Genetica umana

LINKAGE DISEQUILIBRIUM

Il è una situazione per cui un particolare aplotipo è

statisticamente più probabile in un sottogruppo di una popolazione. Indica che la

popolazione deriva da un comune ancestore o, nel caso delle mutazioni patogene, che

la mutazione è avvenuta su un cromosoma ancestrale comune alla popolazione.

Mutazioni e ricombinazioni sono i principali fattori che rispettivamente generano e

distruggono il LD. Quando si verifica una mutazione, si genera LD tra il sito mutato e

gli alleli adiacenti. Inizialmente la mutazione sarà associata solo a quei particolari

alleli, fino a quando non interviene la ricombinazione che separa la mutazione dagli

alleli a cui era associata e la congiunge ad altre forme alleliche.

Il livello di LD decresce con il tempo e con la distanza tra i marcatori (frazione di

ricombinazione) secondo la legge: t

D = (1 - r) D



t 0

dove D rappresenta il LD al momento di inizio e D è il LD dopo t generazioni.

0 t

Per loci indipendenti r = 0.5, quindi il Disequilibrio si dimezza ad ogni generazione,

sono cioè sufficienti poche generazioni per raggiungere le frequenze di equilibrio.

Quanto più i loci sono vicini tanto più r è piccolo e quindi sono necessarie parecchie

generazioni per il linkage equilibrium.

Il linkage disequilibrium si può spiegare con l’effetto fondatore: viene mantenuta la

stessa posizione degli alleli presente al momento in cui è avvenuta la mutazione sul

cromosoma ancestrale.

Consideriamo il gene CF: Linkage equilibrio tra A e

CF (CF può trovarsi sia in

coupling con A1 che con

A2): 50% CF-A1 e 50%

CF-A2.

Linkage disequilibrio tra

B1 e CF (CF si trova

sempre e solo in

coupling con B1): 100%

CF-B1.

Linkage disequilibrium

come strumento di

mappaggio per geni

malattia

Gene della Fibrosi

Cistica

Fibrosi Cistica

La è una patologia autosomica recessiva, che si caratterizza per

un’eccessiva produzione di secrezioni dense. Si osserva un malassorbimento cronico

che comporta incapacità di crescere normalmente (deficit della secrezione degli

enzimi pancreatici e quindi insufficiente digestione delle proteine e grassi); inoltre, si

hanno frequenti infezioni del tratto respiratorio da semplici raffreddori a polmoniti

(ostruzione delle vie respiratorie minori da parte di un muco denso e loro

colonizzazione da parte di batteri.

Caratteristica è la secrezione di NaCl nel sudore (rappresenta anche un test

diagnostico).

Nel 1985 il gene della fibrosi cistica (CF) viene associato ad un polimorfismo proteico

(enzima paraossonasi) di cui si ignora la localizzazione, nediante analisi di linkage.

Per una patologia autosomica recessiva l’analisi di linkage e’ ostacolata dal fatto che

non si conosce la fase, per cui il calcolo si effettua prima considerando che i 2

cis trans lod score

loci(allele polimorfico e locus malattia) siano in e poi in e il valore di

sara’ la media tra i due valori ottenuti.

Nel 1986 furono trovati altri marcatori associati alla CF e il gene della paraossonasi

viene mappato sul cromosoma 7. Tra ognuno di questi marcatori e il gene della CF

sono stati trovati dei ricombinanti; nessuno di questi marcatori è, però, il reale

responsabile della CF. Fu identificata la regione, utilizzando gli RFLP della regione: si

restringe la mappatura di CF alla bande citogenetiche 7q31-32. Met

Si definirono inoltre i marcatori fiancheggianti, come l’oncogene prossimale e il

D7S8 (clone anonimo) distale.

Dal 1986 in poi, si identificano altri polimorfismi nella regione e si fonda un consorzio

chromosme walking,

per cumulare i dati raccolti in più centri. Viene attuato prima il

successivamente, per ovviare alla brevità delle sonde disponibili, si passò al

chromosme jumping.

Nel 1989, si riesce ad evidenziare la presenza di linkage disequilibrium per i marcatori

XV2.c e KM19 che risulteranno far parte del 5’ del gene . Dai dati ottenuti su 114

famiglie britanniche con un figlio affetto: Il cromosoma CF è stato identificato perché

presente nell’affetto, il quale tende a portare gli alleli X1 e K2.

una volta clonato il gene putativo, bisogno’ dimostrare che era il gene della fibrosi

cistica. Furono pertanto esaminati gli affetti e si trovo’ che il 70% dei cromosomi CF

ORF.

presentavano la delezione di una tripletta (ΔF508) senza che venisse alterata la

cystic fibrosis transmembrane conductance

Il prodotto del gene e’ stato definito CFTR(

regulator).

La presenza in omozigosi della ΔF508 in individui gravemente affetti non era

conclusiva, anche se molto convincente: la delezione avrebbe potuto essere un

linkage disequilibrium

polimorfismo come altri in strettissimo con il gene. L’

identificazione del coinvolgimento di CFTR nel trasporto dello ione cloro attraverso le

membrane apicali e la caratterizzazione di alcune mutazioni il cui effetto era piu’

evidente sull’espressione del gene confermarono che CFTR era il gene della Fibrosi

Cistica.

Oggi sono state descritte oltre 700 mutazioni nel gene CFTR. Molte vengono definite

mutazioni private, perché individuate in una sola famiglia. In molti casi non è certo che

siano patogene, potrebbero essere sequenze varianti in un cromosoma in cui è

presente un allele CF.

