Riassunto esame Genetica, prof. Cicchini, libro consigliato Principi di genetica, Snustad

DNAPrincipio trasformante – esperimento di Griffith

Griffith prese due ceppi di un batterio: il ceppo S non patogeno ed il ceppo R patogeno. Attraverso vari esperimenti di iniezione dei batteri in un topo scoprì che mescolando cellule R vive e cellule S morte, il topo moriva e nel suo corpo erano presenti batteri S vivi. Così scoprì che il materiale genetico poteva essere trasmesso. Ma da cosa è costituito il materiale genetico (il “principio trasformante”)? Estraendo e purificando diverse classi di molecole (RNA, proteine, DNA, lipidi, carboidrati) dal ceppo patogeno e mescolandole a cellule di ceppo R, Avery, MacLeod e McCarty scoprirono che era il DNA l’unico in grado di trasformare le cellule R in S, quindi era il principio trasformante.

Il DNA

Il DNA è il materiale genetico, che costituisce una raccolta di tutte le informazioni necessarie alla cellula o all’organismo per determinare le proprie funzioni e caratteristiche morfologiche. Appartiene alla classe degli acidi nucleici ed è formato da nucleotidi, ognuno composto da un gruppo fosfato, uno zucchero a 5 atomi di carbonio e una base azotata. Per il DNA lo zucchero è il desossiribosio (ribosio deossigenato al 2’). I nucleotidi del DNA si distinguono per la base azotata contenuta. Le basi azotate sono di due tipi: purine (2 anelli carboniosi) e pirimidine (1 anello carbonioso). Le purine sono Adenina e Guanina, le pirimidine Timina e Citosina. I nucleotidi sono uniti tramite legame fosfodiesterico, derivato dalla condensazione tra un OH del gruppo fosfato 5’ di un nucleotide ed il gruppo OH 3’ dello zucchero dell’altro nucleotide, con formazione di un legame estere.

Per la regola di Chargaff in un acido nucleico il numero di Adenine è sempre uguale al numero di Timine ed il numero di Guanine è sempre uguale al numero di Citosine. Inoltre, la somma di Adenine e Guanine (le purine) è uguale alla somma di Citosina e Timina (le pirimidine).

La scoperta della doppia elica

Il contributo fondamentale per la costruzione di un modello di DNA a doppia elica fu dato nel 1953 da James Watson e Francis Crick. Utilizzando le informazioni sulle proprietà chimico-fisiche del DNA già esistenti e grazie alla diffrazione a raggi X del DNA fatta da Franklin e Wilkins, intuirono la natura elicoidale della molecola. Introdussero il modello del DNA come una doppia elica con ogni giro di 10 pb, formata da due filamenti antiparalleli tenuti insieme dai legami idrogeno tra le basi azotate.

L’appaiamento tra le basi deve avvenire per forza tra una purina ed una pirimidina per una questione di dimensioni complementari; in questo modo si mantiene costante la distanza tra gli scheletri dei due filamenti. Inoltre proposero che l’Adenina si appaiasse solo con la Timina e la Citosina solo con la Guanina. Questo era stato già verificato sperimentalmente da Chargaff in quanto i membri delle coppie risultavano essere presenti nelle stesse quantità e fu confermato dal fatto che queste coppie permettono legami idrogeno perpendicolari allo scheletro della doppia elica; in particolare tra Adenina e Timina se ne instaurano 2, tra Citosina e Guanina 3.

L’organizzazione del genoma

Nei virus il genoma è compreso in RNA o DNA a singolo o doppio filamento, circolare o lineare. Nei procarioti è sotto forma di DNA circolare a doppio filamento. Negli eucarioti nel nucleo è DNA lineare a doppio filamento, negli organelli è DNA circolare a doppio filamento. Il DNA e diverse proteine istoniche (basiche) e non istoniche formano la cromatina, che si compatta a formare i cromosomi.

La cromatina si compatta in diversi livelli:

• Nucleosomi: formati da 8 molecole di istoni (4 coppie di H2A, H2B, H3 e H4) + DNA arrotolato intorno della lunghezza di 146 pb. La distanza tra nucleosomi è di circa 60 pb. L’istone H1 è legato esternamente.
• Solenoide: i nucleosomi si impacchettano a formare una fibra dello spessore di 30 nm. La struttura dipende dall’interazione tra gli istoni e il grado di compattazione di 40:1 (nella lunghezza occupata da un paio di basi nel DNA lineare, ce ne sono 40 nel DNA organizzato a solenoide).
• Il solenoide si ripiega ad anse grazie alle proteine non istoniche, formando una fibra dello spessore di 300 nm.
• La cromatina così compattata si dispone a formare cromosomi.

