Genetica umana e medica

UNIVERSITÀ DEGLI STUDI DI FIRENZE

GENETICA UMANA E MEDICA

PROF.SSA PAPI - PROF.SSA GENSINI

BIOTECNOLOGIE MEDICHE E FARMACEUTICHE

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GENETICA UMANA E MEDICA

LEZIONE 1: PATOLOGIA MOLECOLARE DEL GENE

In questa lezione andremo ad analizzare lo studio di come le mutazioni incidono su quella che è la quantità

o la funzione del prodotto genico, quindi in definitiva viene valutato come la mutazione correla con quello

che è l’effetto fenotipico. Tra le principali classi di mutazioni troviamo:

• Delezioni, da 1 nucleotide a più megabasi

• Inserzioni

• Mutazioni dinamiche, ovvero unità ripetute in tandem che cambiano dimensione quando vengono

trasmesse alla prole

• Slittamento del modulo di lettura

• Sostituzione di singole basi, che si dividono in:

− Mutazioni sinonime (o silenti)

− Mutazioni missenso (o di senso errato), in cui nel prodotto genico avremo sostituzioni di un

amminoacido con un altro

− Mutazioni nonsense, in cui nel prodotto genico avremo la sostituzione di un amminoacido

con un codone di stop

− Mutazioni nei siti di splicing, causa quasi del 50% di tutte le malattie ereditarie

Vediamo ora quelle che sono le modalità di classificazione delle mutazioni sulla base della

funzionalità/quantità, quindi a seconda di quello che è l’effetto sul prodotto genico:

1. Allele equivalente = si parla di alleli equivalenti in caso di variazioni che non modificano né la quantità

né la qualità biochimica e funzionale del prodotto genico che risulta quindi invariato e normalmente

localizzato (es. le circa 12000 differenze della sequenza del DNA codificante che si osservano nella

popolazione umana che non hanno alcuna conseguenza patologica = polimorfismi). Generalmente le

mutazioni che generano questi alleli sono le mutazioni puntiformi, che non determinano un

cambiamento dell’aminoacido, ovvero mutazioni sinonime che non determinano alterazioni della

proteina; oltre a queste mutazioni gli alleli equivalenti possono essere causati anche da mutazioni a

→

livello delle sequenze introniche che non vadano ad intaccare lo splicing. una variante sinonima

è sempre priva di effetto sul prodotto genico? NO, poiché c’è una posizione di una base che

determina una mutazione sinonima che però può essere causa di una variante patogena:

− se una mutazione sinonima è legata ad una variante della 3° base del codone e si trova

sull’ultima posizione dell’esone potrebbe determinare uno splicing errato con, in genere,

eliminazione dell’esone intero che può poi generare una mutazione di frameshift

− nel caso in cui ci trovassimo nella situazione dove una tripletta risulta essere una parte su un

esone (tipo le prime due basi) e l’altra sull’esone successivo (tipo la terza base) quindi nel

caso venisse eliminato uno dei due esoni per una mutazione sinonima avremmo come

conseguenza la mancanza di una/due basi con conseguente frameshift (lo stesso discorso

vale per le alterazioni sulla 1° base del primo codone sempre dell’esone);

− in aggiunta la modifica di una base all’interno di un esone potrebbe anche generare la

presenza di un nuovo sito di splicing alternativo che verrà poi usato al posto del sito di splicing

→

canonico con conseguente possibile malattia mutazione di splicing

2. Allele ipomorfo = si parla di alleli ipomorfi nel caso di variazioni della sequenza del DNA che riduce la

quantità di prodotto genico e/o la sua funzione; si tratta generalmente di mutazioni silenti e

recessive che agiscono più come modificatori del fenotipo ma che possono causare malattia se sono

presente in emizigosi (organismo o singola cellula che nel suo genotipo presenta alcuni geni in singola

copia, il caso eclatante è quello del cromosoma sessuale maschile) ad esempio gli alleli ipomorfi che

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si trovano in un gene localizzato nel cromosoma X possono determinare una malattia. In aggiunta

→

possiamo trovare alleli ipomorfi anche a causa di delezioni ESEMPIO: alleli ipomorfi sul gene che

codifica per la distrofina, ovvero la proteina che è causa di una distrofia muscolare (Duchenne o

