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ESTRATTO DOCUMENTO

Anche l’alcolismo è un carattere comportamentale che viene influenzato sia dai geni che

dall’ambiente. Sebbene non esista un gene che porta all’alcolismo, è stato osservato che figli di

alcolisti, allontanati dai genitori e adottati da altri non alcolisti, avevano una tendenza decisamente

maggiore di altri individui di diventarlo.

L’azione dei geni in questo caso è quella di rendere l’individuo più o meno suscettibile all’abuso di

alcool, ma questo deve essere ben disponibile nell’ambiente per poter creare dipendenza.

È in corso un forte dibattito sul rapporto di responsabilità dei geni e dell’ambiente nel determinare

l’intelligenza umana. Non vi è dubbio che i geni partecipino alla formazione dell’intelligenza, visto

che alcune malattie genetiche possono diminuirla. Comunque, anche il tipo di famiglia,

l’alimentazione e la cultura sono fattori ambientali importanti nell’influenzare l’intelligenza umana.

32

MAPPATURA DEI GENI NEGLI EUCARIOTI

Sebbene fin’ora abbiamo visto esempi di geni che vengono ereditati in maniera indipendente,

bisogna tenere conto che molti di essi vengono ereditati in gruppo in quanto sono presenti sullo

stesso cromosoma. Geni posti sullo stesso cromosoma sono chiamati geni concatenati e

appartengono allo stesso gruppo di concatenazione.

È bene sottolineare che esistono due tipi di posizioni per i geni concatenati sul cromosoma:

Accoppiamento: i due alleli selvatici sono su un cromosoma e quelli mutanti sull’altro

 + +

w m /wm (w sta per white ed m sta per miniature, riferito all’occhio ed alle ali di

Drosophila). + +

Repulsione: ogni cromosoma possiede un allele selvatico ed uno mutante w m/wm .

Per identificare la presenza di geni concatenati si incrociano individui che abbiano almeno due

differenti caratteri genici. Quindi si analizza la progenie e si determina la frequenza con cui

appaiono le nuove combinazioni fra questi due caratteri: queste si formano in un processo di

ricombinazione genetica e le classi della progenie con nuove combinazioni sono dette

ricombinanti. Se invece le combinazioni restano come quelle parentali, le classi della progenie

sono dette parentali.

In genere, per identificare queste relazioni si utilizza la tecnica del reincrocio (vedi prima). Quando

la frequenza di ricombinazione fra i due geni è minore del 50%, allora si deduce che sono

concatenati.

Determinando la presenza di coppie concatenate è possibile costruire una mappa genica di ogni

cromosoma, importante per determinare il ruolo di ogni gene e studiarne la chimica.

S COPERTA DELLA CONCATENAZIONE GENICA

C ONCATENAZIONE INCOMPLETA NEL PISELLO ODOROSO

Agli inizi del 1900 alcuni studiosi incrociarono due linee pure di pisello odoroso, di cui una con

fiori porpora e polline allungato, ed una con fiori rossi e polline rotondi. Ovviamente, la F 1

mostrava una progenie tutta a fiori porpora e pollini allungati, a dimostrare che questi due caratteri

erano dominanti. Un successivo incrocio fra individui della F , però, non portò al normale rapporto

1

3:1 di incrocio di eterozigoti, ma il rapporto rispetto al colore dei fiori ed alla la forma del polline

era “sbagliato”.

Gli studiosi di quel tempo non riuscirono a spiegare il fatto, ma noi oggi possiamo affermare che i

due caratteri sono portati da due geni che si trovano sullo stesso cromosoma.

Chiamiamo P l’allele per il colore porpora, p quello per il rosso, L quello per il polline allungato e l

per quello rotondo (pag. 136).

Se i due caratteri avessero segregato in modo indipendente, i gameti ottenuti dall’incrocio di due

individui della F (eterozigoti) avrebbe portato a gameti PL, Pl, pL e pl in uguali proporzioni.

1

Invece, visto che gli alleli P e L si trovano sullo stesso cromosoma e sull’omologo si trovano p ed l,

i gameti prodotti sono per il 44% ciascuno PL o pl, e per il 6% ciascuno Pl o pL. Il fatto che si siano

create proporzioni di gameti di questo tipo indica necessariamente una concatenazione fra i due

geni, ma si tratta di una concatenazione incompleta perché, durante il crossing-over, i due

cromosomi omologhi hanno evidentemente scambiato delle parti in modo da poter formare anche

gameti con combinazioni non correlate (il 12% del totale).

Se invece la concatenazione fosse stata completa, si sarebbe ottenuto nella F un rapporto 3:1 fra i

2

fenotipi porpora e allungato, e rosso e rotondo. 33

E M D

SPERIMENTI DI ORGAN SULLA CONCATENAZIONE NELLA ROSOPHILA

Nel 1911 Morgan tentò nuovi esperimenti sulla concatenazione utilizzando la Drosophila.

Osservando i caratteri recessivi w (occhio bianco) e m (miniature: ali ridotte), si accorse che

entrambi erano localizzati sul cromosoma X e quindi concatenati, ma necessitava di una prova

pratica. + +

Incrociò una femmina wm/wm con un maschio selvatico w m /Y (pag. 137).

Alla F i ruoli si erano invertiti, per cui tutti i maschi avevano occhi bianchi e ali ridotte, e tutte le

1 + +

femmine occhi rossi e ali grandi, quindi genotipo w m /wm.

Il successivo incrocio fra due individui della F (equivalente ad un reincrocio perché i maschi sono

1

omozigoti recessivi e le femmine eterozigoti), portò una F in cui le classi parentali erano le più

2

frequenti (ossia la maggior parte della mosche aveva occhi rossi e ali grandi oppure occhi bianchi e

ali piccole), ma erano presenti anche numerose classi ricombinanti (36,9%).

Il fatto che la percentuale di ricombinanti era inferiore del 50% era la prova che i geni erano

concatenati.

Per spiegare la concatenazione, Morgan affermò che doveva essere avvenuto uno scambio di

materiali fra i cromosomi omologhi XX durante la formazione dei gameti. Era il primo passo verso

la scoperta del crossing over. Non poteva essere accaduto nella formazione dello sperma perché X

ed Y non sono omologhi.

In un esperimento successivo, Morgan incrociò maschi selvatici con occhio rosso e corpo grigio, e

femmine con occhi bianchi e corpi gialli. Alla F i rapporti di percentuale davano solo l’1,3% di

2

ricombinanti, per cui Morgan concluse che questi due geni erano più strettamente concatenati di

quelli occhio/ali.

In pratica, tanto più due geni sono vicini sul cromosoma quanto meno è probabile che ci siano

eventi di ricombinazione, perché è improbabile che tali geni vengano divisi durante il crossing-over.

I L CROSSING OVER E LA RICOMBINAZIONE

Ai tempi di Morgan, il fatto che la ricombinazione fosse associata al crossing-over non poteva

essere facilmente osservato e provato come oggi. Prove concrete della veridicità di questa ipotesi

furono trovate solo negli anni ’30.

E SPERIMENTI CON IL GRANTURCO

Il primo esperimento per provare la correlazione fra questi eventi fu effettuata nel 1931, utilizzando

il cromosoma 9 del granturco (Zea mays) ed osservando in particolare due geni eterozigoti per il

colore del seme (C colore e c assenza di colore) e per il tipo di amido prodotto (Wx selvatico e wx

amilopectina – pag. 139).

Uno dei cromosomi omologhi era di forma e lunghezza normale, e portava i geni c Wx. L’altro, con

i geni C wx, era più lungo ed aveva l’estremità più vicina all’allele C ingrossata e colorata (questo

pezzo viene detto knob): in una precedente generazione, il cromosoma 8 si era avvicinato dalla

parte del cromosoma 9 che portava l’allele wx e aveva ceduto un pezzo al cromosoma 9,

allungandolo da una parte e facendogli formare questo ingrossamento dall’altra.

Quest’ultimo cromosoma, così modificato, venne definito un marcatore citologico e i geni

coinvolti marcatori genici.

Quindi, quando avvenne il crossing-over e si formarono due cromosomi ricombinanti, di cui uno C

Wx ed uno c wx, era possibile osservare citologicamente il cambiamento: ora un cromosoma portava

il knob e l’altro il pezzo di cromosoma 8. Solo i cromosomi che avevano questo nuovo assetto

portavano a fenotipi ricombinanti, mentre nelle classi parentali i cromosomi avevano la forma di

partenza, e dunque era evidente che non avevano subito il crossing-over. 34

E D

SPERIMENTI IN ROSOPHILA

Poco tempo dopo un altro studioso pubblicò i propri esperimenti, volti sempre a dimostrare la

correlazione tra crossing-over e ricombinazione, effettuati su Drosophila (pag. 140).

Come nel caso precedente, venivano utilizzati marcatori citologici e genici.

I due geni analizzati erano car (carnation, per il colore dell’occhio color carne) e B (bar, per la

forma dell'occhio a barra). Nessuno dei due è un carattere selvatico, ma car è recessivo e B è

dominante. Inoltre, car è localizzato più vicino all’estremità del cromosoma X rispetto a B.

+

Il maschio parentale aveva su X l’allele recessivo car e l’allele selvatico B (occhio di forma

normale), e mostrava questo fenotipo non avendo alleli corrispondenti su Y.

La femmina aveva entrambi i cromosomi citologicamente distinguibili: su uno degli X, che aveva

+ + +

car e B , c’era attaccata una parte di cromosoma Y dalla parte di car ; sull’altro erano presenti car

e B, ma il cromosoma era molto più corto del normale perché la parte più vicina a B si era spezzata.

Nelle femmine il numero di alleli B determina la presenza di un occhio a barra: nelle omozigoti B/B

la barra è molto stretta, mentre nelle eterozigoti B/+ la barra è più larga.

Quindi, la femmina parentale aveva la barra larga e l’occhio di colore selvatico.

Mentre le classi di gameti maschili prodotti erano due, di cui una col cromosoma Y ed una con il

normale X, nel caso delle femmine si formavano quattro gameti:

Due erano normalmente simili ai parentali.

 +

Due erano ricombinanti: uno di lunghezza normale, con l’allele car e B , l’altro più corto e

 +

con attaccato il frammento di Y, con gli alleli car e B.

Di conseguenza, la progenie portava questi segni citologici e si ebbe una seconda prova della

correlazione fra crossing-over e ricombinazione.

C -

ROSSING OVER ALLO STADIO DI QUATTRO CROMATIDI DELLA MEIOSI

Utilizzando la muffa arancione del pane Neurospora crassa si è potuto dimostrare che il crossing-

over avviene nella profase I, stadio in cui sono presenti quattro cromatidi e non, come si pensava

qualche tempo fa, durante l’interfase, in cui sono presenti due cromatidi.

Prima di tutto bisogna comprendere il ciclo di crescita della Neurospora crassa (pag. 142).

La forma della Neurospora è quella di una massa di filamenti intrecciati. Il colore arancione è

dovuto alle spore asessuali (i conidi) prodotte nella crescita.

La caratteristica che rende questo organismo molto utile per gli esperimenti di genetica sta e nel

ciclo rapido di crescita e nella sua natura aploide, che rende subito evidenti i cambiamenti del

genotipo.

La riproduzione asessuale avviene tramite i conidi o direttamente usando pezzi di Neurospora, in

modo da formare più miceli.

La riproduzione sessuale, invece, vede la presenza di due tipi sessuali, chiamati A ed a. Per produrre

un nuovo individuo sessualmente è necessario che i due tipi, indistinguibili dal punto di vista del

fenotipo, si incrocino. Dai due miceli A ed a, si separano dei nuclei che vanno a fondersi in un

nucleo diploide A/a. Questo va subito incontro a meiosi e poi a mitosi, fino ad arrivare ad otto

cellule aploidi dette ascospore (quattro A e quattro a), contenute in un sacco chiamato asco.

Un particolare importante è che l’ordine delle ascospore riflette esattamente quello dei quattro

cromatidi di ciascuna tetrade: vengono quindi dette tetradi ordinate.

Arrivato a maturazione, l’asco si rompe e le ascospore sono libere di germinare, dopo essere state

trasportate dal vento. 35

Per determinare se il crossing-over avviene in profase I o in interfase, vennero fatti degli incroci fra

+

ceppi geneticamente differenti di Neurospora: il ceppo A aveva un cromosoma con i geni met e his ,

ossia era non in grado di sintetizzare la metionina, ma poteva sintetizzare l’istidina. Il ceppo a, al

+

contrario, era met his. I due geni sono concatenati sullo stesso cromosoma.

Sia l’istidina che la metionina sono necessari per la crescita, quindi per vedere se è stato ereditato

uno o l’altro gene basta osservare su quale terreno di coltura riesce a crescere la nuova Neurospora.

Abbiamo visto che non si ottiene mai una progenie formata completamente da individui

ricombinanti. Se il crossing-over avvenisse allo stadio di due filamenti (in interfase), allora tutti i

filamenti risulterebbero ricombinanti e così anche gli individui ottenuti dalla germogliazione dei

gameti.

Invece, se il crossing-over avvenisse, come è, durante la profase I con quattro cromatidi, solo i due

filamenti più vicini subirebbero la ricombinazione, per cui nella progenie avremmo alcuni individui

con genotipo parentale ed altri ricombinante.

C OSTRUZIONE DI MAPPE GENETICHE

Il processo di mappatura genetica permette di determinare la posizione relativa dei geni sui

cromosomi eucariotici.

D ETERMINARE LA CONCATENAZIONE FRA DUE GENI

Il primo passo per costruire una mappa genetica è quello di determinare se i geni presi in

considerazione sono concatenati.

L’unico modo è quello di analizzare il risultato di un reincrocio in relazione ai due geni considerati

+ + + + + +

(a /a b /b x a/a b/b). Il rapporto tra le possibili classi fenotipiche è di 1:1:1:1 (a b , a b, b a, ab). Se

questo rapporto varia, evidentemente alcuni geni sono concatenati.

Per sapere se la variazione del rapporto è in misura significativa per dire che i geni sono

concatenati, bisogna utilizzare il test del chi-quadro (pag. 145).

Se il risultato finale, ottenuto incrociando su una tabella i valori di chi-quadro e dei gradi di libertà,

è minore o uguale ad un probabilità dello 0,5%, la deviazione è solo dovuta al caso ed i geni

saranno concatenati.

I L RAPPORTO FRA RICOMBINAZIONE E CONCATENAZIONE

Gli esperimenti di Morgan sulla Drosophila per provare la concatenazione, furono importanti anche

perché egli si rese conto che la probabilità di ottenere dei gameti ricombinanti era maggiore per

certi geni concatenati che non per altri: ad esempio, per i caratteri legati al sesso w e m c’era una

probabilità elevata di ottenere ricombinanti, mentre per il corpo bianco o giallo la probabilità era

incredibilmente bassa.

Morgan scoprì che queste probabilità non erano affatto influenzate dalla posizione dei geni

concatenati lungo il cromosoma, ma dalla distanza relativa dei geni concatenati.

Infatti, indipendentemente dal fatto che i geni fossero concatenati in cis oppure concatenati in

trans, la frequenza di ricombinanti era sempre la stessa.

+ + + +

Concatenazione in cis: w m / wm Concatenazione in trans: w m / wm

Uno studente di Morgan, Sturtevant, ipotizzò che la percentuale di ricombinanti potesse essere

utilizzata per stabilire la distanza lungo il cromosoma misurata in unità di mappa (um), fra le

coppie di geni considerate. Una frequenza pari all’1% corrisponde ad 1 um: per definizione,

un’unità di mappa corrisponde alla distanza tra coppie di geni per i quali viene prodotto 1

36

ricombinante su 100. Anche se le ha inventate Sturtevant, le unità di mappa vengono anche

chiamate centi-Morgan in onore a Morgan.

La prima mappa genica si basò su frequenze di ricombinazione rinvenute in Drosophila, utilizzando

i geni w, m ed y (corpo giallo). Si ottennero percentuali di ricombinazione bassi per w ed y, ed alti

per y ed m oppure w ed m: quindi lungo il cromosoma y e w erano vicini ed m era più lontano (pag.

147).

Il reincrocio a due punti è un valido sistema per determinare la percentuale di individui

ricombinanti e quella degli individui parentali in un incrocio.

Vengono incrociati due individui, di cui uno doppio eterozigote per una mutazione autosomica

recessiva (pag. 147) e l’altro doppio omozigote recessivo. Alla F vengono individuate quattro

2

classi fenotipiche, di cui due parentali (su cui non è avvenuto il crossing over) e due ricombinanti.

maggiore sarà il numero di individui con fenotipo parentale, maggiore sarà la probabilità di

concatenazione fra i due geni.

Per calcolare la percentuale di ricombinanti, si usa questa formula:

percentuale di ricombinanti = (n. ricombinanti / tot della progenie) x 100

Il reincrocio a due punti, comunque, viene usato anche per mappare i geni mutati con meccanismi

ereditari particolari:

Mutanti autosomici dominanti: un doppio eterozigote viene incrociato con un doppio

 omozigote recessivo che porta entrambi gli alleli selvatici (il recessivo di un mutante

dominante è l’allele selvatico): + + + + + +

AB / A B x A B / A B

Mutanti legati al sesso recessivi: una femmina doppia eterozigote viene incrociata con un

 maschio emizigote recessivo: + +

a b / ab x ab / --

Mutanti legati al sesso dominanti: una femmina doppia eterozigote viene incrociata con un

 maschio emizigote dominante (per lo stesso motivo dei mutanti autosomici dominanti):

+ + + +

AB / A B x A B / ---

C -

OSTRUZIONE DI UNA MAPPA GENETICA CON IL DOPPIO CROSSING OVER

Una mappa genetica viene costruita valutando anche il numero di volte che il crossing-over è

avvenuto in un dato segmento del cromosoma. Dato che la probabilità che questo evento si verifichi

non è uniforme, si tratta di un calcolo abbastanza complicato. Noi, per semplificazione,

consideriamo che i crossing-over avvengano a caso lungo tutto il cromosoma.

L’evento crossing-over, inoltre, ci pone di fronte ad un’altra difficoltà. Abbiamo visto che, affinché

si possa dire che due geni sono concatenati, la progenie ricombinante non deve superare il 50% del

totale. Se il dato corrisponde al 50%, abbiamo fin’ora affermato che i due geni sono indipendenti.

Ma due geni si definiscono indipendenti sia quando si trovano su cromosomi differenti, sia quando

si trovano sullo stesso cromosoma ma localizzati così lontani che sia praticamente certo che fra loro

avvenga un crossing-over.

Come si distingue il caso di indipendenza per distanza e quello di indipendenza per appartenenza a

due cromosomi diversi?

Si usa il doppio crossing-over: eventi di questo tipo si verificano visto che possono avvenire più

crossing-over in uno stesso ciclo meiotico. Esistono tre tipi di doppio crossing-over (pag. 150): 37

A due filamenti (in cui sono coinvolti due cromatidi su quattro): i cromatidi coinvolti non

 sono fratelli e i quattro genotipi risultanti sono tutti parentali.

A tre filamenti (tre su quattro): risultano due genotipi parentali e due ricombinanti.

 A quattro filamenti: tutti e quattro i genotipi sono ricombinanti.

Consideriamo due geni e tutte le possibilità di crossing-over descritte (singolo e doppio): abbiamo

un totale del 50% di possibilità di genotipi ricombinanti (quindi un’apparente non concatenazione).

Una metà di questo valore, però, è dato dal crossing-over fra loci molto distanti, per cui il valore

50% è troppo elevato e la conclusione che i geni non sono concatenati è sbagliata.

Per capire con certezza se la concatenazione esiste o meno, è necessario tenere conto non di due ma

di tre geni: se a ed m mostrano una percentuale di ricombinazione del 50%, è bene osservare un

terzo gene e, che potrebbe avere percentuali di ricombinazione più basse del 50% sia rispetto ad a

che rispetto ad m. In questo modo, è provato che a ed m sono concatenati ma distanti.

Il doppio crossing-over è veramente importante per costruire una mappa. Due geni vengono posti

più vicini se fra loro sono presenti pochi eventi (o nessuno) di ricombinazione, fatto in genere

dovuto alla piccola distanza che non permette il crossing-over.

Abbiamo visto nel doppio c.o. a due filamenti, però, che un crossing over può non essere registrato

perché avviene nello spazio fra i due loci e la progenie è tutta parentale: potrebbero anche avvenire

una marea di eventi simili, indicando forte distanza tra i due loci, ma nessuno se ne accorgerebbe.

La mappa risulterebbe sbagliata con i due loci troppo vicini.

Quindi, mentre la distanza di mappa genetica è calcolata in base alla frequenza media di crossing-

over tra geni concatenati, la frequenza di ricombinazione è la misura dei crossing-over che danno

origine a scambi osservabili. La relazione lineare che abbiamo posto precedentemente fra frequenza

e distanza, quindi, vale solo per loci molto vicini e non per loci distanti, per cui possono avvenire

eventi non registrati di crossing-over.

