Genetica Umana - Appunti

Università degli Studi di Foggia

Facoltà di Medicina e Chirurgia

Esami di genetica umana e genetica medica

Prof. Maurizio Margaglione

Struttura degli acidi nucleici: DNA, RNA

La genetica è la scienza che studia i geni, i caratteri ereditari e la variabilità genetica degli organismi (genetica: dal greco gennao = dare vita, generare).

DNA o acido deossiribonucleico

Il DNA (desossiribonucleico) è la molecola centrale della vita poiché contiene tutte le informazioni ereditarie degli organismi cellulari e dei virus a DNA. Il DNA è presente nei nuclei cellulari, organizzato nei cromosomi, e in organelli citoplasmatici come mitocondri e cloroplasti (cellule vegetali), ha il compito di dirigere la propria replicazione durante la divisione cellulare e la trascrizione di molecole complementari di RNA.

Struttura del DNA

La struttura del DNA è stata scoperta nel 1953 da James Watson e Francis Crick, i quali, partendo da studi dei cristalli di DNA mediante la tecnica di diffrazione dei raggi X, osservarono che il DNA produceva una diffrazione caratteristica, cioè delle macchie caratterizzate da una croce al centro con bande molto intense a destra e a sinistra corrispondenti alle basi, per cui riuscirono a descrivere la struttura del DNA-B, quella più rappresentata in natura nelle cellule eucariotiche e procariotiche, costituito da 2 filamenti polinucleotidici avvolti a spirale uno sull'altro in maniera destrorsa (senso orario), formando una doppia elica.

Il nucleotide rappresenta l'unità fondamentale del DNA, costituito da una base azotata, uno zucchero e un gruppo fosfato. Le basi azotate sono anelli eterociclici di atomi di C e N, distinte in purine e pirimidine:

• Basi azotate puriniche: adenina (A) e guanina (G).
• Basi azotate pirimidiniche: citosina (C), timina (T); nell'RNA la T è sostituita dall'uracile (U).

Il residuo pentoso presente nei nucleotidi del DNA è un zucchero ribosio a 5 atomi di C a forma di anello del deossiribosio, mentre nell'RNA è presente un residuo di zucchero ribosio. Il gruppo fosfato viene indicato con PO₄^3-. I nucleotidi sono distinti in monofosfato, difosfato e trifosfato a seconda della presenza di 1, 2 o 3 gruppi fosfato, che nel caso del DNA prendono il nome di deossiribonucleotidi perché lo zucchero è il deossiribosio che a livello del C1' si lega alla base azotata: dAMP, dADP, dATP, dGMP, dGDP, dGTP, dUMP, dUDP, dUTP, dTMP, dTDP, dTTP, dCMP, dCDP, dCTP.

In assenza del gruppo fosfato, si parla di nucleoside, costituito dallo zucchero e dalla base azotata, con distinzione tra adenosina, guanosina, citidina, timidina e uridina per i nucleosidi purinici e pirimidinici.

Quindi il DNA è un polimero di unità monomeriche dette nucleotidi, unite tra loro da legami fosfodiesterici, in cui il gruppo fosfato si lega all'atomo di C in posizione 5' di un residuo di zucchero e all'atomo di C in posizione 3' del residuo di zucchero successivo, formando la catena polinucleotidica con alternanza tra zuccheri e fosfati. Per convenzione la direzione delle sequenze degli acidi nucleici è sempre 5’→3’ e le estremità 5' e 3' sono costituite da nucleotidi terminali con i gruppi 5' e 3' liberi.

Inoltre, Watson e Crick hanno dimostrato che:

• Le basi puriniche e pirimidiniche sono disposte all'interno della doppia elica, mentre le catene zucchero-fosfato sono disposte all'esterno, riducendo al minimo le repulsioni tra i gruppi fosfato carichi, costituendo la porzione invariabile del DNA.
• I piani delle basi sono perpendicolari all'asse dell'elica.
• Ogni base di un filamento è legata mediante deboli legami H ad una base del filamento opposto, cioè questi legami si stabiliscono tra coppie di basi specifiche: adenina e timina (A=T) unite da 2 legami H e guanina e citosina (G≡C) unite da 3 legami H, per cui le coppie di basi sono complementari e i 2 filamenti sono complementari, cioè la sequenza di un filamento determina la sequenza dell'altro: se un filamento ha la sequenza A-C, sull'altro avremo la sequenza T-G.
• I 2 filamenti sono antiparalleli, cioè corrono in direzioni opposte 5'→3' e 3'→5'.