Un cromosoma è costituito da 2 bracci ed un centromero. In base alla posizione del centromero il cromosoma si dice telocentrico se il centromero corrisponde ad un’estremità e quindi c’è solo un braccio, acrocentrico se il centromero è in posizione asimmetrica rispetto ai bracci, metacentrico se si trova al centro e i bracci hanno lunghezza uguale.

Per identificare un’area di un cromosoma si indica:

• Numero del cromosoma (es. 1)
• Braccio (braccio corto p e braccio lungo q)
• Regione del braccio (es. 2)
• Banda della regione (es. 4)

Il cariotipo è l’assetto cromosomico completo di un organismo eucariotico. Si studia con il cariogramma, risultato elaborato da un computer dell’ibridazione in situ con sonde marcate fluorescenti. Esponendo il vetrino a diverse lunghezze d’onda, il computer genera il cariogramma.

Replicazione del DNA

Dimostrazione della semiconservatività

Per i procarioti Meselson e Stahl usarono E.Coli. Aumentarono la densità del DNA usando l’isotopo pesante 15 N e studiarono i cambiamenti di densità dopo la replicazione utilizzando il metodo di centrifugazione in gradiente di densità. Scoprirono che ciascuna molecola di DNA figlia era costituita da una catena pesante ed una leggera. Per gli eucarioti Taylor, Woods e Huges usarono vicia faba (fava). Marcarono i cromosomi facendoli duplicare in terreno contenente 3H-timidina radioattiva. Li trasferirono poi in terreno contenente colchicina, che blocca i microtubuli arrestando la cellula in metafase ed impedendole quindi di dividersi. Ad ogni ciclo raddoppia quindi il numero di cromosomi nel nucleo. Facendo una prima autoradiografia in seguito alla duplicazione in terreno marcato ed una seconda in seguito a duplicazione in terreno non marcato, videro che nel primo caso entrambi i cromatidi della coppia erano marcati, nel secondo caso un solo cromatidio per coppia.

Il processo di replicazione secondo Kornberg

• La DNA polimerasi catalizza l’aggiunta di nucleotidi trifosfati al 3’ OH libero di un filamento di DNA.
• La polimerizzazione procede in direzione 5’-3’.
• L’appaiamento delle basi guida la formazione del nuovo filamento (cioè il filamento originale fa da stampo).
• L’energia necessaria per la formazione del legame fosfodiesterico è fornita dal rilascio del gruppo pirofosfato.

La replicazione nei procarioti

Nei procarioti il DNA è circolare, quindi la sintesi dei filamenti procede bidirezionalmente a partire da un’origine di replicazione ORI con la formazione di due forcelle che si muovono in direzioni opposte; si forma quindi la bolla di replicazione. In corrispondenza di ciascuna delle due forcelle avviene la sintesi di entrambi i filamenti: uno (leading) sintetizzato normalmente in direzione 5’-3’ e l’altro (lagging) sintetizzato tramite frammenti di Okazaki.

In E.Coli la sequenza di origine si chiama OriC e comprende 4 ripetizioni di 9 paia di basi (9 mer) e 3 ripetizioni di 13 paia di basi (13 mer). La sequenza di origine viene legata dal complesso d’inizio.

Problema 1: Separazione dei filamenti

Le DNA polimerasi non sono capaci di rompere i legami idrogeno per separare i filamenti della doppia elica. In E.Coli gruppi di proteine DnaA si legano all’ORI, in particolare alle sequenze ripetute 9 mer, raggruppandosi a formare un nucleo intorno cui è avvolto il Dna. Iniziano la separazione dei due filamenti dalle sequenze ripetute 13 mer (ricche di A-T, quindi facilmente separabili). Una volta indotta la separazione iniziale, i filamenti vengono aperti nel corso della sintesi da esameri di DnaB (elicasi). La parte di filamento già separata, ma non ancora duplicata, è ricoperta da proteine SSB. Sia la DnaA che la DnaB sfruttano energia derivante dall’idrolisi di ATP.

Problema 2: Inizio del nuovo filamento

• Le primasi (RNA polimerasi) sintetizzano primer di RNA sul filamento ritardato.
• La DNA polimerasi responsabile della sintesi (in E.Coli la Dna pol III) utilizza questi inneschi per allungare il filamento e creare il frammento di Okazaki.
• Una molecola con attività esonucleasica 5’-3’ (Dna pol I in E.Coli) elimina il primer e lo sostituisce con un frammento di DNA utilizzando come innesco l’estremità 3' del filamento successivo.
• Le ligasi uniscono i frammenti.