Per non incorrere in errori di mappatura, a volte vengono utilizzate delle funzioni di mappa,

formule matematiche che permettono di calcolare le distanze fra loci tenendo conto di c.o. non

registrati.

Altro sistema, un po’ casereccio, è quello di studiare geni molto vicini, perché la probabilità di

incorrere in doppi crossing-over sotto distanze di 10 um è decisamente scarsa.

Altro sistema, più accurato, è l’uso un doppio crossing over a due filamenti, che coinvolga tre geni

all’interno del cromosoma in un tratto relativamente corto (pag. 152): il doppio crossing-over a due

filamenti porterà ad uno spostamento degli alleli del gene centrale, modificando il genotipo e

permettendo di registrare il cambiamento.

M APPATURA DEI CROMOSOMI CON IL REINCROCIO A TRE PUNTI

Il reincrocio a tre punti avviene fra un triplo eterozigote ed un triplo omozigote recessivo.

Supponiamo di avere una pianta in cui sono presenti tre geni concatenati che controllano i fenotipi

del frutto e supponiamo di voler conoscere l’ordine sul cromosoma di tali geni (pag. 154):

+

L’allele recessivo p determina il colore porpora, p il giallo.

 +

L’allele recessivo r determina la forma rotonda, mentre r allungata.

 +

L’allele recessivo j determina frutto sugoso, j secco.

 + + + 3

L’incrocio che dovremo fare sarà p r j /prj x prj/prj. L’incrocio ci darà (2) = 8 classi fenotipiche

differenti, in cui 2 rappresenta il numero di alleli per gene e 3 il numero di geni considerati.

Il primo passo per trovare l’ordine dei geni è determinare quale sta nel mezzo.

Per vedere quale parte della progenie è il risultato di un doppio crossing-over e quale di uno

singolo, si osservano le frequenze: infatti, ci si aspetta che il doppio c.o. sia un fenomeno molto

38

meno frequente del singolo c.o., per cui la coppia di fenotipi presente in minor frequenza sarà il

risultato del doppio c.o.

Nel nostro caso, le due classi meno popolate derivano ognuna dall’unione di un gamete qualsiasi del

+ + +

genitore omozigote e di un gamete p r j oppure prj dell’eterozigote. È j il gene che cambia

posizione nel gamete, quindi sarà j ad essere nel mezzo. Per vedere invece qual è l’ordine degli altri

+ + +

due geni, bisogna osservare che nei gameti parentali dell’eterozigote (p r j e prj), i geni selvatici e

mutanti sono in cis.

L’unico ordine compatibile con i risultati è pjr.

Ora bisogna calcolare le distanze fra i geni. Per comodità, dividiamo la parte di cromosoma che

comprende i tre geni in due regioni: la regione I che comprende il tratto tra p e j, e la regione II tra j

ed r (pag. 155).

Per calcolare la distanza tra p e j bisogna calcolare i ricombinanti fra i due geni. Si sommano sia

tutti i ricombinanti che risultano da singoli crossing-over in questa regione, sia quelli che risultano

da un doppio crossing-over. Il risultato viene diviso per il totale della progenie e moltiplicato per

100. Nel nostro caso, la percentuale è del 20,8%, quindi una distanza di 20,8 um.

Stessa cosa vale per la distanza tra j ed r, ed anche in questo caso si considerano gli individui

risultati da doppio crossing-over (che quindi vengono contati due volte). Calcolata anche questa

percentuale, si ottiene la mappa dei tre geni.

I NTERFERENZA E COINCIDENZA

Si può dire che il fatto che avvenga un crossing-over nella regione I dell’esempio precedente, non

influenzi l’avvento di un crossing-over in regione II ?

Secondo le leggi della statistica, per calcolare la probabilità che avvengano contemporaneamente i

due crossing-over (considerati indipendenti) bisogna moltiplicare la probabilità che avvenga uno

per quella dell’altro.

Nell’esempio riportato, però, la percentuale di doppi ricombinanti è minore rispetto al valore teorico

trovato con questa regola. La discrepanza è dovuta al fatto che il verificarsi di un crossing-over in

realtà influenza il verificarsi dell’altro, a causa di un ingombro fisico chiamato interferenza da

chiasma.

L’entità dell’interferenza, che è necessario conoscere per disegnare una buona mappa cromosomica,

è espressa tramite il coefficiente di coincidenza, dato dal rapporto tra la frequenza di doppi

ricombinanti osservati e la frequenza di quelli attesi.

L’interferenza è data dall’unità meno il coefficiente di coincidenza (1 – coeff. di coinc.).

Se il valore del coefficiente è uguale ad 1, vuol dire che si sono verificati tutti i crossing-over

possibili e infatti l’interferenza è zero. Viceversa, se è uguale a zero vuol dire che non si è verificato

alcun crossing-over e l’interferenza è pari ad 1.

Nei casi in cui un crossing-over ne favorisca un altro, il coefficiente può avere valori >1 e

l’interferenza < 0. 39

MAPPATURA GENETICA

AVANZATA NEGLI EUCARIOTI

A NALISI DELLE TETRADI

L’analisi delle tetradi è una tecnica di mappatura che viene usata per mappare i geni degli eucarioti

in cui i prodotti della meiosi sono contenuti in una singola struttura chiamata tetrade meiotica.

Gli unici organismi eucariotici in cui avviene questo fenomeno sono funghi o alghe unicellulari

aploidi. Per un’analisi genetica di questo tipo, quindi, si usano la Neurospora crassa, il lievito

Saccharomyces cerevisiae e l’alga unicellulare Chlamydomonas reinhardi. Analizzando i fenotipi

delle tetradi si può dedurre immediatamente il genotipo dell’individuo, visto che si tratta di

organismi aploidi.

Per poter continuare il discorso, è necessario conoscere il ciclo vitale di questi tre organismi. Il

ciclo di Neurospora è stato già descritto (vedi paragrafo Ricombinazione tra i geni e ruolo dello

scambio tra i cromosomi). α

Per quanto riguarda Saccharomyces (pag. 169), esistono due tipi sessuali a ed . Ognuno di questi

α

due tipi può generare per mitosi un altro organismo. Se si uniscono una cellula a ed una , si crea

una cellula diploide che va incontro a meiosi, con produzione di quattro ascospore contenute in un

α

asco sferico. Di queste, due sono di tipo a e due . Quando l’asco è maturo, si apre e ogni ascospora

germina dando origine a varie cellule (individui) aploidi.

La differenza maggiore fra questo ciclo e quello della Neurospora è che in questo caso le tetradi

nell’asco non sono ordinate.

Il ciclo di Chlamydomonas è estremamente simile. Le cellule sessuali si sviluppano solo quando

+ -

l’azoto disponibile è limitato ed i due tipi sessuali vengono chiamati mt ed mt . Anche in questo

caso le tetradi non sono ordinate, ma sono racchiuse in un sacco e non in un asco (visto che non si

tratta di un fungo).

U ’

SO DELL ANALISI DELLE TETRADI PER DETERMINARE SE DUE GENI SONO CONCATENATI

L’individuo che viene analizzato è eterozigote per due geni: su un cromosoma sono presenti i due

alleli selvatici, sull’altro quelli mutanti. La meiosi porta alla formazione di un asco o di un sacco

(pag. 171), a seconda dell’organismo utilizzato, che contiene una tetrade che sia ditipo parentale

(PD), ditipo non parentale (NPD) oppure tetratipo (T).

Le tetradi ditipo contengono ognuna due tipi differenti di genotipo (ognuno per due volte): nel

ditipo parentale sono presenti i due genotipi parentali, mentre in quello non parentale sono presenti

due differenti ricombinanti.

Le tetratipo contengono tutti e quattro i differenti tipi di genotipo.

A partire da questi dati è possibile stabilire se i geni sono concatenati o no.

Poniamo il caso in cui i due geni a e b siano posti su cromosomi differenti (pag. 172).

Quando le coppie di cromosomi omologhi si pongono sulla piastra metafasica, sono possibili due

combinazioni (mettiamo che non avvengano crossing-over): + + + +

In un caso, si dispongono da una parte aa e bb, e dall’altra a a e b b . Al momento della

 formazione delle ascospore, si creerà una tetrade (un asco), che contiene due ascospore ab e

+ + + + + +

due a b . La tetrade viene schematizzata come abab a b a b , quindi è del genere DP.

+ + + +

Nell’altro caso, si pongono da una parte aa e b b , e dall’altra a a e bb. Così si forma una

 + + + +

tetrade ab ab a ba b, quindi del genere NPD. 40

Se invece avviene un singolo crossing-over, a partire dalla disposizione che vede da una parte aa e

+ + + + + + + +

bb, e dall’altra a a e b b , si crea una tetrade del tipo aba b ab a b . Quindi il genere è T con due

filamenti parentali e due ricombinanti.

Il rapporto totale, sommando tutti gli individui a genotipo parentale e quelli a genotipo

ricombinante, sarà del 50% ciascuno, ossia la frequenza delle tetradi PD è uguale a quella delle

tetradi NPD.

Ora consideriamo il caso in cui i due geni si trovino sullo stesso cromosoma.

In questo caso non si calcolano possibilità differenti di allinearsi sulla piastra metafasica, ma si può

contare il doppio crossing-over a 2, 3 o 4 filamenti.

Se non avviene nessun crossing-over, si ha una tetrade PD.

Un singolo crossing-over porta a una tetrade T. Il doppio crossing-over porta:

Nel caso di due filamenti, ad una tetrade PD, perché viene scambiata la porzione centrale

 che non tocca le posizioni degli alleli e non modifica nulla.

Nel caso di tre filamenti, a due tetradi T (sono possibili varie combinazioni di filamenti in

 crossing-over).

Nel caso di quattro filamenti, ad una tetrade NPD.

Quindi, poiché le tetradi PD si ottengono sia in caso di mancanza di crossing-over che nel caso di

c.o. doppio a due filamenti, e poiché le NPD si ottengono solo in caso di c.o. doppio a quattro

filamenti, si può dire che due geni sono concatenati se la frequenza di tetradi PD è maggiore di

quella di tetradi NPD.

A questo punto, noto che i due geni sono concatenati, per stabilire la distanza fra essi non è

possibile usare il metodo delle percentuali basate sui singoli individui, perché qui abbiamo a

disposizione solo valori relativi all’insieme della tetrade. Quindi si utilizza una nuova formula:

[( ½ T + NPD) / tetradi totali] x 100

perché i ricombinanti sono rappresentati da metà delle tetradi T e delle NPD (vedi formula vecchia).

C -

ALCOLO DELLA DISTANZA GENE CENTROMERO IN ORGANISMI CON TETRADI LINEARI

Utilizzando la Neurospora crassa e il fatto che produce tetradi ordinate, possiamo determinare la

distanza fra un gene ed il centromero del cromosoma misurando la frequenza di ricombinazione fra

questi due siti.

Mappare un gene rispetto al suo centromero dà un’informazione ancora più precisa della sua

posizione, ma è possibile solo nel caso di tetradi ordinate.

In particolare, ci occuperemo del locus per il tipo sessuale A oppure a (pag. 175). Diciamo che i

cromosomi sono ordinati in modo che nell’asco si trovano, in ordine, due ascospore con centromero

derivato dal cromosoma che portava A e due da quello di a.

Se non avviene nessun crossing-over si determinano due diversi tipi di ascospore: una con

centromero A e allele A, e l’altra con centromero a ed allele a, in rapporto 2:2.

Se avviene il crossing-over, si generano quattro diversi tipi di aschi, dati dalle possibili

combinazioni di crossing-over fra i vari filamenti. Il centromero non è toccato da questo fenomeno:

quindi ci saranno comunque in ordine negli aschi due centromeri A e due a.

Si ottengonodue aschi con un rapporto 1:1:1:1 di posizione fra i geni, cioè AaAa e aAaA, e due

aschi con rapporto 1:2:1, cioè AaaA e aAAa.

Questi aschi con rapporti sfalsati rispetto al normale 2:2, si dicono tetradi da segregazione in

seconda divisone meiotica. La distanza gene-centromero è data dalla metà della percentuale di

questo tipo di tetradi. Si divide per due perché si osserva che in ogni tetrade da segregazione in

41

seconda divisione, metà delle ascospore sono parentali e metà ricombinanti, e noi dobbiamo contare

solo quelle ricombinanti.

R ICOMBINAZIONE MITOTICA

S COPERTA DELLA RICOMBINAZIONE MITOTICA

Nella prima metà del 1900, Stern scoprì che in certi organismi il crossing-over poteva avvenire sia

in meiosi che in mitosi, ossia avveniva un crossing-over mitotico.

La scoperta avvenne in seguito a studi su incroci fra ceppi di Drosophila in cui gli individui

+

portavano due mutazioni recessive legate alla X: il colore giallo del corpo (y) al posto del grigio (y )

+

e corte setole arricciate (sn) invece delle lunghe e curve (sn ).

Nei moscerini con il corpo grigio, le setole sono grigie, mentre in quelli con il corpo giallo le setole

sono gialle. + + +

L’incrocio fra una femmina omozigote y sn/y sn ed un maschio ysn /Y, aveva prodotto la maggior

+ +

parte delle femmine con fenotipo selvatico e genotipo y sn/ysn . Alcune femmine però avevano

delle chiazze di setole gialle, oppure chiazze di setole arricciate, o una chiazza con entrambi i

caratteri. Sebbene strana, l’origine di queste mosche poteva essere spiegata con una non-

disgiunzione o la perdita di un cromosoma.

Altre femmine avevano delle macchie gemelle, cioè un fenotipo a mosaico, perché una macchia

aveva setole gialle lisce ed un’altra setole grigie arricciate. Attorno a queste due le altre erano

normali (pag. 177).

L’unica spiegazione era pensare ad una segregazione anomala nella mitosi, dovuta ad un raro

evento di crossing-over (avviene in meno dell’1% dei casi). Si parte da una cellula diploide con

+ +

fenotipo selvatico sn y/sny (pag. 178). La duplicazione dei cromosomi porta all’appaiamento dei

+ +

due filamenti uguali sn y e dei due sny . Come se si trattasse di una meiosi, queste coppie di

cromosomi si avvicinano ed avviene un crossing-over fra i filamenti più vicini di due coppie

diverse. Questo fenomeno può verificarsi sia fra il centromero e il gene sn, sia fra il gene sn e quello

y.

A questo punto, procedendo nella normale divisione mitotica, i cromosomi duplicati si separano in

due filamenti, ognuno dei quali migra in una cellula differente.

Se il crossing-over è avvenuto fra il centromero ed sn, si creano delle cellule omozigoti per

entrambi i caratteri (osserva il disegno), disposte ovviamente una accanto all’altra, per cui ciascuna

mostrerà un carattere selvatico e l’altro mutante, come avviene nelle macchie gemelle.

Se invece il crossing-over è avvenuto fra sn ed y, solo una delle cellule risultanti darà origine ad una

macchia gialla, mentre l’altra avrà fenotipo selvatico.

M APPATURA DEL GENOMA UMANO

Lo studio delle mappe genetiche ha portato, a poco a poco, alla mappatura del genoma umano. Il

Progetto Genoma Umano (HGP) aveva il compito di localizzare i 50.000/100.000 geni che si ritiene

siano presenti nel nostro DNA.

Un patrimonio del genere è preziosissimo per conoscere le basi delle malattie genetiche conosciute

e di quelle ancora da scoprire.

Sono state determinate completamente anche le mappe geniche della Drosophila, del lievito, del

nematode Caenorhabditis elegans, di E.coli e del topo Mus musculus.

L A COSTRUZIONE DI MAPPE GENETICHE DI CONCATENAZIONE

Una mappa genetica di concatenazione mostra le posizioni relative dei marcatori genetici,

ottenute sempre dall’analisi dei ricombinanti. 42

I marcatori non sono necessariamente cromosomi differenti in forma o dimensioni rispetto agli altri.

Un marcatore può anche essere una zona di DNA abbastanza differente fra diversi individui. Ad

esempio, differenze di questo tipo possono consiste nell’acquisizione o nella perdita di un sito che

lega un enzima di restrizione, in modo che la presenza o l’assenza di questo generi dei frammenti di

lunghezza anomala fra i diversi individui.

La costruzione di mappe genetiche di concatenazione per l’uomo si basa proprio su questi due tipi

di marcatori. Visto però che non è possibile ottenere per l’uomo degli alberi genealogici completi,

come invece si può fare per gli individui in laboratorio, si utilizza un programma del computer che

mette insieme più alberi genealogici incompleti e vi applica il lod score, un test statistico tradotto

come logaritmo del rapporto tra probabilità.

Questo metodo calcola la probabilità che si sarebbe potuto ottenere quello stesso albero

genealogico, se due marcatori genetici fossero stati concatenati. Poi la confronta con la probabilità

che lo stesso albero genealogico si sarebbe ottenuto senza concatenazione.

I risultati sono espressi come il log del rapporto fra queste probabilità: se il valore finale è uguale

10

o superiore a tre l’ipotesi della concatenazione è accettata.

A questo punto si può calcolare la distanza fra i geni. Nelle mappe genetiche umane, 1 um

corrisponde ad 1 milione di paia di basi. 43

MAPPE GENETICHE IN

BATTERI E BATTERIOFAGI

L’organismo più usato nelle analisi genetiche sui batteri è Escherichia coli, molto piccolo e di

forma cilindrica, ricco di cromosomi e con un DNA circolare localizzato in una regione detta

nucleoide, non separata da membrane dal resto della cellula.

L’analisi genetica dei batteri viene fatta preparando un terreno di coltura sul quale gli individui

possano vivere, e seminandoveli. La crescita dei batteri porta alla formazione di una colonia, un

gruppo di cloni aploidi.

Esistono due tipi di terreno: un terreno minimo, che consente al batterio di avere a disposizione il

minimo indispensabile per sopravvivere, ed un terreno completo, che gli fornisce anche quello che

può sintetizzarsi da solo.

E.coli, ad esempio, ha bisogno solo di zucchero (per il carbonio), sali, tracce una certa di vitamina.

Gli organismi in grado di sintetizzare tutte le molecole essenziali sono detti prototrofi, viceversa

quelli che non ne sono capaci sono chiamati auxotrofi.

Spesso l’analisi genetica dei batteri si basa su mutazioni che riguardano la possibilità o meno di

sintetizzare una certa sostanza necessaria per sopravvivere. Quindi, variando il terreno di coltura è

possibile osservare i risultati.

T RASFORMAZIONE BATTERICA

Fra batteri, il materiale genetico può essere trasferito (e non scambiato perché si tratta di un

processo unidirezionale) in tre modi: trasformazione, coniugazione e trasduzione.

La trasformazione è il trasferimento di materiale genetico tra organismi attraverso frammenti di

DNA extracellulari. In pratica, frammenti di DNA vengono assunti da un batterio vivo,

modificandone il genoma. Il nuovo batterio viene definito trasformante.

Sebbene tutti i batteri siano in grado di effettuare la trasformazione, non tutti ci riescono allo stesso

modo. Per facilitare gli studi è stata elaborata la tecnica dell’elettroporazione, che utilizza campi

elettrici per rendere più permeabile la membrana.

Comunque solo pochi individui, all’interno dell’esperimento, finiranno con l’inglobare nel proprio

genoma il nuovo frammento.

Vediamo come funziona l’intero processo: ipotizziamo che il frammento entrante sia portatore dei

+

due alleli selvatici a (pag. 226), mentre nel DNA circolare del ricevente è presente in omozigosi

l’allele a. Durante l’ingresso nella membrana, uno dei filamenti della doppia elica viene degradato,

per cui solo uno riesce ad entrare. Questa singola elica si appaia con il DNA omologo del ricevente.

Due eventi di crossing-over tra il filamento a singola elica e il DNA a doppia elica circolare portano

all’inserzione del frammento nel circolo e si ottiene un cromosoma ricombinante. In questa regione,

+

un’elica porta l’informazione del donatore (a ) ed una quella del ricevente (a), per cui il DNA si

dice DNA eteroduplice.

L’altro frammento, escluso dopo il crossing-over, viene degradato. +

Dopo un ciclo di replicazione, ½ di individui porterà entrambi gli alleli a (trasformanti), mentre

l’altra metà porterà di nuovo due alleli a e è non trasformante.

U SO DELLA TRASFORMAZIONE PER COSTRUIRE MAPPE GENETICHE

Con la tecnica della trasformazione, è possibile stabilire la concatenazione fra geni e il loro ordine.

+ +

Innanzitutto, se due geni x e y del donatore sono lontani fra loro, sarà bassa la probabilità di

trovarli sullo stesso frammento. La probabilità che avvenga una cotrasformazione (ossia una

trasformazione per entrambi i geni), ipotizzando che essi non siano concatenati, è data dal prodotto

44

+ +

delle singole probabilità per il gene x e per y (metodo di calcolo considerando i due geni

indipendenti). Se il risultato è molto minore del valore ottenuto calcolando la stessa probabilità

+ +

come se i due geni fossero correlati, allora x e y sono vicini e si trovano sullo stesso frammento.

