Genomica e DNA profiling - corso completo

DNA PROFILING E APPLICAZIONI IN GENETICA FORENSE

La storia dei marcatori genetici I primi marcatori genetici non sono stati a livello genomico ma a livello fenotipico e, in particolare, un sistema identificabile da un punto di vista biochimico: i gruppi sanguigni. Il limite enorme di questo sistema è che si basa su un approccio di esclusione, per cui non danno un'identità genetica ma posso avere un'informazione genetica solo in caso di risultato negativo; un risultato positivo, invece, non dà alcuna informazione. Questo sistema, perciò, si basa sull'esclusione. Altri approcci sono basati sulla variabilità elettroforetica delle proteine del siero ma hanno vari svantaggi: - le proteine si degradano più velocemente rispetto al DNA - bassa variabilità perché tutto ciò che è codificante nel genoma, si conserva. Sono quindi poco informative. Quindi, si è passati ad analizzare la variabilità del genoma umano.attraverso il DNA fingerprinting basato su minisatelliti (VNTR) e microsatelliti (STR). I vantaggi sono: - maggiore stabilità del DNA rispetto alle proteine - maggiore variabilità e quindi più informativo. La tecnica del DNA fingerprinting è nata nel 1984 quando Alec Jeffreys studiò la variabilità dei loci dei minisatelliti per applicazioni forensi. Facendo un'analisi del DNA con enzimi di restrizione ha scoperto che si ottenevano pattern di digestione ripetitivi presenti in ogni individuo ma variabili in lunghezza, determinando un'impronta digitale di quello specifico individuo. Le prime tecniche, quindi, si basavano su: - estrazione del DNA - taglio del DNA con enzimi di restrizione - elettroforesi su gel di agarosio dei frammenti ottenuti - southern blot e ibridazione con sonde per identificare i siti polimorfici Il risultato era una serie di bande su una lastra a raggi X che dava una profilazione genetica, detta DNA fingerprinting.

Il DNA fingerprinting è una tecnica utilizzata per identificare un individuo attraverso il suo profilo genetico. Questo profilo può essere confrontato con altri profili genetici per trovare eventualmente una corrispondenza tra il profilo del sospettato e il profilo trovato sulla scena del crimine.

Esistono due tipi di analisi utilizzate nel DNA fingerprinting:

1. Multi-locus probes (MLPs): sono le prime tecniche utilizzate e permettono di analizzare contemporaneamente molteplici loci. Tuttavia, i risultati di queste analisi sono di difficile interpretazione a causa del grande numero di loci analizzati contemporaneamente.
2. Single locus probes (SLPs): sono analisi che si concentrano su un singolo locus specifico utilizzando sonde specifiche.

Tuttavia, le prime tecniche utilizzate presentavano due grandi svantaggi:

• Non funzionavano con DNA degradato.
• Richiedevano una grande quantità di DNA, cosa incompatibile con un'analisi forense che si basa su campioni di DNA trovati sulla scena del crimine.

Questo perché, negli anni in cui è nata la tecnica del DNA fingerprinting, la PCR (reazione a catena della polimerasi) non era ancora sviluppata. L'avvento delle reazioni di polimerizzazione a catena ha profondamente cambiato la biologia molecolare, compresa la genetica forense.

I metodi basati sulla PCR hanno quindi rimpiazzato la vecchia analisi deiminisatelliti. Un aspetto importante da tenere presente nell'analisi forense è che solo il 25% delle sequenze genomiche sono correlate alle sequenze codificanti. Di queste solo l'1,5% è direttamente codificante per proteine mentre la restante parte riguarda regioni regolatrici.

Il 75% del genoma, invece, extragenico; il 20% codifica per DNA a singola copia a funzione non completamente nota e più del 50% è formato da DNA ripetitivo suddiviso in:

• sequenze interperse nel DNA legate a fenomeni di trasposizione (circa il 45%)
• DNA ripetuto in tandem (circa l'8%) che è il target della genetica forense. Questo a sua volta comprende:

• DNA satellite: DNA ripetitivo a livello di telomeri e centromeri identico in tutti gli individui in quanto specie-specifico. Non è quindi utile per studiare la variabilità genetica.
• Minisatelliti: formati da

unità ripetute di 9-100 pb.

• Microsatelliti: formati da unità ripetute di 2-6 pb.

Questi ultimi sono più utili per individuare la variabilità genetica e oltre a differire per la lunghezza dell'unità ripetuta, differiscono anche per la frequenza con cui si trovano nel DNA (ossia il numero di loci è minore per i minisatelliti rispetto ai microsatelliti) e il blocco di ripetizione che è più corto per i microsatelliti (dalle 5 alle 30 ripetizioni) rispetto ai microsatelliti (array lunghi diverse kilobasi).

Un'altra differenza è data dal grado di variabilità: i microsatelliti sono le unità più variabili sia per la sequenza (tasso di mutazione all'interno dei microsatelliti è più alto rispetto ai minisatelliti) che per il numero di ripetizioni. Il numero di possibili alleli nella popolazione è quindi elevatissimo.

