Riassunto esame Genetica, Genetica. Un approccio molecolare Russell, prof. Cicchini

Genetica e medicina

La genetica è la branca delle scienze che si occupa di studiare i geni, come si trasmettono e la frequenza con cui si osserva l’espressione di un particolare tipo di gene.

Settori di ricerca nella genetica

La genetica è suddivisa in quattro settori di ricerca:

• Genetica di trasmissione: studia come si trasmettono i caratteri all’interno di un gruppo familiare.
• Genetica molecolare: studia gli eventi molecolari coinvolti nella trasmissione di geni.
• Genetica di popolazione: studia la frequenza con cui compare un gene nella popolazione.
• Genetica quantitativa: studia insiemi di geni che causano patologie geneticamente complesse.

La genetica affida le sue ricerche allo studio di organismi modello in quanto l’evoluzione ha portato alla conservazione dei geni più importanti: per gli eucarioti sono importanti il topo, il lievito e altri, mentre per i procarioti assume importanza fondamentale il batterio presente nell’intestino umano di E. coli.

Prime teorie ereditarie

In tempi remoti i genetisti avevano capito che l’informazione ereditaria doveva essere contenuta in elementi dotati di una certa stabilità, capaci di replicarsi e anche capaci di variazione (fino ad un certo punto). Una volta individuati i cromosomi, composti da proteine e acidi nucleici, si pensava che fosse la componente proteica responsabile della conservazione dei caratteri ereditari e non DNA ed RNA.

Esperimenti chiave

Esperimento di Griffith

Nel corso di studi sullo pneumococco, Griffith notò che la forma S del batterio era virulenta e la forma R innocua. Della forma S erano presenti due tipologie IIS e IIIS, la prima innocua e la seconda aggressiva, e sia IIS che IIIS potevano trasformarsi in R (cioè da IIS a IIR e viceversa ma non IIR a IIIS). Iniettando a topi IIIS questi morivano, mentre IIS e IIR non morivano. Con batteri IIIS uccisi dal calore prima dell’iniezione, i topi rimanevano in vita. Tuttavia, iniettando IIR vivi e IIIS uccisi, il topo moriva, significando che il materiale genetico morto di IIIS aveva “infettato” IIR vivo, forse a causa di un principio trasformante (proteina).

Esperimento di Avery

Avery e il suo team provarono a prelevare il contenuto del batterio IIIS e metterlo in incubazione, in una capsula di Petri, con batteri vivi IIR. Dopo un certo tempo, il ceppo IIIS tornava in vita. Trattando enzimi capaci di degradare rispettivamente proteine, polisaccaridi, RNA o DNA, trovarono che la trasformazione non si osservava solo se veniva degradato il DNA (con desossiribonucleasi – DNasi).

Esperimento di Hershey e Chase

Hershey e Chase studiarono il batteriofago T2 che per sopravvivere inietta il suo contenuto virale all’interno del batterio, usa le sue risorse molecolari e poi porta alla lisi della cellula ospite. Marcarono con isotopi radioattivi contenenti fosforo (presente nel DNA) o zolfo (presente nelle proteine) due fagi T2 e, in seguito, infettarono due diverse colonie batteriche di E. coli: osservarono che il DNA marcato passava da T2 ad E. coli dopo l’infezione e il lisato fagico conteneva il DNA marcato, mentre le proteine marcate radioattivamente restavano nell’ombra fagica. Dedussero che il principio trasformante (e infettivo) era il DNA, che veniva trasmesso da una progenie all’altra.

Struttura di DNA e RNA

Gli acidi nucleici sono composti da: base azotata, zucchero a 5 atomi di carbonio e gruppo fosfato. Lo zucchero è ribosio per l’RNA (con –OH a destra di C2) e desossiribosio nel DNA (–H a destra di C2). Le basi azotate si dividono in due classi: pirimidine (anello eterociclico con 2 atomi di N) e purine (doppio anello con 9 atomi in totale – 4 atomi di N). Le basi azotate pirimidiniche sono citosina, timina (solo nel DNA) e uracile (solo nell’RNA); le purine sono guanina e adenina.

Lo zucchero ha C5’ legato al gruppo fosfato e C1’ legato covalentemente alle basi: la struttura base + zucchero è un nucleoside, la struttura base + zucchero + gruppo fosfato è un nucleotide. L’ossatura del DNA o dell’RNA è costituita dal susseguirsi ordinato di zucchero-fosfato: il gruppo fosfato si lega al carbonio 5’ di uno zucchero e si lega “sopra” al carbonio 3’ di un altro monomero; la polarità della cellula presenterà dunque un’estremità 3’ libera da un lato e un’estremità 5’ libera dall’altro.

