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caricato si dice fMet.tRNA.fMet (tRNA con codone per f.metionina legato a f.metionina).

Il tRNA viene quindi portato alla subunità minore (30S – misure della velocità di sedimentazione) con una molecola di GTP e si situa nel sito P del ribosoma

(quello centrale) grazie al IF­2, formano il complesso di inizio 30S, in seguito si aggiunge la subunità maggiore (50S) che causa l’idrolisi di GTP e allontana i

fattori di inizio creano il complesso di inizio 70S.

Inizio negli eucarioti Ci sono diversi fattori di inizio della trascrizione, la metionina non è legata al gruppo formico e non c’è sequenza di Shine­Dalgarno. Per il

riconoscimento di AUG diversi IF eucariotici (IFe) trovano la cap binding protein, ovvero il cappuccio all’estremità 5’ e a partire da questo, con il modello a

scansione, cercano AUG che è inserito in una sequenza particolare nota come “sequenza di Kozak”. Trovata AUG si lega alla subunità minore anche la subunità

maggiore e si tolgono gli IFe. La coda poli(A) terminale viene portata in prossimità del cappuccio e stimola l’inizio della traduzione.

Allungamento (sia procarioti che eucarioti) All’inizio il tRNA con fMet è legato ad AUG dell’mRNA tramite legami idrogeno nel sito P e nel sito A (quello alla dx

di P) si trova il II codone. Il tRNA legato all’aa appropriato viene portato alla subunità A grazie a fattori di allungamento (EF) legati a GTP che viene poi

idrolizzato nel momento in cui il tRNA trova posto nella subunità A. A questo punto si trovano due tRNA legati ai rispettivi aa nella subunità P e in quella A: un

primo momento vede la rottura del legame tra tRNA e il suo aa nel sito P e in un secondo momento si forma il legame peptidico (grazie alla peptidil transferasi

situata in un rRNA della subunità maggiore che è un ribozima, sia RNA sia enzima) tra l’aa nel sito P e quello nel sito A (e rimane il legame idrogeno tra il tRNA

nel sito A e il suo aa ancorato anche all’aa che lo precede).

L’ultima fase prevede la traslocazione, ovvero lo scorrimento del ribosoma lungo l’mRNA per un codone: lo spostamento è dovuto a fattori di allungamento e a

GTP che viene idrolizzato. Il tRNA scarico (quello in P che ha perso l’aa) si sposta nella subunità E perché così stabilizza la permanenza dei rispetti tRNA

ancora coinvolti nella sintesi in A e in P; quando il legame peptidico tra due nuovi aa è terminato il tRNA in E si sposta ed esce dal ribosoma.

* Caratteristica importante della traduzione è che l’mRNA uscente dal ribosoma si lega un altro ribosoma (formano il poliribosoma) che ricomincia da capo la

sintesi proteica per accelerare la produzione di composti finiti.

Fine della traduzione Quando arriva un codone di stop non esiste un tRNA con aa associato al codone terminale e questo permette a fattori di rilascio (RF) di

inserirsi nella subunità A (sono simili, per struttura al tRNA) e inducono al peptidil transferasi a rompere l’ultimo legame tra tRNA (in P) e il suo aa che ha

terminato la catena di polipeptidi. Il ribosoma si separa perché un fattore di riciclaggio (RRF) si associa alla subunità A, il fattore di allungamento sposta il

ribosoma di 3 basi, il tRNA si sposta in E e l’RRF induce la separazione delle 2 subunità che vengono, poi, riciclate (negli eucarioti funziona uguale ma non

esiste un fattore RRF)

Mutazione, riparazione del DNA ed elementi trasponibili

Mutazione

Attraverso alcuni esperimenti si trovò che le mutazioni causali sono i principali fenomeni alla base della variabilità genetica mentre venne screditata la

precedente teoria dell’adattamento per il quale gli organismi si “adattano” a qualche evento ambientale.

Le mutazioni sono variazioni di una o poche basi all’interno del genoma di una cellula mutante: possono essere mutazioni somatiche, non trasmesse ai figli, o

mutazioni della linea germinale. Per valutare l’incidenza della malattia si calcolano il tasso di mutazioni, probabilità di una mutazione in funzione del tempo, o la

frequenza di mutazione, numero attuale di casi di un tipo di mutazione nella popolazione.

Tipi di mutazione

 Mutazioni per sostituzione (viene sostituita una coppia di basi con un'altra coppia di basi). La mutazione può essere di transizione (coppia purina­

pirimidina è sostituita con purina­pirimidina) o mutazione per transversione (purina­pirimidina sostituita da pirimidina purina).

o Mutazioni missenso – Una coppia di basi cambia e porta alla presenza di un altro aa nella proteina

o Mutazioni non senso – Una coppia di basi cambia e trasforma un codone per un aa in un codone di stop creando una proteina tronca

o Mutazione neutra – Sostituzione di un aa con un altro aa con caratteristiche simili (tipo particolare di mutazioni missenso che non causa

gravi danni)

o Mutazioni silenti – Cambia una coppia, solitamente nella terza parte del codone, ma, a causa del fenomeno della degenerazione del

codice genetico, l’aa sintetizzato è lo stesso.

• Mutazioni per inserzione o delezioni di basi, mutazioni frameshift, che cambiano il codice genetico di lettura, cambiano tutto il codice genetico dalla

mutazione in avanti.

• Mutazioni in avanti – Che portano il fenotipo da selvatico a mutante

• Mutazioni per reversione – Che, lavorando su una prima mutazione, portano il DNA dal tipo mutante al tipo selvatico. Può accadere nel caso della

mutazione non senso, dove c’è un codone di stop al posto di un codone normale e una mutazione può ripristinare, nuovamente, la sintesi di un aa

(se diverso – reversione parziale; se uguale all’originale – vera reversione).

• Mutazioni di tipo soppressore – Una mutazione avviene nello stesso gene (ma in una coppia di basi diverse) o in un altro gene e ripristina la funzione

deleta da una precedente mutazione. Nel caso di mutazioni intrageniche varia una base a monte del gene mutato o nello stesso gene, mentre, per

mutazioni intergeniche (geni soppressori) un altro gene che codifica per tRNA, rispetto a quello mutato, va incontro a mutazione e sintetizza un tRNA

con un anticodone che legge la mutazione del primo gene mutato in modo diverso (es. mutazione non senso – gene soppressore mutato crea tRNA

che al posto di leggere un codone di stop, leggono un codone per qualche aa).

• Mutazioni spontanee – Mutazioni che incorrono spontaneamente nel corso della replicazione o in altri momenti del ciclo cellulare. L’appaiamento di

basi errato può avvenire perché le basi, soggetto al fenomeno della tautomeria cheto­enolica, possono esistere nella forma chetonica (normale) o

enolica (rara): nel caso la base sia enolica è facile che l’appaiamento di basi sia sbagliato. Le mutazioni per delezione o inserzione possono avvenire

anche in fase di replicazione per errori della DNA pol.

• Mutazioni per depurinazione – Dato che il legame covalente tra una purina e il deossiribosio è meno stabile che tra deossiribosio e pirimidina, esso si

può dissociare e creare un sito apurinico, che, quando sarà letto dalla DNA pol causerà la dissociazione di questa dalla doppia elica.

• Mutazioni per deamminazione – La deamminazione (rimozione del gruppo amminico) da una base può variare il tipo di base letto dall DNA pol: una

deamminazione della citosina la trasforma in uracile (e la DNA pol lega quindi A al posto di G) o, al deamminazione della base (poco presente) 5­

metil­citosina la trasforma in T. Le mutazioni di 5mC sono molto frequenti e per tale motivo il punto dove si collocano le 5mC sono detti punti caldi

mutazionali.

• Mutazioni per radiazioni:

o UV: modificano l’energia chimica di alcune molecole che si associano parallelamente tra loro come nel caso dei dimeri di timina (adiacenti

nel filamento) che non si legano più all’A.

o Le radiazioni ionizzanti causano ioni e permettono di rompere legami chimici anche tra molecole dell’ossatura zucchero­fosfato. Possono

causare modifiche complesse nel DNA dell’uomo e sono usate in radioterapia contro alcune forme di cancro. Vi è un rapporto lineare tra

n° di radiazioni e mutazioni. Un tipo di radiazioni ionizzanti frequenti si trova nel radon, derivato per decadimento dall’uranio, che a sua

volta decade producendo radiazioni ionizzanti.

• Mutageni chimici ­ Sostanze naturali o chimiche che inducono mutazioni nel genoma.

o Analoghi delle basi – Basi molto simili alle basi del DNA che si appaiano al posto della base corretta al filamento stampo. Il 5 bromouracile

si lega al posto della timina ed è soggetto al fenomeno della tautomeria chetoenolica e a seconda che sia presente in forma chetonica o

enolica si appaia a sua volta a G o ad A. Esistono tanti analoghi delle basi e non tutti fanno tautomeria chetoenolica.

o Agenti che modificano le basi – Sostanze che modificano le basi per deamminazione (come fa HNO con C, A e G), idrossilazione

2

(NH OH che idrossilando la citosina la fa appaiare con A) o metilazione (che fanno appaiare G metilata con T)

2

o Agenti intercalanti – Agenti chimici che si inseriscono nel f. parentale o in quello figlio e, intercalandosi tra le basi causano mutazioni o

delezioni: se l’agente si inserisce nel f. parentale quando la DNA pol arriva in corrispondenza dell’agente vi appaierà una copia casuale.

Mentre le mutazioni avvengono causalmente in una zona o l’altra del nucleo, in laboratorio, recentemente, si è riusciti a scegliere quale parte del DNA mutare

con la mutazione sito­specifica. Gli agenti mutageni sono sostanze che riescono a entrare nella cellula e ad arrivare direttamente a modificare il DNA e sono

poche in natura: tuttavia, elementi naturali vengono ingeriti o inalati e, quando vengono processati dal metabolismo, diventano agenti mutageni quando prima

non lo erano (benzopirene, idrocarburo policiclico nella sigaretta, viene processato e diventa mutageno e carcinogeno).

Test di Ames: Test che valuta la possibilità che una sostanza sia mutagena. In questa valutazione vengono coltivati in una piastra batteri auxotrofi (cioè incapaci

di crescere nel terreno minimo di coltura) per qualche sostanza. Nella piastra viene inserito, al centro, un dischetto con una sostanza da valutare e, dopo un

giorno, si valuta se i batteri in prossimità del dischetto imbevuto di sostanza, sono diventati revertanti (ovvero hanno acquistato la capacità di crescere anche nel

terreno minimo) a causa di mutazioni indotte dalla sostanza. Il test è positivo se in prossimità del dischetto ci sono tanti batteri revertanti. Il test di Ames è

sensibile anche alle concentrazioni di sostanza nel dischetto.

