Genomica e DNA profiling - corso completo

Chapter 4: Studying DNA (NCBI Genomes)

Estrazione del DNA

L'estrazione del DNA è la base di partenza per qualsiasi studio e applicazione di ingegneria genetica e genomica e può riguardare specie diverse. Ha molteplici applicazioni:

• Genetica forense: Identificare potenziali sospettati, scagionare persone accusate, identificare vittime.
• Stabilire la paternità o altre relazioni familiari.
• Clonazione, ingegneria genetica (ricerca di base).
• Diagnosi di malattie genetiche e tumori (ricerca applicata).
• Ambito zootecnico per definire il pedigree.
• Ambito agroalimentare per definire l’origine di semi/alimenti (tracciabilità).
• Identificazione di specie protette e in via di estinzione.
• Ricostruire storia evolutiva (antropologia molecolare).
• DNA antico (estrazione di DNA da osso).

Da tutti i campioni biologici si può potenzialmente estrarre DNA:

• Sangue: Faccio un pellet di globuli bianchi poiché sono le uniche cellule del sangue contenenti DNA.
• Vari tipi di tessuto: Villi coriali, tessuti derivanti da biopsia o da paraffina.
• Campioni museali (ad esempio da animali impagliati).
• Liquidi biologici come saliva, urina, feci (molto usate nelle scienze naturali per studiare animali selvaggi), liquido seminale, liquido amniotico.
• Bulbo del capello.
• Materiale vegetale anche i semi antichi.

Tuttavia, i campioni più utilizzati sono:

• Sangue (ora difficile da ottenere per motivi etici) anche sotto forma di carte di sangue (sangue fatto cadere a goccia su delle carte che poi secca).
• Uso di swab (spazzolette o pezzi di cotone), mouth wash (risciacquo con collutorio che raccoglie le cellule nella bocca) o “sputacchiere” (raccolgono 5 ml di saliva con una sostanza di conservazione in modo che le DNAasi non degradino il DNA -> metodo più usato).
• Casi limite che riguardano la genetica forense: sigarette, gomma da masticare, sudore, …

Esiste una crescente sensibilità dei comitati etici, perciò qualunque campione biologico deve essere coperto da anonimato. In ospedale, la provetta è associata a un codice a barre che quando viene passato allo scanner dà le info del campione ma non fornisce il nome del paziente. Il nome lo sa solo una persona ma non conosce il codice.

Problema di quando si raccolgono i campioni: non contaminazione. Si è infatti visto che l’1-5% dei campioni raccolti in ospedale risulta contaminato, lasciando intendere un lavoro in mancata sterilità.

Dal tipo di campione dipenderà la scelta del metodo che è influenzata anche da:

• Purezza richiesta.
• Tecnica impiegata per l’identificazione.
• Tempo richiesto.
• Numero di campioni e/o quantità del campione.

Caratteristiche del metodo ideale

(Di solito si cerca un bilancio tra questi fattori):

• Alto grado di purezza.
• Bassa perdita/elevato recupero (devo ottenere più DNA possibile soprattutto se parto da un campione scarso).
• Sicurezza in laboratorio: Non uso di reagenti pericolosi.
• Economico.
• Poco tempo.

Le fasi dell'estrazione del DNA da materiale biologico sono le seguenti

• Lisi cellulare ed inattivazione delle nucleasi.
• Isolamento DNA.
• Precipitazione e purificazione DNA per poi metterlo in soluzione.
• Valutazione quantitativa e qualitativa del DNA estratto.

Per estrarre il DNA esistono dei kit di estrazione già pronti.

Lisi cellulare

3 tipi di cellule:

• Animali: Doppia membrana fosfolipidica facile da rompere.
• Vegetali e batteri: Parete cellulari di proteoglicani molto rigida soprattutto per le cellule vegetali.

Lo scopo è quello di liberare il DNA dall’involucro nucleare e cellulare e dalle proteine istoniche e di inattivare le nucleasi. Si possono utilizzare vari metodi:

1. Disgregazione meccanica: Utilizzata soprattutto per campioni difficili da degradare (quindi, non si usa per cellule animali, ma non esclude i tessuti animali):
   • Omogenizzazione: Sistema che prevede l’uso di pistoni che creano delle forze per rompere i tessuti. Si usa soprattutto per frantumare tessuti difficili come muscolo e fegato.
   • Uso del mortaio: Usato per tessuti animali e campioni di tipo vegetale.
   • Sonicatore: Rompe le membrane cellulari mediante onde sonore ad alta frequenza che vengono applicate su un campione allo stato liquido. Le onde sonore, infatti, causano un’onda d’urto che rompe le membrane cellulari. Questo procedimento viene effettuato in ghiaccio per evitare surriscaldamento del campione.
2. Congelamento-scongelamento: Procedimento molto usato per cellule vegetali (non usato, invece, per le cellule animali) che si basa su cicli di congelamento e scongelamento solitamente in azoto liquido. Questi cicli indeboliscono le pareti cellulari perché l’acqua forma cristalli di ghiaccio che continua ad aumentare e ridurre il volume, portando a una distensione della parete che si indebolisce. Viene poi associato al mortaio che distrugge definitivamente la parete indebolita.
3. Shock osmotico: Si utilizza su cellule già presenti in soluzione. Si utilizza una soluzione ipotonica che fa entrare solvente nella cellula, portandone all’esplosione per eccessivo aumento del volume. Impiegato nelle cellule prive di parete.
4. Trattamento con agenti chimici:
   • Detergenti (SDS, cioè sodio dodecil solfato): Solubilizzano le membrane lipidiche, ma anche denaturano le proteine (sia le proteine di membrana che istoniche che impaccano il DNA) e le dissociano dagli acidi nucleici.
   • Agenti cautropici come l’urea o formaldeide. Rompono i legami idrofobici o i legami idrogeno delle proteine, denaturandole.
   • EDTA o chelex: Agente chelante degli ioni bi o trivalenti presenti nel mezzo in soluzione come gli ioni magnesio o calcio (EDTA infatti viene usato anche come anticoagulante poiché chela il calcio fondamentale per la coagulazione). Nell’estrazione del DNA, è importante che venga chelato il magnesio poiché questi ioni sono i cofattori delle DNAasi che degradano il DNA. In questo modo, ho un blocco delle DNAasi. Viene anche utilizzato per la rottura delle pareti dei batteri perché l’azione chelante destabilizza la membrana in quanto denatura le proteine della membrana; la destabilizzazione aiuta l’azione del lisozima (usato in associazione a EDTA soprattutto per rompere le membrane dei batteri).
5. Digestione enzimatica tramite enzimi che degradano sia le pareti che le membrane.
   • Lisozima: Per la degradazione di pareti batteriche di peptidoglicani precedentemente indebolite dall’utilizzo di EDTA.
   • Liticasi e zimoliasi: Per le pareti dei lieviti.
   • Proteina K: Proteasi che degrada tutte le proteine in modo da ottenere un DNA purificato. È stata scoperta nel 1974 in un fungo saprofita dal quale viene estratta. È usata soprattutto per cellule di mammifero e promuove una digestione in tempi rapidi. È stabile all’aumentare della T e del pH (T ottimale di 56 gradi). Il suo funzionamento, però, è promosso dal legame con due ioni calcio, per cui solitamente viene fornita direttamente legata a questi ioni in quanto, nella soluzione con le cellule, non è presente calcio perché chelato da EDTA. In questo modo, la sua attività non è influenzata dalla presenza di EDTA.
6. Elettroforesi in campo pulsato: Elettroforesi basata su impulsi del campo elettrico in orizzontale e verticale in maniera alternata in modo da separare molecole piuttosto grandi senza romperle, come i cromosomi. Infatti, la lisi generalmente porta a una parziale frammentazione del DNA cromosomale. Se, quindi, si vogliono ottenere cromosomi interi, servono condizioni di lisi blande.

   Questo metodo non è però adatto per separare cromosomi umani perché sono troppo grandi, ma funziona bene per cromosomi di lievito.

Isolamento del DNA

Separazione del DNA dalle altre componenti cellulari (proteine, lipidi, polisaccaridi) e da sostanze interferenti:

1. Centrifugazione basata sul chelex: Una resina a scambio ionico in grado di chelare ioni metallici bi e trivalenti, inibendo così l’attività delle nucleasi che utilizzano ioni magnesio per la loro attività. La procedura è molto rudimentale. Si parte da una soluzione acquosa che viene bollita a cui viene aggiunta la resina. Si rompono, quindi, le membrane e si disattivano le nucleasi. Poi si centrifuga. Nel precipitato trovo membrane e lipidi mentre il DNA isolato è nel surnatante. Utilizzo quindi il surnatante.

   Vantaggi: Metodo più veloce

   Svantaggi: Ottengo un DNA con un basso grado di purezza e denaturato. Inoltre, può inibire la PCR.

2. Utilizzo di solventi organici (metodo del fenolo-cloroformio): Metodo degli anni ’90 e molto usato che si basa sul fatto che questi solventi solubilizzino le sostanze idrofobiche come i lipidi. Si parte da un lisato cellulare a cui si aggiunge il fenolo (liquido pesante immiscibile con l’acqua) che denatura le proteine. Si centrifuga, poi, e si ottiene una separazione di fasi: fase acquosa superiore con acidi nucleici; una intermedia con proteine denaturate e coagulate tra di loro (strato biancastro e denso); strato inferiore con fenolo. Infine, si rimuove la fase acquosa con gli acidi nucleici e la si tratta con cloroformio per rimuovere i residui di fenolo. Ottengo quindi una fase acquosa con DNA che dovrà essere successivamente precipitato con etanolo in quanto il DNA è insolubile in questo composto.