Regola di Chargaff

Chargaff individuò che i nucleotidi sono composti al 50% da purine e al 50% da pirimidine e che il numero di A è uguale al numero di T e il numero di C è uguale al numero di G.

Diffrazione a raggi X (Franklin)

È stata purificata e allungata una soluzione di DNA, colpita con un fascio parallelo di raggi X che veniva diffratto dal peso atomico e dalla posizione delle molecole e, infine, registrato su una pellicola. La struttura riflessa era un’elica.

Modello del DNA di Watson e Crick

• I nucleotidi sono organizzati in filamenti avvolti in un’elica destrorsa in cui i singoli filamenti sono antiparalleli.
• L’ossatura zucchero-fosfato è esterna alla catena e all’interno vi sono le basi associate da legami idrogeno.
• La base A si lega con T con 2 legami H. La base C si lega con G con 3 legami H. Una coppia di basi si dice complementari e i due filamenti sono complementari tra loro.
• Ogni giro di elica contiene 10 coppie di basi. A causa del legame tra le basi, l’ossatura zucchero-fosfato presenta distanze diverse nel corso del filamento: in questo modo si possono osservare un solco maggiore e un solco minore. Nel solco maggiore sono parzialmente esposte le basi e lì si legano le proteine regolatrici di geni.

Tipi di eliche del DNA

• A-DNA: Elica larga e corta, si forma con bassa umidità e ha il solco maggiore stretto e profondo e il solco minore largo e poco profondo. Raro nel DNA umano.
• B-DNA: Elica più stretta e più lunga dell’A-DNA, presenta i solchi maggiore largo e quello minore stretto con uguale profondità. Tipico del DNA umano.
• Z-DNA: Elica che può essere anche sinistrorsa con 12 coppie di basi per giro. L’ossatura ha andamento a zig-zag e il solco maggiore non è apprezzabile.

L’RNA si presenta come il DNA solo che è composto da ribosio, dalla base uracile al posto della timina e che si trova presente come un singolo filamento ripiegato su sé stesso con una struttura molecolare secondaria. Esistono numerose forme funzionali dell’RNA: tRNA, mRNA, rRNA, miRNA e così via.

Genoma e cromosomi

Nei cromosomi troviamo l’intera sequenza del DNA definita genoma: un intero genoma è presente in cellule aploidi, le cellule diploidi contengono un corredo genomico doppio.

Cromosomi virali

I virus possono avere un genoma costituito da RNA o DNA a singola o a doppia elica disposti su uno o più cromosomi. La variabilità genetica dei virus è altissima.

Cromosomi procarioti

Presentano il genoma disposto su un unico cromosoma circolare principale e, a volte, altri cromosomi più piccoli (sia lineari che circolari) che replicano indipendentemente e che, se non funzionali alla sopravvivenza, vengono detti plasmidi. La zona dove è organizzato il nucleo nei batteri è detta nucleoide e non ha una membrana nucleare che separa questa zona dal resto del nucleo, questo perché il DNA è superavvolto: il DNA superavvolto presenta alcune zone normalmente circolari, altre sono superavvolte perché il DNA prima di organizzarsi nella forma circolare si è dissociato per alcune basi che hanno consentito un superavvolgimento. Il superavvolgimento rende tesa la molecola di DNA e può essere superavvolgimento in senso negativo o positivo a seconda che, svolgendo o riavvolgendo la molecola, si perda o si acquisti un giro completo. A creare il superavvolgimento sono coinvolte le topoisomerasi. Poi il DNA è ulteriormente organizzato in anse.

Cromosomi eucarioti

Il genoma umano è organizzato in diversi cromosomi. Le cellule diploidi contengono 46 cromosomi (doppi, uno proveniente dal padre e l’altro dalla madre) e le cellule aploidi 23 cromosomi (22 autosomi + 1 cromosoma sessuale). La quantità di geni all’interno del corredo aploide è costante per specie ed è detta valore c. I cromosomi eucarioti, nel corso del ciclo cellulare, si replicano e assumono svariate forme.

La cromatina è il complesso DNA + proteine (istoniche e non istoniche) compattato. Le proteine istoniche sono piccole proteine circolari con carica positiva che si associano al DNA carico negativamente; ne esistono 5 tipi diversi (H1, H2A, H2B, H3, H4) e sono coinvolte nell’impacchettamento del cromosoma che, senza gli istoni, sarebbe lungo 2 metri per cromosoma. Le proteine non istoniche hanno, solitamente, carica negativa e sono coinvolte in processi di replicazione, riparazione, trascrizione e via dicendo: sono varie da specie a specie (quelle istoniche sono simili per tutti gli eucarioti).