Rilevazione delle mutazioni: Facile se la mutazione è dominante o se l’organismo è aploide. Le mutazioni si possono identificare se la mutazione è visibile

(produce modifica visibile del fenotipo), si può valutare se un mutante è un auxotrofo con il test della “semina in replica”, si valuta anche il ruolo di alcuni geni in

mutanti termosensibili (ovvero il gene mutato viene espresso ad alcune temperature ma non ad altre) ed infine il ruolo di mutanti resistenti (la cui mutazione ha

garantito la resistenza ad un fattore ambientale).

* Semina in replica – Si fa crescere un organismo mutato (alcuni normali e altri auxotrofi) in un terreno minimo + la sostanza necessaria allo sviluppo. Si preme

con del velluto sulla piastra per avere la stessa disposizione degli organismi e si depone il velluto su un altro terreno minimo + sostanza non sintetizzata (per

avere la copia originale) e su un terreno minimo senza nient’altro nel quale si svilupperanno solo le colonie non auxotrofe e, con il confronto con l’altra piastra si

localizza quale è la sostanza auxotrofa.

Riparazione del DNA

La cellula possiede sistemi di riparazione del DNA per far fronte a errori nel lavoro della DNA pol o di mutageni. La DNA pol stessa, nella subunità ha attività

ε

esonucleasica in direzione 3’­5’ per riparare eventuali errori di appaiamento. La cellula ha anche diversi altri modi di riparare a mutazioni del DNA:

• Fotoriattivazione: L’enzima fotoliasi, catturando un fotone, espone i dimeri di timina a lunghezze d’onda specifiche che rompono il dimero e ricreano la

timina originale.

• Riparazione di alchilazione: Enzimi specifici rimuovono i gruppi alchilici apposti su delle basi dagli agenti alchilanti.

Un secondo modo di riparazione dei danni derivati da mutazioni, che solitamente si trovano solo su un filamento, è quello di scindere la porzione di DNA

danneggiato e utilizzare il filamento “buono” per risintetizzare correttamente il DNA.

 Riparazione per escissione di basi: Una glicosilasi elimina la base dallo zucchero e altri enzimi tagliano lo zucchero senza base a livello dell’ossatura

zucchero­fosfato. Interviene, quindi, una DNA pol che rimette una base nel posto dove sono state eliminate le basi, e poi la ligasi unirà il pezzo

appena sintetizzato.

 Riparazione per escissione di nucleotidi: Un complesso proteico si sposta lungo il filamento che contiene dimeri e trova la parte danneggiata

eseguendo due taglia a monte e a valle del dimero legato e quindi alterato. Un'altra proteina svolge l’elica di DNA e il pezzo tagliato viene escisso

dalla elica e sarà una DNA pol I a risintetizzare le basi nuove sulla base dell’altro filamento.

 Riparazione degli errori di appaiamento diretta dalla metilazione: Nei batteri il filamento neosintetizzato è distinto da quello parentale perché in una

sequenza complementare tra i due filamenti di GATC, la A del f. parentale è metilata e quella del filamento neosintetizzato non lo è. L’errore si trova

nel filamento nuovo ma il complesso proteico necessita di sapere quale è il filamento nuovo: per fare questo si lega ad altre proteine che avvicinano il

luogo dell’errore al GACT con A non metilata e, una volta, riconosciuto quale è il filamento neosintetizzato, un’esonucleasi rimuove il f. neosintetizzato

e la DNA pol rimette le basi corrette.

 Sintesi translesionale del DNA: grazie alla risposta SOS vengono sintetizzati dei geni che riparano danni gravi del DNA che impedirebbero la

replicazione dello stesso. In condizioni normali la proteina LexA blocca 17 geni che sintetizzerebbero geni riparatori del DNA, quando insorgono

condizioni critiche RecA causa l’autodemolizione di LexA e i 17 geni vengono espressi per riparare il DNA, come la DNA pol che riesce a sintetizzare

anche oltre le lesioni (anche se questo induce l’aggiunta di basi e causa mutazioni frameshift – comunque meno gravi della non replicazione).

Elementi trasponibili

Sono elementi del DNA capaci di spostarsi da una regione all’altra dello stesso cromosoma (in batteri ed eucarioti) o di cromosomi diversi (negli eucarioti).

Esistono diversi tipi di elementi trasponibili e possono causare inserzioni mutageniche o andare a influenzare la trascrizione perché si sposta in parti del

genoma che codificano per proteine di regolazione genica. La frequenza di spostamento di questi elementi è molto bassa.

Elementi trasponibili nei batteri – Esistono diversi elementi trasponibili.

IS Il pi ù comune è la sequenza di inserizione (IS), sequenze con geni unici, con lunghezza definiti e presenti anche numerose volte nel genoma. Hanno, al

loro interno, geni che sintetizzano per proteine che garantiscono la mobilizzazione dell’elemento. Gli IS hanno alle estremità sequenze ripetute (IR) ma in

direzione opposto (5’­ACCTG……GTCCA­3’) che permettono di riconoscere le estremità dell’IS. Gli IS sono causa di mutazione e, se possiedono al loro interno

promotori, alterano l’espressione di geni adiacenti al luogo dove si sono trasposti. Per spostarsi, questi IS, necessitano dell’enzima trasposasi. La trasposasi

taglia in modo asimmetrico il genoma in un sito bersaglio, l’IS si inserisce all’interno di questo sito e, infine, vi è una sintesi e un’unione dei filamenti scoperti del

sito bersaglio (che si trovano alle 2 estremità dell’IS) che sono rimasti scoperti (sintesi “diretta” perché saranno sintetizzate le stesse cose ai 2 lati).

Trasposoni Sono elementi trasponibili che contengono sia geni per il movimento sia altri geni.

 Trasposoni compositi – hanno una sequenza centrale con geni che codificano per qualcosa in particolare (es. resistenza all’antibiotico) e due

estremità che sono IS (detti ISL – a sx e ISD a dx) con orientamento uguale o invertito con le estremità IR per riconoscere la fine del trasposone che

forniscono anche le trasposasi per la traslocazione.

 Trasposoni non compositi – non contengono IS ai lati ma contengono le estremità IR. I geni centrali codificano sia per qualche proteina particolare sia

per le trasposasi e le resolvasi (che permettono un crossing­over tra trasposoni).

Il meccanismo di trasposizione dei trasposoni prevede l’unione della molecola di DNA donatore e del ricevente in un complesso detto cointegrato. Una volta uniti

il trasposone viene duplicato e si viene quindi a trovare su ambo le molecole che, infine, si separano (trasposizione replicativa). La trasposizione può anche

essere copia e incolla e il DNA donatore perde la sua molecola di trasposone.

Elementi trasponibili negli eucarioti – Causano mutazioni e possono ridurre o amplificare l’espressione di un gene (andando a inserirsi a livello della sequenza

promotore). Gli elementi trasponibili nei vegetali mostrano una particolare caratteristica: alcuni sono vettori autonomi, e possiedono per i geni della traslocazione

e quando si inseriscono in un gene lo rendono un mutabile instabile perché dopo poco il trasposone può spostarsi, altri sono vettori non autonomi, che non

possiedono i geni traslocatori (gli devono essere forniti da vettori autonomi) e se si inseriscono in un mutabile lo rendono un mutabile stabile (solo se viene poi

inserito un vettore, il non autonomo si sposterà).

Barbara McClintok, facendo esperimenti sul mais, individuò, nel 1940, l’esistenza degli elementi trasponibili: osservò che i cariossidi del mais (i chicchi) erano

viola con il gene C, gialli con il gene c e a volte con le macchie. Scoprì che i cariossidi gialli erano dovuti alla trasposizione di un trasposone non autonomo Ds

(grazie all’intervento dell’autonomo Ac) all’interno del gene C che lo rendeva c; nel caso dei cariossidi a pallini Ds alla nascita si trova dentro C e lo rende c ma,

dopo poche fasi dello sviluppo embrionale Ac toglie Ds da c e rende quindi, alcune cellule c (quelle già differenziate) e altre C.

Famiglia di trasposoni Ac­Ds Entrambi si traspongono pi ù o meno nello stesso modo (ma Ds necessita dell’intervento di Ac per spostarsi perché manca degli

enzimi per farlo da solo). Ac, replicato, si traspone subito dopo la replicazione causando due effetti diversi: se traspone in una zona già replicata si limita a

lasciare la zona prima occupata libera e a spostarsi; se, invece, si sposta in una zona non ancora replicata, lascia sempre la zona prima occupata libera ma

spostandosi, viene poi replicato, e questo causa un aumento di Ac sul cromosoma

Lieviti Nei lieviti l’elemento trasponibile Ty è un retrotrasposone e l’attività di trasposizione è detta retrotrasposizione: sono elementi simili ai retrovirus che

hanno un genoma a RNA che viene replicato in un filamento a doppia elica da una trascrittasi inversa e a cui infine viene sintetizzato il filamento complementare

prima dell’inserimento del nuovo DNA a partire dal genoma a RNA del virus. Anche i retrotrasposoni funzionano con la produzione di un intermedio a mRNA, a

partire dal loro DNA, che poi, da una trascrittasi inversa (che loro stessi codificano) viene incluso nel sito bersaglio in forma, nuovamente, di DNA.

Nell’uomo ci sono elementi trasponibili che si spostano con il meccanismo della retrotrasposizione: sono le sequenze LINE (lunghe sequenze intersperse) e

SINE (corte seq. intersperse). Le LINE contengono i geni (trascrittasi inversa) che codificano per gli enzimi che garantiscono la trasposizione; le SINE devono

fare affidamento sulle LINE. Le LINE (L1) sono capaci di codificare le trascrittasi inverse che permettono all’elemento di trasporre mentre le SINE, in particolare

le sequenze Alu, necessitano dei prodotti codificati da LINE per trasporre (la neurofibromatosi è causa dalla sequenza Alu in un introne del gene per la

neurofibromatosi che fa perdere un esone all’mRNA maturo causando una proteina più corta di 800 basi).

Genetica mendeliana

Alcuni caratteri sono ereditabili, altri no. I caratteri ereditabili dipendono dai geni che nel complesso costituiscono il genotipo. Il fenotipo è l’insieme dei caratteri

visibili (o studiabili – come livello enzimatico) ed è in parte determinato dall’ambiente e in parte dal genotipo.

