inserisce in un ambiente non favorevole e in un tempo limitato. In ogni clone che si forma, in alcuni casi la regione che ci interessa può essere intera o no, oppure si formano dei geni con la nostra regione contenuta in una più grande, perché non vi è stato il tempo di tagliare in maniera più efficace.

Vengono fuori cloni con lunghezze diverse, sono diversi. Se fossero tutti uguali, non si potrebbe risalire alla conoscenza completa del genoma. Siccome sono diversi, possiamo sovrapporli l’uno di seguito all’altro, contings, si può risalire all’intera sequenza. La genoteca a cDNA contiene i cloni di un gene di quella determinata cellula, cioè i cloni del gene del cervello non esprimerà quelle del fegato e così via, avrà quelle in comune a tutte le cellule, ovvero gli housekeeping, ossia i geni costituiti insieme i geni espressi da ogni cellula che ne esprime diversi, in base al tipo di cellula.

Screening di una genoteca tramite ibridazione

In una piastra di Petri con Agar, dove crescono dei batteri, e questi, seminati, con una determinata concentrazione per evitare il sovraffollamento, crescono delle placche, mettiamo un filtro di microcellulosa e appoggiamo il filtro, una parte delle colonie si “appiccicano” sul filtro, quindi avremo un certo numero di batteri presi dalle colonie. Per esempio, se abbiamo la sequenza del gene della fibrosi cistica marcato, mettiamo, in presenza di questo filtro (in presenza del DNA marcato), la singola elica marcata, c’è la possibilità che il DNA marcato si naturalizzi con le placche. A questo punto la sonda marcata si lega, se c’è il gene all’interno dei batteri, si può risalire alla placca che ha quel gene.

PCR

È un’alternativa di clonaggio per avere tante sequenze di DNA copiate. La differenza con i vettori, con enzimi di restrizione, che tagliano a caso per fare le genoteche che, con la PCR noi dobbiamo conoscere una sequenza dalla quale creiamo il primer. Utilizzando la Taq-polimerasi, utilizzata ad alta temperatura, poiché resistente a queste, e viene prelevata da un batterio termofilo.

Genomica

La genomica strutturale e funzionale in realtà non sono divise. La genomica è l’insieme di tutte le sequenze nucleotidiche, codificanti e non, di un organismo. La scienza dei genomi è lo studio della struttura, contenuto e dell’evoluzione dei genomi. La genomica non si è solo soffermata sulla sua struttura, ma anche della sua espressione e delle funzioni dei geni e delle proteine. Dalla genomica, da un sequenziamento di un gene, si hanno terabyte e terabyte di dati. La genomica strutturale è l’anatomia dei genomi. La differenza tra procarioti ed eucarioti è il genoma che è diversi, nel numero dei geni e nel numero di byte di informazioni.

Caenorhabditis elegans: numero byte: 100 Mb

Uomo: numero byte: 3,3 Gb

Caenorhabditis elegans: numero geni: 19.099

Uomo: numero geni: 25.000

La cromatina è suddivisa in livelli gerarchici. Per fare un’analisi genomica si parte dai cromosomi. Sempre per tornare al problema dei genomi, si può trovare che gli anfibi hanno una parte di DNA (10⁹ fino a 10¹¹) molto compatta; gli insetti hanno tra 10⁹ alla metà di 10¹⁰. La quantità di DNA contenuto nel genoma aploide dipende dal valore C (dimensioni) ed è una caratteristica unica di ciascuna specie vivente. Le dimensioni del genoma crescono alla complessità dell’organismo, ma in alcuni gruppi c’è un enorme variabilità tra membri di un gruppo. Questa osservazione sulla mancanza di correlazione tra le dimensioni del genoma e la complessità biologica è chiamato paradosso del valore C.

I genomi eucariotici contengono sia sequenze uniche di DNA che DNA ripetuto. Il DNA non ripetuto è formato da sequenze uniche, una copia per genoma aploide. Il DNA ripetuto è formato da sequenze che sono presenti in più copie del genoma aploide: DNA moderatamente ripetuto ha sequenze > di 1000 bp ripetute tra le 10 e le 100 volte; mentre il DNA altamente ripetuto ha sequenze < di 100 bp ripetute migliaia e migliaia di volte.

I geni sono ripetuti poche volte, 2-3; i geni ribosomiali sono ripetuti perché così si possono trascrivere più mRNA, che è il prodotto finale, non c’è la possibilità di amplificare a livello traduzionale, né di trascrizione, quindi vengono formati molti mRNA. I geni nell’uomo corrispondono solo l’1,3% del genoma umano, nel lievito di birra invece sono il 70% (quelli che esprimono), cioè quello codificante. La presenza di tanto DNA, cosiddetto junk-DNA o DNA spazzatura, non si capiva il senso della sua presenza. Il DNA altamente ripetuto non può essere considerato junk-DNA.

In realtà, svolge altre funzioni, ha infatti un ruolo nel silenziamento genico. Invece, il silenziamento post-trascrizionale di geni attivi, ha molti genomi, anche quelli che non contengono geni propriamente detti, vengono trascritti e hanno un ruolo nella regolazione, micro-RNA e si-RNA. Micro-RNA e small-RNA, insieme legano l’mRNA, richiamano il complesso Risc e lo degradano. La decifrazione dei genomi di molte specie, ha portato a poter classificare tutti i geni all’interno di un genoma, gran parte dei geni è sconosciuta, non ne conosciamo il ruolo ben preciso in realtà.

Nello splicing alternativo vi è la possibilità che alcuni introni possono essere considerati esoni ed eliminati come esoni, mentre altri rimangono introni, si creano così delle proteine alternative. Gli introni che permettono lo splicing alternativo sono molti, 94% nell’uomo. Circa il 75% dei geni nell’uomo subiscono lo splicing alternativo. Si sono scoperti dei geni sovrapposti, dove questi geni che codificano per più proteine, cioè viene letta “con un registro di lettura diversa”, per esempio la lettura partendo dal gene 1 o dal gene 2 o dal gene 3, sfalsando tutto. Oppure, in questa realtà, si è scoperto che si possono leggere le eliche in direzione 5’ → 3’ l’una, e l’altra 3’ → 5’ formando proteine diverse.