Livelli di compattamento della cromatina

• Il primo livello è la fibra 10 nm e sembra una collana di perle dove le perle sono nucleosomi, ovvero 8 proteine istoniche [2(H2A+H2B+H3+H4)] che avvolgono ad anello 147 basi. I nucleosomi sono collegati da DNA linker.
• Il livello successivo di compattamento è dovuto all’istone H1 che fa assumere una forma a zig-zag alla cromatina.
• Il livello seguente è la cromatina a 30 nm che probabilmente sembra un’elica. Questa struttura crea poi delle anse grazie a proteine non istoniche che si legano in regioni SAR (regioni associate all’impalcatura) che creano l’impalcatura cromosomica che assume una forma a fiore ripetuta.

La cromatina si trova in due stati principali:

• Eucromatina, poco compatta, presente all’inizio della fase S per la replicazione e facilmente trascrivibile.
• Eterocromatina, particolarmente compatta, con geni trascritti inattivi; l’eterocromatina costitutiva presenta compattamento per entrambi i geni dei cromosomi omologhi, l’eterocromatina facoltativa invece presenta solo uno dei due cromosomi compatto e inattivo (come nel corpo di Barr per la X femminile dei mammiferi).

Nei cromosomi delle cellule eucariotiche troviamo sempre due strutture tipiche:

• Telomero: rappresenta una specifica sequenza di DNA alle estremità della doppia elica (quindi il cromatidio avrà 2 telomeri), ha sequenza variabile e spesso è ancorato alla membrana nucleare della cellula eucariotica per garantire stabilità alle estremità cromosomiche. Solitamente i telomeri hanno sequenza nucleotidica ripetuta e sono disposti a singolo filamento ripiegato su sé stesso. In Drosophila, i telomeri contengono trasposoni (parti di DNA che si spostano liberamente nel filamento).
• Centromero: si vede come un restringimento del cromosoma in una zona più o meno equatoriale che risulta particolarmente importante per la segregazione dei cromatidi nel corso della mitosi. I centromeri hanno sequenza e funzione simile per tutti gli eucarioti ma variano molto da organismo a organismo.

Il DNA può essere presente a sequenza unica (ripetuto poche volte), a sequenza moderatamente (10 ripetizioni) e DNA altamente ripetuto. Nei procarioti, a parte geni che costituiscono tRNA e rRNA, il DNA è presente come sequenza unica, mentre nell’uomo le sequenze uniche sono il 60% e la maggior parte dei geni che codificano per proteine sono di queste specie.

Le sequenze moderatamente e altamente ripetute possono essere presenti a intervalli regolari o disposte in cluster (come per telomeri e centromeri) di geni che si ripetono: le sequenze a intervalli regolari possono essere lunghe (LINE) o corte (SINE) e si osservano con una certa regolarità nel genoma. Le LINE1 sono il 15% del genoma umano e sono dei trasposoni – le Alu sono SINE che rappresentano il 9% del genoma e sono trasposoni ma non codificano più gli enzimi che consentono il loro spostamento.

Replicazione del DNA

Watson e Crick ipotizzarono una replicazione del DNA semiconservativa, dove l’elica si apre e si ricrea un filamento complementare per ogni elica parentale in modo che le due eliche composte dalla replicazione contengano un filamento originale e uno nuovo.

Meselson confermò l’ipotesi del modello semiconservativo facendo crescere un batterio con DNA con N¹⁵ (isotopo denso) e un altro con N¹⁴ e permettendo la replicazione cellulare: con la tecnica della centrifugazione all’equilibrio in gradiente di densità (dove una provetta con CsCl viene centrifugata e si ottiene una provetta con densità diverse dall’apice alla base) valutò se dopo la replicazione si osservavano una banda N¹⁵ e una N¹⁴ (modello conservativo – un vecchio filamento parentale e uno completamente nuovo) o una banda intermedia N¹⁴-N¹⁵ come previsto dal modello semiconservativo e, ovviamente, dall’esperimento emerse il secondo caso.

Enzimi coinvolti nella replicazione

Kronberg, biochimico, individuò nella DNA polimerasi I l’enzima coinvolto nella replicazione del DNA e studiò che per la sintesi in vitro di DNA erano necessari quattro componenti: precursori di nucleotidi (le basi azotate + fosfato), DNA pol I, elica parentale, primer “innesco” di DNA e Mg²⁺ (per far funzionare la DNA pol I).