Mendel studiò i piselli odorosi e arrivò a determinare le leggi alla base dell’ereditarietà. Scelse i piselli odorosi perché sono facili da studiare, possono

autofecondarsi ma, rimuovendo il pistillo (organo femminile del fiore) e prelevando il polline prodotto dagli stami (organi maschile) di un altro fiore poteva anche

procedere con la fecondazione incrociata.

Inizialmente fece autofecondare le piante per un po’ di generazione in modo da sapere di lavorare con caratteri ereditabili di linee pure.

Mendel incrociò due piante di linee pure e osservò che nella prima generazione si osservavano solo figli che mostravano un carattere: capì che i caratteri erano

trasmessi da fattori particellari (oggi geni) che esistono di diversi tipologie (alleli) e ogni individuo aploide contiene 2 alleli.

Pertanto le piante della linea pura risultavano omozigoti (con alleli uguali) e, nella meiosi, formavano cellula aploide con un solo allele. Nella fecondazione i

gameti si fondono e vanno a creare un individuo omozigote o eterozigote a seconda degli alleli che si fondono: nella F1 si notavano solo fenotipi di un carattere

perché un allele è dominante sull’altro (che invece è recessivo).

Pertanto l’eterozigote che ha un allele dominante (S) e uno recessivo (s) mostrerà un fenotipo dove il dominante “domina” sul recessivo (fenotipo Ss). Le linee

pure erano omozigote con omozigosi dominante (SS) o recessiva (ss). Incrociando i diversi contenuti aploidi che si vanno a formare a partire dai genitori nel

quadrato di Punnet si possono calcolare le frequenze fenotipiche del figlio.

Nella F1 i figli sono tutti eterozigoti Ss con fenotipo dominante (rapporto 1:1).

Nella F2 ricompare il carattere omozigosi recessivo (per casualità e probabilità) e il rapporto fenotipico è 3:1 (ogni 3 dominanti un recessivo).

Il fenotipo recessivo deriva SOLO da un genotipo omozigote recessivo (ss) e solitamente produce una mutazione con perdita di funzione o mutazione nulla (il

prodotto codificato dal gene è assente o funziona parzialmente). Il genotipo Ss ha un allele che codifica bene per il suo prodotto e basta a sopperire il mancato

prodotto dell’altro.

Principio della segregazione Gli alleli presenti in un organismo nel corso della meiosi segregano indipendentemente creando gameti aploidi, ognuno con un

allele del organismo da cui proviene.

* In realtà non è così perché dipende da dove sono localizzati i loci dei geni.

Possiamo schematizzare e calcolare le frequenze fenotipiche delle progenie con il quadrato di Punnet o con lo schema ramificato che calcola le probabilità

fenotipiche derivate dall’unione di gameti diversi.

Autofecondazione F1 (Ss) Gameti S (1/2), gameti s (1/2).

Progenie F2 Gameti SS (1/2 x 1/2) = 1/4; gameti Ss ¼ + ¼ = ½ ; gameti ss ¼ .

Rapporti progenie: SS 1: Ss 2: ss:1 rapporto fenotipico 3:1

La validazione del principio della segregazione indipendente, volta anche a capire se un individuo in F2 fosse omozigote dominante o eterozigote (che

esprimono lo stesso fenotipo) è l’autofecondazione delle piante con fenotipo dominante di F2: se la progenie aveva fenotipo 1:1 erano omozigoti dominanti,

eterozigoti se era 3:1.

Altro metodo per saggiare se un individuo è omozigote dominante o eterozigote è il test del reincrocio: questo test prevede la fecondazione di un individuo con

fenotipo dominante e un omozigote recessivo. Se la progenie è tutta eterozigote dominante allora il padre dominante era SS, se la progenie è 50% dominante e

50% recessivo allora il padre era Ss (basta fare il quadrato di Punnet per capirlo).

Continuando gli esperimenti incrociando le piante e osservando due caratteri alla volta Mendel osservò che la segregazione dei geni che codificano per caratteri

diversi è indipendente e che un carattere non influenza l’altro. Per tale motivo la seconda legge proposta da Mendel il principio dell’assortimento indipendente

che nella progenie F1 mostrava individui eterozigoti per entrambi i caratteri (con fenotipo dominanti) detti diibridi.

A partire dall’autofecondazione di individui diibridi Mendel si aspettò di trovare nella F2 4 diverse tipologie di caratteri, ovvero SY, Sy, sY e sy e così fu nel

rapporto 9:3:3:1 che, calcolando le frequenze fenotipiche su un quadrato di Punnet dove vengono incrociati i possibili gameti contenti all’interno sia gameti del

caratterere S sia gameti del carattere Y, risultano corretti. E’ anche possibile fare il calcolo con lo schema ramificato.

Test del chi­quadro – Test di analisi statistica che ci permette di valutare se il risultato di un esperimento rispetto al risultato di un valore atteso è dovuto o meno

al caso. Per il calcolo del valore di chi­quadro è importante per rifiutare un’ipotesi (valore atteso) perché sappiamo che l’evento osservato non è dovuto al caso o

affermare che l’evento osservato ha probabilità nella media di avvenire e quindi è dovuto al caso.

Per il calcolo del valore del chi quadro bisogna:

• Calcolo gli scarti (d) ­ valore osservato (o) – valore atteso (a)

• 2

Quadrato degli scarti – d (deviazione standard al quadrato)

• 2 2

Divido il valore di d per il valore atteso (d /a)

• 2

dei valori appena ottenuti. La somma è il valore di chi­quadro ( )

Σ Χ 2

Infine si studiano i gradi di libertà (n° fenotipi/casi ­1) e si cerca nella tabella il valore corrispondente di : una volta trovato si vede il valore di probabilità

Χ

corrispondente al fenomeno osservato. Se il valore di P > 0,05 l’ipotesi attesa non può essere rifiutata perché il valore osservato è casuale. Valori di P<0,05

indicano che il fenomeno osservato non è dovuto al caso.

Nell’uomo per studiare l’ereditarietà dei caratteri si costruisce l’albero genealogico della famiglia andando a valutare i possibili genotipi delle generazioni

successive per capire se la trasmissione è di tipo dominante o recessiva. Dal pedigree è possibile capire l’ereditarietà di caratteri autosomici dominanti e

recessivi che presentano le seguenti caratteristiche:

 Recessivo : un individuo affetto è ss. Il carattere salta le generazione. Da un incrocio tra 2 eterozigoti si ha la progenie 1:3. Genitori entrambi affetti

hanno tutti i figli affetti. Un individuo affetto ha almeno i genitori eterozigoti.

 Dominante: Il carattere si presenta in tutte le generazioni. Figli affetti hanno almeno 1 genitore affetto. Individui affetti sono solitamente eterozigoti

(omozigoti sono letali). Genitori eterozigoti hanno la metà dei figli affetti.

Basi dell’ereditarietà

I geni sono all’interno dei cromosomi e solitamente negli organismi ci sono un corredo doppio di cromosomi, ovvero sono presenti due cromosomi con gli stessi

geni (ma alleli diversi), detto corredo diploide che si forma a partire dalla fecondazione dei gameti con corredo aploide.

I due cromosomi che portano gli stessi geni sono detti cromosomi omologhi.

Ogni specie ha un numero di cromosomi tipico, nell’uomo sono 46, e sono presenti coppie di cromosomi autosomici, uno derivante dal padre e uno dalla madre,

e i cromosomi sessuali che specificano il sesso (XX nella femmina, sono uguali; XY nell’uomo).

I cromosomi differiscono tra loro per forma e dimensione: una prima differenza si nota a partire dalla posizione del centromero (strozzatura centrale del

cromosoma) che può essere metacentrico (con due bracci uguali), submetacentrico (un braccio corto e uno lungo), acrocentrico (un braccio più un pallino alla

fine) o telocentrico (il centromero è ad una estremità).

L’insieme dei cromosomi costituisce il cariotipo che è specifico per la specie cui si riferisce: i cromosomi, all’interno del cariotipo, sono numerati da 1 a x a partire

dal più lungo.

Sono stati sviluppati metodi per riconoscere i cromosomi e uno dei più utilizzati consiste nell’applicare enzimi proteolitici ad un campione di cromosomi che

modificano le proteine in alcuni punti dei cromosomi che poi sono colorati in modo che si creino delle bande, dette bande G (metodo: bendaggio G).

Per parlare di geni vi è una specifica nomenclatura: il braccio corto è p, quello lungo è q; ogni braccio è diviso in regioni dove l’1 è la parte più vicina al

centromero e ogni regione è suddivisa in sottoregioni (con i decimali).

* 7q31.2­31.3 gene per la fibrosi cistica: cromosoma 7, braccio lungo, regione 31 e sottoregione 2 e 3.

Un altro metodo di colorazione consiste nell’usare delle sonde fluorescenti che ibridano specificatamente con alcune regioni dei cromosomi creando bande

caratteristiche di diversi colori.

Teoria cromosomica dell’ereditarietà

In base a studi su diversi insetti si osservò che le leggi di Mendel potevano essere spiegate in base allo studio dei cromosomi e della loro ereditarietà. Per di più

si osservò che il sesso è determinato dalla presenza di due cromosomi X nella femmina e nel maschio da un solo cromosoma X o da un cromosoma X più un

altro piccolo cromosoma Y. Il maschio produce gameti che possono avere il cromosoma X o Y e pertanto è eterogametico, la femmina è omogametica.

A causa della condizione omogametica delle femmine la presenza di un gene su X comporta la presenza dello stesso gene sull’altra X; il maschio, invece,

presenta un gene su X ma non c’è corrispondenza tra X e Y, è definito emizigote, e la presenza di un carattere recessivo o dominante su tale cromosoma del

maschio è irrilevante perché anche il recessivo sarà espresso in quanto non vi è un altro gene compensativo sull’altro cromosoma.

La valutazione dell’eredità dei caratteri sessuali è stata studiata attraverso studi su Drosophila che concernevano l’osservazione della trasmissione di caratteri

da padre F0, femmina F1 e maschio F2 (ereditarietà crisscross).

In base a questi studi è stato rapidamente compreso che l’ereditarietà di geni localizzati su cromosomi sessuali non seguiva le leggi di Mendel in quanto i

rapporti fenotipici di F1 e F2 non coincidevano.

Studi successivi osservano altre eccezioni alle leggi di Mendel come il fenomeno della non­disgiunzione, per la quale da una madre xx e da un padre XY si

ottenevano oltre a maschi e femmine coerenti con la teoria cromosomica dell’ereditarietà anche maschi con XY (in teoria dato che ricevono x dalla madre

dovrebbero essere xY) o femmine xx (in teoria dovrebbero essere xX). Questo fenomeno è stato spiegato mediante la possibilità che due cromosomi possano,

per qualche problema, non segregare, nel corso della meiosi causando aneuploidia, ovvero mancanza di uno o più cromosomi rispetto al normale o cromosomi

presenti in sovrannumero.

