Riassunto esame Genetica, Genetica. Un approccio molecolare Russell, prof. Cicchini

REPLISOMA.

Replicazione a cerchio rotante Replicazione che si osserva in batteriofagi che mostrano un DNA a doppia elica circolare. Il DNA circolare è inciso in un punto

e i filamenti vengono separati: il filamento che mostrerà libera l’estremità 5’ verrà separato dal circolo tra proteine SBB mentre il DNA che espone il filamento 3’

fungerà da primer per la replicazione che procederà in quella direzione causando uno “slittamento” del filamento parentale (retrocede la parte che espone 3’ e si

allunga la lingua 5’ tenuta separata dalle SBB). Dato che la DNA pol lavora SOLO in direzione 5’3’ la replicazione sar à discontinua: ogni slittamento del

filamento parentale precederà la sintesi di un nuovo pezzo. Dato la continuità del cromosoma circolare la sintesi della replicazione può formare molecole molto

lunghe tra loro, unite testa­coda, a formare un concatamero (come quelle che andranno a costituire la progenie fagica che si sviluppa dopo l’infezione di un

batterio da parte del batteriofago).

Replicazione negli eucarioti

Replicazione simile a quella sopra descritta di E. coli, soltanto che, a causa della complessità e delle dimensioni dei cromosomi eucariotici, sono presenti

diverse origini di replicazione che si aprono e si “raggiungono” aprendosi via via che la replicazione avanza. Negli eucarioti si nomina replicone il DNA compreso

tra un’origine di replicazione e la forca di replicazione che va aprendosi. Mentre E. coli conta di un replicone unico mentre il genoma degli eucarioti conta

numerosi repliconi più corti che, per di più, iniziano la replicazione in tempi diversi.

Negli eucarioti l’origine di replicazione si trova in brevi sequenze di nucleotidi note come sequenze autonome di replicazione (ARS) a cui si legano le ORC

(complesso di riconoscimento dell’origine) che si lega in diverse zone di ARS e recluta altre proteine coinvolte nella replicazione che però non consentono l’inizio

della replicazione e quindi formano un complesso prereplicativo che non replica fintanto che la fase S del ciclo cellulare non inizia: la fase S inizia con la proteina

licesing factor che arriva all’ORC prereplicativo e induce il legame di elicasi e altre proteine coinvolte nella replicazione (licesing factors poi viene degradata).

Il numero di enzimi coinvolti nella replicazione per quanto riguarda gli eucarioti è molto vasto.

Replicazione dei telomeri Il filamenti parentali presentano primer a RNA ai telomeri che, vengono rimossi dalla pol I, ma non riescono ad essere sostituiti da

un filamento di DNA stampo perché manca una “base” 3’ cui appoggiarsi per iniziare la sintesi del filamento. Per tale motivo esistono le telomerasi, enzimi

composti da RNA e proteine, che si ancorano all’estremità 5’ sporgente (quella parentale cui è stato tolto il primer) e, grazie alle sue 11 basi di RNA, si sposta in

direzione opposta al filamento stampo e sintetizza l’allungamento del filamento parentale scoperto: in questo modo, quando il nuovo filamento si replicherà, vi

sarà un sufficiente allungamento del telomero da non permettere un accorciamento dello stesso ad ogni replicazione.

Dato che la telomerasi con RNA permette la sintesi di DNA è detta trascrittasi inversa.

I filamenti di DNA sono inizialmente associati alle proteine istoniche che, si dissociano prima della fase S e poi vengono duplicati: nel momento in cui tornano nel

filamento suddividono lo spostamento (eseguito da chaperonine istoniche) in tetramero di H3/H4 e dimero H2A e H2B che si mescolano per formare nucleosomi

nuovi, mezzi nuovi o parentali.

Relazione geni­enzimi

Nel 1902 Garrod intuì la relazione che intercorre tra geni ed enzimi studiando l’Alcaptonuria, errore congenito del metabolismo (malattia con urine scure e artrite

in tarda età): capì che la malattia derivava dall’accumulo di acido omogentisico (HA) nella via di produzione del maleilacetoacetico a causa di omozigosi

recessiva che impedisce la produzione di un enzima.

Beadle e Tantum proposero la teoria che i geni sono collegati agli enzimi facendo esperimento sulla muffa del pane (fungo miceliale si riproduce per spore che

formano una rete intrecciata). La Neurospora è capace di svilupparsi (sessualmente o asessualmente) in terreni minimi che contengono solo sali inorganici, C

organico e vitamina biotina perché sono in grado di sintetizzare da sé vitamine e amminoacidi necessari alla sopravvivenza: con mutageni (sostanze che

causano mutazioni) crearono ceppi auxotrofi della Neurospora incapace di sintetizzare un aminoacido o una vitamina in particolare e quindi incapaci di crescere

nel terreno minimo, inserirono il ceppo auxotrofo in un terreno di coltura con terreno minimo + un aminoacido/vitamina specifica e videro che le spore si

sviluppavano solo se nel terreno di coltura era presente l’aa che non erano in grado di sintetizzare.