Non ci sono altre mutazioni molto frequenti, sono tutte mutazioni con frequenza che

non supera qualche punto percentuale: in media il 70% degli alleli mutati sono ΔF508;

altre 12 mutazioni hanno una frequenza combinata del 15%.

La presenza di centinaia di mutazioni diverse rende molto difficili i test diagnostici per

la CF. Questi consistono in:

- Screening per PCR e successiva amplificazione

- Amplificazione specifica con primer che legano sequenze mutate

La patologia ha una frequenza di 1 affetto su 25000 individui mentre si stima che i

portatori siano 1 su 25.

Difatti, supponendo che la popolazione sia in equilibrio di HW:

2

q = 1/2500 q=1/50

Þ

poiché p = 1-q = 49/50

la frequenza dell’eterozigote (2pq) è pari a

2pq = 2x49/50x1/50 = 1/25

I genitori portatori hanno, dunque, il 25% di

probabilità di avere un figlio affetto e individui sani

con un fratello o sorella affetto hanno 2/3 di

probabilità di essere portatori.

I portatori di CF sono molto frequenti anche per

vantaggio dell’eterozigote:

effetto del gli eterozigoti

hanno un vantaggio riproduttivo rispetto agli omozigoti (potrebbe essere dovuto al

salmonella tiphi,

fatto che sono maggiormente resistenti alla un batterio che richiede

Cl per crescere e riprodursi e la CF e’ causata da un difetto del canale del Cl). Altra

ipotesi è legata al fatto che gli eterozigoti per CF secernono grandi quantità di

mucopolisaccaridi nel muco polmonare che li rende maggiormente resistenti alle

infezioni batteriche. E ancora, si ritiene che il ridotto flusso d’acqua attraverso la

mucosa intestinale conferisca ali eterozigoti una maggiore capacità di sopravvivenza

alle infezioni intestinali responsabili di diarrea infantile (un tempo frequente causa di

morte).

In base al tipo di approccio sperimentale, i metodi usati per la diagnosi molecolare

genetica possono essere distinti in diretti e indiretti.

La “diagnosi indiretta” è l’unico mezzo di indagine molecolare disponibile quando si

conosce solo la localizzazione del locus malattia sul genoma umano. È un tipo di

indagine possibile esclusivamente nei casi familiari (coinvolge infatti l’intera famiglia)

e viene condotta mediante studi di linkage utilizzando marcatori associati alla

malattia, di cui viene seguita la segregazione all’interno della famiglia stessa.

La “diagnosi diretta” è possibile solo dopo l’identificazione del gene malattia: in questo

caso la mutazione responsabile di una patologia viene ricercata e rilevata

direttamente su DNA, RNA o prodotto proteico del probando.

La ricerca diretta di mutazioni può essere effettuata mediante due approcci:

1. Analisi specifica di una mutazione nota. Da un punto di vista metodologico sono

stati approntati diversi metodi di indagine: analisi di restrizione, ASO (Allele Specific

Oligoprobe), ARMS (Amplification Refractory Mutation System), OLA

(Oligonucleotide Ligation Assay).

2. Ricerca aspecifica di mutazione, ignota o nota. Si conoscono differenti approcci

metodologici da usare a seconda delle dimensioni del gene in esame e del numero

di campioni da analizzare: sequenziamento del DNA, tecnica SSCP (Single Straind

Conformation Polymorphism), tecnica DGGE (Denaturing Gradient Electrophoresis),

tecnica DHPLC (Denaturing High Performance Liquid Chromatogrphy).

La scelta del metodo diagnostico per la ricerca di mutazioni dipende da fattori vari

come:

- Dimensione del gene

- Tipi di mutazione

- Eterogeneità allelica

- Materiale biologico disponibile

- Numero di campioni da testare

- Ricerca di mutazioni note o ignote.

Analisi di restrizione. È operata da enzimi specifici, detti “endonuleasi di

 restrizione”, che sono stati isolati da numerosi ceppi batterici. Questi enzimi si

legano a una sequenza di DNA, detta sito di riconoscimento o sito di restrizione,

lunga solitamente 4-8 nucleotidi, e tagliano entrambi i filamenti di DNA.

Se una mutazione puntiforme con sostituzione anche di una sola base crea o

abolisce un sito di restrizione, può essere facilmente individuata ponendo

l’amplimero all’azione dell’enzima. La semplice elettroforesi in gel di agarosio o di

poliacrilamide, seguita da colorazione con bromuro di etidio, permette di

visualizzare direttamente la presenza o l’essenza del sito di restrizione.

Nel caso in cui la mutazione crei un sito di restrizione per uno specifico enzima,

questo taglia il DNA con la mutazione. Il prodotto della PCR viene digerito con

l’enzima appropriato: il frammento corrispondente all’allele mutato viene digerito

creando due frammenti; il frammento corrispondente all’allele normale non verrà

diferito in quanto non possiede il sito di restrizione.

Dopo elettroforesi su gel di agarosio è possibile discriminare il soggetto omozigote

normale (presenza di una banda, per l’assenza del sito di restrizione), dal soggetto

omozigote mutato (presenza di due bande, che testimoniano la digestione su

entrambi i frammenti), dal soggetto eterozigote (presenza di tre bande

corrispondenti al frammento intero e a quello digerito)

Bisogna, infine, effettuare la conta genica, tramite Equilibrio di H-W, per questo

polimorfismo.

L’errore nell’analisi di restrizione può riguardare il soggetto omozigote normale, a

seguito di una digestione enzimatica non eseguita correttamente, oppure può

interessare il soggett