La cotrasformazione permette anche di determinare l’ordine dei geni: prendiamo il caso di tre geni

p, q ed o. Si osserva che p e q sono trasmessi spesso insieme, e così accade per q ed o.

Evidentemente, p e q sono vicini, così come q ed o, mentre p ed o sono lontani. Allora l’unico

ordine possibile è pqo.

C ONIUGAZIONE

S E.

COPERTA DELLA CONIUGAZIONE IN COLI

La coniugazione è un processo attraverso il quale un frammento di DNA viene trasferito da una

cellula batterica all’altra mediante contatto diretto. Dopo il primo contatto, si forma un ponte fra le

due cellule ed un frammento di cromosoma del donatore passa attraverso il ponte al ricevente. Il

frammento può subire ricombinazione con la regione omologa nel ricevente, che viene chiamato

transconiugante.

La coniugazione fu scoperta nella seconda metà del 1900 da Tatum e Lederberg: i due studiosi

provarono a mischiare due differenti colonie di E.coli che avevano bisogno di differenti terreni di

coltura per poter sopravvivere: mentre uno aveva bisogno di un certo amminoacido, l’altro riusciva

a sintetizzarlo. Dopo il mescolamento, posti su un terreno minimo molti più batteri di prima

riuscivano a sopravvivere: molti erano ex-autotrofi che avevano ricevuto il materiale genetico

dall’altro ceppo, diventando in grado di sintetizzare tutto ciò di cui avevano bisogno.

Per verificare che fosse necessario un contatto cellula-cellula e non solo la presenza di frammenti di

DNA liberi, un altro studioso pose i due ceppi in un tubo ad U, separati da un filtro poroso che

avrebbe lasciato passare il DNA ma non le cellule. Dopo un po’, posti i batteri su un terreno

minimo, nessun nuovo individuo sopravviveva, perché non erano avvenute coniugazioni.

I F

L FATTORE SESSUALE

Lo studioso Hayes fu il primo a scoprire che il processo di coniugazione è unidirezionale ed

+

avviene attraverso un fattore sessuale F, per cui la cellula donatrice possiede il fattore F e quella

- +

ricevente il fattore F . Durante la coniugazione, il fattore F si replica e passa dalla cellula F a quella

-

F (pag. 230).

Il fattore F è un esempio di plasmide, un DNA circolare a doppia elica indipendente dal DNA che

porta l’intero genoma e che si replica autonomamente. Contiene una regione di DNA chiamato

origine, necessaria per iniziare la replicazione nel batterio ricevente, e vari geni per la formazione

di strutture di connessione chiamate pili F.

Il processo inizia con il taglio di un singolo filamento dell’elica circolare del fattore F, a partire

dall’origine: come un rotolo che viene srotolato, il filamento tagliato comincia ad entrare nella

-

cellula F , mentre una sua copia viene duplicata sul filamento rimasto chiuso nel donatore, in modo

che questo non abbia regioni a singola elica esposte.

Allo stesso modo, mentre il filamento passa nel ricevente, viene sintetizzata l’elica complementare.

- +

Ora la cellula F è diventata F , perché ha acquisito i geni del fattore F.

C (H )

EPPI AD ALTA FREQUENZA DI RICOMBINAZIONE FR

Come potevano avvenire le ricombinazioni per i geni cromosomici (cioè presenti sulla principale

molecola di DNA) durante la coniugazione, che apparentemente interessava solo il DNA del fattore

F? 45

Hayes isolò dei donatori inusuali che, incrociati con riceventi, davano una frequenza di

ricombinazione mille volte più elevata del normale, per cui vennero chiamati Hfr da high-

frequency recombination.

Il motivo di questa elevata frequenza di ricombinazione è che il DNA del fattore F si sarebbe

ricombinato attraverso un crossing-over doppio con il normale DNA circolare batterico. I plasmidi

capaci di integrarsi in questo modo sono detti episomi.

A questo punto, il fattore F non replica più in modo indipendente, ma è legato al resto della

molecola pur continuando ad essere funzionale. Come se non fosse successo niente, incontrando

- +

una cellula F quella F costruisce un pilo F e comincia a trasferire il DNA per il fattore F. Questa

volta, però, il passaggio non termina alla fine del segmento di DNA per il fattore, ma prosegue

inserendo tutto il cromosoma batterico nel ricevente, che si trova ad avere due molecole circolari di

DNA batterico.

Un altro evento di crossing-over doppio può portare all’integrazione del nuovo cromosoma con

quello vecchio, dando al batterio un mucchio di nuove caratteristiche.

Comunque generalmente non viene trasferita tutta la molecola di DNA del donatore, perché questo

evento richiederebbe troppo tempo. Quindi, visto che una parte del DNA per il fattore F si trova alla

fine di tutta la molecola e dunque non viene trasferita quasi mai, la cellula ricevente non passa ad

+

F . 1

F F

ATTORI

Quelle volte in cui viene trasferito tutto il DNA, può avvenire una excisione spontanea del fattore

F, cioè che questo venga separato dal DNA batterico con un singolo evento di crossing-over, in

modo da creare due molecole circolari.

Delle volte capita che l’excisione non sia esatta, per cui nella molecola circolare del fattore F viene

inserito anche un tratto di DNA batterico (pag. 231): questi fattori così modificati vengono detti

1 1

fattori F , seguito dal nome del gene in più ottenuto (es: se viene prelevato il gene lac, sarà F (lac)).

1 -

Quando avviene una coniugazione tra un F ed un F , quest’ultimo eredita anche il nuovo gene.

Possiede quindi una doppia copia di questo e una singola copia degli altri, per cui ha un genoma

parzialmente diploide.

Questo particolare tipo di coniugazione viene detto F duzione.

U SO DELLA CONIUGAZIONE INTERROTTA PER MAPPARE I GENI BATTERICI

La coniugazione è un ottimo punto di partenza per mappare i geni. Esistono due possibilità di

-

procedere. In entrambi i caso vengono incrociati un individuo Hfr ed uno F , ed il trasferimento del

DNA viene artificialmente interrotto a tempi differenti per i vari incroci (coniugazione interrotta).

1. Osservando quali geni sono stati duplicati nell’ordine di tempo, si ottiene una mappa. Ad

esempio, se il gene a è stato duplicato dopo 9 minuti e il gene b dopo 11, evidentemente b

sarà posto dopo a, ad una distanza in um comparabile con i minuti trascorsi.

2. Il fattore F determina, all’interno dell’Hfr, l’ordine di trasferimento dei geni. Quindi, a

seconda del punto di inserzione, un individuo Hfr differisce dall’altro sia per il punto in cui

ha inizio il trasferimento, sia per l’ordine dei geni.

Queste differenze nel punto di origine del trasferimento risultano molto importanti per

mappare un DNA circolare come quello di E.coli: vengono incrociati due individui in modo

che, dopo una serie di coniugazioni interrotte, si siano ottenuti un numero tale di frammenti

separati da completare la molecola. Per determinare l’ordine dei geni, i frammenti vengono

confrontati uno con l’altro (pag. 234) e messi in ordine parallelamente a seconda delle

somiglianze, in modo che si crei una scaletta in cui ogni frammento porta una nuova

informazione rispetto al precedente. 46

Quando le informazioni della coda dell’ultimo frammento si sovrappongono a quelle della

testa del primo, si è determinato l’ordine circolare dei geni.

È sempre in seguito a questi esperimenti che si è scoperta la circolarità del DNA dei batteri.

Gli esperimenti di coniugazione interrotta, inoltre, hanno reso possibile la determinazione delle

seguenti regole di coniugazione:

In un grafico, all’aumentare del tempo di coniugazione, diminuisce la frequenza dei

 ricombinanti (per interruzione della coniugazione). Ovviamente, nella realtà maggiore è il

tempo di coniugazione, maggiore è la percentuale di ricombinanti, ma il grafico ci fa capire

quanto sia raro un lungo tempo di coniugazione.

Per lo stesso motivo del punto precedente, la frequenza dei ricombinanti diminuisce quanto

 più tempo il gene impiega a passare attraverso il pilo F.

La velocità di trasferimento varia da coppia a coppia.

T RASDUZIONE

La trasduzione è un processo attraverso il quale i batteriofagi (i virus batterici, chiamati anche

fagi) funzionano da intermediari nel trasferire l’informazione genetica da un batterio all’altro.

Questi particolari fagi sono definiti fagi vettori, sebbene non siano molto funzionali in termini di

quantità di DNA trasferito, dato che riescono a trasportare meno dell’1% dell’intero cromosoma

batterico.

I riceventi che vanno incontro a ricombinazione per questo frammento vengono detti trasduttanti.

I BATTERIOFAGI

In un fago, il materiale genetico (DNA o RNA) è contenuto in un singolo cromosoma, circondato da

un involucro proteico. λ.

I due tipi principali di fagi sono il T4 ed il

Il T4 è formato da una testa che contiene il DNA, uno stilo che funge da collo rivestito da una

guaina proteica, ed una piastra basale, dalla quale partono le fibre della coda, che gli permettono di

λ,

aderire al batterio (pag. 236). Il fago invece, è formato semplicemente da testa e guaina.

Il metodo di intrusione ed infezione del fago T4 nel batterio può essere riassunto in sei punti (ciclo

litico):

1. Il fago aderisce al batterio e penetra la sua membrana attaccandosi con le fibre e spingendo

verso il basso. In questo modo il suo DNA passa attraverso la guaina ed entra nel batterio.

2. Il cromosoma batterico viene degradato.

3. Il suo posto è preso dal cromosoma del fago che, utilizzando sia elementi del batterio che

propri, replica il proprio cromosoma in varie copie.

4. L’informazione genetica del fago viene espressa e si producono nel batterio teste, code e

tutti i componenti.

5. Il fago viene assemblato.

6. La membrana del batterio viene rotta, causandone la morte, mentre nuovi fagi escono dal

suo interno (questa massa viene chiamata lisato).

Fagi che, come in questo caso, distruggono il batterio, sono detti fagi virulenti.

λ

Il ciclo di un fago è un po’ più complesso (pag. 238). Esso, dopo aver inserito il proprio

cromosoma nel batterio, può seguire due vie: effettuare un normale ciclo litico oppure entrare nel

ciclo lisogeno. In quest’ultimo caso, il cromosoma non si replica autonomamente, ma viene

integrato con il cromosoma batterico e si replica con esso (il genoma latente nel batterio viene detto

47

allora profago). Una proteina repressore impedisce che vengano espresse le proteine fagiche.

Quando uno stimolo ambientale distrugge il repressore (es. raggi ultravioletti), vengono espresse le

proteine per i fagi e la cellula entra nel ciclo litico.

Il batterio infettato viene detto lisogeno, il fenomeno di inserimento del cromosoma fagico in quello

batterico è detto lisogenia, ed i fagi che sono in grado di effettuarla sono chiamati fagi temperati.

T RASDUZIONE GENERALIZZATA E SPECIALIZZATA

Possono avvenire due diversi tipi di trasduzione:

Trasduzione generalizzata: qualsiasi gene può essere trasferito da un batterio all’altro.

 Trasduzione specializzata: vengono trasferiti solo determinati geni.

La scoperta del meccanismo di trasduzione generalizzata avvenne in modo molto simile a quello

della coniugazione in E.coli, grazie allo studioso Lederberg.

Come nel caso precedente, venne utilizzato un tubo ad U in cui due ceppi di batteri autotrofi erano

separati da un dischetto poroso, attraverso il quale non potevano passare. Dopo vari esperimenti,

vennero trovati dei prototrofi (risultato dell’incrocio dei genomi dei due ceppi) anche se non c’era

stato un contatto cellula-cellula.

L’agente filtrabile, come venne chiamato, fu identificato in un fago (fago trasducente).

Il meccanismo della trasduzione è il seguente (pag. 239):

1. Un fago temperato infetta il batterio e si replica per ciclo litico, senza degradare il DNA

batterico ma solo frammentandolo.

2. Al momento di assemblare le proprie parti, alcuni fagi catturano solo il proprio cromosoma

sparso nella cellula, mentre altri prendono soltanto frammenti di DNA batterico (qualunque

frammento va bene, per questo è una trasduzione generalizzata), diventando trasducenti.

3. La cellula batterica è lisata ed i fagi vanno ad infettare altri batteri. Quelli trasducenti

passano il DNA batterico in un altro batterio.

4. Il nuovo frammento trova il suo omologo, e con un evento di doppio crossing-over può

inserirsi nel DNA al suo posto. Il vecchio frammento viene degradato.

Si tratta comunque di una serie di eventi abbastanza rari, a partire dall’inserzione di DNA batterico

nel fago.

Usando la trasduzione generalizzata, è possibile mappare un genoma batterico. Il principio è lo

stesso usato con la trasformazione. Visto che il fago può trasportare solo piccoli frammenti di

cromosoma batterico, se in seguito ad un evento di trasduzione il batterio ricevente si sarà

modificato per un gene a ed uno b, è evidente che i due geni sono vicini nel filamento

(cotrasduzione).

Sempre con lo stesso principio, si può osservare a tempi diversi quali geni sono stati passati dal fago

al batterio prima e quali dopo, in modo da poterne stabilire l’ordine.

Alcuni fagi temperati possono trasdurre solo specifiche parti del cromosoma batterico, per cui si

parla di trasduzione specializzata.

λ

Prendiamo il caso di un fago che infetta E.coli (pag. 242). Avviene un riconoscimento di

omologhi tra il DNA circolare del fago e quello del batterio, per cui un evento di crossing over

permette l’inserimento del primo nel secondo. Una normale excisione del DNA batterico (come

accade di solito) permette la formazione di una normale molecola circolare di DNA fagico. Delle

rare volte, però, accade che l’excisione non sia precisa, per cui il fago acquista un pezzo di DNA

1

batterico (un po’ come avveniva per la formazione di F ).

Ora il fago è difettante per alcuni geni, ma trasporta dei geni specifici del batterio: sono specifici

perché l’inserzione del DNA del fago è avvenuta in un punto preciso di omologia. 48

Visto che si occupa di geni specifici, la trasduzione specializzata è spesso usata artificialmente per

spostare alcuni geni da un batterio all’altro.

M APPATURA CON IL SISTEMA DELLE PLACCHE

Oltre ai sistemi fin’ora descritti, per mappare i geni dei batteriofagi si può usare un sistema identico

a quello che si usa per gli eucarioti, cioè l’utilizzo degli incroci a due, a tre o quattro fattori.

L’unica grossa differenza sta nel riuscire ad adattare questi sistemi al ciclo vitale dei nuovi

individui.

Per prima cosa bisogna contare tutti i fagi di una colonia: si piastrano batteri e fagi su un terreno

solido in modo che i primi lo ricoprano completamente, mentre i fagi saranno molti di meno. Subito

comincia l’infezione e la sua propagazione, con formazione di varie chiazze sulla piastra (placche).

Ogni placca ha un solo progenitore, per cui contando le placche si conosce il numero dei fagi.

Come seconda cosa, bisogna essere in grado di distinguere i fenotipi dei fagi per poterne

conoscere il genotipo (sono aploidi). Visto che è assurdo pensare ad un riconoscimento

morfologico, si opera su modificazioni che alterino il ciclo vitale in modo da originare placche di

tipo diverso.

Consideriamo ora un esperimento di mappatura in cui vengono usati due ceppi di fagi che

+

differiscono per il gene h (h è in grado di lisare sia il ceppo di E.coli B che il ceppo B/2 mentre h

+

lisa solo il ceppo B) ed il gene r (r produce placche limpide, mentre r le produce torbide).

+ +

L’incrocio è ottenuto aggiungendo una serie di fagi di tipo h r e di tipo hr ad una coltura di batteri

di ceppo B. Molti batteri vengono infettati contemporaneamente dai due fagi e possono avvenire

+ +

eventi di crossing-over che generano cromosomi h r e hr. Alla lisi del batterio, verranno espulsi

fagi normali e ricombinanti.

Alla fine dei cicli litici, i fagi vengono posti su una piastra che contenga sia ceppi batterici B che

+ +

B/2: si creano quattro tipi di placche, due parentali e due ricombinanti (h r dà placche torbide e

piccole, mentre hr dà placche grandi e limpide), in cui la grandezza delle placche è ovviamente

relazionata alla possibilità di lisare uno o entrambi i ceppi.

Dopo aver contato e osservato le placche, è possibile calcolare la frequenza di ricombinazione fra h

ed r: + +

[placche (h r ) + (hr)]/placche totali x 100

Poiché anche nei fagi la frequenza di ricombinazione può essere usata come base per calcolare la

distanza fra i geni sulla mappa, abbiamo ottenuto un sistema di mappatura.

A NALISI DELLA STRUTTURA FINE DI UN GENE

Fin’ora ci siamo occupati di mutazione intergeniche, cioè casi di ricombinazione fra un gene

proveniente da un cromosoma ed uno proveniente da un altro.

In realtà sono frequenti anche ricombinazioni intrageniche, come per esempio quella fra due alleli

di uno stesso gene.

Esperimenti sulla struttura interna di un gene hanno aperto la via per la costruzione di mappe fini

della struttura del gene, mappe dettagliate di siti allelici all’interno dello stesso gene.

Vennero scelti proprio i batteriofagi per questi esperimenti perché si riproducono molto

velocemente e quindi è possibile osservare in breve tempo ricombinazioni potenzialmente presenti a

bassa frequenza.

Come premessa, bisogna rendere noto che il fago T4 infetta sia E.coli B che E.coli K12(λ), e che

+

contiene numerosi geni r (placche torbide) sul suo cromosoma. Nei suoi esperimenti, Benzer

49

utilizzò dei mutanti per il gene rII che, oltre a distinguersi nella forma delle placche dai portatori del

+

gene r , sono incapaci di lisare K12(λ).

A II

NALISI PER RICOMBINAZIONE DEI MUTANTI R

Benzer volle costruire la mappa genetica della struttura fine della regione rII. Egli capì che il difetto

+

di rII di crescere su K12(λ) poteva essere usato per distinguere, in una colonia mista fra rII ed r , gli

+

individui r .

Incrociò 60 mutanti di T4 rII a due a due, in tutte le possibili combinazioni, dentro E.coli B (cioè

incrociò due fagi T4 su 60 e ripeté l’esperimento per tutte le possibili combinazioni dei 60 fagi) e

raccolse la progenie (pag. 247). Piastrò ogni volta un campione della progenie fagica sia su E.coli B

+

che su E.coli K12(λ), in modo da isolare i rari individui T4 r prodotti dalla ricombinazione

+

genetica fra i due mutanti rII usati in quel caso. Infatti, solo gli r possono infettare E.coli K12(λ).

+

Così Benzer fu in grado di calcolare la percentuale di ricombinanti r . ora doveva ricondurre questo

dato alla costruzione della mappa fine.

La progenie possibile da tutti i tipi di incroci era: parentale rII1 o rII2 (dal primo o dal secondo

+

fago), ricombinante r e ricombinante rII1,2 (con entrambe le mutazioni rII).

+

Poiché la produzione di un individuo r oppure di uno rII1,2 era dovuta in entrambi i casi ad un

singolo evento di crossing over, si può dire che il numero totale di ricombinanti è dato dal doppio

+

degli individui r . Visto che la formula per trovare la distanza di mappa fra due mutazioni si basa

sulla percentuale di progenie ricombinante, si ha che la distanza di mappa fra due mutazioni rII è

data da: +

[(2 x num. di ricombinanti r ) / num. tot. della progenie] x 100 = dist. di mappa tra la mutazione

rII1 e rII2

Il valore ottenuto da questa formula, però, non è esatto. Benzer capì che era necessario sottrarre dal

+

totale gli individui r ottenuti dalla reversione di individui singoli rII. Infatti, quando E.coli B o

K12(λ) venivano iniettati con un singolo fago rII, delle volte si osservavano nella progenie

+

individui r . +

Altre volte, poi, accadeva che non veniva prodotto alcun ricombinante r dall’incrocio di due rII. Il

dato fu interpretato ipotizzando che in realtà le mutazioni su rII avvenivano, ma coinvolgevano lo

stesso sito, cioè che era stata modificata la stessa coppia di nucleotidi all’interno del gene, in modo

che una mutazione annullasse l’altra: mutazioni di questo tipo sono definite omoalleliche, in

contrapposizione a quelle eteroalleliche. +

I calcoli di Benzer determinarono, fra l’altro, la percentuale minima di ricombinanti r da due rII,

corrispondente allo 0,01%. Questo valore può essere usato per calcolare la distanza molecolare

minima (in termini di coppie di basi) a cui avviene la ricombinazione: il risultato fu che la

ricombinazione avveniva minimo a tre coppie di basi di distanza fra i siti.