   Caratteristiche fenolo:

   • Puro.
   • Saturato con tampone (TRIS HCl) poiché è igroscopico (attira acqua) e quindi tenderebbe ad asciugare la fase acquosa.
   • Addizionato con idrossichinolina (antiossidanti) che rallenta la veloce ossidazione del fenolo ed è un inibitore delle RNAasi -> se si ossida il campione diventa arancio e funge quindi da segnale dell’invecchiamento della soluzione.

   Vantaggi: DNA molto puro, resa elevata

   Svantaggi: Utilizzo di sostanze pericolose ed è un procedimento lungo

3. Cromatografia a scambio ionico: Nella colonnina per la cromatografia inserisco una resina carica positivamente su cui si fa passare una soluzione di DNA. Vi si lega quindi tutto ciò che è carico negativamente tra cui il DNA. Per separare le varie componenti, si eluisce con una soluzione salina a diverse concentrazioni e a diverso pH. Infatti, a basse concentrazioni e a pH bassi si staccano le proteine; a concentrazioni maggiori e a pH maggiore si stacca anche il DNA. Si separano quindi le molecole cariche negativamente in base alla forza con cui si legano alle particelle cariche positivamente con cui la resina è funzionalizzata.
4. Estrazione basata su membrane in silice: È il metodo più usato. Si basa sull’affinità del DNA per una membrana in silice a cui si aggiungono sali cautropici, ossia sali con l’effetto di protonare i gruppi fosfati del DNA e di rendere positivi i gruppi imminici delle basi azotate. Questo rende impossibile l’interazione tra DNA e acqua: il DNA diventa insolubile ma affine alla membrana a cui si lega. Poi, si toglie la membrana (con il DNA attaccato) e si butta tutto quello che resta. Per eliminare le impurità, si fanno dei lavaggi della membrana con etanolo ottenendo così una membrana con solo DNA puro. Il DNA viene staccato dalla membrana con un buffer di eluizione (acqua) e in assenza di sali cautropici (il DNA non è più protonato e quindi non si lega alla silice).
5. Salting out: Permette di separare (tiro fuori) le proteine dal solvente facendole precipitare grazie un’elevata concentrazione salina e un determinato pH che fa precipitare solo le proteine e non il DNA. Dopo centrifugo in modo che le proteine si trovino nel pellet e il DNA nel surnatante.

   Svantaggio: Spesso nel soluto rimangono alte concentrazioni di sale che rimangono anche nel DNA il quale si degraderà più velocemente anche se congelato.

6. Uso di biglie magnetiche rivestite con membrana in silice. In presenza di sali cautropici e di biglie, il DNA si lega alla membrana delle biglie (come per la semplice membrana di silice). Si usa poi un magnete che attira a sé le biglie (in quanto magnetiche) che a loro volta hanno legato il DNA. Il liquido che resta senza biglie è lo scarto che posso buttare mantenendo il magnete attaccato (in modo da non perdere le biglie). Posso fare anche dei lavaggi delle biglie con etanolo per eliminare le impurità. Poi rimetto le biglie in soluzione senza sali cautropici ma con acqua/solvente in cui il DNA si dissolve e il DNA si stacca ed entra in soluzione. Grazie al magnete, recupero le biglie.

   Vantaggi: Metodo estremamente selettivo.

   Svantaggi: Il limite è la saturazione delle biglie che hanno una certa superficie e quindi non possono legare più di un tot di DNA. Sono, inoltre, molto care.

7. Estrazione charge-switch: Uso di biglie paramagnetiche rivestite da molecole che cambiano la carica in base al pH del mezzo in cui si trovano. Inizialmente, quindi uso un pH basso a cui le biglie hanno carica positiva per poter legare il DNA (negativo). Per staccare il DNA, invece, aumento il pH in modo che acquisiscano una carica negativa respingendo il DNA, prima legato. È meno usato rispetto alle biglie magnetiche ricoperte di silice.

Precipitazione del DNA

Fase effettuata in base al metodo di purificazione utilizzato che ha lo scopo di concentrare, desalificare e recuperare gli acidi nucleici in forma solida. Ad esempio, non si usa per il metodo con le biglie, ma è da effettuare se il DNA è stato purificato tramite il metodo del fenolo-cloroformio, il salting out (perché l’ambiente in cui si trova è troppo salato) e in presenza di sali cautropici.