Ipotesi un gene – un enzima Tramite la dissezione genetica di una via biochimica è stato scoperto che un gene codifica per un enzima (ad oggi sappiamo che

un gene codifica per una catena polipeptidica e un enzima può essere costituito da più catene polipeptidiche). L’esperimento consistette nel mettere in un

terreno di coltura un prodotto della via metabolica per vedere se le spore crescevano in modo da correlare l’enzima ad un preciso prodotto metabolico. Se veniva

messo l’enzima finale tutte le spore crescevano; si è osservato che se manca un enzima a monte della via metabolica basta uno qualsiasi dei successori della

vita metabolica (ci sono i geni che codificano gli enzimi) per arrivare a codificare il prodotto finale, se, invece, veniva eliminato un enzima che codificava per un

prodotto a valle della via metabolica anche se erano presenti tutti i prodotti prima dell’ultimo passaggio questo passaggio non poteva avvenire (per mancanza

dell’apposito enzima) e pertanto la spora non riusciva a crescere (cioè meglio errore nella codifica enzimatica a monte piuttosto che a valle).

Deficienze enzimatiche a causa di geni nell’uomo:

• Fenilchetonuria: Nel cromosoma 12q24.1 (12 – n° del cromosoma/ q­ braccio lungo/24 – regione/1 – subregione) nel gene che codifica per la

fenilalanina idrossilasi. Senza questo enzima la fenilalanina non viene trasformata in tirosina; una piccola quantità di fenilalanina è necessaria per la

sintesi proteica. Gli individui affetti da PKU mostrano accumulo di fenilalanina che porta alla produzione di acido fenilpiruvico che danneggia le cellule

nervose pertanto questi soggetti devono seguire una dieta rigorosa che porti solo piccole quantità di fenilalanina (nell’aspartamente, dipeptide, c’è

fenilalanina). La malattia è pleiotropica, produce vari effetti e può limitarsi alla mancanza di tirosina (che si può prendere con la dieta) o a ritardi

mentali a causa dell’accumulo di acido fenilpiruvico.

Nei bambini si controlla la presenza di PKU mettendo una goccia di sangue su un terreno di coltura dove la b­2­tienilalanina, solitamente, inibisce la

crescita del batterio Bacillus subtilis: se nel sangue c’è accumulo di fenilalanina la tienilalanina non inibisce il batterio che dunque cresce.

• Albinismo: Mutazione autosomica recessiva per un gene che codifica per la tirosinasi che trasforma la tirosina in DOPA dalla quale deriva la

melanina. Senza l’enzima non si ha melanina. Dato che la via biosintetica è lunga se due genitori omozigoti per due enzimi diversi della via generano

figli può esserci un figlio normale eterozigote.

• Sindrome di Kartagener: Mutazione dei geni che codificano per la dineina (la proteina motrice dei microtubuli). I pazienti mostrano frequenti infezioni

ai seni paranasali e ai polmoni perché i mcirotubuli non rimuovono bene i batteri dalle vie respiratorie; mostrano sterilità perché oociti e spermatozoi

non si possono spostare e a volte destricardia (cuore a destra) perché nello sviluppo embrionale i microtubuli girando in senso orario a livello del

nodo causano un flusso che divide i vari tessuti a dx e sinistra: senza questo movimento i nodi si spostano casualmente a dx o sx.

• Malattia di Tay­Sachs: Causata da una mutazione di un gene su 12q23­q24 che codifica per un enzima lisosomiale (che degrada qualche

componente all’interno del lisosoma) e precisamente il gene HAXA che codifica per l’enzima N­esosamminidasi che elimina la parte N­terminale

dell’acetilgalattosammina che si trova nei gangliosidi cerebrali. Senza questo enzima i gangliosidi si accumulano sulle membrane dei neuroni e a due

anni di età portano a paralisi, problemi dell’alimentazione, deficienza, cecità e perdita dell’udito sino a morte entro i 3­4 anni. La diagnosi può essere

precoce per un punto color ciliega circondato da un anello bianco nella retina.

Dato che i geni codificano anche per proteine non enzimatiche, tra l’altro presenti in misura maggiore rispetto agli enzimi, mutazioni di alcuni geni possono

portare ad avere proteine con struttura mutata e quindi, difettose. Sono state oggetto di studio le varie mutazioni a carico dell’emoglobina, la proteina che

trasporta l’ossigeno grazie all’associazione di ogni catena di polipeptidi con il gruppo Eme:

 Anemia falciforme: Omozigosi recessiva per un gene che porta l’emoglobina ad assumere una forma a falce (e non ovoidale come l’Hb normale) che

non riesce a trasportare bene ossigeno nei tessuti, causa una morte precoce della cellula e, a causa della forma, sedimenta nei capillari bloccando il

circolo. Gli individui eterozigoti sono portatori.

Esperimenti con l’elettroforesi hanno paragonato Hb­A (normale) con Hb­S (anemia falciforme) e hanno visto che Hb­S migra più lentamente rispetto

ad Hb­A verso il polo negativo. L’Hb è costituita da 4 catene di polipeptidi (due globine e due ) e nell’Hb­S una delle due catene presenta una

α β β

Valina nell’N­terminale; idrofobica senza carica) rispetto all’acido glutammico (idrofilico, carica negativa) e questo determina una struttura diversa

dell’Hb­S che precipita e causa la forma a falce dell’eritocitra.

 Fibrosi cistica: Mutazione del gene in posizione 7q31.2­q31.3 che causa l’accumularsi di muco denso e vischioso nei polmoni e problemi a pancreas

e digestione in giovani e adulti. Si prova ad espellere il muco per percussioni toraciche e a prevenire infezioni batteriche con antibiotici. I pazienti con

fibrosi cistica presentano ∆F508 (delezione, mancano 3 coppie di basi, fenilalanina in posizione 508). Il gene codifica per la proteina CFTR (trasporto

transmembrana della fibrosi cistica) che, se mutata, ha una conformazione variata e, dato che solitamente è un canale ionico per il cloro, causa una

variazione nel trasporto ionico.

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