Nell’essere umano la determinazione del sesso dipende dalla presenza o meno del cromosoma Y che porta in sé il gene che codifica per il fattore di

determinazione testicolare che fa sì che il tessuto che formerà le gonadi diventi testicolo e non ovaie. La conferma di questo tipo di ereditarietà è arrivata

dall’analisi di alcune patologie determinate da anueploidia:

o Sindrome di Turner: individuo femmina con carattere XO. La madre ha avuto una non­disgiunzione e uno dei gameti “aploidi” aveva XX e l’altro

niente. La fecondazione ha portato un X dal padre e un oocita vuoto dalla madre con la formazione del genotipo sessuale XO (detto 45,x – perché ci

sono 45 cromosomi e non 46). La sindrome porta a infertilità, assenza dello sviluppo dei caratteri sessuali secondari e immaturità dei caratteri

sessuali primari.

o Sindrome di Klinefelter – Dalla non­disgiunzione materna lo zigote si forma per fusione di un Y dal padre e l’oocita XX della madre con genotipo XXY.

Individui maschi più alti della media con poco sviluppo testicolare e intelligenza inferiore alla media.

In seguito venne ipotizzato, ipotesi di Lyon, che doveva esistere un meccanismo di compensazione genica per rendere femmina l’individuo con XX e maschio

quello con una sola X (e quindi aploidia per quel cromosoma).

Nella femmina, infatti, si è osservato che uno dei 2 cromosomi X è particolarmente condensato a formare un corpo di Barr nel quale, sostanzialmente,

l’espressione genica è silenziata (lyonizzata). L’inattivazione della X è un fenomeno epigenetico per il quale si osserva una variazione dell’espressione genica

non dovuta ad una variazione della sequenza genetica. Il fenomeno della lyonizzazione è alla base di eventi di mosaicismo, fenomeno per il quale cellule

somatiche appartenenti allo stesso individuo mostrano l’inattivazione di una o dell’altra X e questo determina variazione nell’espressione allelica (si osserva

questo fenomeno nel pelo delle gatte che in determinate zone esprimono una X e in altre l’altra X).

Il meccanismo di inattivazione dell’X è dovuto inizialmente alla presenza di due o più regioni Xic (X inactivation center) perché se è presente in singola copia

significa che c’è solo un X e non avviene il silenziamento dell’X e, in seguito, l’espressione del gene XIST incluso nella regione Xic, che codifica per un RNA non

traducibile che si lega allo stesso cromosoma che l’ha prodotto (la X da disattivare) e ne induce l’eterocromatizzazione.

Determinazione del sesso in Drosophila e nematode Il sesso dipende dal rapporto tra n ° di cromosomi X e dal n° di autosomi. In questo caso il gene Y non ha

alcuna influenza sul sesso dell’individuo (serve solo per la fertilità del maschio). Il sesso femminile è presente quando vi è una corrispondenza tra l’assetto

diploide dell’X e l’assetto diploide degli autosomi, quindi X:A ≥1 l’individuo è femmina. Il maschio ha aploidia per l’X e diploidi per i caratteri autosomici quindi

X:A ≤ 0,5 l’individuo è maschio. Se l’individuo ha rapporto 0,5<X:A>1 l’individuo è sterile e interesso. La compensazione dell’X è data da una maggiore

espressione dei geni sull’X da parte del maschio.

In altre specie la condizione omogametica XX causa ermafroditisimo (sia maschio che femmina), in alcune l’omogamesi è maschile e l’eterogamesi femminile o

da semplici differenze alleliche (a o A in due geni autosomici) e in questo caso il fenotipo di maschio e femmina è uguale (determinazione genica del sesso).

Ereditabilità dei caratteri sui cromosomi sessuali:

• Ereditabilità X recessiva: la malattia si osserva per femmine xx o per maschi xY. Le femmine sono solitamente eterozigoti xX, i maschi di madri affette

sono SEMPRE affetti le femmine no. Da genitori eterozigoti il maschio è 50% affetto e anche la femmina (perché anche papà da x). La distrofia

muscolare di Duchenne è un esempio di carattere recessivo legato all’X

• Ereditabilità dominante legata all’X: Da padre affetto nascono SOLO figlie affette (ricevono X) e nessun figlio affetto. Da madre affetta il 50% dei figli

(maschi e femmine è affetto). Un esempio è la trombopatia costituzionale.

• Ereditabilità legata all’Y (carattere olandrico): Le femmine non sono MAI affette e i figli maschi di padri affetti sono SEMPRE affetti. Un esempio è il

carattere dell’orecchio peloso.

Estensione e deviazione della genetica mendeliana

In natura non esistono soltanto due alleli per ogni gene ma si osserva la condizione di alleli multipli. I genotipi possibili a partire da un n numero di alleli è

n(n+1)/2 genotipi diversi di cui n sono sia gli alleli sia i genotipi omozigoti.

Una condizione di alleli multipli sono il gruppo sanguigno ABO: il gruppo sanguigno è determinato dagli antigeni presenti sul lato extracellulare che possono

essere di 3 tipi diversi A, B e O. In condizione di omozigosi si possono trovare il fenotipo A, B od O che consiste nell’allele recessivo (espresso solo con O). A e

B sono dominanti su O, quindi in eterozigosi si possono osservare i fenotipi A e B.

Gli antigeni, presenti sulla membrana dei globuli rossi, servono come riconoscimento cellulare e il corpo, solitamente produce anticorpi contro l’agente estraneo

che è l’antigene. Individui con antigene A produrranno anticorpi con l’antigene B e viceversa, individui con gruppo sanguigno O non producono antigeni e

individui con gruppo AB producono antigeni anti A e anti B.

A livello molecolare si osserva che i diversi genotipi corrispondono all’aggiunta di un diverso zucchero sulla superfice di un lipide di membrana a seconda che il

genotipo sia A, B o AB, da parte di una glicosiltransferasi; nel caso del genotipo O non viene aggiunto alcuno zucchero al lipide che presente da solo è detto

antigene H. Alcune persone non hanno nemmeno il gene che codifica per l’antigene H e hanno il fenotipo Bombay: questi individui producono anticorpi anti­O.

+

Un altro esempio di allelia multipla è il colore degli occhi di Drosophila nel quale osserviamo il colore selvatico rosso (w ), il colore bianco (recessivo – w) e un

e + e e

colore simile all’arancione determinato dal gene eosina (w ): w è dominante sia su w che su w , mentre w è dominante su w. Il colore degli occhi, inoltre, è

codificato da un gene posto sul cromosoma sessuale e pertanto segue la legge dell’eredità cromosomica.

Dominanza incompleta – Mendel considerò solo la possibilità di caratteri dominanti e recessivi completamente tali e non prese in considerazione la possibilità di

una dominanza incompleta per la quale il fenotipo eterozigote, che esprime entrambi gli alleli (sia dominante che recessivo) avendo solo un gene dominante (e

non due) ha una minore espressione del prodotto codificato e pertanto il fenotipo è più lieve rispetto all’omozigote.

Il caso contrario, della dominanza completa, dove basta solo un gene per produrre quantità sufficiente di prodotto, è noto come aplosufficiente.

Codominanza – Fenomeno per il quale il fenotipo eterozigote esprime entrambi gli alleli in quanto non si osserva prevalenza di dominanza: è il caso del genotipo

AB per il gruppo sanguigno.

Alleli letali – Nel caso una mutazione colpisca un gene essenziale si parla di allele letale. Nel caso di allele letale dominante è sufficiente l’eterozigosi per

portare l’individuo alla morte, nel caso di allele letale recessivo è necessaria l’omozigosi recessiva.

Il pelo giallo nel topo è codificato da un allele letale recessivo e il topo non sopravvive ai primi stadi embrionali se ha un genotipo omozigote recessivo. Nel caso

di eterozigosi il topo sopravvive e l’allele letale è dominante sul fenotipo selvatico, pertanto il topo avrà il pelo giallo (anche se per morire deve essere omozigote

recessivo). La spiegazione di questo fenomeno è data considerano che il fenotipo giallo è determinato sia dal gene agouti sia dal gene Raly (i due geni sono

vicini e il promotore di Raly influenza anche Agouti): nel caso di eterozigosi si osserva una variazione nell’attività regolatrice di Raly su Agouti, nel caso di

omozigosi recessiva Rely non funziona proprio e per tale motivo il topo muore.

Nell’uomo sono noti diversi geni letali come il gene HAXE che mutato e in omozigosi recessivo causa la malattia di Tay­Sachs nella quale manca un enzima

importante (perché lo splicing è alterato) per il sistema nervoso.

Penetranza incompleta – Dato che il fenotipo osservato è causato da un’interazione dei geni con l’ambiente (già a livello della replicazione cellulare e anche

nelle fasi successive) è possibile anche osservare il fenomeno della penetranza incompleta: la penetranza è il numero di persone che esprimono il fenotipo in

relazione alle persone con uguale genotipo e, se è 1 (100%), tutti gli individui con uguale genotipo mostrano lo stesso fenotipo. Se la penetranza è < 100 allora

solo una data percentuale di persone mostra il fenotipo sulla totalità di pax con lo stesso genotipo (es. 50­80% per brachidattilia).

Espressività costante/variabile – Sempre a causa dell’interazione gene­ambiente è possibile che un allele mutato con 100% di penetranza abbia diversi gradi di

espressività in diversi soggetti: alcuni soggetti possono avere un’espressione limitata del fenotipo mutato altri invece una forte espressione (spesso più grave)

dello stesso.

Influenza dell’ambiente sul fenotipo

• L’età di insorgenza A diverse et à i geni espressi sono diversi e pertanto l’età è causa di espressività diversa del gene.

• Sesso Il sesso pu ò causare l’espressione diversa dello stesso gene. Solitamente i geni il cui carattere è espresso diversamente sono situati su

cromosomi autosomici e, a partire da questo, se l’individuo è maschio il gene sarà espresso se femmina no (caratteri limitati dal sesso) o il carattere

è espresso diversamente su maschi e femmine (caratteri influenzati dal sesso) come nel caso della calvizie dove il gene risulta dominante (presente

anche in eterozigosi) per i maschi e recessivo nelle femmine.

• Temperatura La temperatura influisce sull’espressione genetica in quanto il gene viene espresso ma l’enzima codificato funziona in relazione alla

temperatura, come accade nei gatti siamesi dove la diversa temperatura corporea consente alla tirosinasi di funzionare alle fredde estremità (e il pelo

è nero perché c’è melanina) e di non funzionare nelle parti centrali calde dove l’attività enzimatica è inibita.