Caratteristiche della DNA pol I: aggiunge, sempre, ad un nucleotide con OH in 3’ libero un precursore attaccando all’OH 3’ il fosfato (che a sua volta è legato alla base al carbonio 5’ dello zucchero successivo): la reazione, sfavorita energeticamente, avviene per idrolisi di due dei 3 fosfati del precursore (ne rimane solo uno). La DNA pol I è capace solo di lavorare aggiungendo fosfati al 3’ e non in direzione opposta e sceglie le basi corrette (il più delle volte) da accoppiare.

Esistono due tipi di DNA pol coinvolti nella replicazione: DNA pol I e DNA pol III. DNA pol I è una catena di polipeptidi, DNA pol III è composta da 3 subunità (α, β, θ) e racchiude le funzioni catalitiche delle polimerasi: entrambe le polimerasi lavorano in direzione 5’–3’ (ovvero aggiungono solo a 3’) e hanno attività esonucleasica in direzione 3’–5’ (ovvero riescono a togliere nucleotidi all’estremità 3’ – tornano indietro rispetto alla sintesi!). L’attività esonucleasica (che può avvenire anche in 5’–3’) è importante per la “correzione di bozze” della sintesi del nuovo filamento.

Replicazione (in E. coli)

La replicazione inizia in una zona “replicatore” che contiene l’origine di replicazione, il punto nel quale si srotola la doppia elica di DNA (a formare la bolla di replicazione) e dove si formeranno i filamenti stampo a partire dai filamenti parentali. All’origine di replicazione si forma un’apertura a Y, detta forcella replicativa, che, nelle molecole di DNA circolare, avanza in due sensi in modo da rendere la replicazione bidirezionale.

Per dare inizio alla replicazione servono apposite proteine iniziatrici che si leghino all’origine di replicazione e permettano l’ancoraggio al filamento parentale delle DNA elicasi che srotolano il doppio filamento, aprendolo nelle due direzioni grazie all’energia prelevata dall’idrolisi di ATP. La DNA elicasi richiama a sé la DNA primasi formando il primosoma: la DNA primasi è importante a causa dell’incapacità della DNA pol I di sintetizzare un filamento stampo dal nulla; questa primasi crea un primer a RNA che crea un primo pezzo del filamento stampo che permetterà alla DNA pol di sintetizzare un nuovo filamento (poi l’RNA sarà rimosso in seguito). A tenere aperti i filamenti appena dissociati intervengono delle proteine dette SSB (single-strand binding) che impediscono l’appaiamento, energeticamente favorito, di basi complementari.

I due filamenti, tuttavia, decorrono in senso antiparallelo: un filamento decorrerà in senso 5’3’ (filamento guida) e l’altro, complementare, in direzione 3’5’. La DNA pol è però solo capace di lavorare aggiungendo nucleotidi (e in particolar modo il fosfato) al 3’ dell’ossatura e, per tale motivo, la replicazione avviene in due diverse direzioni nel filamento guida e in quello stampo: nel filamento guida la replicazione seguirà la direzione in cui si apre la forcella di replicazione, nel filamento lento decorrerà nel senso inverso dell’apertura della forcella (in modo da restare in 5’3’).

• Nel filamento guida la DNA pol (III) necessita soltanto di un primer per iniziare la replicazione e poi replica in modo continuo seguendo la forcella di replicazione.
• Nel filamento lagging la replicazione è discontinua perché, avanzato in senso contrario, necessita di continui primer a RNA perché al DNA polimerasi, lavorando in direzione 5’3’ anche nel filamento che si apre in direzione 3’5’, torna indietro di poco, da un primer all’altro, formando tronconi di filamento stampo noti come frammenti di Okazaki. I filamenti di Okazaki sono intervallati tra loro da numerosi primer che poi la DNA pol I rimuoverà (attività esonucleasica) per rimetterci un filamento di DNA complementare (tanto non ha bisogno di primer perché ci sono già gli inneschi) e, infine, tutti i vari frammenti vengono uniti da una DNA ligasi.

Il filamento lento si ripiega in modo da orientarsi in direzione 5’3’ anche perché la DNA pol III fa parte di un complesso proteico inseparabile. Tutte le proteine coinvolte nella replicazione del DNA si trovano a formare, in prossimità della forcella di replicazione, un complesso proteico noto come replisoma.

Replicazione a cerchio rotante

Replicazione che si osserva in batteriofagi che mostrano un DNA a doppia elica circolare. Il DNA circolare è inciso in un punto e i filamenti vengono separati: il filamento che mostrerà libera l’estremità 5’ verrà separato dal circolo tra proteine SBB mentre il DNA che espone...