Il complesso formato da elicasi e primasi è chiamato primosoma ed interviene nell’inizio di ciascun frammento di Okazaki.

DNA polimerasi nei procarioti

• Dna polimerasi I – attività esonucleasica 5’-3’ e polimerasica 5’-3’: rimuove i primers di RNA e riempie i gaps.
• Dna polimerasi II – attività esonucleasica 3’-5’ e polimerasica 5’-3’: riempie le interruzioni dovute a danni strutturali; si occupa quindi del proofreading.
• Dna polimerasi III – è la vera responsabile della replicazione. È un enzima multimerico formato da:
• Nucleo catalitico (polimerasi core) composto dalle subunità α, ε, θ; α ha la funzione di sintesi, ε di proofreading e θ è un fattore di assemblaggio.
• Subunità τ serve per la dimerizzazione della polimerasi, che ne aumenta la produttività.
• Subunità β è la proteina che serve per l’ancoraggio della polimerasi al Dna. Mantiene la polimerasi core in prossimità dell’estremità 3’ del filamento crescente.
• Complesso γ, β – costituito da varie subunità, ha funzione di caricare la pinza sul Dna. È molto importante nel filamento lento, dove è richiesto un continuo riposizionamento.
• Due polimerasi core legate dalla subunità τ catalizzano contemporaneamente la polimerizzazione del filamento leading e di quello lagging. Sul filamento lagging si formano anse nella parte legata a proteine SSB per permettere alle polimerasi di rimanere unite.

Ruolo della Dna girasi e topoisomerasi

La Dna girasi è una topoisomerasi di tipo II. Le topoisomerasi sono enzimi che partecipano alla replicazione scaricando lo stress topologico dovuto al superavvolgimento del DNA. Esistono due tipi di topoisomerasi:

• Le topoisomerasi di tipo I incidono un solo filamento, facendo passare quello intatto attraverso la rottura e saldando nuovamente quello inciso.
• Le topoisomerasi di tipo II rompono entrambi i filamenti, formando una lacuna in cui passa un intero segmento di elica. Di queste fa parte la dna girasi.

Nei procarioti la replicazione ha termine in corrispondenza del sito di terminazione ter.

Replicazione negli eucarioti

Inizi di replicazione chiamati ARS (sequenze replicanti autonomamente) multipli. Si formano quindi più repliconi ed il loro numero è variabile: ad esempio durante l’embriogenesi è più alto per permettere di velocizzare il processo di replicazione. Ogni origine è attiva in momenti diversi della replicazione: si parla di asincronia dell’attività replicativa nei vari punti del genoma. Le proteine usate per lo svolgimento sono:

• Topoisomerasi
• Elicasi (Rp-A), che mantiene i singoli filamenti allungati.
• Proteina di replicazione A

Le polimerasi eucariotiche

• Polimerasi α: forma un complesso stabile con la primasi, allungando gli inneschi di RNA fino alla lunghezza di circa 30 nucleotidi.
• Polimerasi δ: è la polimerasi che catalizza l’allungamento, iniziando dalle catene sintetizzate dalla pol α. Per attivarsi deve interagire con la proteina PCNA (che la fa scorrere lungo la molecola, facendo da pinza), che a sua volta è caricata sul Dna grazie a cambiamenti conformazionali dovuti all’interazione con RFC (fattore di replicazione C), il caricatore della pinza.
• Polimerasi ε: partecipa al lavoro della pol δ.
• Altre polimerasi (13 in totale), con ruoli non ben chiari.

La rimozione degli inneschi di RNA è a carico di ribonucleasi H1 e FEN-1 (le polimerasi non hanno attività esonucleasica 5’-3’). Negli eucarioti, un altro fattore è la presenza di istoni, che devono essere aggiunti ai filamenti figli.

• Nap-1 (fattore di assemblaggio della cromatina) trasporta gli istoni dai sito di sintesi al nucleo
• CAF-1 trasporta gli istoni ai siti di replicazione legandosi alla PCNA

Riparazione del DNA

In E.Coli la frequenza di errore è di 1 ogni 10⁷ pb. Gli errori possono essere facilmente individuabili perché uno scorretto appaiamento tra basi azotate altera la struttura del DNA. Gli appaiamenti sbagliati possono essere riaggiustati dalla polimerasi prima dell’aggiunta del nucleotide successivo in quanto non può polimerizzare a partire da un nucleotide non appaiato. La subunità ε della polimerasi III di E.coli ha attività esonucleolitica 3’-5’ e può accorgersi dell’errore perché la parte di filamento male appaiata ha facilità a staccarsi e ad incontrare la subunità stessa.

