Genomica ed epigenomica

PROGETTO GENOMA

Alla fine degli anni ’80-’90 si è sviluppata l’idea di sequenziare il genoma umano.

Non è sempre stato semplice progettare e realizzare tale progetto, poiché non

c’erano le tecnologie di adesso, avrebbero richiesto più di 10 anni e tanti soldi e

sottrarre denaro ad altre ricerche biologiche, quindi erano contrari al progetto

genoma e avrebbero tolto le risorse per tale ricerca.

Il progetto finale nel 2002, ma prima si scoprì che i geni umani erano molto meno di

quelli immaginati, circa in 100.000 erano quelli immaginati, poi si è scoperto che

erano in realtà 25.00, e si ottenne il primo importante risultato.

I primi dati del sequenziamento del genoma furono alla fine del 2001, DRAFT la prima

bozza e sono nel 2002-2003 fu raffinata, anche se si continuano le ricerche.

Renato Dulbecco fu il lanciatore dell’idea di sequenziare il genoma umano, insieme a

L. Hood.

Questo progetto ha portato a diversi risultati:

- identificazione dei circa 30.000 geni umani;

- determinare la sequenza di 3 bilioni di paia di basi chimiche del DNA umano;

- informazioni nei database;

- analisi;

- ricerche sul genoma hanno portato a rilasciare tecnologie nel settore privato,

etico, legale e sociale.

Altri aspetti sono ancora da risolvere dal punto di vista etico, sociale e legale, per

esempio un genotipo di una determinata malattia, in America alcune assicurazioni

private non accettano di assicurare persone che avevano una predisposizione, anche

bassa, ad una determinata malattia. 31

Il consiglio pubblico ha reclutato almeno 50 volontari di diversa etnia per eliminare i

polimorfismi nelle diverse popolazioni (quelle varianti); ottenere il consenso

informatico per i dati; costruire librerie di BAC/PAC; scegliere 8 librerie per la

costruzione fisica di mappe fisiche, da maschi di etnia sconosciuta mischiati in

maniera casuale (per via dell’X nei maschi ci sono tutti i tipi di cromosomi);

sequenziamento shotgun gerarchici.

Lo stesso ha fatto Celera con 20 donatori, ottenere il consenso informatico per i dati;

stabilire linee cellulari permanenti e librerie di 10-15 Kbp; scegliere 5 librerie con sia

maschi che femmine di tante etnie; shotgun dell’intero genoma.

La sequenza di un genoma comunque ci dice:

- per quanto riguarda i numeri, contiene 3 bilioni di basi nucleotidiche;

- la lunghezza dei geni in media è di 3.000 basi, ma per esempio nel gene della

Drosophila è di 2-4 milioni di basi nucleotidiche (ha esoni molto lunghi);

- il numero totale dei geni è di 25.000-35.000;

- il 99,999% delle basi nucleotidiche sono uguali a tutti gli individui, solo 3 milioni

sono diversi, solo una base è diversa;

- le funzioni sono sconosciute;

- il 50% dei geni sono scoperti.

Dal punto di vista di come il genoma è organizzato, il sequenziamento del genoma ci

dice:

- che non c’è una distribuzione uguale di geni, ma ci sono regioni più ricche di

altre, le ricche sono piene di GC che è predominante (i geni stanno in regioni

più protette) e povere le regioni di AT;

- i geni sono concentrati in aree casuali, lungo il DNA, con all’interno regioni non

codificanti;

- le isole CG sono situate a monte dei geni e che queste sequenze sono lunghe

fino a 30.000;

- non tutti i geni hanno le regioni GC prima del loro 5’;

- il cromosoma 1 ha più geni e il cromosoma Y ha meno geni.

Le implicazioni etiche, legali e sociali al progetto genoma umano:

- la correttezza nell’uso di informazioni genetiche che, ad esempio, prevedono la

suscettibilità a determinate malattie, quindi la privacy e la riservatezza su

questi dati;

- tutto ciò ha un certo impatto psicologico e possibile discriminazione;

- test genetici compiuti dagli individui;

- problemi nel campo della procreazione;

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- istruzione pubblica e professionale;

- commercializzazione del genoma per guadagno, ad esempio pagare i diritti

d’autore;

- implicazioni filosofiche.

Attualmente sono stati sequenziati 800 organismi:

- moscerino della frutta;

- topo, sistema modello di mammifero;

- C. elegans, individuato come oggetto di ricerca di Sidney Fremer;

- E. Coli, per gli eucarioti;

- S. Cerevisiae, eucariotici inferiori;

- A. Thaliana, rappresentatore delle piante.

Se si vedono i diversi cromosomi nell’uomo con colori diversi, i quali ognuno si

riferisce ad ogni cromosoma, se si vedono le stesse sequenze nel topo, questi non

sono tanto diversi da quelli umani.

Le stesse sequenze sono sparse nei cromosomi del topo, basta abbinare i colori e

vediamo i cromosomi umani.

Questo vuol dire che ci sono delle regioni che sono rimaste insieme da milioni di anni.

Queste regioni di sintonia, ci dicono che esiste un’omologia fra le specie.

E questo ci dà la possibilità di studiare dei modelli per aiutarci nella spiegazione e

conoscenza delle varie specie.

Uomo = un gene ogni 100.000 basi;

S. cerevisiae = un gene ogni 2.000 basi.

Questo ci dice che nell’uomo molte regioni non sono codificanti proteine, mentre in

S. cerevisiae quasi tutto il DNA codifica per le proteine.

La differenza delle dimensioni del genoma non danno ragione al numero dei geni, cioè

ci sono specie che si possono comparare (uomo - C. elegans), pur avendo suppergiù

lo stesso numero di geni.