L’espressione di un determinato fenotipo è dovuto all’interazione gene­ambiente dove il genotipo presenta una norma di reazione, ovvero un determinato range

(piccolo o largo) entro il quale l’ambiente può determinare variazioni di espressività (il genotipo determina x condizioni possibili e solo l’interazione con

l’ambiente determina quale sarà la condizione finale espressa).

Effetto materno Alcuni caratteri fenotipici sono influenzati dal genotipo nucleare della madre e non dal padre e nemmeno dal genotipo del figlio, questo perch é

nell’oocita sono depositati mRNA e altri componenti prima della fecondazione. I geni che determinano questi caratteri sono detti geni con effetto materno. Un

carattere di questo tipo è la spiralizzazione delle conchiglie che è determinata non dal genotipo della conchiglia stessa ma dal genotipo della madre: la spirale è

destrorsa se il genotipo è D e sinistrorsa se è d; se il figlio ha genotipo d/d può presentare una spirale destrorsa nel caso la madre sia D/d (D è dominante su d).

Questo fenomeno è spiegato dall’orientamento del fuso mitotico dopo la fecondazione che è dovuto a mRNA presenti nell’oocita prima della fecondazione e

pertanto geni con genoma materno.

Per capire queste deviazioni alle leggi mendeliane si usa studiare le mutazioni a partire dai individui con fenotipi mutanti: una volta ottenuti fenotipi mutanti

(uguali) è importante capire se entrambi manifestano la mutazione sullo stesso gene o su geni diversi. Questo è possibile con il test di complementazione (test

cis­trans).

Il test di complementazione prevede un incrocio tra due mutanti che mostrano lo stesso fenotipo e l’osservazione del fenotipo della progenie: se i figli risultano

con il fenotipo selvatico (che non c’è nei genitori) vuol dire che dall’incrocio di due genitori omozigoti per due geni mutati in due luoghi diversi (quindi xx e yy) si

sviluppano figli (Xx e Yy) che, non presentando alcuna omozigosi risultano aver riacquistato il fenotipo selvatico.

Se invece, alcuni individui della progenie, avessero dimostrato fenotipo uguale ai genitori (entrambi omozigoti o eterozigoti) significa che hanno ereditato

omozigosi (quindi aa) dai genitori che pertanto presentavano mutazione sullo stesso gene.

Molti caratteri sono dovuti all’interazione di geni localizzati in loci diversi, pertanto, i possibili fenotipi che emergono da queste interazioni multiple sono diversi

proprio a causa dell’interazione: questo si osserva nella forma della cresta del pollo che è determinata dall’interazione tra i geni R e P che segregano

indipendentemente.

R e P sono dominanti quindi omozigosi o eterozigosi in entrambi i loci danno forma a noce, se vi è un gene dominante e l’altro omozigote recessivo si

manifesterà solo il carattere del gene dominante, se sono entrambi recessivi si osserva la mancata produzione a livello biochimico del carattere che pertanto

risulta nullo. Il n° totale di fenotipi, grazie a questo fenomeno, aumenta a causa dell’interazione tra geni.

Epistasi recessiva Fenomeno per il quale si osserva un’influenza di un gene localizzato su un locus su un altro gene localizzato in un altro locus. Esempi tipici

sono il colore del pelo del topo e del cane.

Nel labrador si osservano 4 possibili colori e questi dipendono da 4 genotipi diversi: A e a codificano rispettivamente per colore nero e marrone ma, perché il

colore sia deposto, è necessaria un altro prodotto (melanocortina) codificato a partire da un gene che si localizza su un locus diverso da A/a detto gene E/e. Se

il cane ha genotipo E/­ (che significa E/E o E/e) allora ci sarà il prodotto che permette la deposizione di A od a e il cane sarà marrone o nero; se il genotipo del

cane è e/e mancherà il prodotto che permette la deposizione di A ed a e pertanto, senza colore, il cane apparirà bianco. In questo fenomeno il gene influenzato

è detto ipostatico, quelle che influenza è detto epistatico.

Epistasi dominante Nel caso di epistasi dominante si osserva che un genotipo dominante su un locus (W) rende conto di un solo possibile fenotipo

indipendentemente dal genotipo presente nell’altro locus mentre il genotipo dell’altro locus è espresso (o meglio si nota) solo se il gene epistatico dominante è in

omozigosi recessiva.

Un esempio è il colore della zucca che può essere verde, giallo o bianco: il colore è bianco se sul gene epistatico è presente eterozigosi o omozigosi dominante

mentre il giallo e verde si osservano solo se sul gene epistatico si osserva omozigosi recessiva. Una possibile spiegazione è data dal fatto che la presenza del

carattere dominante sul gene epistatico causa un’alterazione del colore depositato nell’altro locus che, dunque, diventa sempre bianco.

Geni modificatori Sono geni che influenzano l’espressivit à di geni su locus diversi non determinando o inibendo completamente l’espressione del gene ma

intensificando o diminuendo l’espressività dell’altro gene (non c’entrano con le sequenze regolatrici di geni!!!); se hanno la capacità di modificare l’espressività di

un gene e portarlo dallo stato mutato a quello selvatico sono detti geni soppressori.

Ereditarietà materna (DIVERSISSIMA DA EFFETTO MATERNO!) Alcuni organelli citoplasmatici hanno un loro DNA e la trasmissione di questo DNA non

segue le leggi mendeliane perché, non trovandosi all’interno del nucleo, non segrega secondo le leggi dell’ereditarietà cromosomica e non è suddiviso in

cromosomi. Il citoplasma e gli organelli derivano in primo luogo dalla madre che li passa direttamente nell’oocita (lo spermatozoo solitamente fornisce solo la

sua parte aploide di DNA) e pertanto i geni all’interno di questi organelli (soprattutto mitocondri e cloroplasti) presentano un fenotipo identico a quello della

madre.

Effetto materno – mRNA depositato nel citoplasma, il genotipo è uguale a quello nucleare materno / Ereditarietà materna, il fenotipo è uguale a quello materno

ed è ereditato dal genotipo extranucleare materno.

Tra le patologie umane causate da mutazione a mtDNA (DNA mitocondriale) troviamo la neuropatia ottica ereditaria di Leber che porta individui adulti alla

cecità: questo è dovuto da mutazioni in geni del mitocondrio che codificano per 8 proteine della catena di traporto degli elettroni che risulta meno funzionale e

porta alla morte del nervo ottico.

Le malattie dovute a mutazioni di mtDNA sono eteroplasmatiche, ovvero presentano mitocondri più o meno funzionali anche all’interno dello stesso individuo

perché nello stesso sono presenti alcuni mitocondri normali e altri deficitari. Ovviamente queste patologie possono colpire anche individui maschi che,

ugualmente alle femmine, ereditano i mitocondri dalle madri.

Mappe genetiche

Le leggi di Mendel prevedono la segregazione indipendente per geni in loci diversi (posti su cromosomi diversi) ma si è osservato che geni posti sullo stesso

cromosoma (sintenici) possono, a volte, associarsi, e segregare insieme lasciando immutato una parte di genotipo rispetto ai genitori o segregare

indipendentemente grazie alla ricombinazione genetica. In base a queste osservazioni è possibile costruire delle mappe genetiche che considerano la

probabilità di ricombinazione e l’associazione tra geni (quasi mai completa, ovvero sempre associazione e mai ricombinazione) usando come punti di riferimento

all’interno di uno stesso cromosoma delle mutazioni (marcatori genici) o dei polimorfismi (marcatori di DNA).

Sulla base di alcune osservazioni Morgan osservò che tanto più 2 geni sono vicini sullo stesso cromosoma tanto minore sarà la possibilità che siano coinvolti in

processi di ricombinazione dovuti al crossing­over nel corso della profase della I divisione meiotica. Esperimenti eseguiti su Drosophila, la cui femmina mostra

differenze a livello fisico del cromosoma per alcuni caratteri, hanno confermato che la ricombinazione dei geni è dovuta ad un fenomeno fisico di scambio di

parti tra cromosomi diversi.

A partire da questi fenomeni è possibile costruire delle mappe di associazione che mostrano la localizzazione dei geni all’interno del cromosoma.

Testcross per rilevare l’associazione Tramite il testcross, incrocio tra omozigote recessivo e individuo con genotipo ignoto (ma fenotipo dominante), è possibile

2

determinare l’associazione a partire dall’ipotesi nulla che due geni NON siano associati e procedendo, tramite test del a valutare le deviazioni del fenomeno

Χ

2 2

osservato dal fenomeno atteso per ottenere il valore di . Una volta ottenuto il valore di X e sapendo i gradi di libertà si cerca nella tabella il valore che indica

Χ

la probabilità di ottenere un risultato diverso da quello osservato: se p<0.05 possiamo dedurre che il risultato non è dovuto ad un fenomeno casuale e, pertanto,

è possibile affermare che i geni siano associati.

Tramite l’incrocio testcross è possibile, con un attenta valutazione della progenie, valutare se i geni segregano indipendentemente (rapporto fenotipi ricombinanti

e parentali 1:1), se presentano associazione completa (solo fenotipi parentali) o presentano associazione incompleta (nella progenie vi è una maggioranza di

fenotipi parentali e pochi ricombinanti).E’ possibile “osservare” il fenomeno di ricombinazione indicando l’allele selvatico e l’allele mutato su due omologhi:

+¿

m +¿

wm

+¿ wm m

+¿

w

(conf. cis) o (conf. trans – i selvatici sono su omologhi opposti)

¿

w ¿

¿

¿

Possiamo suppore che tra la prima e la seconda disposizione sia avvenuto un crossing­over.

Per costruire mappe dei geni si usa anche la frequenza di ricombinazione tra due geni dove un centiMorgan (unità di mappa) corrisponde ad una

ricombinazione ogni 100 eventi meiotici (quindi geni quasi sempre associati).

La f. di ricombinazione è diversa dalla f. di crossing over: nel primo caso si studia la frequenza entro la quale 2 marcatori ricombinano tra loro mentre nel caso

della f. di crossing over si parla dello scambio fisico che avviene tra omologhi.

In base alle frequenze di ricombinazione possiamo costruire una mappa fisica sulla localizzazione dei geni sul cromosoma come segue: consideriamo tre geni

w, m e y.

La f. di ricombinazione tra m­w è 32,7%, tra w e y è 1% e tra m e y è 33,7%: possiamo affermare che w e y sono strettamente associati e distano 1 cM e che m

è più vicino a w di quanto non lo sia y.

Pertanto l’ordine dei geni è m……32,7 cM……w…1 cM…y (l’ordine è m­w­y).