In questo caso la definizione di allele sta nel numero

di ripetizioni dell'unità ripetuta: es. allele di 5 ripetizioni e allele di 9 ripetizioni. Minisatelliti (VNTR) Alcuni loci di minisatelliti mostrano un'elevata variabilità allelica. Su questi si è basata la prima analisi fingerprinting di Jeffrey che ha usato un'analisi MLPs. Questo metodo di fingerprinting viene anche definito multiloci RFLP-VNTR perché si basa sulla digestione del DNA con RFLP per ottenere frammenti di lunghezze diverse in base al numero di ripetizioni. Oltre al problema dell'elevata quantità di DNA necessaria per questo tipo di analisi (diversi ng), si ha anche un problema di interpretazione nella genetica forense perché spesso è difficile prelevare solo il campione del sospettato e solitamente si ottengono due profili contemporanei (quello della vittima e quello del sospettato), rendendo però l'analisi MLP impossibile da decifrare. Per produrre profili più semplici, si è

quindi passati alla SLP: di tutti i minisatelliti si sceglie un locus altamente variabile in tutta la popolazione e analizzo solo quello che viene amplificato tramite PCR e analizzato attraverso una sonda specifica. Pertanto, otterrò al massimo due bande per ogni locus e il confronto è più semplice perché so quante bande devo avere e quindi posso discriminare i due profili genetici. Nell'analisi MLP invece, poiché analizzo tanti loci in contemporanea, può essere che io abbia bande date dalla sovrapposizione di frammenti appartenenti a loci diversi ma della stessa dimensione che però non posso distinguere.

Quindi i vantaggi di un'analisi SLP sono che:

• sono altamente polimorfici perché uso minisatelliti ipervariabili
• sono più sensibili rispetto a MLP (posso partire da poco DNA)
• permettono di analizzare campioni misti
• dimensione dell'allele facilmente identificabile ed inseribile in un database

riproducibilità ed elevato potere discriminatorio Svantaggi di SLPs: - comunque mi serve un po' di DNA (50-500 ng: più di quanto spesso si ottenga sulla scena del crimine) perché uso minisatelliti e quindi porzioni di DNA abbastanza grandi - richiede DNA non troppo degradato perché altrimenti rischio di non ottenere prodotto di PCR. Essendo le sequenze lunghe, ho una maggiore probabilità che siano danneggiate - richiede tempi lunghi L'analisi in cui alcuni minisatelliti con alleli relativamente brevi (circa 1000 pb) vengono prima amplificati tramite PCR viene definita amplified fragment lenght polymorphisms (AFLPs). Il primo protocollo sperimentale messo appunto per l'analisi AFLP risale al 1995 e prevede: - DNA genomico digerito con EcroRI e MseI: il primo taglia in maniera infrequente mentre il secondo ha una sequenza di riconoscimento più frequente e quindi taglia più frequentemente. - ottengo frammenti che vengono ligati aadattatori con sequenze note per creare nuovi siti di priming perla PCR, ossia gli adattatori servono per avere una sequenza nota su cui disegnare un primer diamplificazione.- l'amplificazione pre-selettiva che avviene mediante uso di primer complementari agli adattatori più una base scelta dall'operatore che ancora i primer ai frammenti ligati.- amplificazione selettiva che avviene usando primer complementari agli adattatori + 1 con aggiunta di ulteriori due pb→ Vantaggio: posso non sapere nulla del campione di partenza per fare quindi un'analisi blind- carico sul gel il risultato che è simile al DNA fingerprinting, ossia una serie di bande di dimensioni diverse che sono individuo specifiche. Oppure se analizzo in elettroforesi capillare ottengo un elettroferogramma con una serie di picchi individuo specifici. Questo permette di fare una genotipizzazione, una tecnica molto utile nell'individuazione di specie diverse laddove non si conosce nulla.della specie in analisi (es. analisi su funghi molti dei quali sono simili da punto di vista morfologico ma diversi da punto di vista genetico). Limiti della genotipizzazione con AFLP: - l'amplificazione non avviene sempre e amplifica solo i frammenti in un range di dimensione compatibile con analisi di PCR (400-1600 bp) - il risultato si basa sulla presenza o assenza dell'amplificato perché i polimorfismi si basano sull'acquisizione o sulla perdita del sito di restrizione o di basi selettive. È un marker dominante che non permette la distinzione tra omozigoti ed eterozigoti - Tecnica costosa che richiede molto tempo e di difficile interpretazione Microsatelliti Per ovviare a questo problema, si sono ricercate regioni più brevi di DNA che potessero essere amplificate tramite PCR anche in caso di degradazione parziale del DNA: i microsatelliti o STR (Short tandem repeat). I vantaggi dei microsatelliti: - più di un milione all'interno del genoma umano - amplificatimediante PCR standard- analisi più sensibile e quindi si può partire da poco DNA (in teoria potrei partire da una singola cellula,come un solo capello -> 100 pg corrispondenti a 15 cellule)- si può fare l'analisi anche su DNA degradato- i piccoli prodotti di PCR ottenuti possono essere misurati con precisione grazie a un'elettroforesi in gel di poliacrilammide. Un numero elevato di STR è stato classificato ma nelle indagini forensi generalmente se ne analizzano circa solo 20. La profilazione genetica è quindi un insieme di varianti alleliche a molteplici loci di microsatelliti che sono variabili tra individui e sono ereditati. La nomenclatura degli alleli è riferita al numero di ripetizioni che essi contengono. Esistono tre diverse categorie di STR: 1. Simple repeats: unità ripetute identiche sia per lunghezza che per sequenza ma ripetute un numero diverso di volte per alleli diversi. 2. Simple repeats con allele non consensus:una delle ripetizioni non è completa perché una parte è stata deleta e la delezione si è f