M APPATURA PER DELEZIONE

Per costruire la mappa della struttura fine del gene rII, Benzer avrebbe dovuto effettuare all’incirca

5 milioni di incroci. Per evitarlo, sviluppò un sistema semplificativo che prevedeva l’uso della

mappatura per delezione per localizzare mutazioni non evidenti nel fenotipo.

La maggior parte dei mutanti rII è un mutante puntiforme, in cui cioè è mutata una sola coppia di

+

basi. Alcuni mutanti rII non revertivano ad r anche se la mutazione insorta non era omoallelica, e

furono definiti mutanti per delezione, cioè che avevano perso il pezzo del DNA corrispondente al

+

gene r , per cui non era più possibile una ricombinazione. 50

Tre serie di incroci fra un mutante puntiforme ed alcuni mutanti per delezione opportunamente

selezionati producevano dati che, incrociati fra loro, davano l’esatta posizione della mutazione nella

regione rII.

T EST DI COMPLEMENTAZIONE E CISTRONE

Teoricamente, ogni gene è un’unità funzionale, cioè ogni gene specifica per una funzione. Benzer

provò a vedere se ciò era vero anche per la regione rII, cioè provò a vedere se due mutanti rII

accoppiavano la mutazione allo stesso gene, lo studioso utilizzò il test per complementazione di

Lewis, usato per stabilire se due mutazioni che hanno lo stesso effetto fenotipico appartengono allo

stesso gene o a due geni differenti.

Nel caso di Benzer, egli iniettò un batterio K12(λ) con due mutanti rII (uno rIIA e l’altro rIIB), per

vedere se potevano aiutarsi a produrre una progenie. Se ciò accadeva, voleva dire che le mutazioni

erano complementari, cioè si trovavano su unità funzionali (geni) differenti che specificavano per

prodotti differenti.

Altrimenti, le due mutazioni non erano complementari e si trovavano sulla stessa unità funzionale.

È importante sottolineare che, affinché avvenga complementazione, non è necessaria la

ricombinazione.

Facciamo un esempio: poniamo che due fagi rII abbiano ognuno una mutazione in un gene diverso

dall’altro (pag. 252), ossia uno in rII - geneA e l’altro in rII - geneB. Il primo produce un prodotto

A non funzionale e B funzionale, e viceversa l’altro. Di conseguenza, messi in coppia le due

mutazioni si complementano ed il fago rII può sopravvivere anche sul batterio E.coli K12(λ).

Se invece il batterio K12(λ) viene infettato con due fagi, di cui ognuno porta la mutazione rII su A,

nessuno dei due potrà sopravvivere, le mutazioni non si complementano e sono per forza sullo

stesso gene.

Per estensione, analizzando due mutazioni che, prese singolarmente, portano allo stesso fenotipo

(letale) posso determinare se quella regione di DNA che contiene le mutazioni è composta da uno o

più geni (unità funzionali).

Il test di complementazione, quando si riferisce a mutazioni poste nello stesso gene, può anche

essere definito test cis-trans, perché le due mutazioni possono essere in trans (su due cromosomi

diversi) in cis. Mutazioni poste in cis si complementano sempre (un individuo eredita la mutazione,

ma l’altro eredita un cromosoma sano), mentre le mutazioni in trans originano per forza due

individui mutati (ciascuno eredita una mutazione da uno dei due cromosomi).

Le mutazioni poste su due geni differenti si trovano di solito in trans e comunque si complementano

sempre. Nel caso in cui due mutazioni poste su geni differenti non si complementano, allora vuol

dire che entrambe influenzano la stessa funzione e dunque non c’è un gene “giusto” per sopperire

alla mancanza. Si dice che appartengono allo stesso cistrone, definito come il più piccolo segmento

di DNA che codifica per un RNA.

Ormai, comunque, il termine cistrone non viene quasi più usato, sostituito dal più universale gene.

51

GLI INIZI DELLA GENETICA MOLECOLARE:

FUNZIONE GENICA

L’ -

IPOTESI UN GENE UN ENZIMA

Nel 1902 Garrod fornì una prova della relazione fra geni ed enzimi.

Egli studiò una malattia provocata da difetti genetici, l’alcaptonuria, scoprendo che le persone

affette secernevano nell’urina un acido, non prodotto in urine normali. La presenza dell’acido era

dovuta all’incapacità degli individui malati di metabolizzare un composto a causa della mancanza

dell’enzima specifico.

Garrod affermò che la malattia era dovuta ad un errore congenito del metabolismo.

Beadle e Tatum furono i primi studiosi che si occuparono seriamente di genetica biochimica, una

branca della genetica fondata proprio dai due scienziati, che combinava genetica e biochimica nella

comprensione delle catene metaboliche.

Importantissimi furono i loro studi su Neurospora crassa, che permisero ai due di formulare

l’ipotesi un gene – un enzima, per quale ottennero il premio Nobel.

Innanzitutto, Beadle e Tatum si resero conto che alla Neurospora bastavano le sostanze presenti nel

terreno minimo per sintetizzare i composti di cui aveva bisogno (era prototrofa). Quindi pensarono

che fosse possibile isolare dei mutanti nutrizionali, cioè delle Neurospore auxotrofe, che

necessitavano più che un terreno minimo per crescere.

Per farlo, procedettero in questo modo: trattarono spore asessuali (conidi) di Neurospora con raggi

X per ottenere delle mutazioni, quindi incrociarono questi conidi con ceppi selvatici (prototrofi)

dell’opposto tipo sessuale. In questo modo, tutti i mutanti sopravvissuti avevano una base genetica

nutrizionale nota.

Una spora per asco della progenie venne fatta germinare su un terreno completo, in cui erano

presenti tutti gli amminoacidi, le vitamine, i sali. Quindi, ogni coltura fu posta su un terreno

minimo: le colture che non sopravvivevano erano i mutanti auxotrofi, quelli interessanti per

l’esperimento.

Per identificare il tipo di mutazione insorta, gli auxotrofi vennero posti su due differenti terreni di

coltura: uno minimo con aggiunta di amminoacidi ed uno minimo con aggiunta di vitamine.

Così vennero divisi non auxotrofi, auxotrofi per amminoacidi ed auxotrofi per le vitamine.

Beadle e Tatum, poi, vollero identificare lo specifico composto di cui aveva bisogno ogni ceppo.

Quindi, nel caso degli amminoacidi, analizzarono ogni ceppo in 20 provette differenti, ognuna con

un terreno minimo in cui era aggiunto un diverso amminoacido: dove la spora germogliava, quello

era l’amminoacido per cui mostrava la mutazione.

IDENTIFICAZIONE DEI PASSAGGI DI UNA CATENA BIOCHIMICA ATTRAVERSO LA GENETICA

Beadle e Tatum ipotizzarono che le cellule di Neurospora fossero in grado di trasformare le

sostanze del terreno di coltura in amminoacidi seguendo una serie di reazioni biochimiche che

coinvolgevano più geni. Poiché la trasformazione avveniva per tappe, di cui ognuna portava ad un

differente prodotto utilizzato come base per la reazione successiva, la mancanza del prodotto finale

(l’amminoacido) era indice di un errore in una tappa della catena. Ogni tappa è catalizzata da un

enzima e poiché era stata la mutazione di un gene a portare al blocco di una tappa, i due scienziati

proposero che ogni gene codificasse per un enzima: era nata l’ipotesi un gene – un enzima.

La dimostrazione dell’esistenza della catena di trasformazione venne da un esperimento, in cui si

osservava la vita di alcuni mutanti per il gene A, B o C di una catena. Il mutante per C arrivava al

prodotto B ma non al finale C, ed accumulava grosse quantità di B. Stessa cosa per B, che

52

accumulava grosse quantità di A. In mutanti per il primo gene della catena si accumulava il

substrato.

Oltre a dimostrare l’esistenza di una catena, questo esperimento servì anche per determinare

l’ordine di azione dei geni, semplicemente osservando i prodotti accumulati ad ogni tappa e traendo

le conclusioni.

Un altro sistema per studiare l’ordine d’intervento dei geni è quello di osservare gli effetti

dell’aggiunta di specifici prodotti intermedi in un terreno minimo su cui vengono fatti crescere dei

mutanti del gene che specifica per quell’amminoacido. Nella catena per l’arginina (pag. 269), ad

esempio, l’ultimo passaggio vede la trasformazione dell’argininsuccinato in arginina. Se un

individuo mutante per l’enzima che trasforma l’argininsuccinato viene posto in un terreno minimo

con aggiunta arginina, esso riesce a sopravvivere. Quindi il gene per questo enzima è l’ultimo della

catena. A ritroso, si può scoprire l’ordine di tutti i geni coinvolti.

L’ipotesi un gene – un enzima, però, non era esatta, perché spesso più geni possono codificare per

un solo enzima, essendo gli enzimi spesso composti da più catene polipeptidiche. Quindi, ogni gene

doveva codificare per un polipeptide. L’ipotesi più esatta è un gene – un polipeptide.

D ’

EFICIENZE ENZIMATICHE A BASE GENETICA NELL UOMO

Molte malattie dell’uomo sono causate da mutazioni di singoli geni che, però, codificando per un

enzima di una catena biochimica, possono provocare gravissimi danni: si tratta degli “errori

congeniti del metabolismo” di Garrod.

F (PKU)

ENILCHETONURIA

La fenilchetonuria o PKU è causata da una mutazione recessiva su un gene autosomico che porta

alla mancata sintesi dell’enzima fenilalanina idrossilasi. La sua assenza impedisce la

trasformazione dell’amminoacido fenilalanina in tirosina.

La fenilalanina è un amminoacido essenziale, cioè deve essere introdotto dalla dieta, ma è molto

dannoso se presente in eccesso. L’amminoacido in eccesso entra in una seconda catena biochimica

e viene convertito in acido fenilpiruvico, causando forti danni cerebrali, crescita ridotta e morte

prematura.

Inoltre, anche se possono assumerla dal cibo, i fenilchetonurici mancano di tirosina, necessaria per

la produzione di adrenalina e melanina (per questo spesso i malati hanno occhi azzurri e pelle molto

chiara).

Purtroppo, la dieta stretta priva di fenilalanina che viene imposta ai malati è molto costosa e non

tutti riescono a proseguirla fino al completo sviluppo, momento in cui tutte le funzioni cerebrali si

sono completamente formate.

A LBINISMO

L’albinismo è una malattia legata ad un allele recessivo e si verifica in caso di mancanza

dell’enzima che codifica la trasformazione della tirosina in melanina.

Quindi, gli albini hanno pelle e capelli bianchi, occhi rossi ed ovviamente sono sensibilissimi alla

luce.

S L -N

INDROME DI ESCH YHAN

La sindrome di Lesch-Nyhan è un’alterazione letale dovuta alla mutazione di un gene posto sul

cromosoma X. Visto che in genere i maschi affetti muoiono prima dell’età riproduttiva, non ci sono

femmine affette ma solo portatrici. 53

La malattia è dovuta all’assenza di un enzima specifico per l’utilizzo delle purine che, accumulate,

sono convertite in acido urico. Dopo pochi mesi di vita, si osserva ritardo nello sviluppo motorio e

più tardi spasmi incontrollati. Con la crescita sopraggiunge anche il ritardo mentale, che porta i

malati ad assumere comportamenti autolesionistici ed aggressivi.

S T -S

INDROME DI AY ACHS

I lisosomi sono degli organelli dotati di membrana che contengono degli enzimi digestivi. Molte

malattie nell’uomo sono causate da errori genetici per questo o quell’altro enzima digestivo e nella

loro totalità sono definite malattie lisosomali da accumulo.

Una delle malattie lisosomali più note è la sindrome di Tay-Sachs, che porta all’accumulo nelle

cellule cerebrali di un composto da degradare, con conseguente degenerazione mentale e morte

entro i tre anni. Prima della morte, il bambino passa attraverso paralisi, cecità, perdita dell’udito e

problemi nutrizionali.

C ONTROLLO GENETICO DELLA STRUTTURA DELLE PROTEINE

I geni contengono, tra l’altro, l’informazione necessaria per la costruzione delle proteine.

Una delle proteine più studiate è l’emoglobina.

A :

NEMIA FALCIFORME SINTOMI E CAUSE

L’emoglobina, il pigmento rosso del sangue, ha la funzione di trasportare l’ossigeno nel corpo.

Questa funzione è facilitata dalla forma concava degli eritrociti che la trasportano.

Nell’anemia a cellule falciformi, gli eritrociti assumono una forma irregolare che non gli permette

di legare bene l’O e di passare all’interno dei capillari. In alcuni casi il flusso del sangue è bloccato

per vaste aree, provocando danni e dolore. All’anemia falciforme è associata spesso un’anemia

emolitica, ossia una diminuzione della speranza di vita degli eritrociti a causa della loro fragilità

meccanica.

L’anemia falciforme è dovuta ad una modificazione dell’emoglobina normale, chiamata HbA, in

un’altra forma detta HbS, in cui un amminoacido differente da quello solito compone la catena

polipeptidica. β),

La normale struttura dell’emoglobina è formata da quattro subunità uguali a due a due (α e

ciascuna delle quali è associata ad un gruppo eme, necessario per il legame con l’ossigeno (pag.

274). La sostituzione dell’amminoacido valina al posto della glutammina porta ad una

β,

modificazione della struttura della subunità in modo tale da irrigidire e deformare gli eritrociti.

β β

S A

La mutazione per l’anemia falciforme è codominante con l’allele selvatico , per cui individui

β β

S A

eterozigoti producono entrambi i tipi di emoglobina (HbA ed HbS) e si dicono affetti dal

tratto per l’anemia falciforme. Queste persone hanno una vita normale anche se i loro globuli

rossi vivono un po’ meno.

La prova che l’anemia falciforme derivava da un difetto dell’emoglobina venne da Pauling intorno

al 1950: egli studiò per elettroforesi le emoglobine derivate da tre diversi individui, di cui uno sano,

uno malato e uno affetto dal tratto dell’anemia falciforme (nel meccanismo di elettroforesi,

molecole di carica diversa e stesso peso molecolare migrano a velocità diverse).

L’analisi rivelò che le emoglobine dell’individuo sano migravano ad una certa velocità, quelle

dell’individuo affetto dal tratto per l’anemia falciforme migravano con due velocità (relative ai due

tipi), mentre quelle di individui completamente malati erano le più veloci.

La scoperta del fatto che questa malattia era determinata dalla presenza di un amminoacido

β,

sbagliato e più indirettamente da un errore sul gene per la subunità fu un’altra prova del fatto che

54

α

le coppie di basi nel DNA codificano per le proteine. Inoltre, visto che la subunità era sana,

β

mentre la era malata, si provò anche che un gene può specificare per un solo polipeptide.

G ABO ’

ENETICA BIOCHIMICA DEL GRUPPO SANGUIGNO NELL UOMO

Abbiamo già parlato dei gruppi sanguigni. Ricordiamo che il gene che codifica per i differenti

A B

gruppi sanguigni (il locus ABO) è caratterizzato da una serie di alleli multipli I , I ed i.

Conoscere la base molecolare dei gruppi sanguigni ABO fornisce un’ulteriore prova alla relazione

fra geni e sequenze amminoacidiche delle proteine.

Il locus ABO è coinvolto nella produzione delle glicosiltransferasi, enzimi che vengono utilizzati

per la sintesi dei polisaccaridi e che funzionano aggiungendo uno zucchero ad una catena

preesistente. In questo caso particolare, ci interessa il fatto che le glicosiltransferasi possono

costruire dei polisaccaridi da unire ai lipidi. I glicolipidi formati compongono gli antigeni presenti

sulla membrana del globulo rosso.

A partire dall’antigene H, le glicosiltransferasi aggiungeranno un diverso tipo di zucchero a

seconda che l’individuo sia di gruppo A, B o AB, determinando la formazione rispettivamente degli

antigeni A, B e sia A che B. Negli individui di gruppo O la catena non continua la sua formazione,

quindi è presente direttamente l’antigene H, che non scatena alcuna reazione anticorpale visto che si

tratta di una struttura nota a tutti.

L’antigene H viene prodotto da un locus che può portare l’allele H oppure h. Gli individui

omozigoti per l’allele h, che impedisce la formazione dell’antigene H, sono come gli individui di

gruppo O, perché non producono né anticorpi A nè B. Si parla di gruppo sanguigno Bombay e gli

individui portatori producono anticorpi contro l’antigene H in generale (e dunque anche contro il

gruppo O che ha base nell’antigene H).

Come conseguenza della presenza di questo nuovo gruppo, si ha che l’incrocio fra due individui di

B

gruppo O può generare un figlio di gruppo A oppure B: se un genitore è h/h I /- e l’altro è H/H i/i, il

B

bambino può essere H/h I /i, e quindi gruppo B.

F (CF)

IBROSI CISTICA

La fibrosi cistica è una malattia che causa disfunzioni al pancreas, ai polmoni ed alla digestione, e

si manifesta con la presenza di muco molto vistoso. Spesso porta sterilità.

È dovuta alla mutazione di un cromosoma autosomico che porta alla delezione di tre coppie di basi

consecutive sul gene e, visto che ogni amminoacido è codificato da una tripletta di basi, i malati di

fibrosi cistica mancano di un amminoacido. La nuova sequenza determina la formazione del gene

CF, che codifica per la sintesi di una proteina dannosa, la CFTR. Questa causa un alterato trasporto

dei sali attraverso le membrane che porta tutti i sintomi descritti.

Di nuovo, è stato dimostrato che i geni codificano per specifiche proteine, per cui quando vengono

danneggiati anche le proteine-prodotto ne subiscono le conseguenze.

C ONSULENZA GENETICA

Al giorno d’oggi è possibile determinare se un individuo sia o meno portatore di un difetto genetico.

La consulenza genetica fornisce l’analisi della probabilità che un individuo sia portatore di un

difetto genetico o del rischio che i futuri genitori possano generare un bambino con un difetto

genetico. Il consulente genetico deve, inoltre, aiutare le persone a prevenire o curare la propria

malattia.

Innanzitutto è necessario analizzare l’albero genealogico. Quindi si individua la presenza di

eterozigoti (portatori) per la mutazione recessiva e si determinano i rischi in caso si progetti il

concepimento. Altrimenti, è possibile determinare direttamente sul feto la presenza o meno del

difetto. 55

In quest’ultimo caso si analizzano anomalie nelle proteine o enzimi prodotti, ma non ci sono cure

possibili in caso di positività.

La procedura più comune di analisi del feto è l’amniocentesi (pag. 280): attraverso una siringa

viene prelevato il liquido amniotico nel quale nuota il feto. Esso contiene infatti cellule sfaldate

dalla pelle del feto, che possono essere coltivate in laboratorio e studiate.

Altro sistema è l’analisi dei villi coriali, che può essere effettuata più precocemente

dell’amniocentesi. Consiste nel prelievo di alcune cellule del corion, un tessuto embrionale che

circonda la placenta (essendo un tessuto embrionale, riflette la genetica del feto). 56

SECONDA PARTE:

S ,

TRUTTURA MOLECOLARE

FUNZIONE E TRASMISSIONE

DEL MATERIALE GENETICO 57

LA STRUTTURA DEL MATERIALE GENETICO

L : DNA RNA

A NATURA DEL MATERIALE GENETICO ED

Molto prima che DNA ed RNA fossero scoperti, era chiaro ai genetisti che la molecola

trasportatrice dell’informazione avrebbe dovuto avere determinate caratteristiche:

Doveva possedere stabilmente l’informazione genetica.

 Doveva essere in grado di replicare con cura l’informazione.

 Doveva potersi modificare per permettere l’evoluzione.

All’inizio del 1900 si pensava che l’informazione genetica fosse portata dalle proteine. Anche dopo

l’osservazione del nucleo e la scoperta del DNA, per tutti i primi 40 anni di questo secolo non si

arrivò a particolari conclusioni a riguardo.

L DNA

A SCOPERTA DEL COME MATERIALE GENETICO

La scoperta del DNA come materiale genetico venne dagli esperimenti di Griffith sui topi.

Nei suoi studi, Griffith iniettava i topi con due diversi ceppi di batteri pneumococchi, il ceppo S,

virulento in quanto in possesso di una specifica membrana polisaccaridica, ed R, non virulento

perché mancante della membrana specifica.

A sua volta il ceppo S contiene due forme differenti IIS e IIIS.

Se i topi venivano iniettati con batteri R non morivano, al contrario di quello che accadeva se

iniettati con il ceppo S. Se si usavano cellule S morte, ugualmente non succedeva nulla.

Griffith provò ad iniettare un topo con cellule R e IIIS morte. Il risultato era che il topo moriva ed in

esso si trovavano cellule virulente IIIS. Visto che le cellule R derivavano da IIS, non avrebbero mai

potuto originare IIIS, quindi non era avvenuta una semplice mutazione.

Griffith indicò il fattore che aveva indotto il cambiamento come il principio trasformante.