La replicazione delle estremità dei cromosomi

I telomeri sono brevi sequenze ripetute che formano l’estremità di un cromosoma. Questi danno stabilità al cromosoma, evitando che interagisca con altri. Il primer iniziale del filamento leading e quello finale del filamento lagging non possono essere sostituiti dalla DNA polimerasi perché la loro estremità libera è la 5’. La telomerasi è un enzima contenente una componente di RNA detta TERC (componente di RNA della telomerasi), ricca in A e C e perfettamente complementare ai telomeri, ed una trascrittasi inversa detta TERT (trascrittasi inversa della telomerasi), che trascrive l’RNA contenuto nel sito TERC.

Meccanismo di allungamento dei telomeri

• Fase di sintesi: sintetizza le sequenze telomeriche utilizzando come innesco l’estremità 3’ dell’altro filamento e come stampo l’RNA contenuto nella molecola stessa.
• Fase di traslocazione: dopo aver sintetizzato una sequenza abbastanza lunga, la telomerasi si stacca dal filamento. Questo si ripiega a formare una piccola forcella terminale per interazioni tra residui di guanina. A questo punto si è creato un innesco per la DNA polimerasi (α o δ), che colma la lacuna tra l’estremità della forcella e l’estremità 5’ del filamento a cui era stato rimosso il primer, utilizzando come stampo l’altra parte del filamento. La ligasi salda i pezzi di filamento.

Nell’uomo la maggior parte delle cellule somatiche manca di attività telomerasica o ce l’ha molto bassa, per cui la cellula ha una “scadenza”: man mano che perde frammenti terminali del cromosoma, invecchia. Le cellule a proliferazione continua, come quelle delle gonadi maschili e quelle embrionali, hanno alta attività telomerasica. Anche nelle cellule tumorali la telomerasi è espressa ad alti livelli.

La trascrizione del DNA

Dogma centrale

DNA → mRNA → proteina

Cos’è un gene? È un segmento di DNA che contiene l’informazione necessaria per la sintesi di uno specifico polipeptide.

Nei procarioti la sintesi di una proteina avviene tramite trascrizione del DNA e successiva traduzione dell’RNA. Il tutto avviene nel citoplasma. Negli eucarioti l’espressione segue più fasi:

• Nel nucleo: trascrizione del DNA, maturazione del trascritto primario (splicing e poliadenilazione), trasporto attraverso l’involucro nucleare.
• Nel citoplasma: traduzione, maturazione della proteina

Ognuna di queste fasi prevede un controllo per regolare la qualità e la quantità di proteina sintetizzata.

Gli RNA

Gli RNA sono molecole a singolo filamento.

• Codificanti (4%):
• mRNA – vengono tradotti per la sintesi di proteine.
• Non codificanti (96%):
• rRNA – RNA ribosomiali. Hanno funzione strutturale e vengono sintetizzati nel nucleolo.
• tRNA – RNA transfer. Funzione di trasporto degli aminoacidi.
• snRNA – piccoli RNA nucleari. Servono per lo splicing dell’mRNA.
• snoRNA – piccoli RNA nucleolari. Servono per modificazione dell’mRNA.
• Small non coding RNA:
• miRNA – micro RNA. Regolazione post trascrizionale di molti geni.
• siRNA – small interfering RNA. Determinano la degradazione di RNA complementari.
• piRNA – piwi-interacting RNA. Controllo di trasposoni (elementi genetici capaci di spostarsi all’interno del genoma) nella linea germinale degli animali.
• natsiRNA – natural antisense transcript derived siRNA. Regolazione post-trascrizionale (sono siRNA, quindi degradazione) durante stress.
• tasiRNA – trans-acting siRNA regolazione post-trascrizionale nelle piante.
• Long non coding RNA:
• XIST – inattiva il cromosoma X

Trascrizione

Per la trascrizione è necessario che una proteina riconosca una specifica sequenza. Questa interazione avviene nel solco maggiore, che permette un buon accesso alla proteina e una buona specificità nella formazione di legami idrogeno tra il bordo delle coppie di basi e le catene laterali della proteina.