E’ possibile mappare i geni all’interno del cromosoma eseguendo un incrocio tra genitori omozigoti recessivi e eterozigoti al fine di osservare la frequenza di

ricombinanti nella progenie e, in base ai ricombinanti della progenie possiamo calcolare le unità di mappa che intercorrono tra due geni con la seguente formula:

n° ricombinanti

Freq. diricombinazione dimappa)= x 100

(unità n° della progenie

Il valore della frequenza di ricombinazione è compreso tra 1 e 50: non è possibile superare il valore del 50% di ricombinazione in quanto a partire da

segregazione indipendente di due geni si osserverà, nelle cellule figlie, un rapporto 1:1 di geni ricombinanti e geni non ricombinanti (quando il rapporto è 1:1 il

valore della f. è 50) e questo ci informa che i geni si collocano in posizioni molto distanti sullo stesso cromosoma o su due cromosomi diversi.

Le mappe genetiche si possono anche costruire studiando le ricombinazioni che avvengono su un reincrocio di prova a 3 punti, ovvero un incrocio tra un

genotipo eterozigote per 3 punti e un omozigote recessivo per 3 geni.

Genetica di batteri e batteriofagi

Metodi di indagine genetica in batteri

Il batterio più studiato è stato E. Coli e l’indagine genetica inizia mediate la creazione di colture di batterio: le colture sono terreni dove il batterio è in grado di

proliferare creando cloni a partire da un singolo individuo.

Il terreno di studio può essere liquido, in provetta, o un terreno solido di agar noto come piastra di Petri.

Il terreno può essere minimo (e contenere solo elementi essenziali da cui poi il batterio sintetizza ciò che gli serve) o completo (completo di aminoacidi, proteine

e via dicendo).

I batteri sono detti prototrofi quando sono in grado di sintetizzare gli elementi a partire dal solo terreno minimo mentre sono detti auxotrofi se, a causa di qualche

mutazione, sopravvivono solo se viene loro fornito un terreno minimo + qualche elemento non sintetizzato a causa della mutazione o un terreno completo (se il

+

batterio porta la sigla thi indica che ha il gene selvatico funzionante!).

Gli studi di genetica sono possibili con incroci di batteri (selvatici e anche ricombinanti) che creano una coltura su un terreno completo, con la replica plating, si

replica (passando per un pezzo di velluto) i batteri presenti sul terreno completo e si piastrano su terreni minimi + qualche altro elemento al fine di vedere quali

mutazioni ha ereditato la progenie (perché si va a vedere nella piastra madre – quella originale – quali sono le colonie mutanti).

Elementi extracromosomici:

o Plasmidi – Elementi extracromosomici capaci di replicazione autonoma (hanno un origine di replicazione detta OriV) che contengono geni utili al

batterio (non necessari alla sopravvivenza, solitamente garantiscono qualche resistenza agli antibiotici) e sono lunghi da 5kb a 100 kb. A livello di

OriV si separano i filamenti e ha inizio la replicazione del DNA che crea copie identiche del plasmide. Ci sono centinaia di plasmidi all’interno del

batterio.

o 5

Episoma – Elementi extracromosomici che contegono geni utili al batterio, lunghi 10 kb. Rispetto al plasmide, essi sono capaci di integrarsi al

cromosoma batterico.

Coniugazione Avviene uno scambio tra due regioni omologhe di DNA di batteri diversi. La coniugazione consiste nel passaggio di una porzione di genoma da

un batterio donatore e un altro ricevente tramite unione delle cellule che formano tra loro un ponte dove avviene la replicazione. La coniugazione è un processo

unidirezionale e prevede l’associazione di batteri con “sesso” opposto: il batterio F+ possiede un episoma che contiene un origine e 12 geni per la creazione di

lunghi filamenti di coniugazione detti pili F (pili sessuali) mentre il batterio F­ non lo possiede.

Quando due batteri F+ e F­ vengono posti sullo stesso terreno minimo la cellula F+ si collega tramite il pilo F al batterio F­ e tra essi si forma un ponte

citoplasmatico: una volta connessi un filamento singolo dell’episoma si separa dalla doppia elica, a partire dall’origine e si sposta in F­ dove viene sintetizzato il

filamento stampo grazie alla DNA pol e il batterio si trasforma in F+. Il filamento rimasto singolo di F+ si osserva replicazione per far tornare a doppio filamento

l’episoma.

Questo episoma è presente solo in copia singola nel batterio e se presente in forma semplice non è in grado di inserirsi nel DNA dell’altro batterio.

Hfr (High frequecy of recombination): Particolari fattori F (l’episoma semplice della coniugazione) che, per ricombinazione, si integra al cromosoma batterico e,

in seguito, replica insieme alla replicazione del DNA batterico. Una volta che il DNA batterico ha acquistato il fattore F è capace di coniugarsi (prima non lo era)

al batterio F­.

La coniugazione avviene perché il fattore F integrato nel cromosoma batterio a formare Hfr si separa dal doppio filamento a livello dell’origine e si trasferisce

nell’altro batterio dove inizia la sintesi del filamento stampo: solitamente non viene copiato tutto il cromosoma del batterio Hfr perché l’appaiamento termina

prima.

Come è possibile l’integrazione del fattore F a formare Hfr è anche possibile il fenomeno opposto per cui si forma, a partire da un Hfr, per excissione, un fattore

F+ e un cromosoma batterico normale.

Quando si forma un fattore F a partire da Hfr si può excidere anche una parte del cromosoma batterico (nel senso che geni appartenenti al cromosoma vengono

inclusi nel fattore F excisso) e pertanto si otterà un frammento detto F’ che conterrà il fattore F + geni batterici. Questo fattore F’ è capace di coniugazione in un

batterio F­ che quando acquisterà F’ diventerà a sua volta F’ e, dato che magari il batterio in precedenza possedeva già alcuni geni presenti in F’ può anche

diventare un merodiploide (mezzo diploide perché alcuni geni sono presenti in doppia copia e altri in quantità aploide!): questa coniugazione è detta F­duzione.

Trasformazione La trasformazione è un fenomeno nel quale si osserva una variazione del fenotipo del batterio ricevente (come accade nello pneuomocco S

morto e R vivo che uccide comunque il topo!). Non è necessario che due batteri siano particolarmente associati e basta solo un frammento di DNA a permettere

la trasformazione: il batterio che è capace di integrare del DNA nel suo cromosoma batterico è detto batterio competente. La cellula competente acquista il DNA

+

di un batterio donatore che porta, ad esempio, un allele selvatico a su un frammento a doppio filamento. Il frammento doppio entra nel batterio competente e

+

uno dei 2 filamenti si degrada in modo che rimanga solo un singolo filamento che porta a . Questo singolo filamento si appaia con il DNA batterico a formare

+

una tripla elica e, in seguito, mediante un evento di doppio crossing­over il frammento a si integra al DNA batterico (che prima possedeva a) e quest’ultimo

perde a che si integra nel frammento di DNA appena entrato che poi andrà incontro, in quanto filamento singolo a degradazione.

Si ha quindi un DNA batterico formato da un filamento con geni del batterio competente e l’altro filamento con geni del donatore (questa molecola è detta

+

eteroduplex) e, nel momento in cui si formeranno 2 cellule figlie la replicazione formerà un figlio con a e l’altro con a (quindi solo una delle 2 cellule figlie è

trasformata).

Trasduzione – Avviene nei batteriofagi, ovvero in batteri che contengono fagi di virus perché sono stati infettati.

Il virus inietta il proprio DNA all’interno del batterio ospite il DNA batterio si frammenti in brevi sequenze e, di seguito, si osserva la replicazione (del ciclo litico

normale – quello in cui non c’è integrazione del DNA virale nel DNA batterico) sia dei frammenti di DNA batterico, che daranno origine alla progenie fagica, sia

del DNA batterico frammentato, sia delle teste/capsidi del virus.

Quando la cellula andrà incontro a lisi, cosa normale nel ciclo litico, alcuni capsidi possono incorporare dentro se stessi del DNA batterico e non il DNA della

progenie fagica. Il lisato fagico (formazione di nuovi virus a partire dalla progenie fagica) andrà a “infettare” batteri vicini e, alcuni, riceveranno il virus contenente

DNA batterico e non virale. Questo DNA batterico è quindi inserito nella cellula batterica e può integrarsi, mediante crossing­over, al DNA batterico normale

permettendo quindi la trasduzione.

Variazione numero e struttura dei cromosomi

I cromosomi possono subire mutazioni che causano variazioni della quantità dei cromosomi all’interno del genoma o variazioni della struttura del cromosoma.

Lo studio di queste mutazioni è la citogenetica e si avvale di indagini genetiche che studiano variazioni nell’associazione di geni. Generalmente, queste

mutazioni, originano da rotture del cromosoma che va a creare un frammento che facilmente si “appiccica” ad un’altra parte del cromosoma.

Variazioni strutturali

Delezioni Per rottura del cromosoma o per crossing over tra parti dello stesso cromosoma che fallisce si osserva la perdita di una parte del cromosoma con

conseguente perdita dei geni corrispondenti. Con analisi del cariotipo si osserva che nella coppia di omologhi i 2 cromosomi non sono simili ma uno è, spesso,

più corto dell’altro e tra loro si appaiano, nel corso della meiosi, formano delle strane anse e, se la delezione riguarda il centromero gli omologhi non segregano

correttamente. La delezione si può “diagnosticare” quando si rileva il fenomeno della pseudodominanza, ovvero quando il fenotipo è quello del carattere

recessivo perché su due omologhi autosomici c’è solo il gene recessivo e manca l’altro allele a compensare la mutazione.

Gli individui si dicono eterozigoti per una delezione (cioè hanno cromosomi diversi).

Patologie note dovute ad una delezione sono la sindrome del cri­du­chat, nel quale il bambino ha ritardo mentale, gravi anomalie fisiche e piange come un gatto

a causa di anomalie allo sviluppo della laringe, dovuta ad una delezione del braccio corto del cromosoma 5 e la sindrome di Prader Willi, nella quale a causa

della delezione di parte del braccio lungo del cromosoma 15 il bambino manifesta prima crescita ridotto e poi obesità.

Duplicazione A causa di un crossing­over andato male è possibile osservare una duplicazione di un tratto di DNA che viene sparso in modo random nel

cromosoma. Tramite l’analisi citogenetica è possibile studiare questo fenomeno perché in appaiamento si creano anse strane tra omologhi. Le duplicazioni

possono aver dato origine ai diversi tipi di Hb a causa della presenza di più catene polipeptidiche per ogni tipo.