Quello che in realtà era successo era che le cellule virulente erano state uccise ma il loro materiale

genetico non era andato distrutto: un fenomeno di ricombinazione aveva creato dei mutanti virulenti

che possedevano il gene S, in grado di sintetizzare la membrana polisaccaridica.

Nel 1944 Avery e soci tentarono un esperimento: lisarono una cellula IIIS e separarono i vari

componenti della cellula. Quindi li aggiunsero uno ad uno in diverse provette dove si trovavano dei

batteri R, per vedere quale fra questi era il principio trasformante. Fu così che venne scoperto che

erano il DNA e l’RNA a provocare i cambiamenti.

Quindi, Avery utilizzò delle nucleasi (enzimi che degradano gli acidi nucleici) per determinare

quale fra DNA ed RNA era responsabile della trasmissione dell’informazione. Quando veniva

degradato l’RNA con una ribonucleasi (RNasi), il principio trasformante funzionava ancora. Al

contrario la degradazione del DNA con una DNasi non faceva ottenere trasformazioni.

A sostegno dell’ipotesi di Avery che fosse il DNA a portare l’informazione, altri studiosi

osservarono che esso risiedeva nel nucleo, ove erano presenti i cromosomi (di cui si conosceva la

natura ereditaria), e che non veniva degradato molto facilmente, al contrario degli altri componenti

cellulari.

Verso la metà degli anni ’50, Hershey e Chase scoprirono con certezza che il DNA era il materiale

genetico.

Fecero crescere due colonie di E.coli in due terreni separati che possedevano uno gli isotopi

radioattivi per lo zolfo, e l’altro per il fosforo: il DNA contiene fosforo ma non zolfo, e viceversa le

proteine. Quindi infettarono E.coli e divisero i due stock di fagi T2 ottenuti: da una parte quelli con

proteine marcate con zolfo, dall’altra quelli con DNA marcato con fosforo. 58

A questo punto, un E.coli non marcato veniva infettato con entrambi i tipi di T2, ottenendo che la

marcatura al fosforo restava all’interno del batterio e si ritrovava anche nella progenie di T2, mentre

quella allo zolfo non si ritrovava in nessun caso.

Visto che i geni rappresentano il progetto per costruire nuovi fagi, è evidente che il materiale

genetico sarebbe dovuto entrare nella cellula e restarci per generazioni: quindi il DNA era

ufficialmente ritenuto il materiale responsabile dell’ereditarietà.

L ’RNA

A SCOPERTA DELL COME MATERIALE GENETICO

Alcuni virus non possiedono DNA, ma solo RNA come materiale genetico (il virus del mosaico del

tabacco (TMV) o il virus della poliomielite).

TMV è formato solo da proteine ed RNA, in cui quest’ultimo forma un’elica circondata da varie

scaglie proteiche, in modo da essere protetto nei confronti di enzimi degradatori. Se si iniettava

nelle cellule del tabacco l’elica di RNA priva dell’involucro, si osservavano i sintomi della malattia,

al contrario di quello che accadeva se si inseriva RNA degradato oppure solo le proteine.

Così fu dimostrato che in certi casi anche l’RNA può essere un vettore genetico.

L DNA RNA

A COMPOSIZIONE CHIMICA DI ED

DNA ed RNA sono macromolecole, in quanto hanno un peso pari ad alcune migliaia di dalton, e

sono polimeri composti da unità monomeriche dette nucleotidi.

Ogni nucleotide è formato da un pentoso (un anello a cinque termini), una base azotata ed un

gruppo fosfato (pag. 299). Un nucleoside, invece, comprende solo lo zucchero e la base, per cui a

volte il nucleotide viene chiamato nucleoside fosfato.

Il termine acidi nucleici per indicare queste macromolecole deriva dal fatto che vengono isolate dai

nuclei e sono acide.

Lo zucchero utilizzato è il ribosio nel caso dell’RNA ed il desossiribosio nel caso del DNA. I due

pentosi differiscono perché il desossiribosio manca di un gruppo –OH in posizione 2’ (sostituito da

un –H).

Visto che l’RNA è provvisto di gruppi –OH in posizione 2’, è soggetto ad idrolisi, mentre il DNA è

molto più stabile: questa è probabilmente una delle ragioni per cui è il DNA, e non l’RNA, il

veicolo principale genetico dell’informazione.

Le basi azotate si distinguono in due tipi: purine e pirimidine. Le purine sono adenina e guanina,

mentre le pirimidine sono nel DNA timina e citosina, e nell’RNA citosina e uracile (che differisce

dalla timina per la mancanza di un gruppo metilico).

Le basi azotate si uniscono agli zuccheri attraverso un legame covalente con il C in posizione 1

dello zucchero, mentre i gruppi fosfati hanno lo scopo di unire le posizioni 3’ e 5’ di zuccheri posti

in fila, attraverso un legame fosfodiesterico estremamente stabile.

L DNA:

A STRUTTURA FISICA DEL LA DOPPIA ELICA

Furono James Watson e Francis Crick che scoprirono nel 1953 la struttura molecolare del DNA.

Essi si basarono su tre punti principali:

Si sapeva che la molecola di DNA era formata da nucleotidi.

 Era noto che il DNA ha uguali numeri di adenine e di timine (A = T) e la stessa cosa vale

 per le guanine e le citosine (G = C). Queste relazioni sono note come regole di Chargaff.

L’RNA, a singolo filamento, non vi obbedisce, e la stessa cosa fa il DNA quando è a

filamento singolo.

Era stata già fatta una “radiografia” del DNA da Franklin, che indicava che la molecola

 aveva una struttura ad elica. 59

A partire da questi dati, Watson e Crick poterono costruire l’ormai ben noto modello a doppia elica

del DNA.

Le fibre del DNA assumono la cosiddetta conformazione B, considerata la forma nativa del DNA

perché si ritrova sulle teste degli spermatozoi. Questa struttura (pag. 303) consiste in due filamenti

polinucleotidici che si avvolgono intorno ad un asse comune con andamento destrorso, formando

una doppia elica dal diametro di 2 nm.

I due filamenti sono antiparalleli, cioè hanno polarità opposta: uno va dalla direzione 5’a quella 3’,

e viceversa per l’altro (3’-5’). Si definisce in genere testa l’estremità 5’ e coda quella 3’, in modo

che la testa di uno si trovi in corrispondenza della coda dell’altro.

Le basi occupano la parte centrale dell’elica, mentre le catene zucchero-fosfato si trovano alla

periferia, in modo che i gruppi fosfato (carichi) non si respingano. I piani delle basi sono

perpendicolari all’asse dell’elica, cioè le basi sono impilate come monete.

Ogni base è legata con legami idrogeno ad un’altra base posta sul filamento opposto, in un

fenomeno noto come appaiamento delle basi complementari. L’adenina si associa con la timina

con due legami idrogeno, e la guanina con la citosina con tre legami idrogeno (coppie di basi

secondo W. e C.). Il legame idrogeno è relativamente facile da aprire, per cui è molto funzionale

all’uso del DNA.

Le coppie di basi sono distanziate di 0,34 nm una dall’altra. Un avvolgimento completo dell’elica

occupa 3,4 nm, per cui ci sono 10,4 coppie di basi per giro di elica. Di conseguenza, ogni base

ruota di 36° in senso orario rispetto alla precedente.

A causa dell’asimmetria del desossiribosio, le scanalature dell’elica assumono diverse grandezze

per cui abbiamo un solco maggiore ed un solco minore.

Il DNA è una molecola enorme: nell’uomo è composto da 2.900.000 coppie di basi, per un totale di

µm

990.000 di lunghezza. In realtà, la struttura del DNA reale non è così schematica e non segue

necessariamente queste regole, anzi la sua struttura è molto sequenza-specifica, il che rende più

facile l’attacco delle proteine sequenza-specifiche della trascrizione.

L E ALTRE DOPPIE ELICHE

Quando l’umidità diminuisce, il DNA B va incontro ad una modificazione reversibile, detta DNA

A, un’elica destrorsa più larga (10,9 coppie di basi per giro di elica) e più piatta di quella di DNA B.

La maggiore caratteristica sta nel fatto che le coppie di basi sono inclinate rispetto all’asse dell’elica

e non più perpendicolari.

Altro tipo di DNA è il DNA Z, con un’elica sinistrorsa, 12 coppie di basi per giro di elica e la

grandezza delle scanalature inversa a quella del DNA B. Questa conformazione viene assunta più

facilmente quando basi puriniche e pirimidiniche si alternano fra di loro. Sembra che il DNA B

modificato in DNA Z sia un inibitore dell’espressione genica.

L’RNA a doppia elica (anche se in genere è a singola elica) non riesce ad assumere la stessa

conformazione del DNA B, a causa delle interazioni dei gruppi –OH in 2’, ma assomiglia molto di

più al DNA A e si chiama RNA A. Stessa cosa accade per i filamenti ibridi RNA-DNA.

Nelle cellule si trova tipicamente DNA B, visto che il DNA A si forma solo in condizioni di umidità

molto bassa e l’interno della cellula è molto umido.

Non è ancora ben chiaro a cosa serva il DNA Z. Alcuni studiosi hanno proposto che il suo

andamento sinistrorso potrebbe aiutare il DNA B a svolgersi durante la replicazione, mentre altri

hanno proposto che forse il DNA Z rappresenta la forma più stabile del DNA in condizioni

ambientali estreme. 60

L’ORGANIZZAZIONE DEL

DNA NEI CROMOSOMI

C ARATTERISTICHE DEI CROMOSOMI DEI BATTERI E DEI VIRUS

I CROMOSOMI BATTERICI

In E.coli il DNA è organizzato in un unico cromosoma lungo circa 1000 paia di basi.

Visto che la quantità di DNA presente nella cellula del batterio è pari a 1000 volte la sua lunghezza,

esso deve essere compresso in modo tale da potervi entrare.

Esistono due forme del DNA batterico, rilassata e superavvolta, chiamate assieme topoisomeri.

La forma rilassata si ottiene semplicemente unendo le due estremità di una doppia elica di DNA.

Quella superavvolta, invece, si ottiene svolgendo un’estremità del doppio filamento corrispondente

a due giri, e poi unendola all’altra estremità. In questo modo si ottiene un DNA circolare instabile,

con due giri di elica in meno. Per stabilizzarsi, il DNA già chiuso si avvolge attorno al proprio asse

per due giri (giri di superelica), arrivando alla forma superavvolta (pag. 313).

Esistono a loro volta due tipi di superavvolgimento: negativo e positivo. Nel primo caso, il DNA

non forma l’elica per il tratto corrispondente al superavvolgimento, perché ruota in senso opposto al

normale andamento destrorso: è come se volessimo svolgere una scala a chiocciola per un giro, per

cui il numero di gradini resta uguale, ma per percorrerla c’è un giro di 360° in meno da fare.

Al contrario, nel superavvolgimento positivo il DNA si avvolge ancora di più in senso orario.

In entrambi i casi, il DNA diventa più compatto.

La quantità ed i tipi di superavvolgimento dipendono da enzimi chiamati topoisomerasi: la

topoisomerasi II srotola il DNA rilassato e forma superavvolgimenti negativi, mentre la

topoisomerasi I converte il DNA superavvolto negativamente allo stato rilassato.

Nel DNA degli eucarioti, la forma superavvolta è garantita dalla presenza di un complesso di

proteine chiamate istoni. Anche i procarioti possiedono dei complessi proteici, simili ma non

identici agli istoni: il DNA si organizza con queste proteine formando delle anse, che lo dividono in

100 domini (un dominio = un’ansa) di circa 40.000 paia di basi ciascuno. In queste zone il DNA è

superavvolto negativamente (pag. 135).

I T-

CROMOSOMI DEI FAGI PARI

Ogni fago infetta un batterio specifico. I batteriofagi T2, T4 e T6 (T-pari) hanno tutti una struttura

simile: sono formati da un involucro proteico provvisto di fibre della coda, che contiene DNA. Sono

fagi virulenti e la loro iniezione porta quasi sempre alla lisi della cellula batterica. Le principali

caratteristiche dei cromosomi sono:

1. Permutazione circolare: i risultati di analisi genetiche hanno dimostrato che i fagi T2 e T4

possiedono un DNA circolare, in cui però il filamento esterno e quello interno sono spezzati,

ognuno in un punto differente (pag. 137). La spiegazione sta nel fatto che il DNA fagico è

composto da più cromosomi tutti della stessa lunghezza, ma in cui le estremità non

coincidono nel cerchio.

2. Ridondanza terminale: alle estremità di ogni filamento si trovano le stesse basi, cioè se

all’estremità 5’ ho i geni AB, a quella 3’ avrò ugualmente AB.

Il motivo della formazione di queste strutture sta nel modo in cui il DNA è impacchettato

nella testa dei fagi: quando viene iniettato in un batterio, il DNA fagico si replica più volte.

Tra le alcune di queste nuove molecole di DNA avviene una ricombinazione che coinvolge

le estremità ridondanti, in modo da formare, da due cromosomi, un unico frammento detto

concatamero. In questo filamento viene ripetuta la sequenza delle basi del cromosoma

originale (pag. 139). 61

Vari altri cromosomi si uniranno a quello concatamero, formando un frammento sempre più

lungo. Al momento di spezzarsi per entrare nelle teste dei fagi, visto che in queste entra una

quantità di DNA pari al genoma più qualche altra coppia di basi, è logico dedurre che ci sarà

una ridondanza alle estremità (genoma + frammento in più, preso dal genoma che segue nel

concatamero). ΦΧ

I 174

L CROMOSOMA DEL BATTERIOFAGO

ΦΧ174

Il fago è abbastanza piccolo. Ha un DNA circolare a singolo filamento, non ha fibre della

coda ed è costituito da sei subunità proteiche, ognuna delle quali contiene il DNA e possiede una

punta implicata nel processo infettivo.

Contiene un numero molto elevato di nucleotidi, che non possono essere inseriti nelle subunità in

forma distesa, ovviamente, ma nemmeno nella maniera compatta dei batteri. In questo fago, infatti,

l’organizzazione strutturale è più complessa (pag. 320): alcuni geni contengono al loro interno

l’informazione per altri geni, mentre l’estremità di uno si va a sovrapporre con quella di un altro.

Solo pochissime sequenze non specificano per degli amminoacidi.

ΦΧ174

La struttura del fago è quindi caratterizzata dalla presenza di geni sovrapposti: se il gene

A* è sovrapposto ad A, la traduzione di quest’ultimo comincia durante quella del primo, utilizzando

la stessa cornice di lettura (una cornice di lettura è uno dei tre modi per cui una sequenza di basi può

essere raggruppata in codoni). λ

I L CROMOSOMA DEL BATTERIOFAGO

λ

Il cromosoma del fago è lineare, a doppia elica e non è associato a proteine strutturali. Le due

estremità della molecola sono a singola elica e complementari, in modo che subito dopo l’infezione

si possa creare un DNA circolare tutto a doppia elica. Queste sequenze complementari sono dette

cos.

Il DNA del fago contiene inoltre una sequenza chiamata ter che determina la produzione di

un’endonucleasi (un enzima che taglia gli acidi nucleici in un punto qualsiasi interno alla molecola).

Quando il fago si replica, va a creare un cromosoma concatamerico che viene in seguito tagliato

dall’endonucleasi prodotta da ter, in grado di riconoscere le sequenze cos e ricreare il cromosoma

iniziale.

C ARATTERISTICHE DEI CROMOSOMI DEGLI EUCARIOTI

Mentre i procarioti hanno un singolo tipo di cromosoma (magari presente in varie copie), gli

eucarioti hanno un numero diploide di cromosomi. Il numero cromosomico umano è 46. L’uomo

possiede una serie aploide di cromosomi (pari a 23 cromosomi) proveniente dall’uovo ed una

uguale dallo spermatozoo.

I L CARIOTIPO

L’insieme completo di tutti i cromosomi metafasici (si usano questi perché sono i meglio visibili) di

una cellula è definito cariotipo, un valore specie-specifico.

Quando si disegna un cariotipo, si indica la forma ed il numero relativo ad ogni cromosoma. Questi

vengono allineati in ordine di grandezza e di posizione del centromero (pag. 324). Gruppi di

cromosomi con morfologia simile sono indicati con le lettere dell’alfabeto. Tutti sono disegnati in

modo da avere vicino il proprio omologo, mentre i cromosomi del sesso (nel maschio) sono spaiati,

visto che hanno dimensioni troppo diverse. 62

Spesso, però, identificare forme simili solo ad occhio è troppo complicato. Sono state inventate

delle colorazioni che reagiscono in modo differente nelle varie parti del cromosoma, creando dei

bandeggi cromosomici tipici per ognuno, così possono essere identificati molto meglio.

Il bandeggio G evidenzia le zone ricche di adenina e timina, ed è il sistema più usato.

I C

L VALORE

La quantità totale di DNA del genoma aploide è definita come il suo valore C. Dà un valore delle

relazioni evolutive presenti fra le specie, per cui vi è una tendenza all’aumento del valore C quanto

più gli organismi sono lontani dal progenitore.

Le differenze maggiori sono quelle tra phyla differenti.

Aumentare il valore di C, però, non significa aumentare di complessità, perché una ragione di

questa maggiore quantità di DNA sta nella presenza di più sequenze ripetute del genoma.

L A STRUTTURA MOLECOLARE DEL CROMOSOMA EUCARIOTICO

Ogni cromosoma eucariotico è formato da una molecola di DNA a doppia elica lineare, che

contiene una quantità in peso di proteine circa doppia rispetto a quella del DNA.

La cromatina costituisce il cromosoma ed è formata da DNA e proteine associate.

Esistono due tipi di cromatina:

Eucromatina: costituisce la maggior parte del genoma, di cui rappresenta la parte attiva,

 ovvero quella parte i cui geni vengono tradotti. È despiralizzata in interfase (per essere

letta), ma si condensa durante la mitosi (per la duplicazione).

Eterocromatina: rappresenta la parte inattiva del genoma, quella che non viene espressa, in

 virtù del suo estremamente maggiore compattamento. Si trova disposta vicino ai centromeri,

ai telomeri (le estremità del cromosoma) ed in altri luoghi specie-specifici. Esistono due tipi

di eterocromatina:

− Eterocromatina costitutiva: sempre inattiva, ed è quella dei centromeri e dei

telomeri.

− Eterocromatina facoltativa: contiene geni che vengono inattivati a seconda delle

necessità, come i corpi di Barr.

Entrambi i tipi di cromatina contengono due proteine associate al DNA: istoni e proteine non

istoniche. Gli istoni sono le principali proteine del DNA, responsabili del suo superavvolgimento.

Se però gli istoni vengono eliminati ed il DNA si svolge, le proteine non istoniche riescono a

mantenere la struttura del cromosoma.

Istoni: sono proteine basiche abbastanza piccole. La loro basicità, associata ad una carica positiva

(gli istoni sono composti per il 25% da lisina ed arginina, amminoacidi positivi), permette un forte

legame con il DNA acido e negativo.

Gli istoni sono di cinque tipi: H1, H2A, H2B, H3 ed H4. Tutti, a parte il primo, hanno conservato la

loro struttura proteica fra i diversi organismi, indicando che il ruolo svolto da queste proteine è

sempre lo stesso.

DNA ed istoni si associano a formare i nucleosomi, in cui il DNA si avvolge attorno ad un

complesso formato da 9 istoni (un istone H1 e due copie di tutti gli altri). Mentre i quattro tipi di

istoni formano un cilindro (ottamero) a due piani, diviso alla base in quattro spicchi, l’H1 è

attaccato all’esterno (pag. 328). Attorno a questo complesso riescono ad avvolgersi 180 paia di basi

di DNA, che compie un giro e ¾ attorno all’ottamero.

Il DNA che unisce due nucleosomi (e quindi non gira attorno a niente) è chiamato DNA linker, e la

forma che ne risulta è quella di una collana di perle dello spessore di 11 nm (pag. 330). 63

Questa struttura a collana, però, non permette l’avvolgimento necessario. Si passa quindi ad un

secondo livello di impaccamento, denominato fibra di cromatina di 30 nm di spessore. A questi

livelli leggere il DNA è impossibile ed infatti ci troviamo in corrispondenza della metafase.

L’istone H1 svolge un ruolo essenziale, ma non chiaro, nel formare questo impaccamento.

In pratica, la fibra è una struttura composta da sei nucleosomi per giro e compatta quindi il DNA di

sei volte. Anche questo impaccamento non basta. Il successivo vede la presenza anche delle

proteine non istoniche.

Proteine non istoniche: comprendono tutte le proteine associate al DNA ad eccezione degli istoni.

Lo sono anche proteine ed enzimi legati alla replicazione, trascrizione & co. Quindi sono molte più

che le proteine istoniche.

Sono proteine acide al contrario degli istoni, per cui si legano a questi e non al DNA. Inoltre,

sempre differentemente dagli istoni, variano molto fra i diversi organismi.