Becker), situato sul cromosoma sessuale X

3. Allele amorfo = si parla di alleli amorfi nel caso di variazioni di sequenza del DNA che non permette

la produzione del prodotto genico o, se lo produce, il prodotto risulta privo di attività; anche in questo

caso gli alleli amorfi sono causa di malattia quando sono presenti in emizigosi tuttavia nel caso di

allele amorfo in eterozigosi avremo generalmente un portatore sano di una malattia autosomica

recessiva. Le varianti del DNA che causano alleli amorfi sono in particolare le mutazioni frameshift

poiché generalmente portano alla formazione di codoni di stop prematuri; altre mutazioni che

possono causare alleli amorfi sono le mutazioni nonsenso, ed infine anche le mutazioni missenso

nel caso avvengano in una parte di sito catalitico (es. enzima che non si riesce ad attaccare) o in una

parte deputata al riconoscimento (es. enzima che non lo riconosce più). Ovviamente poiché alcune

mutazioni di splicing (viste prima) possono dare poi anche una mutazione frameshift, anche le

mutazioni di splicing possono originare alleli amorfi→ NB. può essere causa di malattia anche quando

il 50% del dosaggio (prodotto dall’altro allele non mutato) è insufficiente a mantenere lo stato di

salute (aploinsufficienza, ma esistono poche malattie che sottostanno a questa caratteristica). In

aggiunta possiamo trovare alleli amorfi anche a causa di delezioni.

Perché mutazioni frameshift e non senso determinano per lo più la perdita completa del prodotto

proteico e non la sintesi di proteine tronche? Poiché vengono riconosciuti, da un meccanismo di

difesa detto Non-Sense Mediated Decay, i codoni di stop prematuri per poi eliminare gli mRNA che

li presentano così da evitare la produzione di proteine tronche che potrebbero precipitare ed essere

più tossiche per la cellula rispetto alla loro assenza

ESEMPIO: sindrome di Waardenburg, è una malattia autosomica a trasmissione dominante causata

da una mutazione amorfa nonsenso (anche se sono state individuate forme di questa sindrome

dovute anche a diverse mutazioni) nel gene PAX3 che è caratterizzata dalla presenza di capelli

brizzolati, eterocromia, sordità, alterazioni della pigmentazione della pelle e lateralizzazione del

canto mediale.

Quindi, riassumendo, ciò che può generare alleli ipomorfi o amorfi sono:

• DELEZIONI

− Intero gene

− Parte del gene

• Sovvertimento della struttura genica

− Inserzione, inversione, traslocazione

• Inattivazione del promotore

• Destabilizzazione dell’mRNA

• Mutazioni di splicing

− Inattivazione del donatore/accettore

− Attivazione di siti criptici di splicing

4. Allele ipermorfo

5. Allele neomorfo Vedi lezione 2

6. Allele antimorfo

Tutte le mutazioni che generano alleli ipomorfi e amorfi vengono chiamate mutazioni “loss of function” e

sono causa soprattutto di fenotipi recessivi, infatti, per la maggior parte dei prodotti genici la presenza di

quantità corrispondenti alla metà del prodotto normale è compatibile con un funzionamento normale fatta

→

eccezione per le situazioni di aploinsufficienza nelle quali la patologia è trasmessa in maniera dominante.

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a volte un polipeptide non funzionale anomalo può interferire con la funzione dell’allele normale negli

eterozigoti tramite effetto dominante negativo (antimorfo).

ESEMPIO APLOINSUFFICIENZA: stenosi sopravalvolare aortica, gli eterozigoti per una delezione o mutazione

amorfa dell’elastina (proteina presente in tutti i tessuti) hanno tessuti elastici che funzionano normalmente

nella maggior parte degli organi ma spesso si sviluppano problemi localizzati all’aorta, nella regione

sopracardiaca (sopravalvolare), questo avviene perché è il punto che contiene una quantità particolarmente

grande di tessuto elastico per motivazioni di necessità quindi solo in quel tratto risulta insufficiente la

produzione di elastina.

Quindi l’inattivazione biallelica, per mutazioni in omozigosi o in eterozigosi composta, è causa di quasi tutti i

difetti del metabolismo in cui abbiamo mutazioni che inattivano un enzima (difetti enzimatici) con

conseguente accumulo di prodotti proteici a monte e carenza del prodotto della reazione catalizzata da quel

dato enzima; queste mutazioni amorfe o ipomorfe sono anche causa della mutazione del gene CFTR le cui

alterazioni sono responsabili della fibrosi cistica, ed infine queste mutazioni sono anche causa delle

-globina) -globina)

talassemie, malattie dove mutazioni puntiformi (es. o delezioni (es. dei geni si

accompagnano ad un’assenza del prodotto genico.