Tutto ciò rispetta le cosiddette regole di Chargaff, cioè:

• La quantità di A è uguale alla quantità di T, cioè il n° dei residui di A è uguale al n° dei residui di T.
• La quantità di G è uguale alla quantità di C, cioè il n° dei residui di G è uguale al n° dei residui di C.
• Per cui 2A + T è uguale a G + C, cioè la somma dei residui purinici è uguale alla somma dei residui pirimidinici.

La composizione in basi del DNA può essere specificata in percentuale: ad esempio, un DNA con una percentuale in GC = 40% e AT = 60% ha una composizione in basi pari a: G 20%, C 20%, A 30%, T 30%.

I filamenti nucleotidici sono separati da una distanza regolare di 1 nm rispetto al centro dell'elica. La doppia elica ha un diametro di 2,37 nm, con un passo corrispondente a 3,4 nm per ciascun filamento dell'elica, costituita da 10 coppie di basi per giro.

Il DNA presenta 2 profonde scanalature, il solco maggiore e il solco minore, dovuti al fatto che le catene di zucchero-fosfato che si trovano all'esterno dell'elica seguono un andamento a spirale tra 2 basi, e i 2 filamenti non sono equidistanti dal centro dell'elica, per cui i legami fosfodiesterici procedono a zig-zag.

Conformazioni DNA A e Z

Oltre al DNA-B, sono state identificate altre conformazioni, cioè il DNA A e il DNA Z. Il DNA A è la forma che il DNA assume in condizioni di bassa umidità e disidratazione, rappresentata da un'elica destrorsa, con un diametro di 2,5 nm, passo di 2,9 nm, e 11 coppie di basi per giro dell'elica. Le basi hanno un piano inclinato di 20° rispetto all'asse dell'elica, con solco maggiore più ampio e solco minore più stretto rispetto al DNA-B, per cui si presenta come un nastro piatto avvolto intorno ad un buco cilindrico.

Il DNA Z è costituito da una doppia elica sinistrorsa (levogira), con un diametro di 1,8 nm, passo di 4,6 nm, contenente 12 coppie di basi per giro. Il solco maggiore è più superficiale, non distinguibile, e il solco minore più profondo, simile ad una punta da trapano sinistrorsa. Le coppie di basi hanno il piano ruotato di 180° rispetto all'asse della doppia elica, e l'unità ripetitiva è un dinucleotide, in cui i legami fosfodiesterici procedono a zig-zag.

RNA o acido ribonucleico

L'RNA differisce dal DNA perché è un acido nucleico a singolo filamento costituito da unità monomeriche o nucleotidi tenuti insieme da legami fosfodiesterici (5’→3’). Lo zucchero è il β-D-ribosio con presenza del gruppo OH in posizione 2 (C2'), rispetto al deossiribosio del DNA.

Le basi azotate sono adenina, guanina, citosina e uracile (U al posto della timina), che rispetta le caratteristiche chimiche di una base azotata pirimidinica ma presenta un gruppo metilico CH₃ in posizione 5.

Inoltre, l’RNA è una molecola a breve emivita continuamente sintetizzata grazie alla trascrizione del DNA e distrutta dalla cellula in base alle sue esigenze funzionali.

Vari tipi di RNA

Dal punto di vista funzionale possiamo distinguere:

• rRNA o RNA ribosomiale (80%): sintetizzato nei nucleoli e assemblato nel citoplasma alle subunità maggiore e minore delle proteine ribosomiali sintetizzate nel R.E.R., formando i ribosomi su cui avviene la traduzione o sintesi proteica.
• tRNA o RNA transfer o di trasferimento (15%): ha il compito di trasferire gli amminoacidi ai ribosomi durante la sintesi proteica; esiste un t-RNA specifico per ogni amminoacido e regola la sintesi dei polipeptidi sui ribosomi durante la traduzione.
• mRNA o RNA messaggero (5%): regola la sintesi dei polipeptidi sui ribosomi durante la traduzione.
• snRNA o piccolo RNA nucleare (small nuclear RNA), sno-RNA o piccolo RNA nucleolare.