Si usa alcol (isopropanolo, molto efficace ma difficilmente eliminabile, o etanolo al 70%, che serve anche per fare lavaggio dopo l’uso di isopropanolo), poiché è una sostanza in cui DNA non è solubile, e sali come ammonio acetato che attirano l’acqua di solvatazione -> disidrato il DNA e lo metto in qualcosa in cui non è solubile per cui precipita.

Gli acidi nucleici poi si risospendono in acqua bidistillata sterile o in opportuno solvente che previene la degradazione degli acidi nucleici come il TE, formato da Tris (pH buffer) ed EDTA (chelante dei cationi).

Accorgimenti durante l’estrazione per evitare di danneggiare troppo il DNA:

• Ridurre gli stress meccanici: DNA non si vortexa, no pipettare in maniera troppo vigorosa, maneggiare con delicatezza.
• Impedire la digestione del DNA da parte delle nucleasi: uso inibitori (come soluzioni contenenti EDTA, chelex o altri agenti chelanti), lavorare con guanti in modo da non rilasciare le DNAasi presenti sulla pelle, uso di materiali sterili DNA free.

Problemi dopo estrazione DNA

• Poco DNA: Ad esempio, se uso le biglie, ho poco DNA in termini relativi perché ne ho usate poche e si sono saturate.
• DNA non puro: Ad esempio, se faccio il chelex o se sbaglio a togliere il surnatante nel metodo fenolo-cloroformio (contaminazione da fenolo). In questo caso, devo rifare il lavaggio con cloroformio.
• Degradazione veloce: Salting out e/o kit economici.
• Denaturazione: Chelex (intrinseco nel metodo).
• DNA troppo frammentato che ha implicazioni sulle applicazioni successive: Vedi accorgimenti.

Valutazione qualitativa e quantitativa del DNA estratto

• Spettrofotometro: Valutazione qualitativa del grado di purezza e quantificazione poco precisa.
• Fluorimetro: Quantificazione precisa ma no analisi qualitativa.
• Elettroforesi su gel: Valutazione semi-quantitativa e qualitativa.

Spettrofotometro

Le componenti essenziali di questo strumento sono:

• Fonte di luce policromatica che bombarda il DNA. Può essere tungsteno (per luce nel visibile) o deuterio (per luce nel campo dell’UV).
• Cuvetta con un cammino ottico noto (di solito 1 cm) in cui viene posto il DNA.
• Filtro monocromatore in cui viene fatta passare la luce prima di colpire il DNA, in modo da selezionare una lunghezza d’onda definita.
• Detector che capta il segnale luminoso emesso dal DNA dopo che è stato colpito dal fascio di luce. Questo segnale luminoso viene convertito in impulso elettrico.

Lo spettrofotometro si basa sul principio che tanto più DNA c’è nella soluzione, tanta più luce verrà emessa. Tipicamente, la spettrofotometria usa una luce UV e il segnale elettrico si misura come assorbanza.

Assorbanza (A) = ε × lunghezza cammino ottico × concentrazione

L’assorbanza è quindi legata da una relazione di proporzione diretta con la concentrazione della soluzione. La concentrazione del DNA si ricava dall’assorbanza grazie alla legge di Lambert-Beer!

Il DNA ha il picco massimo di assorbimento a 260 nm. Ad un valore di assorbanza di 1 corrisponde una concentrazione di DNA di 50 µg/mL = ng/µL. L’assorbimento del DNA, in realtà, non è sempre uguale ma varia rispetto al fatto che sia a singola elica (picchi di assorbanza più alti -> assorbanza 1 = 33 µg/mL) o a doppia elica (valore precedente).

Quindi, la misura allo spettrofotometro mi dà anche informazioni sul fatto che sia denaturato o meno. Inoltre, la spettrofotometria ha anche un valore qualitativo perché dà delle informazioni sul grado di purezza che viene indicato con dei rapporti della misura di assorbimento del DNA a diverse lunghezze d’onda:

• Grado di contaminazione da proteine: A260/A280 le proteine hanno un picco di assorbimento a 280 nm. Un DNA contaminato può avere delle proteine e, quindi, per determinare il grado di contaminazione da proteine si fa il rapporto tra l’assorbanza a 260 nm e quella a 280 nm. Non sarà mai nullo perché qualche proteina ci sarà sempre, ma ci sono dei rapporti ideali compresi tra 1.6-2 e di 1.8-2 per RNA.
• Quando estraggo DNA e non voglio RNA, uso RNAasi per degradarlo.
• Grado di contaminazione da fenolo: A260/A230. Valore ottimale di 2.2 -> rapporti inferiori indicano contaminazione da fenolo. In questo caso, dovrei ripurificare con cloroformio.