APPROFONDIMENTO: DELEZIONI GENE DELLA DISTROFINA

La Distrofia di Duchenne è la forma di distrofia muscolare più frequente nel

bambino ed è una delle forme più gravi che inizia quando il bambino ha già

imparato a camminare (2-3 anni), il bambino infatti sviluppa una progressiva

debolezza agli arti inferiori per cui inizia a cadere senza la capacità di rialzarsi.

Quando arriva in età precoce (10-12 anni) la degenerazione muscolare avanza

costringendo spesso i soggetti alla sedia a rotelle dopo la quale solitamente

sopraggiunge la morte a causa dell’insufficienza anche dei muscoli respiratori.

È una forma di distrofia muscolare trasmessa come carattere legato all’X che

è dovuta all’assenza di una proteina detta distrofina (che funge, lungo le fibre

muscolari, da legame tra l’actina del citoscheletro e la lamina basale), la cui

assenza determina una serie di eventi che portano alla degenerazione del tessuto muscolare che viene

→

sostituito da tessuto fibroso e adiposo. Una donna portatrice può avere figlie malate solo in caso di

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concomitanza col la Sindrome di Turner (X X) in cui si ha delezione parziale o completa di uno dei due

cromosomi X.

Patologia simile alla DMD è la distrofia muscolare di Becker (DMB): nella DMD l’alterazione del gene per la

distrofina causa l’assenza totale di distrofina nel muscolo, mentre la DMB è causata da alterazioni che

portano alla diminuzione, ma non all’assenza totale. La DMB ha un esordio più tardivo, generalmente tra i 5

ed i 25 anni, ed un decorso più benigno.

La causa più frequente di queste distrofie è la presenza di delezioni nel gene (parziali o totali), quando la

delezione colpisce esoni che non sono in frame si genera un frameshift e quindi la DMD, mentre quando la

delezione colpisce esoni in frame si ha la DMB 4

LEZIONE 2: PATOLOGIA MOLECOLARE DEL GENE Eterozigoti composti

Nell’ultima lezione abbiamo parlato di mutazioni con perdita di funzione Soggetti in cui ci sono due

(loss of function) e un’altra caratteristica di queste mutazioni è che il loro mutazioni inattivanti il gene,

effetto sul fenotipo dipende da quanto è alterato il livello del prodotto ciascuna sui due alleli, quindi la

genico, nel senso che se c’è una quota di prodotto genico anche somma delle due mutazioni

funzionante in maniera minore rispetto al soggetto wild-type in genere la (entrambe loss of function)

→

sintomatologia è più lieve. se il prodotto genico non è totalmente genera una sorta di condizione

alterato (presenza di mutazioni ipomorfe) il fenotipo può essere variabile e di omozigosi recessiva, dove

nettamente meno grave. comunque il fenotipo dipende

NB. quando entrambi gli omololghi sono colpiti possono essere influenzati dalla quantità di prodotto

in maniera diversa, le persone con condizioni autosomiche recessive sono genico

spesso eterozigoti composti.

Normalmente gli eterozigoti che portano un solo allele mutato con una

mutazione che abolisce completamente la funzione sono in genere normali

(poiché c’è l’altro allele che funziona) a condizione che l’allele residuo sia completamente normale così da

riuscire a produrre una quantità sufficiente di prodotto genico. Se il prodotto genico è inferiore al 50% si

determina una malattia sempre più grave tanto più grave è la riduzione del prodotto genico; esistono inoltre

delle condizioni in cui c’è proprio la gravità della malattia che si presenta in modo graduato

A. CONDIZIONE RECESSIVA SEMPLICE

B. CONDIZIONE DOMINANTE CAUSATA DA APLOINSUFFICIENZA

C. CONDIZIONE RECESSIVA CON GRAVITÀ GRADUATA

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Un’esempio della tipologia C è la sindrome di Lesch-Nyhan che è una malattia del metabolismo causata dalla

mutazione nel gene ipoxantina-guanina fosforibosil transferasi (HPRT), è una malattia recessiva legata al

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cromosoma X che quindi si manifesta quasi esclusivamente nei soggetti di sesso maschile. l’intero gene

(mappato a livello di Xq26-q27) è stato clonato e sequenziato e sono state identificate più di 200 mutazioni

responsabili della malattia.