Sintesi o replicazione del DNA

La sintesi o replicazione del DNA avviene durante la fase S del ciclo cellulare con duplicazione del DNA parentale e formazione di 2 molecole di DNA identiche che saranno distribuite nelle 2 cellule figlie al momento della divisione cellulare. In pratica, ciascuno dei 2 filamenti del DNA funge da stampo per la sintesi di un nuovo filamento complementare, formando 2 molecole di DNA a doppia elica, ciascuna formata da un filamento derivante dal DNA parentale della cellula progenitrice e un filamento complementare neosintetizzato, per cui la replicazione del DNA è semi-conservativa perché il DNA delle cellule figlie è identico a quello della cellula progenitrice (replicazione conservativa, dispersiva).

La sintesi del DNA è controllata da vari enzimi e proteine, tra cui l'enzima DNA polimerasi. Nelle cellule procariotiche esistono 3 tipi di DNA polimerasi: la DNA polimerasi III, deputata alla replicazione del DNA, con attività di sintesi in direzione 5’→3’ e velocità di sintesi pari a ~1000 nucleotidi/sec.; la DNA polimerasi I, deputata alla replicazione e riparazione, e la DNA polimerasi II, deputata alla riparazione con attività di esonucleasi 3’→5’. La riparazione si deve alla correzione degli errori che avvengono durante la sintesi (correzione di bozze).

Nelle cellule eucariotiche esistono 3 classi principali di DNA polimerasi:

• DNA polimerasi DNA-dipendenti, ad alta fedeltà: sono dette DNA-dipendenti perché usano il filamento stampo di DNA per la sintesi del filamento complementare e sono dette ad alta fedeltà perché sono dotate di attività esonucleasica 3’→5’ di correzione di bozze, con alta fedeltà di replicazione (1 errore/10⁹ nucleotidi copiati). Nel nucleo, la sintesi si deve alla DNA polimerasi α e δ con velocità di sintesi pari a ~50 nucleotidi/sec.; la riparazione si deve alla DNA polimerasi ε, che è in grado di identificare le basi incorporate in maniera errata, tagliare il segmento di DNA contenente l’errore e sintetizzare il DNA corretto.
• DNA polimerasi mitocondri: la sintesi e riparazione del DNA sono modulate dalla DNA polimerasi γ.
• DNA polimerasi DNA-dipendenti, a bassa fedeltà: ricordiamo la DNA polimerasi ι (iota), che ha un tasso di errore 20.000 volte maggiore alle DNA polimerasi ad alta fedeltà (cellule del SI).
• DNA polimerasi RNA-dipendenti o trascrittasi inverse: questi enzimi sintetizzano il DNA utilizzando uno stampo di RNA, deputato alla sintesi dei telomeri, come l’enzima telomerasi.

Nelle fasi iniziali della replicazione del DNA si ha l’intervento dell’enzima topoisomerasi II, che taglia un filamento del DNA, favorendo lo svolgimento del DNA.

La replicazione del DNA avviene in punti specifici detti origine di replicazione: nelle cellule procariotiche c’è solo una origine di replicazione, mentre nelle cellule eucariotiche sono attive più origini di replicazione contemporaneamente, ecco perché la fase S dura solo 1-2 ore. A livello delle origini di replicazione si forma la forcella o forca di replicazione, punto di biforcazione della doppia elica parentale, in cui si ha l’intervento dell’enzima elicasi che determina la separazione dei 2 filamenti del DNA parentale, favorendo il progressivo srotolamento della doppia elica e la formazione del filamento guida o leader (leading strand) e del filamento in ritardo (lagging strand), cosiddetto perché la sua sintesi inizia leggermente in ritardo rispetto a quella del filamento guida.

Le proteine SSB (single strand-binding protein) si legano ai filamenti denaturati impedendo che questi possano riavvolgersi a formare la doppia elica, che bloccherebbe la replicazione. La sintesi dei filamenti si deve all’intervento dell’enzima DNA polimerasi α, che usa i precursori, cioè i deossinucleosidi trifosfato (dATP, dCTP, dGTP, dTTP), da cui derivano i nucleotidi, catalizzando la sintesi mediante legami fosfodisterici.

