Genetica Umana - Appunti

Analisi del Cariotipo

• azospermia).
• coppie candidate alla fecondazione assistita.
• diagnosi di conferma o definizione dell'anomalia cromosomica individuata nel periodo pre-natale.
• anamnesi familiare + per anomalie cromosomiche.
• diagnosi di mosaico cioè presenza in un individuo di 2 o più linee cellulari originate da uno zigote.
• valutazione di anomalie cromosomiche in pz sintomatici.
• diagnosi di anomalie cromosomiche nella patogenesi tumorale.
• studio dei cromosomi metafasici.

L'Analisi del Cariotipo si basa sullo perché hanno raggiunto il massimo livello di condensazione più facilmente osservabili al M.O. e sono, in genere, studiando cellule in proliferazione attiva, cioè:

• analisi di routine campione viene prelevato con un semplice prelievo di sangue.
• diagnosi di neoplasie e displasie emolinfopoietiche.
• biopsia midollare indicata per le cellule del midollo osseo.

.─ biopsia cutanea prelevati con (mosaicismo). fibroblasti─ biopsia da tumori solidi prelevate mediante .cellule neoplastiche trofoblasto durante la vita embrionale liquido─ del o gli presenti nel villi coriali amniociti amniotico durante la vita fetale diagnosi prenatale di anomalie cromosomiche, importanti per la .Analisi del Cariotipo varie fasi L’ avviene in : prelievo di poche gocce di sangue periferico alcuni ml, ad es. o prelievo del materiale biologico di sangue eparina impedisce la coagulazione in presenza di che ne . separare i linfociti terrenoper e in un centrifugazione allestimento di terreni di coltura stimola notevolmente la divisione dei linfociti contenente (PHA) che .fitoemoagglutinina blocca la divisione cellularesi la che ,dopo 48-72 h aggiunge al terreno di coltura colchicina impedendo la formazione dei microtubuli del fuso . rompe le membrane cellulari perle che cellule sono trattate con una soluzione salina ipotonicalisi osmotica facendo disperdere i cromosomi,

• Le cellule sono fissate su un vetrino da microscopio, lasciate essiccare all'aria e colorate in modo sequenziale con diverse intensità di colorazione a seconda del grado di condensazione della cromatina. Questo permette di ottenere una rappresentazione grafica del cariotipo, con la formazione di bande cromosomiche caratteristiche di ogni regione.
• L'idiogramma del cariotipo viene ottenuto mediante il gruppo di bandeggio (ISCN, 1995), con distinzione tra le bande A, B, C, D, E, F, G (1-3), (4-5), (6-12, X), (13-15), (16-18), (19-20), (21-22 e Y).
• Il cariogramma è ottenuto fotografando il preparato e analizzando l'immagine al computer. Rappresenta le coppie di cromosomi in cui si notano gli omologhi, uno di origine materna e l'altro di origine paterna, morfologicamente uguali. Gli autosomi sono numerati in ordine crescente dall'autosoma 1 al 22, mentre la coppia di cromosomi sessuali o eterosomi è rappresentata dai cromosomi XX nel cariotipo.

punto di vista trascrizionale. bandeggio G, Q, R, T e C

Possiamo fare una distinzione tra i cromosomi a seconda della tecnica usata. Nel bandeggio G i cromosomi sono sottoposti a digestione enzimatica con tripsina, che ha affinità per le regioni ricche in basi AT e che colora le bande G, osservando al microscopio bande G-positive, alternate a bande G-negative, scure e chiare.

Nel bandeggio Q i cromosomi sono colorati con Quinacrina, che ha affinità per le regioni ricche in basi AT e che produce bande fluorescenti, per cui le bande Q sono corrispondenti a quelle G.

Nel bandeggio R i cromosomi sono denaturati (60°C) in una soluzione salina tamponata, colorati con Giemsa e osservando al microscopio le bande R che sono complementari opposte alle bande G, infatti la "R" sta per reverse. Per cui si osservano le bande R chiare opposte alle bande G scure.

mentre le regioni ricche in basi GC colorando con la cromomiocina evidenziano le bande R scure opposte alle bande G chiare. I cromosomi sono denaturati nel processo di bandeggio T ad alte temperature e colorati con Giemsa fluorocromico, corrispondono ai telomeri mettendo in evidenza le bande T (bande R telomeriche).

I cromosomi sono denaturati nel processo di bandeggio C in una soluzione satura di idrossido di bario e colorati con Giemsa, mettendo in evidenza le bande C. Le regioni costitutive dell'eterocromatina sono caratterizzate dall'alta condensazione del DNA e si trovano nelle regioni centromeriche o pericentromeriche dei bracci del cromosoma. La regione centromerica è localizzata nelle regioni q e sul braccio corto del cromosoma Y ed è costituita da sequenze di DNA altamente ripetute e ricche in basi AT. Mentre l'eterocromatina si replica in fase S tardiva, l'attività trascrizionale è pochissima e gli eteromorfismi cromosomici corrispondono agli assenti geni codificanti.

Gli eteromorfismi cromosomici sono differenze morfologiche grossolane che interessano le regioni di DNA ripetitivo.

1. Anomalie cromosomiche non chiarite con le tecniche tradizionali.
2. Diagnosi di anomalie non valutabili con le tecniche tradizionali.
3. Diagnosi di nuove sindromi in base alla valutazione di nuove correlazioni genotipo-fenotipo.
4. Monitoraggio di pazienti portatori di anomalie cromosomiche asintomatiche.
5. Identificazione di marker cromosomici e localizzazione dei geni-malattia sui cromosomi.
6. Studio di tessuti inclusi in paraffina, ad esempio diagnosi retrospettiva su materiale conservato in laboratori anche 20-30 anni dopo la morte del paziente (medicina legale).
7. Ridefinire la classificazione (nosologia) delle sindromi genetiche.
8. Utilizzo del liquido amniotico, sangue, biopsie tissutali come materiale biologico.
9. Il materiale biologico utilizzato nella FISH può essere fresco, crioconservato o paraffinato.
10. Il materiale fissato sul vetrino portaoggetti viene trattato con una soluzione e viene fatto reagire con un frammento di DNA a doppia elica specifico per la sonda contenente una sonda a.

Il DNA è costituito da una regione cromosomica da studiare marcata con un composto fluorescente. La sonda viene detta fluoresceina rodamina, tra cui la fluoresceina (fluorescenza verde) e la rodamina (fluorescenza rossa).

Il DNA della sonda e il DNA bersaglio sono denaturati ad alte temperature o in soluzione alcalina per rompere i legami H e separare i 2 filamenti. Successivamente avviene il legame o ibridizzazione tra le sequenze di basi complementari del filamento della sonda e del DNA bersaglio, formando molecole a doppio filamento. Queste molecole emettono un segnale fluorescente, che può essere osservato al microscopio a fluorescenza di colore diverso per ogni cromosoma (marcatore).

Esistono vari tipi di sonde:

• Sequenze ripetute a livello centromerico: indicate per lo studio delle regioni centromeriche e pericentromeriche (eteromorfismi cromosomici).
• Sonde telomeriche: specifiche per i telomeri.
• Sonde specifiche per un intero braccio cromosomico o per regioni più o meno estese del braccio stesso.
• Colorazione selettiva di specifiche sequenze di basi.