Nell’impaccamento del DNA questa classe proteica svolge il ruolo fondamentale di rappresentare

una base per la formazione dei domini ad ansa del DNA. In pratica, la fibra di cromatina forma

delle anse che vengono mantenute grazie all’adesione a questa base. Sembra che, per organizzare

meglio l’intera struttura, ogni ansa possa funzionare in modo indipendente nei confronti della

trascrizione e della replicazione.

C ENTROMERI E TELOMERI

I centromeri controllano la precisa segregazione dei cromosomi duplicati nelle cellule figlie. Negli

eucarioti appaiono come delle costrizioni lungo il cromosoma.

Sembra che il centromero, per attaccarsi al fuso mitotico o meiotico, utilizzi delle proteine

specifiche dalla struttura abbastanza complessa.

Quando i centromeri non funzionano correttamente avviene una nondisgiunzione. Se ad esempio il

centromero manca, il cromosoma non riesce ad attaccarsi al fuso e migra a caso all’interno della

cellula ed in genere va perduto.

Il telomero è la regione di DNA che si trova alle estremità di un cromosoma. I telomeri sono molto

importanti nel determinare la stabilità del cromosoma.

Le sequenze telomeriche si dividono in due tipi:

Sequenze telomeriche semplici: si trovano proprio all’estremità del cromosoma e

 consistono in sequenze ripetute a tandem. Donano stabilità e partecipano attivamente al

processo di replicazione (vedi cap. seguente).

Sequenze associate ai telomeri: si trovano accanto all’estremità dei cromosomi e sono

 lunghe e complesse, anche se ripetute.

Fanno eccezione a questa regola degli eucarioti i cromosomi della Drosophila, i cui telomeri sono

costituiti da trasposoni, sequenze ripetute del DNA che possono spostarsi in altri punti del genoma.

DNA A SEQUENZE UNICHE E RIPETUTE NEI CROMOSOMI DEGLI EUCARIOTI

Il DNA è stato diviso in funzione delle sequenze che si riscontrano al suo interno: DNA a singola

copia (o sequenze uniche, presenti in forma di una o poche copie nel genoma), sequenze

3 5

moderatamente ripetute (presenti da poche a 10 -10 volte) e sequenze altamente ripetute

5 7

(presenti da 10 a 10 volte).

Nei procarioti il DNA è tutto presente come DNA a singola copia (ad eccezione dei geni per rRNA

e tRNA), mentre negli eucarioti sono frequenti tutti e tre i tipi (uomo: 64% - 25% - 10%

rispettivamente).

Le sequenze ripetute sono di due tipi: in tandem e sparse. 64

Le sequenze ripetute in tandem sono disposte in tandem nel genoma. Ne sono esempi comuni i

geni per l’rRNA e per il tRNA, o per gli istoni (ad eccezione di uccelli e mammiferi). Le sequenze

in tandem possono codificare per geni simili ma non identici, per cui si creano delle famiglie

multigeniche come quella della globina, in cui vari geni posti in tandem codificano per differenti

tipi di globina.

Molte di queste sequenze non codificano per delle proteine, ed infatti la maggior parte di esse si

trova in corrispondenza dei centromeri e dei telomeri. Contengono una quantità di coppie CG

maggiore rispetto al normale DNA, per cui formano una banda che reagisce differentemente dalle

altre alla colorazione: si parla di bande satelliti e DNA satellite.

Le sequenze ripetute sparse si riferiscono a quelle sequenze ripetute sparse nel genoma e non in

tandem, e sono abbastanza poche. Sono un esempio i geni per gli istoni degli uccelli e dei

mammiferi, i trasposoni, sequenze che non sono geni.

Questo tipo di sequenze è presente come famiglie nel DNA: le famiglie SINE, con sequenze corte,

e le famiglie LINE, molto più lunghe. Le proporzioni relative ad ogni famiglia variano molto fra le

specie eucariotiche, ed il loro ruolo non è molto chiaro. 65

REPLICAZIONE E RICOMBINAZIONE DEL DNA

R DNA

EPLICAZIONE DEL NEI PROCARIOTI

Per Watson e Crick fu subito chiaro qual era il sistema di replicazione del DNA: la doppia elica

doveva essere srotolata in modo che un’elica singola fungesse da stampo per la figlia. Alla fine del

processo si erano formate due eliche di DNA, ognuna composta da un filamento figlio ed uno

parentale: questo sistema di conservazione dell’elica parentale venne chiamato modello

semiconservativo.

Gli altri due modelli proposti erano quello conservativo, in cui i due filamenti parentali si

riassociavano dopo la sintesi, e quello dispersivo, in cui il DNA si frammenta in varie parti,

vengono copiati gli stampi, si associano parentali con parentali e figli con figli, e doppie eliche

parentali e figlie si mischiano in una sola elica.

L’ M S

ESPERIMENTO DI ESELSON E TAHL

In effetti, l’evidenza dimostrò che Watson e Crick erano nel giusto, grazie all’esperimento condotto

da Meselson e Stahl. I due scienziati presero delle provette (pag. 344) in cui era stato inserito

14 15

E.coli. Nel terreno di coltura usarono, al posto del comune azoto N , il suo isotopo N . Per

parecchie generazioni lasciarono crescere il batterio in queste provette, in modo che tutto l’azoto

15

presente fosse in forma di N (anche nella doppia elica).

Quindi, Meselson e Stahl presero alcuni batteri e li trapiantarono in un terreno che conteneva solo

14

N : dopo una generazione, la doppia elica mostrava una densità esattamente intermedia fra la forma

15 14

completamente N e quella completamente N , dimostrando che un filamento (quello paterno) era

15 14

rimasto N mentre quello di nuova sintesi era N .

Alla luce di queste osservazioni, però, se era escluso il modello conservativo (si sarebbe dovuta

14

trovare tutta la doppia elica con N ), non lo era quello dispersivo.

Invece, analizzando le generazioni successive, si osservò che parecchie doppie eliche erano

14 14 15

completamente N , ed una sola restava ancora N /N . Quindi, il modello di replicazione era per

forza semiconservativo.

L DNA

E POLIMERASI

Attraverso una serie di esperimenti volti ad identificare tutte le sostanze necessarie per replicare il

DNA in vitro, vennero scoperte le DNA polimerasi, enzimi coinvolti nella sintesi del DNA.

Per replicare il DNA dunque erano necessari:

desossiATP, desossiGTP, dCTP e dTTP (o più in generale si possono dire dNTP – desossi

 ribonucleoside trifosfato), precursori dei nucleotidi.

2+

Ioni magnesio (Mg )

 Un frammento di DNA

 DNA polimerasi I

Le DNA polimerasi catalizzano la polimerizzazione dei nucleotidi in una catena di DNA. La

reazione che guidano è: (dNMP) + dNTP (dNMP) + PP

n n+1 i

in cui n rappresenta il numero di desossiribonucleotidi 5’ monofosfati che compongono il DNA. In

pratica, la DNA polimerasi aggiunge un altro elemento alla catena privandolo di un gruppo

pirofosfato (PP ).

i 66

L’aggiunta avviene in direzione 5’- 3’ (pag. 347), precisamente sul gruppo 3’OH dell’ultimo

nucleotide, attraverso un legame fosfo-diesterico con il fosfato in posizione 5’ presente sul

nucleoside entrante. Immediatamente si libera il gruppo PP . È importantissimo notare che la catena

i

preesistente funge da primer (innesco) per la nuova catena.

L’attacco dei desossiribonucleotidi non è casuale, ma la DNA polimerasi I opera una selezione

viaggiando lungo lo stampo contemporaneamente all’allungamento della catena e trovando la base

complementare a quella presente sullo stampo.

Studi sulla replicazione del DNA dimostrarono che la DNA polimerasi I non era l’unico enzima che

partecipava al processo di replicazione nei procarioti. Mutanti del gene per questo enzima infatti si

replicavano normalmente. Si pensò di conseguenza che la DNA polimerasi I doveva avere un ruolo

anche nella riparazione degli errori.

Altre DNA polimerasi sono la II e la III. Quest’ultima è coinvolta nel processo di replicazione

come la I, mentre non si conosce il ruolo della II.

Oltre a poter agganciare nuovi nucleotidi, tutti e tre questi enzimi hanno attività esonucleasica,

cioè possono catalizzare la rimozione di nucleotidi in direzione 3’-5’ (opposta alla crescita), allo

scopo di controllare l’accuratezza dell’ultima coppia aggiunta. Quando si verifica un errore

-5

(frequenza di 10 per coppia), la replicazione si blocca, si innesca l’attività esonucleasica e poi si

-

ricomincia (meccanismo di correzione di bozze). Questo sistema porta la frequenza di errori a 10

9 .

La DNA polimerasi I può avere attività esonucleasica anche in direzione 5’-3’ (vedi prossimo

capitolo).

Le DNA polimerasi di qualsiasi specie possono funzionare in un’altra, per cui se si pone la DNA

polimerasi di E.coli in una cellula umana, essa funzionerà ugualmente (e viceversa).

L A REPLICAZIONE SEMIDISCONTINUA

Per essere letto, il DNA deve essere svolto in due eliche singole.

Quando il DNA a doppia elica si srotola dall’estremità, si forma una struttura ad Y chiamata forca

replicativa (pag. 353). Poiché la DNA polimerasi può catalizzare l’attacco dei nucleotidi solo in

direzione 5’ – 3’, sul filamento stampo 5’ – 3’ non si potrebbe costruire il filamento figlio

(direzione di sintesi 3’ – 5’).

Fu lo studioso Okazaki a risolvere la questione: il filamento “comodo” per la DNA polimerasi

veniva replicato in modo continuo (tutto di fila), mentre quello “scomodo” ha una replicazione

discontinua. In pratica vengono sintetizzati singoli frammenti di Okazaki in direzione 5’-3’, che

verranno uniti da enzimi appositi a formare l’elica figlia corrispondente. Il filamento sintetizzato in

modo continuo è detto elica leading, mentre quello discontinuo è detto elica lagging.

Nei procarioti, l’apertura della doppia elica produce una bolla di replicazione, il cui perimetro è

determinato da singoli filamenti stampo. La bolla di replicazione può essere considerata come

l’unione di due forche di replicazione orientate in maniera speculare. Per questo si parla di

replicazione bidirezionale, visto che all’interno della bolla la replicazione ogni forca segue due

vie, di cui una in partenza da un 5’ ed una da un 3’ (pag. 352).

Q ’ DNA

UADRO D INSIEME DELLA REPLICAZIONE DEL NEI PROCARIOTI

1. Nei procarioti, l’inizio della replicazione vede l’azione di una topoisomerasi I che rilassa

una porzione del DNA circolare superavvolto.

2. L’apertura della doppia elica (denaturazione) avviene in corrispondenza di una sequenza

detta origine di replicazione (pag. 351). Nel cromosoma circolare di E.coli esiste una sola

origine di replicazione, che procede in due direzioni. L’apertura della doppia elica avviene

67

ad opera della DNA elicasi, che si lega al DNA. Questo evento consuma ATP ed ogni

molecola consumata fa muovere l’elicasi di un passo più avanti lungo l’elica.

Sembra che siano presenti due elicasi lungo l’elica, una che si muove sull’elica leading e

l’altra su quella lagging.

3. L’elica lagging resta esposta dopo lo svolgimento, perché su di essa gli enzimi per la

replicazione si attaccano con ritardo. Per evitare il riavvolgimento del DNA a singola elica

nella sua struttura secondaria, delle proteine destabilizzanti l’elica o proteine SSB si

legano al filamento lagging. Il legame non copre le basi, che quindi possono ancora essere

lette dalla polimerasi. Ogni volta che vengono sintetizzati due frammenti di Okazaki, fra

questi si pongono delle proteine SSB, che si spostano dall’intervallo precedente.

4. La DNA primasi si lega all’elicasi formando un complesso detto primosoma. La primasi è

essenziale perché nessuna DNA polimerasi è in grado di iniziare un filamento di DNA:

sanno solo aggiungere desossiribonucleotidi su un filamento preesistente. La primasi

sintetizza esternamente al filamento un RNA primer, che comincia con una coppia AT ed

una GC. Su questo primer la DNA polimerasi III può agire, aggiungendo le basi

complementari allo stampo. Agiscono in contemporanea due polimerasi III: una sull’elica

leading e l’altra su quella lagging.

Sull’elica leading la DNA primasi sintetizza un solo primer in direzione 5’ – 3’, mentre

sull’altra lo fa in direzione opposta e spesso (crea i primer per i frammenti di Okazaki).

5. L’allungamento delle nuove eliche avviene in maniera differente. Sull’elica leading tutto

procede normalmente. Su quella lagging, affinchè la DNA polimerasi III possa sintetizzare

in direzione 5’ – 3’, sono necessari due frammenti di Okazaki: uno espone l’estremità 3’ e

l’altro quella 5’, quindi l’enzima può sintetizzare il frammento intermedio. Quando la sintesi

del frammento è finita, la DNA polimerasi III si dissocia.

L’allungamento dell’elica lagging è sempre in ritardo rispetto a quello della leading perché

devono essere prima sintetizzati i primer, e poi si può proseguire.

6. Sul filamento lagging, i frammenti non sono uniti, ma l’estremità 5’ di uno è adiacente a

quella 3’ dell’altro. Quando si dissocia la III, una DNA polimerasi I sintetizza il pezzetto

mancante sempre nella direzione giusta e, quando incontra un primer, lo taglia via grazie

alle sue proprietà esonucleasiche 5’ – 3’.

A questo punto, una DNA ligasi unisce i frammenti adiacenti.

Tutto questo complesso di DNA e proteine non si muove liberamente, ma è strettamente associato a

formare una precisa macchina replicativa (pag. 355) o replisoma. L’elica lagging si ripiega ad

ansa, in modo che la propria DNA polimerasi III formi un complesso con quella dell’elica leading.

In questo modo, la sintesi del nuovo filamento su un’elica e sull’altra avviene contemporaneamente,

perché le due DNA polimerasi III si muovono entrambe attaccate al primosoma. Comunque, il

filamento lagging sarà in ritardo “di un’ansa” rispetto all’altro.

R DNA

EPLICAZIONE DEL CIRCOLARE E REPLICAZIONE A CERCHIO ROTANTE

Non in tutti i procarioti il DNA resta nella forma circolare, come accade in E.coli.

θ

In certi casi le molecole assumono una conformazione a (theta – pag. 356), a causa del continuo

avanzamento della bolla di replicazione alle due estremità.

Sorge però un problema: il rilassamento di un superavvolgimento creerà dei superavvolgimenti

positivi da un’altra parte dell’elica. La soluzione più semplice sarebbe quella di far ruotare il

cromosoma contemporaneamente all’apertura della forca. Calcolando però la velocità di

avanzamento dell’elicasi, lo srotolamento dell’elica dovrebbe avvenire troppo velocemente per

compensare. Invece sono le topoisomerasi che risolvono tutto, perché introducono continuamente

68

nuovi superavvolgimenti negativi nel DNA o convertono quello superavvolto negativamente in

rilassato.

Un altro tipo di replicazione del DNA circolare è quella a cerchio rotante, tipica di molti DNA

virali ed usata nei processi di coniugazione batterica, ad esempio nel passaggio del plasmide F. Il

procedimento è il seguente (pag. 358): il filamento più esterno dell’elica viene tagliato e l’estremità

5’ viene separata dall’altro filamento e coperta di proteine SSB che evitano il ripiegamento in una

struttura secondaria. Un complesso proteico simile a quello della forca replicativa curva il filamento

separato in forma di ansa, in modo che possano verificarsi contemporaneamente l’allungamento

dell’estremità 3’ e di quella 5’, sempre con il sistema dei frammenti di Okazaki.

La replicazione a cerchio rotante porta alla formazione di una lunga molecola lineare. Se sono state

scritte più copie dello stesso cromosoma, la molecola verrà successivamente tagliata nei cromosomi

corrispondenti.

R DNA

EPLICAZIONE DEL NEGLI EUCARIOTI

La replicazione degli eucarioti è più complessa rispetto a quella dei procarioti anche perché, mentre

in quest’ultimo caso è presente un solo cromosoma, negli eucarioti sono presenti molti cromosomi.

Quindi deve essere attivo un complesso sistema di controllo, dovuto all’azione contemporanea dei

prodotti di molti geni.

In particolare, durante il ciclo cellulare (mitotico o meiotico) vengono attivati dei punti di controllo

(checkpoint) basati sull’azione di un gruppo di proteine chiamate cicline e di enzimi chinasi

ciclina dipendenti: le cicline si legano agli enzimi, i quali fosforilano alcune proteine chiave per il

passaggio in S. L’attivazione dell’enzima provoca la degradazione delle cicline.

Il primo checkpoint si verifica in fase G e stabilisce se la cellula sia in grado o meno di entrare in

1

fase S, per cui se la cellula non si trova in un ambiente favorevole o non è cresciuta abbastanza non

proseguirà nel ciclo.

Il checkpoint G controlla che il DNA si sia replicato, mentre quello in fase M controlla l’esatto

2

appaiamento dei cromosomi sul fuso prima della separazione dei cromatidi fratelli.

I NIZIO DELLA REPLICAZIONE

Se negli eucarioti il sistema si basasse su una sola origine di replicazione per cromosoma come è

per i procarioti, per replicare un cromosoma umano ci vorrebbero circa 830 ore.

Per questo negli eucarioti troviamo numerose origini di replicazione su un solo cromosoma: ognuna

è chiamata sequenza a replicazione autonoma o ARS. Si è comunque osservato che non tutti gli

ARS corrispondono ad origini di replicazione.

La replicazione procede bidirezionalmente, cioè dopo l’apertura della doppia elica ad opera delle

topoisomerasi, la forca replicativa si allarga da entrambe le parti. Ad un certo punto, due forche

adiacenti si incontreranno e si fonderanno.

Il tratto di DNA compreso fra un’origine di replicazione e le due estremità della forca è chiamato

replicone e corrisponde in pratica alla bolla dei procarioti, solo che è più piccolo e più lento (può

permettersi la lentezza, tanto ci sono più origini di replicazione).

E NZIMI E PROTEINE DELLA REPLICAZIONE α, β γ δ

Nelle cellule di mammifero sono state identificate cinque DNA polimerasi diverse: , ,

ε

ed . α β γ δ ε

nucleo nucleo mitocondrio nucleo nucleo 69

Riparazione Replicazione

Sintesi del DNA del DNA del DNA Sintesi del DNA

nucleare mitocondriale

Attività -- -- -- --

primasica

-- -- Correzione di Correzione di Correzione di

bozze bozze bozze

R EPLICAZIONE DELLE ESTREMITÀ DEI CROMOSOMI

Visto che le DNA polimerasi possono sintetizzare nuovo DNA soltanto se hanno già a disposizione

un primer, replicare le estremità dell’elica lagging diventa complicato.

Infatti, dopo la replicazione il primer posto sulla nuova estremità 5’ viene tagliato via e la DNA

polimerasi non può compensare con nuovi nucleotidi, visto che manca il primer (pag. 365). In

questo modo, i cromosomi diventerebbero più corti ad ogni ciclo di replicazione.

La lunghezza cromosomica è mantenuta per aggiunta di sequenze ripetute a tandem presso i

telomeri grazie all’enzima telomerasi. La telomerasi è fatta di proteine e di RNA, con una sequenza

complementare all’unità ripetuta dei telomeri (che è sempre fissa).

Quindi l’enzima può legarsi all’estremità del filamento nudo di DNA, facendo combaciare le

proprie basi con quelle del filamento, ma in modo che sporga all’esterno una sequenza di RNA

AAC. Una DNA polimerasi sintetizza le tre basi TTG.

Ora che tutto il filamento di RNA della telomerasi è saturato, l’enzima può slittare verso l’esterno

(direzione 3’) in modo che solo la tripletta AAC dell’estremità 3’ del suo RNA resti appaiata con il

DNA. Così, di nuovo una parte di RNA sporge libero all’esterno, e di nuovo una DNA polimerasi

sintetizza i nucleotidi necessari.

Riepilogando, ci troviamo di fronte ad un doppio filamento di DNA, di cui uno completo ed uno

interrotto. Dopo un vuoto di qualche paio di basi, troviamo in corrispondenza del filamento

interrotto un tratto di RNA: in pratica, abbiamo creato un frammento di Okazaki con il suo primer.

Una DNA polimerasi sintetizza le basi mancanti ed il primer viene eliminato. Ora il taglio non crea

problemi, perché vengono perdute solo sequenze ripetute e il cromosoma non si è accorciato.

R DNA

ICOMBINAZIONE DEL

I H

L MODELLO DI OLLIDAY PER LA RICOMBINAZIONE

Nella metà degli anni ’60, Robin Holliday propose un modello per la ricombinazione reciproca

dei cromosomi omologhi (pag. 368). Il modello si basa sulla presenza di due cromosomi omologhi,

+ +

di cui uno abbia alle estremità opposte l’allele a e b , e l’altro gli alleli a e b.