Questo deficit determina 3 malattie di gravità assolutamente diversa nei soggetti maschi emizigoti:

• si può avere una forma classica di malattia dove l’enzima è praticamente assente quindi si ha un

accumulo di acido urico e c’è un comportamento neurologico caratteristico in quanto si hanno

atteggiamenti autolesionisti

• esistono poi varianti di questa malattia in cui persiste una piccola attività enzimatica (tra 1,5 e 8%)

per cui aumenta l’acido urico in circolo e quindi si hanno variazioni delle caratteristiche neurologiche

ma non alterazioni comportamentali di tipo autolesionistico

• se il deficit a livello dell’enzima è ancora meno

importante (più dell’8%) allora avremo solo

un’iperuricemia HPRT-correlata senza avere alterazioni

comportamentali o neurologiche

la grande maggioranza dei pazienti presenta, tra i 3 e i 12 mesi

di età (caratteristica tipica delle malattie metaboliche poiché è

necessario un periodo di tempo durante il quale si accumula la

sostanza che poi determina la malattia), ritardo motorio, più

spesso ipotonia o difficoltà a raggiungere le normali tappe di

sviluppo motorio; atri pazienti sono identificati per la comparsa

di movimenti involontari (=movimenti coreici) o di aumento del tono muscolare. Una minoranza di pazienti

può presentare complicanze legate alla iperproduzione di acido urico che si deposita nelle articolazioni.

4. Allele ipermorfo = si parla di alleli ipermorfi nel caso di variazioni di sequenza del DNA che

determinano l’aumentata quantità o funzione di un prodotto genico; l’allele ipermorfo può essere

semplice o avere una combinazione di altri effetti come ad esempio quello di essere presente in una

localizzazione impropria o in un tempo sbagliato inoltre l’allele ipermorfo è associato di regola ad un

tratto genetico dominante, in quanto l’aumentata espressione/funzione non può essere limitata

dall’allele non mutato. In questi casi si parla di mutazioni “gain of function” e ciò che causa questi

alleli sono:

− Trisomia

− Duplicazion

− Amplificazioni (tumori) Recettori FGFR

− Trasposizioni vicino a promotori forti

− Eccessiva attività del prodotto genico I 4 tipi di recettori FGFR hanno una

ESEMPIO: acondroplasia e sindromi correlate, tutte a struttura comune caratterizzata dalla

trasmissione dominante. L’acondroplasia è una delle formi presenza di un dominio di legame

più comuni di nanismo ed è caratterizzata da un mancato extracellulare che contiene 3 anse (loop)

simili a quelli presenti nelle

sviluppo armonico della cartilaggine di accrescimento delle immunoglobuline, di un dominio

ossa lunghe degli arti che sono molto più corte del normale, transmembranoso e di un dominio

mentre il tronco è poco interessato, con quindi gravi disturbi catalitico tirosin-chinasico

della crescita; presentano inoltre caratteristiche del viso intracitoplasmatico; la prima e la

peculiari con la radice del naso infossata e questo è dovuto seconda ansa immunoglobulino-simili

alla ipoplasia quindi al mancato completo sviluppo del sono separate da una regione acida

massiccio frontale, e presentano anche una testa più grande

e sproporzionata rispetto al tronco. 6

L’acondroplasia è infatti legata alle mutazioni dei

recettori di tipo 3 dei fattori di crescita fibroblastico

(FGFR3), infatti l’acondroplasia è causata nella quasi

totalità dei casi dalla mutazione nel dominio di

transmembrana al codone 380 che sostituisce la glicina

con un’arginina.

Esiste una forma più lieve di acondroplasia, detta

ipocondroplasia, dove la statura è un po' più alta

rispetto a quella presente nell’acondroplasia e dove non sono così evidenti le anomalie della faccia;

nel 70% dei casi abbiamo un’unica mutazione a carico della lisina 540 del primo dominio tirosin-

chinasico che viene trasformata in leucina. Esiste poi un’altra variante che risulta essere letale, detta

nanismo tanatoforo, a causa del torace assolutamente ristretto che impedisce la respirazione e della

testa eccessivamente sproporzionata; questo nanismo tanatoforo è legato a due mutazioni: una nel

secondo dominio tirosin-chinasico dove troviamo la sostituzione della lisina 650 con una metionina

e l’altra nel secondo interloop dove troviamo la sostituzione dell’arginina 258 con una cisteina.

Come fanno queste mutazioni missenso ad essere mutazioni gain of function? Normalmente una

volta che il fattore di crescita fibroblastico (FGF) entra in contatto con il recettore (FGFR) causa la

dimerizzazione del recettore, dopodichè si ha un’autofosforilazione e tramite il dominio tirosin-

chinasico si ha il passaggio dei segnali alla catena sottostante. Quando si hanno invece queste

mutazioni pun