Questo vale anche per lo stato evolutivo, si può comparare la complessità

dell’organismo, cioè il numero delle cellule, ma non si può paragonare lo stato

evolutivo tra specie diverse in questo momento.

SNP (single nucleotide polymorphism)

La diversità è una ricchezza.

La diversità di una specie assicura il successo riproduttivo di una specie in caso di

cambiamenti dell’ambiente esterno. 33

La presenza di variabilità genetica, assicura la risposta evolutiva ed adattativa di una

specie in un ambiente esterno.

La riproduzione sessuale mantiene un’alta variabilità e la riproduzione asessuale

mantiene cloni dell’individuo di partenza.

La diversità biologica nasce dalle mutazioni:

- indotte da agenti mutageni, come la radioattività;

- spontanee che originano da errori durante la replicazione del DNA, quindi

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abbiamo gli errori in vivo ogni 10 bp ed errori in vitro ogni 10 bp.

La DNA polimerasi possiede un’attività esonucleasica impiegata nella

correlazione di bozza.

Le altre proteine contenute nell’apparato di replicazione e il sistema di riparo

conosciuto come methyl-directed mismatch repair (sistema di riparo per il

cattivo appaiamento tra le basi sbagliate; una doppia elica con il mismatch o

cattivo appaiamento; il sistema di riparo mismatch repair, attiva e riconosce il

mismatch, deve o levare la G e mettere una T, mutando la sequenza oppure

togliere una A e mettere una C; sfruttando che nella specie umana, vi sono le

citosine presenti in C e le G che sono metilate (quasi tutte).

La metilazione è post-replicazione.

La nuova elica verrà etilata dopo la replicazione, così il mismatch repair

riconosce la metilazione e così è in grado di correggere l’errore.

Queste varianti genetiche sono quelle che garantiscono la variabilità fenotipica, come

ad esempio i gruppi sanguigni.

Però esistono delle mutazioni dannose che portano a delle malattie, ad esempio la

mutazione del gene p53, marca uno dei primi baluardi contro i tumori.

La differente sensibilità ai diversi allergeni e queste differenze genotipiche fra

nucleotidi possono servire per identificare dei geni che non si conoscono, come ad

esempio per identificare delle malattie che non si conoscono, questo è chiamato

linkage disequilibrium.

POLIMORFISMO

Un sito viene definito polimorfismo quando si conoscono almeno due forme dell’elica,

la più rara delle quali ha una frequenza dell’1%, due varianti che hanno una certa

presenza; il meno frequente almeno dell’1%.

Molto spesso le frequenze sono diverse, questo è solo un valore soglia.

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Naturalmente durante il sequenziamento, se una delle due sequenze ha ricevuto una

nuova mutazione rara, quello non è polimorfismo, poiché non è un rappresentante

dell’1% dei polimorfismi di una popolazione.

Quindi ci permette di distinguere gli errori dovuti alla replicazione da un

polimorfismo.

Diverse tipi di mutazioni che danno origini ai polimorfismi sono le mutazioni geniche

che influenzano un solo gene, quindi qualsiasi delezione, inserzione, e così via; le

mutazioni cromosomiche che influenzano porzioni più ampie dei cromosomi, quindi

le delezioni.

Il loro carattere distintivo è che interessano una regione discreta del cromosoma

(visibile al microscopio) che contengono molti geni.

MUTAZIONI GENETICHE

MUTAZIONI PUNTIFORMI

Una delle più importanti sono le sostituzioni di basi (SNP) di una singola base

nucleotidica con un’altra.

Quel locus genomico differisce tra individui di una base, sempre con la definizione di

polimorfismo, in una popolazione il 99% hanno un allele A e l’1% un allele B, i due

alleli, di cui l’allele B è il più raro e per essere considerato un polimorfismo, esso deve

comparire in una popolazione con un valore dell’1%.

Distinguiamo due tipi di SNP: dentro un gene e fuori un gene.

La maggior possibilità di uno SNP è quella di cadere fuori dai geni, nel DNA non

codificante, 97%.

La differenza è che se un SNP cade su una componente genomica, cioè dentro un

gene, ciò aveva effetto sul fenotipo e quindi poteva essere utilizzato come marcatore

genomico.

Ma anche alcune mutazioni possono accadere dentro un gene, ma non si

esprimevano sul fenotipo, queste sono dette mutazioni silenti, perché il codice

genetico è ridondante, perché un codone codifica per uno stesso amminoacido,

stessa proteina prodotta.

Nelle mutazioni di senso cambia il codone che codifica un altro amminoacido, ma non

è così devastante, poiché ciò che cambia è l’amminoacido, ma non la sua funzione,

cioè cambio di amminoacidi basici tra di loro, ma rimangono basici.

Sono delle mutazioni conservative. 35

Stesso numero di amminoacidi, ma una sequenza che differisce per un amminoacido.

Le mutazioni non senso producono proteine tronche, poiché hanno meno

amminoacidi; sono importanti e non possono essere tralasciate.

Trasformazione di un codone per un amminoacido con un codone di STOP.

Un concetto importante è che una mutazione sia visibile, ovvero, che sia dominante

o recessivo, dipende dal fenotipo preso in considerazione.

In Drosophila c’è una mutazione Cy (dominante) white;

+

Cy/Cy selvatico

+ +

Cy /Cy selvatico

Cy/Cy nodi perché muore

Cy &eg