Il primo stadio è il riconoscimento ed allineamento, in cui le due coppie di cromosomi omologhi

si appaiano perfettamente (formazione del complesso sinaptonemale negli eucarioti). Quindi, su

ogni cromosoma si rompe la doppia elica più interna al complesso e ogni elica invade il cromosoma

vicino. Una DNA ligasi salda le eliche così incrociate producendo un intermedio di Holliday.

Il punto di ramificazione può migrare verso destra o sinistra, facendo spostare sempre più l’elica

sull’altro cromosoma.

Per visualizzare meglio il procedimento, si disegnano i cromosomi così modificati come una croce,

ottenuta tirando le estremità dei cromosomi e ruotando le due braccia più in basso di 180°.

La fase successiva è quella di taglio e giunzione, in cui si ricreano due doppie eliche separate: un

enzima taglia il punto di incrocio fra le quattro braccia orizzontalmente o verticalmente. Nel primo

caso si creano due cromosomi di cui ognuno ha un’interruzione su un’elica speculare a quella

dell’altro. Una ligasi salda il filamento. Poiché ognuno dei due filamenti interni contiene un

frammento di DNA ricombinante fiancheggiato da quello parentale, si parla di duplex pezzati. 70

In caso di taglio verticale, l’interruzione si forma per entrambi i cromosomi sul filamento più in alto

ed una ligasi sistema il problema. In questo caso vi sono frammenti di DNA ibrido in ogni elica, e

non solo in quelle interne, per cui si parla di duplex congiunti. + +

Osservando i risultati finali, i duplex pezzati continuano ad avere le estremità parentali (a b ab),

+ +

mentre i congiunti sono ricombinanti (a b ab ).

Quindi: il modello di Holliday predice che durante uno scambio di loci tra due cromosomi

omologhi, si verifica un vero scambio genetico soltanto nella metà dei casi.

R IPARAZIONE DEGLI ERRORI DI APPAIAMENTO E CONVERSIONE GENICA

Abbiamo visto che nelle tetradi il rapporto di segregazione degli alleli è di 2:2 (il calcolo di PD, T e

NPD dava 50% ricombinanti e 50% parentali). Occasionalmente appaiono rapporti 3:1 ed 1:3,

probabilmente dovuti ad un processo noto come conversione genica, in cui i rapporti si modificano

in seguito alla correzione di errori di appaiamento.

Prendiamo il caso di due omologhi fra cui avviene un evento di ricombinazione ed il risultato finale

di due coppie di cromosomi duplex pezzati (pag. 370). Se lo scambio avviene in corrispondenza di

un gene centrale, è possibile che l’appaiamento del nuovo filamento con quello vecchio risulti

errato, visto che un filamento ha il gene parentale e l’altro quello ricombinante.

Per riparare l’errore, un’endonucleasi rimuove il segmento errato, una polimerasi catalizza la sintesi

di nuovo DNA e la ligasi salda l’interruzione. Può accadere che venga eliminato il segmento

parentale e il nuovo DNA sia costruito usando come base quello ricombinante.

Per questo si verificano rapporti anomali nelle tetradi. 71

LA TRASCRIZIONE, L’RNA

ED IL PROCESSAMENTO DELL’RNA

Nel 1956, poco tempo dopo la scoperta della doppia elica da parte di Watson e Crick, quest’ultimo

definì dogma centrale il processo a due fasi della sintesi proteica: trascrizione e traduzione.

La trascrizione è il processo di trasferimento dell’informazione dalla doppia elica di DNA alla

singola elica ad RNA. La traduzione consiste invece nella trasformazione del messaggio

dell’mRNA in un polipeptide.

I L PROCESSO DI TRASCRIZIONE IN GENERALE

Il processo di trascrizione necessita un enzima che sia in grado di formare l’RNA a partire dal

DNA: l’RNA polimerasi. Come per il processo di replicazione, anche la trascrizione necessita

l’apertura della doppia elica, che nei procarioti è resa possibile dall’RNA polimerasi stessa, mentre

gli eucarioti utilizzano proteine specifiche.

Solo un’elica del DNA (DNA stampo) viene usata per sintetizzare il filamento ad RNA, perché se

fossero utilizzate entrambe si produrrebbero due RNA complementari che codificherebbero per

proteine completamente diverse.

Il filamento di RNA viene sintetizzato in direzione 5’ – 3’ e dunque lo stampo ha orientamento 3’-

5’. Il filamento di DNA complementare allo stampo (5’ – 3’) viene detto filamento senso.

La reazione di polimerizzazione dell’RNA è molto simile a quella del DNA, con la differenza che le

RNA polimerasi possono cominciare la sintesi senza bisogno di primer, ma non possono correggere

le bozze.

L RNA RNA

E DIVERSE CLASSI DI E LE POLIMERASI

La trascrizione dà origine a quattro diversi tipi di RNA: mRNA (RNA messaggero), tRNA (RNA

transfer), rRNA (RNA ribosomiale) e snRNA (piccolo RNA nucleare).

Solo le molecole di mRNA vengono tradotte per produrre i polipeptidi, ed il processo avviene

attraverso i ribosomi. Un gene che codifica per un mRNA viene detto gene strutturale, perché

porta alla sintesi di una proteina.

I ribosomi sono formati da proteine e tre (nei procarioti) o quattro (negli eucarioti) molecole di

rRNA.

I tRNA invece hanno il ruolo di trasportare gli amminoacidi presso i ribosomi in maniera specifica,

in modo che possano comporre le proteine durante la traduzione.

Gli snRNA sono coinvolti nel processamento (maturazione) dell’RNA precursore e sono presenti

solo negli eucarioti. Infatti, l’RNA eucariote derivante dalla trascrizione non è subito utilizzato, ma

viene chiamato pre-RNA in quanto rappresenta più che altro un precursore.

I procarioti, invece, producono direttamente RNA funzionante.

Nei batteri un solo tipo di RNA polimerasi trascrive sia i geni strutturali che quelli per tRNA ed

rRNA. Negli eucarioti ci sono tre tipi di RNA polimerasi:

RNA polimerasi I RNA polimerasi II RNA polimerasi III

nucleolo plasma del nucleo plasma del nucleo

Sintesi degli rRNA Sintesi degli mRNA ed Sintesi di tRNA, rRNA 5S

(18S, 28S e 5,8S) alcuni snRNA, e degli altri snRNA

attacco del cappuccio in 5’ 72

Tutte le RNA polimerasi eucariotiche sono costituite da diverse subunità, almeno due grandi e

quattro piccole. Sembra che esse si siano conservate durante l’evoluzione, perché sono molto simili

anche fra specie molto diverse.

L A TRASCRIZIONE DEI GENI STRUTTURALI

I PROCARIOTI

I geni strutturali dei procarioti si possono dividere in tre parti:

Promotore: a monte del punto di inizio della trascrizione.

 Sequenza codificante

 Terminatore: a valle della sequenza codificante.

Il promotore di E.coli ha due sequenze critiche per l’inizio della trascrizione, poste nel punto -35 e

-10 lungo la molecola di DNA (si indica con +1 la prima coppia di basi della sequenza codificante

ed il resto va da sé).

Affinché inizi la trascrizione non basta il legame della RNA polimerasi, ma questa deve formare un

complesso con altre proteine per costituire un oloenzima, i cui principali componenti sono il nucleo

β β’), σ,

enzimatico della RNA polimerasi, costituito da quattro polipeptidi (2α, e ed un fattore

indispensabile per il riconoscimento del promotore.

Inizialmente l’oloenzima si lega al promotore nel punto -35, con il DNA ancora in forma di doppia

elica (pag. 384). Un legame più stretto porta all’apertura di circa due giri dell’elica, con centro in

posizione -10 (bolla di trascrizione).

Poiché le sequenze promotrici non sono sempre uguali, l’oloenzima si legherà ad esse con diversa

intensità per i vari geni, regolando la velocità di inizio della trascrizione. Inoltre esistono numerosi

σ

fattori diversi, ognuno specifico per un promotore. σ

Dopo la polimerizzazione di 8 o 9 nucleotidi, il fattore si dissocia e la trascrizione viene

proseguita dal nucleo enzimatico, che avanza provocando una torsione del DNA. In questo modo, la

doppia elica che il nucleo si lascia alle spalle torna avvolta.

In questa fase, all’interno della bolla si trova un filamento di DNA senso ed una doppia elica ibrido

DNA-RNA. L’RNA trascritto si allontana man mano che viene prodotto. ρ

La terminazione avviene in due differenti modi a seconda che si parli di terminatori (rho)

ρ,

dipendenti, in cui la terminazione dipende dall’interazione con una proteina oppure di

ρ

terminatori indipendenti, in cui è il nucleo enzimatico stesso che termina la trascrizione.

In questo secondo caso, il processo di terminazione si basa sulla presenza lungo il DNA di una

sequenza con simmetria bipartita (pag. 385), dove cioè un asse di simmetria divide il terminatore

in due parti complementari. Di conseguenza, avrà simmetria bipartita anche il singolo filamento di

RNA, che si chiuderà su sé stesso appaiando le basi complementari. Si forma una forcina da cui

spunta, in direzione 3’, una coda di U (nel DNA c’erano A).

Sembra che questa struttura destabilizzi il legame RNA-DNA, causando il rilascio dell’RNA e la

fine della trascrizione.

ρ ρ

I terminatori dipendenti, invece, non formano la forcina e non hanno la coda di U. La proteina

lega l’ATP. Quando riconosce il corrispondente del terminatore sull’RNA, vi si lega idrolizzando

ATP e provocando il distacco dell’RNA dal DNA.

G LI EUCARIOTI

Un gene strutturale possiede di solito un’ampia gamma di sequenze di regolazione (poste di solito

73

a poche centinaia di basi a monte del sito di inizio della trascrizione), a cui si legano dei fattori

trascrizionali (TF), proteine necessarie per l’inizio della trascrizione, oppure proteine regolatrici,

che attivano o reprimono la trascrizione del gene.

I fattori di trascrizione sono necessari per permettere alla RNA polimerasi di legare il promotore.

Prendono il nome della RNA polimerasi con cui agiscono (TFI, TFII, TFIII) e, visto che molti

assieme possono agire su un unico enzima, sono indicati anche con una lettera (TFIA, TFIB, …).

Sembra che alcuni di questi fattori si leghino sul promotore, mentre altri sulla RNA polimerasi

stessa.

La regione regolatrice posta immediatamente nelle vicinanze del sito di inizio della trascrizione è

chiamata promotore. Esso si articola in diversi elementi promotori (pag. 387): il più vicino al sito

è il TATA box, quindi il CAAT box e due GC box. Nessun promotore contiene tutti e tre i tipi, per

cui nessuno è strettamente indispensabile.

TATA regola la trascrizione in modo che avvenga nel punto esatto, CAAT determina l’entità della

trascrizione ed i due GC aiutano il legame della RNA polimerasi.

Oltre ai promotori, sono necessarie delle sequenze enhancer o di intensificazione, che spingono

alla massima intensità la trascrizione. Esse sono in grado di attivare il gene sia che si trovino a

monte, a valle o all’interno della sequenza codificante.

Il loro funzionamento si basa sul legame con delle proteine regolatrici, che provocano una torsione

della doppia elica. L’occhiello che si forma porta le proteine dell’enhancer ad interagire con le

proteine regolatrici o con i fattori trascrizionali del promotore.

Opposti agli enhancer ma con caratteristiche simili sono i silencer, che reprimono l’attività.

I ’ RNA

L PROCESSAMENTO DELL M EUCARIOTICO

Una molecola di mRNA è composta da tre parti (pag. 389): una sequenza leader non tradotta, posta

in posizione 5’ (detta anche 5’ UTR), una sequenza codificante ed una sequenza di coda non

tradotta (3’ UTR).

Le principali differenze fra l’mRNA procariotico e quello eucariotico stanno nel fatto che mentre il

primo è pronto per l’uso appena dopo la trascrizione, il secondo deve essere modificato in

un’operazione di processamento. Inoltre, l’RNA procariotico comincia ad essere tradotto mentre

una parte viene trascritta, visto che la cellula non possiede il nucleo (accoppiamento di

trascrizione e traduzione). Negli eucarioti, la traduzione inizia dopo che l’mRNA è stato

completamente trascritto, perché mentre la trascrizione avviene nel nucleo, la traduzione avviene

nel citosol.

Le modificazioni post-traduzionali a cui va incontro il pre-mRNA coinvolgono entrambe le

estremità, ma anche la zona centrale della molecola, da cui bisogna eliminare gli introni (sequenze

non codificanti, opposte agli esoni).

L’estremità 5’ è modificata dall’aggiunta di un cappuccio in 5’. La modifica consiste nell’aggiunta

di una guanina metilata alla fine della catena, legata al nucleotide precedente con un legame 5’ – 5’,

e nella metilazione degli ultimi due nucleotidi della catena.

È la RNA polimerasi II che, dopo la trascrizione di 20-30 nucleotidi, inserisce la guanina metilata.

Questa struttura resterà anche nell’mRNA maturo ed è necessaria per l’attacco al ribosoma.

La modificazione dell’estremità 3’ invece consiste nell’aggiunta di 50-250 adenine, a formare una

coda di poli(A). Con questo sistema viene evidenziata la parte terminale della molecola, sebbene la

trascrizione continui anche parecchie basi dopo il punto di inizio della coda di poli(A).

Qualche decina di nucleotidi a monte del sito di attacco del poli(A), si trova una sequenza

AAUAAA (pag. 392), mentre più o meno alla stessa distanza ma a valle, si trova una sequenza ricca

in GU oppure in U. Un complesso sistema di interazione fra proteine piega il pre-mRNA ad ansa ed

opera un taglio in un punto intermedio alle due sequenze. L’enzima poli(A) polimerasi, utilizzando

ATP, catalizza l’aggiunta di nucleotidi A alla nuova estremità 3’ dell’RNA (non li attacca

74

all’estremità 3’ originale perché questa si trova ancora in fase di trascrizione), creando la coda di

poli(A).

Ultima fase della maturazione del pre-mRNA è l’eliminazione degli introni, in modo che lungo la

molecola ci sia una sequenza di esoni uno dopo l’altro. La dimostrazione che l’mRNA non contiene

introni venne da esprimenti di R looping: l’mRNA viene ibridato ad una molecola di DNA a doppia

elica, in modo che l’ibrido DNA-mRNA sia più stabile di DNA-DNA. In certi tratti, però, il DNA

non trova una corrispondenza sull’mRNA, e quindi riforma una doppia elica con il filamento di

DNA abbandonato e si forma un’ansa ad R (R loop). Questi tratti privi di basi complementari

all’mRNA corrispondono agli introni.

La quantità di introni è molto maggiore negli eucarioti superiori che in quelli inferiori. Fra i

procarioti, solo pochissimi fagi (come T4) contengono introni.

Con l’introduzione del concetto di pre-mRNA, bisogna riformulare la definizione di gene: il gene

diventa la regione di DNA che corrisponde al trascritto primario di RNA, e comprende introni ed

esoni.

Per poter tagliare gli introni (mRNA splicing), innanzitutto, il macchinario proteico deve poter

riconoscere gli introni dagli esoni: in genere gli introni iniziano con una sequenza GU in 5’ e

terminano con AG in 3’. Il primo taglio avviene in 5’ (pag. 395), in modo da separarre l’esone 1

dalla molecola che contiene introne ed esone 2. L’estremità libera dell’introne si piega su sé stessa

ad occhiello, in modo da legare la G ad un’A che fa parte della sequenza del punto di

ramificazione posta qualche nucleotide a monte dell’estremità 3’ dell’introne. La struttura viene

chiamata RNA laccio.

Il passo successivo è il taglio in 3’, mentre l’introne è ancora a forma di laccio, e il legame fra i due

esoni prodotti. L’RNA laccio viene degradato.

Tutto questo processo di taglio dell’introne avviene all’interno di un complesso di proteine

chiamato spliceosoma, costituito da pre-mRNA legato ad snRNA.

L A TRASCRIZIONE DEGLI ALTRI GENI

L’RNA RIBOSOMIALE ED I RIBOSOMI

La sintesi proteica avviene sui ribosomi, che legano mRNA e tRNA facilitandone l’interazione.

Essi sono formati da due unità strutturali, una grande ed una piccola, formate ognuna da un

complesso di rRNA e proteine.

I ribosomi procariotici hanno dimensione 70S e sono costituiti da una subunità grande 50S ed una

piccola 30S. Poiché S è una misura del tasso di sedimentazione di una particella sottoposta a

centrifugazione e dipende sia dal peso molecolare che dalla struttura tridimensionale, non è detto

che 50S + 30S dia 80S.

Circa i 2/3 del ribosoma dei procarioti sono formati da rRNA ed 1/3 da proteine.

I ribosomi degli eucarioti sono più grandi di quelli dei procarioti: hanno dimensione 80S e sono

costituiti da una subunità 60S ed una 40S. Sono costituiti per metà da rRNA e metà proteine.

Le regioni di DNA che contengono i geni per l’rRNA costituiscono il DNA ribosomiale o rDNA.

La produzione delle stesse quantità dei vari tipi di rRNA è garantita dal fatto che vengono trascritti

tutti su un’unica molecola di pre-rRNA, che viene successivamente tagliata. Il tratto di DNA che

contiene l’informazione per il pre-RNA (unità trascrizionale) è composto da un gene per ognuno

dei tipi, ed E.coli possiede sette di queste unità.

Nei pricarioti, i geni nell’unità trascrizionale sono posti nell’ordine 5’-16S-23S-5S-3’.

All’estremità 5’ si trova il promotore ed a quella 3’ il terminatore, mentre i geni sono separati da

sequenze spaziatrici.

Nelle sequenze spaziatrici fra 16S e 23S, e fra 5S ed il terminatore sono state trovate delle molecole

di tRNA, che vengono rimosse con la trascrizione. 75

Mano a mano che procede il processamento (con taglio della molecola in tre parti ed eliminazione

degli spaziatori), gli rRNA vengono incorporati nei ribosomi.

Negli eucarioti i geni per ognuno dei tre tipi di rRNA sono disposti nell’ordine 5’-18S-5,8S-28S-

3’. Visto che si ripetono numerose unità trascrizionali di questo tipo lungo il DNA, si parla di unità

ripetuta di rDNA. Si può dire che i geni per rRNA eucariotico appartengono alla classe del DNA

moderatamente ripetuto. La trascrizione avviene nel nucleolo, dove si assemblano i ribosomi che

vengono trasportati successivamente nel citosol.

L’rDNA viene trascritto dalla RNA polimerasi I con formazione del pre-rRNA, il quale contiene i

tre geni e delle sequenze che li dividono (pag. 400): alle due estremità dell’unità trascrizionale si

trovano delle ETS (o sequenze spaziatrici esterne), mentre a dividere fra loro i geni si trovano le

ITS (o sequenze spaziatrici interne). Tra un’unità ripetuta e l’altra si trova una sequenza NTS (o

sequenza spaziatrice non trascritta), che contiene le sequenze promotrici per l’RNA polimerasi I.

Un primo taglio separa le unità ripetute una dall’altra, eliminando le NTS. Quindi viene tagliata via

l’ETS in posizione 5’. L’unità viene divisa in due parti, di cui una contiene l’rRNA 18S ed un pezzo

di ITS, e l’altra contiene gli altri due geni più ETS ed ITS.

Nel passo finale, il gene 18S viene isolato, mentre l’altro frammento si piega su sé stesso ed una

serie di tagli libera i due rRNA.

Il processamento del pre-rRNA avviene in complessi formati da proteine ribosomiali, pre-rRNA e

rRNA 5S.

I geni per l’rRNA 5S sono posti in zone separate dall’unità ripetuta che contiene gli altri tre rRNA.

Il promotore per la RNA polimerasi III (che si occupa dell’rRNA 5S) si trova all’interno del gene

stesso e viene detto ICR (regione di controllo interna). Sia che ci sia bisogno di sintetizzare un

rRNA 5S, sia che si tratti di un tRNA, la RNA polimerasi III necessita la mediazione delle TF.

In genere il pre-rRNA non contiene introni. In quegli organismi che fanno eccezione, gli introni

vengono persi in un processo di self-splicing in cui, senza l’aiuto di altre proteine, il pre-rRNA

stesso promuove il proprio taglio. Questa scoperta, sebbene non si possa dire che il pre-rRNA si

comporti da vero enzima visto che alla fine del processo risulta modificato, ha portato a considerare

la possibilità che la vita sulla Terra si sia evoluta a partire da alcuni RNA con capacità enzimatiche,

in grado di auto-replicare le prime molecole di acidi nucleici.

L’RNA TRANSFER

Le molecole di tRNA rappresentano il 10-15% di tutto l’RNA presente nella cellula procariotica od

eucariotica. Il suo ruolo è quello di trasportare gli amminoacidi nel ribosoma e legarsi all’mRNA,

per poi produrre una catena polipeptidica.