Inversione Fenomeno nel quale viene escisso un frammento di DNA da un cromosoma, il frammento si ruota di 180 ° e poi si reintegra all’interno del

cromosoma. La conseguenza è diversa a seconda che il frammento reinserito contenga (pericentrica) o non contenga (paracentrica) il centromero. Si possono

osservare anse nel momento dell’appaiamento degli omologhi durante la meiosi. Se l’inversione è omozigote non si osservano gravi alterazioni e così anche se

non avviene crossing­over: se avviene il crossing over si ha la formazione di gameti con lunghezze diverse e a causa dell’eccessiva riduzione alcuni possono

non essere funzionanti.

Traslocazione Esistono diverse tipologie di traslocazione. La prima, traslocazione intracromosomica, si osserva che un frammento di DNA cambia la sua

posizione all’interno del genoma; nel caso della traslocazione intercromosomica non­reciproca, un tratto di DNA si sposta da un cromosoma all’altro mentre se si

ha la traslocazione intercromosomica reciproca si osserva uno scambio di frammenti di DNA. Queste mutazioni modificano l’associazione dei geni e, a seconda

che la mutazione di reciproca o meno, causano alterazioni nell’appaiamento e nella segregazione durante la meiosi.

Traslocazione robertsoniana La sindrome di Down (familiare) può anche essere causata (nel 2% dei casi) da una traslocazione reciproca che porta all’unione

tra il braccio lungo del cromosoma 21 e il braccio lungo di un altro cromosoma (lasciando l’altro cromosoma con le sole braccia corte del 21 e dell’altro

cromosoma – solitamente è un cromosoma senza geni essenziali e viene perduto). I gameti prodotti dall’individuo dove è avvenuta la traslocazione possono

dare origine alla sindrome di Down perché in uno dei possibili gameti segregano 2 braccia lunghe del cromosoma 21 che si uniscono con il 21 dell’altro genitore

e si osserva la nota sindrome. Se lo zigote possiede 3 cromosomi dell’altro cromosoma coinvolto nella traslocazione solitamente non è vitale.

Mutazioni cromosomiche e tumori – Molti tumori sono causate da variazioni strutturali del cromosoma. Le mutazioni che più frequentemente permettono lo

sviluppo di un tumore, perché trasformano un proto­oncogene in un oncogene, sono delle traslocazioni reciproche.

La leucemia mieloide cronica (CML) è causata da una traslocazione reciproca tra il braccio lungo del cromosoma 22 e il cromosoma 9: si forma quindi un

cromosoma piccolo piccolo con il braccio corto del 22 e una parte del 9 detto cromosoma Philadelphia dove si trovano vicini il proto­oncogene ABL e il gene

BCR; la prossimità di questi due geni fa diventare ABL un oncogene che codifica per una tirosin chinasi sempre attiva.

Il linfoma di Burkitt è causato da una traslocazione tra l’estremità distale dell’8 con l’estremità distale del 14 e il conseguente passaggio del gene MYC da proto­

oncogene a oncogene.

Mutazioni dinamiche

Malattie da espansione di triplette – Patologie causate dall’espansione in tandem (il numero di ripetizioni varia) di una tripletta. Queste patologie solitamente si

manifestano con disordini neurologici e tanto più è alto il n° di ripetizioni tanto più è grave la patologie. Alcune di queste malattie trovano un’espressione

dell’amplificazione solo nel maschio o nella femmina (nell’X fragile l’espansione è solo in individui femmina). Queste patologie sono caratterizzate dalla

manifestazione fenotipica della malattia solo se l’amplificazione supera un determinato n° di ripetizioni (sotto quel n° si ha fenotipo parzialmente invalidato o

completamente sano).

L’espansione non è un fenomeno che accade una sola volta ma tende ad aumentare nel corso delle generazione, per tale motivo si osserverà il fenomeno

dell’anticipazione genica, nel quale ad ogni generazione, a causa dell’aumento delle triplette espanse, si ha un peggioramento della malattia ed una comparsa

ancora più precoce della stessa.

Queste malattie sono dovute proprio all’espansione perché anche individui sani possiedono ripetizioni in tandem della tripletta ma il numero delle ripetizioni è

limitato: una mutazione porterà questo numero a crescere e nelle prime generazioni il cromosoma l’allele sarà pre­mutato (con un numero troppo basso di

ripetizioni per avere il fenotipo malato). Si dice che la mutazione ha portato instabilità genetica nel sito dove si avrà l’espansione. Se l’instabilità avviene in una

cellula che va incontro a mitosi si osserveranno tessuti diversi o cellule dello stesso tessuto con quantità diverse di triplette espanse (instabilità mitotica); solo

nell’instabilità meiotica la patologia viene trasmessa e si osserva il fenomeno dell’anticipazione genica.

L’espansione delle triplette è probabilmente dovuto ad appaiamenti errati e slittamenti del filamento figlio nel corso della replicazione, in questo modo si replica lo

stesso gene del filamento stampo più volte.

Oltre un certo numero di ripetizioni si ha la patologia perché le espansioni stesse causano una variazione nella conformazione del DNA e perché si otterranno

mRNA, e dunque proteine, malfunzionanti o non funzionanti.

Molte patologie neurodegenerative sono dovute ad una ripetizione di CAG che viene tradotto in poliglutammina.

Una patologia che presenta ripetizioni è la Sindrome dell’ X fragile nella quale si osservano da 200 a 1300 ripetizioni di CGG nel cromosoma X a livello del sito

fragile: il sito fragile è una zona nella quale si può osservare una strozzatura del cromosoma perché questo non si compatta bene nel corso della mitosi e, in

questa patologia, in questa regione dove ci sono le triplette espanse c’è il gene FMR che subisce metilazioni a livello della citosina e quindi la codifica di FMR1

non funzionante (serve nel SNC).

Questa malattia presenta anche la dipendenza dal sesso del genitore perché soltanto se è la madre a trasmettere l’allele premutato (con un n° di ripetizioni <

200) si avrà un aumento delle triplette nel corso della fase embrionale a livello dell’ovulo materno. Se l’allele è trasmesso dal padre non si osserverà espansione

dell’allele pertanto, solo le figlie (i maschi ricevono X) erediteranno la premutazione (senza espansioni!!), se l’allele è trasmesso dalla madre (che ha 2X) il 50%

dei figli maschi sarà affetto e il 50% delle figlie avrà la mutazione completa (ma fenotipo parzialmente invalidato perché compensa l’altra X).

Malattia di Huntington – E’ una malattia neurodegenerativa che porta a ritardo mentale, a movimento coreici e alla morte in 15 anni. L’espansione si osserva se

l’allele è ereditato dal padre. L’espansione interessa il gene IT15 (su 4p) e codifica per l’huntingtina: si ha l’espansione della tripletta CAG che codifica

glutammine in eccesso. Il numero di ripetizioni per la premutazione è 23­36 CAG e per avere la malattai 36­121 CAG. La proteina mutata interagisce in modo

strano con altre proteine e si trova in prossimità del nucleo oltre che provoca tossicità cellulare.

Meccanismo patogenetico In base alle mutazioni delle proteine si pu ò avere un meccanismo di guadagno di funzione per la quale si osserva un accumulo di

aggregati proteici che sono tossici per la cellula e inducono mutazioni mitocondriali e alterazioni nella trascrizione; o un meccanismo di perdita di funzione per

cui, per esempio, si ha una perdita della funzione anti­apoptotica e la cellula sopravviverà replicandosi indefinitamente.

Un altro tipo di mutazione osservabile riguarda il numero dei cromosomi presenti nell’assetto cromosomico. Quando un organismo ha un numero esatto di

cromosomi (o un multiplo) si dice euploide, quando questo numero è diverso di parla di aneuploidia.

L’aneuploidia deriva, solitamente, da una non­disgiunzione in meiosi I o II che causa la formazione di gameti con un assetto non aploide: quando questi gameti

andranno ad unirsi con l’altro gamete si formerà uno zigote con assetto anueploide.

Esistono diversi tipi di anueploidia:

• Nullisomia: lo zigote manca della coppia di cromosomi. La non­disgiunzione deve essere avvenuta in entrambi i genitori e lo zigote ha ereditato i

gameti senza cromosomi.

• Monosomia: Un gamete privo di cromosomi l’altro aploide. Non­disgiunzione in un solo genitore.

• Trisomia: Un gamete diploide (non­disgiunzione) e l’altro normale

• Tetrasomia: Due gameti diploidi.

L’aneuploidia può riguardare uno o diversi cromosomi. Nella popolazione umana è facile osservare aneuploidi riguardo al sesso soprattutto femminile, a causa

della lyonizzazione della X. Embrioni monosomici difficilmente sopravvivono, così anche gli embrioni trisomici.

Sindrome di Down ­ Bambini con trisomia del 21 presentano ritardo mentale, bassa statura e mani corte. L’incidenza della malattia correla con l’età della madre

(e del padre se la madre >35 aa) perché è probabilmente dovuta ad errori nella meiosi II quando l’oocita rimane troppo tempo dentro l’ovaio. Fumo combinato

con contraccettivi orali aumenta il rischio. La sindrome può anche essere dovuta a traslocazione robertosiniana.

Sindrome di Patau – Trisomia del 13. Bambini con labiopalatoschisi, ritardo mentale, malformazioni cardiache che raramente sopravvivono oltre i 3 mesi.

Sindrome di Edwards – Trisomia del 18. Si osserva in particolar modo per neonati femmine. Diverse malformazione corporee, capo allungato, ritardo mentale.

Raramente sopravvivenza oltre 6 mesi.

Un ultimo tipo di variazione dell’assetto cromosomico causa la variazione non di una sola coppia di omologhi ma di tutte le coppie di omologhi e l’organismo che

ne deriva è definito monoploide, se presenta solo una copia di ogni omologo (come aploide, ma l’organismo normale è diploide) o poliploide, se presenta un

numero di copie > 2 di omologhi (negli uomini è comune la triploidia, che porta all’aborto o morte precocissima, con 3 copie di ogni omologo). Questi assetti

cromosomici derivano da errori nella formazione del fuso, da non­disgiunzioni che coinvolgono tutti i cromosomi o da assenza di citocinesi (che fa restare la

cellula duplicata ma non divisa).

Regolazione dell’espressione genica nei procarioti

Nei batteri, come anche negli eucarioti, possiamo trovare due classi di geni all’interno del genoma: geni regolati, attivati in seguito alle necessità della cellula e

geni costitutivi, che codificano per proteine necessarie alla sopravvivenza dell’organismo. I geni che codificano per proteine che andranno a formare una

macchina proteina, quindi a lavorare insieme, si trovano, nei batteri, posti uno di fianco all’altro nell’operone e formano un mRNA policistronico (cioè un mRNA

che codifica per geni diversi).