È necessario l’intervento dell’enzima primasi per iniziare la sintesi di un primer di RNA, cioè un breve filamento di RNA costituito da 3-5 nucleotidi, che presenta un gruppo OH libero all’estremità 3’, dove la DNA polimerasi aggiunge i nuovi nucleotidi complementari al filamento stampo unendo i nucleotidi in successione, mediante legami fosfodisterici in direzione 5’→3’ ad opera di una pirofosfatasi, l’idrolisi del pirofosfato (PPi) fornisce l’energia necessaria alla reazione.

Sintesi del DNA

La sintesi del DNA è asimmetrica e semi-discontinua perché il DNA è costituito da 2 filamenti complementari e antiparalleli, cioè il filamento 5’→3’ e il filamento 3’→5’:

• La sintesi del filamento guida avviene in direzione 5’→3’, nella direzione di movimento della forchetta di replicazione, con sintesi continua, perché la DNA polimerasi aggiunge nucleotidi in successione al gruppo OH libero in 3’.
• La sintesi del filamento in ritardo avviene sempre in direzione 5’→3’ ma in direzione opposta al movimento della forchetta di replicazione e in modo discontinuo, sintetizzato in piccoli segmenti lunghi 100-1000 nucleotidi ciascuno, detti frammenti di Okazaki, a partire da un primer di RNA per intervento dell’enzima DNA ligasi, che catalizza la formazione di un legame fosfodiestere tra il gruppo OH 3’ dell’estremità di un frammento di Okazaki e il gruppo fosfato 5’ del frammento di Okazaki adiacente, formando un filamento continuo.

Gene: definizione, struttura e funzione dei geni

I GENI rappresentano l’unità fondamentale dell’ereditarietà, cioè segmenti di DNA che contengono l’informazione ereditaria necessaria per la vita e garantiscono la trasmissione dei caratteri ereditari.

L’insieme dei geni costituisce il patrimonio genetico di un organismo, cioè il genoma. Il genoma umano è costituito da ~30.000 geni:

• Ogni gene occupa sul cromosoma una posizione specifica detta locus.
• I geni sono presenti in coppie sui cromosomi omologhi, cioè un gene di origine materna e uno di origine paterna, che controllano i caratteri nella stessa misura o in modo diverso.
• Ogni gene è costituito da un n° di basi ≥ 1.000 ed ha una lunghezza proporzionata alla quantità di informazioni da codificare.

La struttura di base dei geni è rappresentata dall'unità trascrizionale costituita da 2 regioni, cioè la regione strutturale e la regione regolatoria, importanti per i processi di trascrizione e traduzione.

La regione strutturale è localizzata a valle del sito di inizio della trascrizione (3’), caratterizzata da un’alternanza tra sequenze del DNA codificanti o esoni che vengono trascritte in pre-mRNA e sequenze del DNA non codificanti o introni, che pur trascritte in pre-mRNA, successivamente vengono rimosse durante il processo di maturazione dell'mRNA mediante il meccanismo dello splicing, in modo da formare la molecola di mRNA matura, che passerà nel citoplasma per essere tradotta nelle proteine sui ribosomi citoplasmatici.

In realtà, non tutti gli esoni sono codificanti e solo il 2,7% dei geni codifica per una proteina. All'estremità 5' del sito di inizio della trascrizione c'è il codone d’inizio AUG, mentre all'estremità 3' ci sono il sito di arresto della trascrizione UGA e il sito di poliadenilazione dove sarà aggiunta la coda di poli(A).

Gli esoni e introni sono presenti in n° variabile nei diversi geni, ma la lunghezza del gene dipende dal n° degli introni. Gli introni iniziano con il dinucleotide GT e terminano con il dinucleotide AG, definite sequenze di giunzione, che svolgono un ruolo importante nel processo di splicing. I geni privi di introni, i geni mitocondriali, i geni degli istoni e molti geni che codificano per i tRNA sono.

Gli esoni sono costituiti da una regione detta open reading frame (ORF), cioè quadro di lettura, localizzato al 5’ della traduzione ed importante per dare inizio alla sintesi proteica. La regione regolatoria è localizzata all'estremità 5' monte del sito di inizio della trascrizione ed è rappresentata dal promotore (TATA box), enhancer e silencer, cioè elementi genici a corta sequenza importanti per la regolazione della trascrizione del gene.

Trascrizione del DNA, Traduzione e Modificazioni Post-traslazionali

Espressione dell’informazione genetica

L’espressione dell’informazione genetica contenuta nel DNA avviene in 2 fasi: la trascrizione del DNA in RNA e la traduzione o sintesi proteica.