I geni possono essere ulteriormente classificati in geni inducibili, solitamente inattivi e attivati in seguito all’interazione di un induttore (molecola di vario tipo) e

una proteina regolatrice dei geni a livello di una sequenza regolatrice di geni a monte del gene da codificare, o geni reprimibili, che sono solitamente attivi e

vengono disattivati con lo stesso meccanismo.

Operone lac di E. coli (tipico esempio di gene inducibile).

E. coli cresce in un terreno minimo contenente Sali minerali più una fonte di glucosio: per l’attività metabolica del glucosio sono espressi i relativi geni.

Se, come fonte di carbonio, ad E. coli, viene fornito lattosio al posto di glucosio devono venire sintetizzati i geni che permettono il metabolismo di quest’altro

zucchero. Questi geni sono espressi nel momento in cui è disponibile lattosio al posto del glucosio e pertanto sono regolabili.

I geni coinvolti nel metabolismo del lattosio sono 3: ­galattossidasi (gene lacZ), che scinde il legame tra glucosio e galattosio (che insieme formano il lattosio), il

β

lattosio permeasi (gene lacY), che permette il trasporto dentro la cellula del lattosio e ­galattoside transacetilasi (gene lacA), utile nel metabolismo del lattosio.

β

Mediante esperimenti di mappatura genetica fu osservato che i 3 geni del metabolismo del lattosio sono associati tra loro in ordine 5’ –lacZ, lacY, lacA – 3’ con

una sola sequenza promotore a monte del gene che crea quindi un solo mRNA che nella traduzione formerà le 3 diverse protenie.

Tramite studi su mutazioni individuare che variazioni all’attività del gene conseguivano in seguito a mutazioni in due regioni a monte dei 3 geni: una regione

subito prima di lacZ detta operatore (lacO) e un'altra classe sopra lacO detta gene per il repressore (gene lacI).

Mutazioni a lacO Mutazioni portate all’operone grazie all’uso di batteri parzialmente diploidi (batteri con fattore F’ che contiene alcuni geni del cromosoma

+ ­ +

batterico). In uno degli esperimenti si osservava che il batterio parzialmente diploide presentava una sequenza lacO ­ lacZ ­ lacY ed un’altra sequenza con

c + ­

lacO (mutato)­lacZ ­lacY : trovarono che lacY (adiacente all’operatore non mutato) era espresso solo in presenza di lattosio mentre lacZ (vicino all’operatore

mutato) veniva espresso sempre. A partire da queste osservazioni fu possibile affermare che una mutazione sull’operatore va ad influenzare SOLO i geni a valle

sulla stessa molecola di DNA dell’operatore e non ha alcuna influenza su geni dell’altra molecola (altrimenti avremmo avuto lacY sempre espresso!), questo

fenomeno è stato identificato come cis­dominanza. + + — + ­ + + ­

Mutazioni di lacI In un diploide parziale contenente una sequenza lacI ­lacO ­lacZ lacY e una sequenza lacI lacO ­lacZ ­lacY fu osservato che in assenza di

­

induttore non veniva espresso né lacZ né lacY (se la mutazione fosse cis­dominante come prima lacZ doveva essere espresso dove era presenza lacI ) e

+ ­

dunque fu affermato che lacI aveva un effetto dominante (quindi rendeva “silente” lacI ) anche sull’altra sequenza di DNA e pertanto si osservò che questa

­

sequenza era trans­dominante. Alla sequenza lacI fu assegnata la codifica per il gene repressore: su una cellula aploide con lacI si osserva un’espressione

costitutiva.

Modello dell’operone di Jacob e Monod

L’operone è tutta la sequenza che comprende lacI – P(promotore di lacO)­lacO­lacZ­lacY e proposero un modello di regolazione dei geni lacO e lacY sulla base

delle interazioni tra operatore, promotore dell’operatore e gene repressore. +

Il gene lacI si trova a monte di tutta la sequenza e ha un suo promotore ed una sua sequenza terminale: solitamente è presente come lacI e codifica

attivamente per una sequenza di 360 aa che costituisce il gene repressore dell’operone lac.

Il gene repressore prodotto da lacI si lega al promotore di lacO (quindi subito dopo) e copre questo promotore impedendo alla RNA pol di legarvisi. Quando è

presente lattosio (nella forma di allolattosio) nel terreno di coltura, questo si lega al gene repressore attaccato al promotore di lacO e causa in esso una modifica

conformazionale (perché è una proteina allosterica) che ne causa la dissociazione dal promotore stesso e permette quindi all’mRNA di legarsi e iniziare la

codifica.

Una mutazione di lacO causano una variazione di basi nel promotore che non viene quindi riconosciuto dal repressore e rende costitutiva l’espressione dei 3

geni; così anche una mutazione di lacI codifica per un repressore poco funzionale e questo non si attacca al promotore e non può impedire la sintesi dei 3 geni.

s

* Altre mutazioni di lacI Esiste una mutazione nota come lacI che produce un super­repressore, ovvero un repressore trans­agente (che quindi blocca anche

l’altra sequenza di DNA) che si attacca al promotore e non si separa da esso nemmeno in presenza di allolattosio perché non è un repressore allosterico e

dunque non ha variazioni di conformazione che ne causano il distacco dal promotore.

Regolazione positiva dell’operone lac Regolazione che attiva lac e lo fa soltanto se è presente lattosio e completamente assente il glucosio (perché se è

presente un po’ di glucosio è preferibile il consumo di questo da parte della cellula). Quando è

presente soltanto il lattosio una proteina detta CAP (catabolite activator protein) si lega a cAMP a

formare un complesso che si attacca ad una regione, detta sito CAP, a monte del promotore lacO e

causa un forte legame del mRNA con l’operone lac (solitamente il legame è deboluccio!). Quando

nel terreno è presente anche del glucosio si ha inibizione di questa regolazione, repressione da

cataboliti, perché la presenza del glucosio agisce su un gene che codifica per l’adenilato ciclasi che

a sua volta permette la trasformazione di AMP a cAMP (in sostanza il glucosio riduce i livelli di

cAMP e quindi CAP non ha elementi cui legarsi!).

Operoni reprimibili

Nelle vie anaboliche esistono soprattutto operoni repressi nel momento in cui il prodotto è presente

come prodotto finale. Un esempio tipico è l’operone per il triptofano che se E. coli è posta su un

terreno minimo codifica per enzimi necessari alla biosintesi del triptofano mentre, se posta su un terreno contenente trp è repressa e non produce gli enzimi.

L’operone per trp è costituito da 5 geni strutturali (E­D­C­B­A) e a monte di E ci sono l’operatore (trpO) e il suo promotore. Tra trpO e trpE c’è una piccola

sequenza detta trpL (leader) che al suo interno, verso trpE contiene un sito attenuatore (att). Sono presenti diversi meccanismi di regolazione:

° Repressione di trp quando è presente il triptofano: a monte (un po’ lontano) dall’operone trp si trova una sequenza regolatrice che codifica attivamente un

repressore allosterico (aprorepressore) che, solitamente, ha una forma che non gli permette di legarsi a trpO e quindi l’operone trp esprime i suoi geni. In

presenza di triptofano, lo stesso triptofano interagisce con l’aprorepressore modificandone la conformazione che diventa attiva e quindi riesce a legarsi a trpO

inibendo la sintesi dei geni dell’operone.

° Controllo della quantità di trascritti lunghi e brevi: se il triptofano è assente l’operone trp lavora al massimo, se è presenti in scarse quantità l’operone esprime

debolmente i suoi geni. Questo è possibile perché, tramite un sistema di attenuazione, vi è un controllo della quantità di trascritti lunghi (che esprimono tutti i 5

geni) rispetto a quello corti (che terminano nella regione att di trpL).

La regione trpL codifica per un mRNA e quindi ha una regione di inizio (AUG), una regione contenente due codoni per il triptofano (UGG­UGG) detta regione 1,

un codone di stop e altre due regioni a valle (prima dei 5 geni trp) dette 2 e 3. Per questo processo è importante considerare che la trascrizione, nei batteri, è

seguita subito dalla traduzione da parte dei ribosomi (non c’è membrana del nucleo).

Quando il trp manca nella cellula da trpL si produce mRNA che si può appaiare per complementarietà di basi: si appaia tra 1­2, formando un segnale di

antiterminazione, se il ribosoma non presenta tRNA appaiato all’aa trp e quindi è indotta l’espressione dei 5 geni per il triptofano. Se nella cellula vi è almeno un

po’ di trp l’mRNA prodotto da trpL si appaia nelle regioni 2­3 inducendo un segnale di terminazione (dato dal ribosoma che porta tRNA legati a trp) che induce

l’inibizione nell’espressione dei 5 geni e il trascritto, quindi, termina con l’mRNA di trpL.

Questo tipo di controllo avviene, quindi, in seguito all’inizio della trascrizione.

Regolazione genica negli eucarioti

La regolazione genica negli eucarioti è in parte associabile alla regolazione nei procarioti e in parte è specifica per gli eucarioti in quanto sono dotati di

membrana nucleare e hanno necessità di espressione genica anche in base al differenziamento della cellula. Anche negli eucarioti i geni sono suddivisibili in

geni costitutivi e geni condizionali (espressi in base alle necessità della cellula).

E’ importante osservare che anche se la cellula differenziata è capace di esprimere solo determinati geni non significa che questa ha perso gli altri geni:

esperimenti di clonazione dove nuclei di cellule differenziati sono introdotti in oociti enucleati hanno permesso l’ottenimento di embrioni funzionali a riprova del

fatto che anche la cellula differenziata, sotto appositi segnali, può tornare ad esprime geni non più espressi.

Mentre nei procarioti le cellule effettuano la regolazione a livello trascrizionale e solo parzialmente a livello traduzionale (perché la traduzione segue

immediatamente la trascrizione), negli eucarioti la regolazione avviene a diversi livelli di cui i più importanti sono: l’accessibilità della cromatina, la regolazione

trascrizionale, la regolazione post­trascrizionale.


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Lydia90

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DETTAGLI
Corso di laurea: Corso di laurea magistrale in medicina e chirurgia (a ciclo unico)
SSD:
A.A.: 2014-2015

I contenuti di questa pagina costituiscono rielaborazioni personali del Publisher Lydia90 di informazioni apprese con la frequenza delle lezioni di Biologia e genetica e studio autonomo di eventuali libri di riferimento in preparazione dell'esame finale o della tesi. Non devono intendersi come materiale ufficiale dell'università La Sapienza - Uniroma1 o del prof Cicchini Carla.

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