Tutti i tRNA hanno una sequenza 5’-CCA-3’ all’estremità 3’ ed assumono una conformazione a

trifoglio, corrispondente ad una struttura secondaria perché si estende in sole due dimensioni nello

spazio. Questa struttura deriva dall’appaiamento fra basi complementari, che determinano la

formazione di anse a singola elica alle loro estremità. L’ansa opposta alle estremità libere contiene

una sequenza di tre nucleotidi detta anticodone che, durante la traduzione, si appaia al codone a tre

nucleotidi dell’mRNA.

Poiché ogni tRNA è specifico per un amminoacido ed ogni amminoacido corrisponde a più tipi di

tRNA (vedi capitolo successivo), devono essere presenti nella cellula numerosi geni per il tRNA,

alcuni ripetuti più volte (ridondanza genica).

Nei procarioti i geni per il tRNA possono venire trascritti sia in un unico RNA che contiene

numerose copie di tRNA, separate da uno spaziatore, sia possono essere compresi nell’unità

trascrizionale dell’rRNA e funzionare da spaziatori per le sequenze di rRNA. Come queste, quindi,

le sequenze di DNA per il tRNA fanno parte del DNA moderatamente ripetuto. 76

Mentre nei procarioti i geni per il tRNA sono trascritti dalla stessa RNA polimerasi che si occupa

degli altri RNA, negli eucarioti il trascritto avviene ad opera di una RNA polimerasi III, che

produce un pre-tRNA.

Le modificazioni a cui va incontro questo precursore all’interno del nucleo consistono nell’aggiunta

della sequenza 5’-CCA-3’ presso l’estremità 3’ e nella trasformazione chimica di molti nucleotidi.

Come l’mRNA, anche il tRNA possiede una sequenza leader ed una di coda, ma al contrario

dell’mRNA queste sequenze vengono eliminate.

Delle volte negli eucarioti troviamo tRNA provvisti di un introne, posto in posizione 3’ rispetto

all’anticodone. Ovviamente viene eliminato. 77

IL CODICE GENETICO

E LA SUA TRADUZIONE

L A STRUTTURA DELLE PROTEINE

Le proteine hanno un ruolo fondamentale nei processi biologici: possono essere enzimi

catalizzatori, messaggeri chimici, ormoni, recettori di ormoni, possono trasportare importanti

sostanze biologiche (ioni metallici, ossigeno, ...), e generare il movimento delle fibre muscolari.

Possono partecipare alla formazione delle ossa, dei tendini o altro come collageno.

Ma soprattutto, ed è la cosa che più ci interessa, le proteine sono il prodotto dell’informazione

genetica.

Tutte le proteine sono composte da 20 amminoacidi standard (pag. 418)

α−

Questi composti sono noti come amminoacidi in quanto, con la sola eccezione della prolina che

è ciclica, hanno un gruppo amminico primario e un gruppo carbossilico legati allo stesso atomo di

α,

carbonio che diventa asimmetrico. Anche la glicina rappresenta un’eccezione in quanto le catene

laterali sono rappresentate entrambe dall’H.

α−amminoacidi

Gli sono ioni dipolari, perché presentano una carica positiva sul gruppo amminico

+

e una negativa nella zona opposta, sul gruppo carbossilico (il gruppo amminico basico sottrae un H

3+ -

al gruppo carbossilico acido, formando NH e COO ), sebbene la molecola sia nella sua totalità

neutra. α−amminoacidi

Per questo, la maggior parte degli è molto solubile in acqua. Inoltre, per la presenza

di un gruppo acido ed uno basico, un amminoacido può comportarsi sia come acido che come base.

Sostanze con questa proprietà vengono dette anfotere.

α−amminoacidi

Gli si uniscono mediante l’eliminazione di una molecola d’acqua (pag. 419), a

seguito del quale il C e l’N si legano con un legame chiamato legame peptidico. In seguito a questo

legame, si formano dei residui amminoacidici che sono rappresentati dal resto della molecola.

Le molecole che si sono unite presentano una direzionalità, con un gruppo amminico N-terminale

ed uno carbossilico C-terminale. Il successivo allungamento avviene nella direzione che va da N a

C. Di conseguenza, nelle proteine a più di due amminoacidi, gli amminoacidi intermedi non

presentano né il gruppo amminico né carbossilico.

Se sono presenti due residui si parla di dipeptidi, se sono tre sono tripeptidi, da tre a dieci sono

oligopeptidi ed oltre sono polipeptidi. 2

Il numero possibile di proteine è praticamente infinito: solo nel caso dei dipeptidi sono possibili 20

= 400 dipeptidi diversi.

La struttura molecolare di una proteina è il risultato di interazioni complesse e la sua forma finale

deriva dalla composizione di una struttura sull’altra:

Struttura primaria: è la sequenza amminoacidica della catena, determinata dalla sequenza

 nucleotidica del gene.

Struttura secondaria: è l’organizzazione spaziale dello scheletro della catena senza contare

 i gruppi laterali. Se una catena polipeptidica forma sempre lo stesso angolo tra i suoi carboni

α, forma un’elica, ed una delle più comuni eliche che troviamo nelle cellule è l’α-elica,

α-elica

scoperta da Pauling e Corey. I legami idrogeno che stabilizzano l’intera sono posti

tra il gruppo C=O e il gruppo N-H dell’amminoacido posto quattro amminoacidi più avanti.

β.

Gli stessi due studiosi scorpirono un’altra struttura secondaria, il foglietto Questa

struttura utilizza i legami idrogeno non per legare parti interne della propria catena, ma per

legarsi con altre catene vicine, e crea una struttura globale a zig-zag. 78

Struttura terziaria: si riferisce alla struttura 3D di una catena polipeptidica intera e può

 anche essere indicata come la conformazione della proteina. È costituita essenzialmente da

un collage di proteine secondarie disposte secondo una precisa inclinazione strutturale.

Struttura quaternaria: è l’organizzazione strutturale di più subunità (più catene

 polipeptidiche). Il vantaggio di formare queste strutture per le proteine di grandi dimensioni

(nelle piccole proteine non si formano strutture quaternarie), è lo stesso che si ha quando si

costruisce un palazzo con elementi prefabbricati: se si rompe un pezzo si può sostituire solo

quello. Oppure, come nel caso degli enzimi, aumentare il numero di subunità (piuttosto che

allungare la catena) può far aderire meglio l’enzima al substrato.

L A NATURA DEL CODICE GENETICO

Come deve essere letta la molecola di mRNA per trovare la corrispondenza con gli amminoacidi?

Per costruire l’RNA, la cellula ha a disposizione quattro nucleotidi diversi (A, U, G, C) che, posti in

un codice a tre lettere, formerebbero 4 x 4 x 4 = 64 codoni. Assurdo, visto che ci sono solo 20

amminoacidi. Però, se il codice fosse a due lettere si avrebbero solo 16 codoni, e ad una lettera solo

4 codoni. Il codice a tre lettere è l’unico possibile, il che ci suggerisce che alcuni amminoacidi

possono essere specificati da più di un codone.

I L CODICE GENETICO È A TRIPLETTE

Fu Francis Crick che, attraverso degli esperimenti sul fago T4 svolti nei primi anni ’60, riuscì a

provare che il codice genetico è a triplette.

Innanzitutto, un mutageno è un composto chimico in grado di indurre mutazioni e gli individui

risultanti sono detti revertenti. Crick utilizzò un mutageno in grado di causare mutazioni per

inserzione o delezione di una coppia di basi, determinando uno scivolamento in fase di lettura. Egli

pensò che, se il mutante rII (vedi Analisi della struttura fine di un gene nel fago) di T4 era dovuto

ad una inserzione o delezione, il trattamento con il mutageno selezionato avrebbe revertito la

+

mutazione allo stato selvatico r : cioè un’inserzione può essere corretta da una delezione.

Effettivamente, in alcuni casi ottenne che la mutazione opposta a quella che aveva generato il

+

mutante rII portava al revertente r , cioè ripristinando la vecchia fase di lettura tutto tornava

normale.

Quindi, Crick provò ad indurre in un gene normale un numero superiore ad uno di mutazioni tutte

dello stesso tipo, cioè o tutte inserzioni o tutte delezioni. Soltanto quando provocava una serie di tre

delezioni o tre inserzioni, quindi comunque multipli di tre, otteneva un revertente con un

amminoacido in più o in meno, ma con il resto della sequenza esatto.

Se invece le mutazioni erano una, due, quattro… o loro multipli, si otteneva un polipeptide

completamente differente.

La conclusione fu che il codice genetico è a triplette.

L A DECIFRAZIONE DEL CODICE GENETICO

Gli esperimenti che portarono alla decifrazione del codice genetico si basano su una tecnica

chiamata sintesi proteica cell-free, che consiste nell’isolare in una provetta i ribosomi, mRNA, i

tRNA con i rispettivi amminoacidi ed i fattori proteici necessari per la traduzione. In questo caso si

trattava di componenti derivati da E.coli. Nella provetta col passare del tempo l’mRNA veniva

degradato, quindi la traduzione si bloccava.

Se si aggiungono amminoacidi marcati radioattivamente e degli mRNA a sequenza nota, si può

determinare la corrispondenza fra amminoacidi e codoni dell’mRNA.

Un sistema è quello di produrre mRNA composti solo da un tipo di nucleotide, ottenendo che la

tripletta x x x è un codone per l’amminoacido Y (es. UUU è il codone della fenilalanina).

1 1 1 79

Utilizzando due basi diverse mischiate a caso nell’mRNA, si determinano i codoni “misti”. Con due

3

basi, si ottengono 2 = 8 codoni. Prendiamo il caso delle basi A e C mischiate. Gli studiosi

osservarono che quando il codone conteneva due A ed una C (ma non potevano sapere la sequenza

esatta) si otteneva asparagina, mentre due C ed una A davano istidina.

L’esperimento venne ripetuto per tutte le possibili coppie di basi, determinando la composizione,

ma non la sequenza, in basi dei codoni relativi a vari amminoacidi.

Ma il sistema che permise di determinare la sequenza e la composizione in basi dei vari codoni fu il

saggio di legame ai ribosomi. I ribosomi legano l’mRNA ed un tRNA carico dell’amminoacido

corrispondente. Il legame avviene anche se l’mRNA è lungo quanto un codone. Quindi, tentando

tutte le combinazioni di basi possibili in un unico codone ed osservando quale amminoacido portava

legato il tRNA, si venne a conoscenza della sequenza (e della relazione con gli amminoacidi) di 50

codoni.

L E CARATTERISTICHE DEL CODICE GENETICO

Le caratteristiche del codice genetico sono le seguenti:

Il codice genetico è a triplette

 Non ha segni di interpunzione, cioè è letto in modo continuo.

 Non ha sovrapposizioni, per cui viene letto in serie di tre.

 È quasi universale, perché è condiviso da un enorme numero di organismi.

 È degenerato, cioè per ogni amminoacido è presente più di un codone, ad eccezione della

 metionina e del triptofano. La degenerazione si basa su schemi ben precisi: per la maggior

parte dei casi, se due codoni hanno le prime due basi uguali (es UCx ed UCy),

indipendentemente dalla terza specificano per lo stesso amminoacido. In altri casi,

considerando sempre due codoni con le prime due basi uguali, se la terza è A o G, essi

specificano per lo stesso amminoacido, mentre le è U o C specificano per un altro (pag. 425

- istidina ed altri).

Ha segnali di inizio e di fine. Il codone AUG segna l’inizio (in certi casi GUG) e specifica

 per una metionina. Dei 64 codoni possibili, solo 61 (codoni senso) specificano per degli

amminoacidi: gli altri tre (codoni di stop) terminano semplicemente la traduzione (UAA,

UAG, UGA).

L’anticodone vacilla: visto che 61 codoni specificano per gli amminoacidi, dovrebbero

 esistere 61 tRNA. Crick propose l’ipotesi del vacillamento, per cui le prime due basi (a

partire dall’estremità 3’ del tRNA) dell’anticodone seguono strettamente l’appaiamento

secondo le coppie di basi di Watson e Crick, mentre la terza coppia ha molte meno

restrizioni e la base sul tRNA può appaiarsi con più tipi di basi sull’mRNA secondo lo

schema:

tRNA G C A U I (inosina)

mRNA U, C G U A, G A, U, C

Il codice genetico è privo di ambiguità, cioè un codone specifica solo per un certo

 amminoacido. L’unica eccezione è rappresentata da GUG che, se si trova all’inizio della

catena funge da codone d’inizio attaccando una metionina, mentre se si trova al suo interno

specifica per la valina. Questo è un esempio di variazione sito-specifica nella traduzione

del codone.

L A TRADUZIONE DEL MESSAGGIO GENETICO 80

L’mRNA che si lega ai ribosomi viene letto in direzione 5’ – 3’ ed il polipeptide risultante viene

sintetizzato a partire dall’estremità N-terminale verso la C-terminale.

L’amminoacido corretto viene legato al tRNA dall’enzima aminoacil-tRNA sintetasi, presente

nella cellula sotto 20 forme differenti. I vari tRNA che portano l’anticodone specifico per un certo

amminoacido devono possedere uno stesso sito di riconoscimento per la sintetasi.

Il complesso amminoacido-tRNA forma un aminoacil-tRNA (o tRNA carico): l’adenina alla fine

di ogni estremità 3’ dei tRNA si lega all’amminoacido specifico, in un legame che coinvolge il

gruppo carbossilico di questo ed il gruppo 3’ OH dell’adenina.

Il processo è definito caricamento del tRNA.

I tre stadi fondamentali della traduzione sono l’inizio, l’allungamento e la terminazione.

L’ INIZIO

La traduzione comincia a partire dal codone AUG, che specifica per una metionina.

Nei procarioti, per cominciare la traduzione oltre al codone AUG è necessaria l’interazione di vari

fattori proteici. La subunità ribosomiale 30S si lega sull’mRNA (pag. 431) presso il sito di attacco

del ribosoma, a monte di AUG, che orienta il ribosoma secondo la corretta fase di lettura.

La maggior parte dei siti di attacco contiene una sequenza ricca in purine (A e G), nota come

sequenza di Shine-Dalgarno, che si lega ad una sequenza ricca in pirimidine presente sull’rRNA

30S.

La traduzione comincia con la formazione di un complesso di inizio 30S: la subunità ribosomiale

30S lega tre fattori d’inizio ed un GTP (molecola energetica simile all’ATP). Questo complesso

proteico lega l’mRNA ed il tRNA che porta legato l’amminoacido specifico per l’inizio della

traduzione, una metionina.

La metionina iniziale è modificata in forma di formilmetionina (fMet), in cui al gruppo amminico

è stato aggiunto uno formilico. Il tRNA corrispondente è differente dagli altri (perché specifico per

la fase iniziale) ed è chiamato tRNA.fMet .

Uno dei tre fattori d’inizio viene rilasciato e la subunità ribosomiale 50S si lega al complesso

d’inizio 30S, provocando l’idrolisi del GTP ed il rilascio degli altri due fattori. Si forma così il

complesso d’inizio 70S, in cui il ribosoma completo mostra due siti per gli aminoacil-tRNA: il sito

peptidilico P in direzione 5’ (a sinistra) e quello aminoacilico A in direzione 3’. Il tRNA.fMet si

lega al sito P.

Negli eucarioti manca la sequenza di Shine-Dalgarno, ed al suo posto è presente un fattore di

inizio degli eucarioti, una proteina che riconosce il cappuccio in 5’ dell’mRNA e vi si lega. Quindi

interviene un complesso formato dalla subunità ribosomiale 40S, il tRNA carico di metionina (che

negli eucarioti non è formilata – comunque il tRNA è specifico per l’inizio), vari altri fattori di

inizio e GTP.

La subunità così composta migra lungo l’mRNA alla ricerca di AUG, inserito in una corta sequenza

specifica che indica che non si tratta di un codone per un amminoacido ma proprio di quello

d’inizio della traduzione. Trovato AUG, la subunità 40S vi si lega, seguita da quella 60S, formando

il complesso d’inizio 80S, anch’esso fornito di sito P ed A.

L’ ALLUNGAMENTO

A parte piccoli particolari, la fase di allungamento è identica fra procarioti ed eucarioti.

Dopo il legame con il tRNA, all’interno del ribosoma si trova libero il sito A. Un aminoacil-tRNA

specifico per il codone esposto in A viene portato al ribosoma, aiutato da GTP ed alcune proteine

che si distaccano subito dopo. 81

I due tRNA vicini lasciano che gli amminoacidi interagiscano: il legame fra il tRNA in P ed il suo

amminoacido si rompe, mentre si forma quello fra l’amminoacido ormai libero e quello legato al

tRNA in posizione A. Il legame è catalizzato dalla peptidil transferasi, fortemente aiutata

dall’rRNA che compone la subunità maggiore, a riprova del fatto che alcuni rRNA hanno attività

enzimatica.

La formazione del legame peptidico stimola il ribosoma a spostarsi lungo l’mRNA in direzione 3’

(traslocazione), e quindi a buttare fuori dal sito P il tRNA scarico, aiutato da GTP ed altri fattori

proteici. Ora il peptidil-tRNA (così detto perché non porta più un solo amminoacido, ma una

catena peptidica) si trova sul sito P ed il sito A è vuoto. Un nuovo aminoacil-tRNA si lega in A ed il

ciclo ricomincia fino al codone di stop.

Lo slittamento del ribosoma rende disponibile il codone d’inizio ad un altro evento di traduzione: in

questo modo, sullo stesso mRNA si vengono a trovare numerosi ribosomi che traducono lo stesso

gene, ciascuno in ritardo rispetto al precedente. Si forma cioè un polisoma.

L A TERMINAZIONE

Quando l’mRNA passa all’interno del ribosoma i codoni UAA, UAG o UGA, la terminazione del

processo è arrivata.

Il ribosoma riconosce questi codoni solo grazie all’aiuto dei fattori di terminazione (RF), presenti

in più tipi nei procarioti, ed un solo tipo negli eucarioti. Il peptidil-tRNA sul sito P rilascia il

polipeptide con l’aiuto della peptidil transferasi, quindi il tRNA è rilasciato dal ribosoma, che si

dissocia subito dopo.

La metionina iniziale viene rimossa sia nei procarioti che negli eucarioti.

L’

ASSORTIMENTO DELLE PROTEINE NELLA CELLULA

Negli eucarioti, alcune proteine vengono secrete all’esterno, altre sono invece destinate a particolari

comparti della cellula, per cui devono contenere l’informazione necessaria per arrivare al giusto

bersaglio.

L E PROTEINE NEL RETICOLO ENDOPLASMATICO

Gran parte del reticolo endoplasmatico ha un aspetto ruvido per la presenza dei ribosomi (reticolo

endoplasmatico ruvido). Le proteine prodotte da questi ribosomi vengono liberate nello spazio

vescicolare del reticolo.

Tali proteine possiedono degli amminoacidi aggiuntivi presso la sequenza N-terminale, che

rappresentano una sequenza segnale che permette il legame della proteina alla membrana del

reticolo endoplasmatico.

Non appena questa sequenza viene esposta all’esterno del ribosoma durante la traduzione, viene

riconosciuta da una particella di riconoscimento del segnale (SRP), che vi si lega e blocca la

traduzione finché il complesso non raggiunge la membrana del reticolo endoplasmatico. Qui, una

proteina integrale di membrana, la proteina di ancoraggio, attacca SRP e la traduzione riprende in

modo che la proteina sia immessa nel lume del reticolo. L’accoppiamento di sintesi e trasporto è

detto trasporto cotrasduzionle.

Quando la sequenza segnale è passata interamente attraverso la membrana, viene tagliata via da una

segnal peptidasi.

Alla fine della traduzione la proteina si trova completamente all’interno del lume ed in genere viene

modificata per aggiunta di carboidrati, formando una glicoproteina. In genere a questo punto si

forma attorno ad essa una vescicola secretoria, che gli permette di viaggiare fino all’apparato di

Golgi. 82

L E PROTEINE NEI MITOCONDRI E NEI CLOROPLASTI

Molte delle proteine destinate ai mitocondri o ai cloroplasti sono proteine ribosomiali, enzimi per la

catena di trasporto degli elettroni (mitocondri) o per la fotosintesi (cloroplasti).

Al contrario di quanto accade per le proteine destinate al reticolo endoplasmatico, queste devono

essere completamente sintetizzate prima che inizi il trasporto nell’organello, definito

posttraduzionale.

Le proteine destinate a mitocondri e cloroplasti contengono una sequenza extra presso l’estremità

N-terminale detta sequenza di transito, necessaria per il trasporto, che viene rimossa

immediatamente dopo.

L E PROTEINE NEL NUCLEO

Sono molte le proteine destinate al nucleo: quelle ribosomiali, le istoniche, non istoniche, gli enzimi

per la replicazione, la ricombinazione e la trascrizione del DNA e per il processamento dell’RNA.

Per entrare nel nucleo è necessaria una sequenza di localizzazione nucleare, con un trasporto di

tipo posttraduzionale. Il riconoscimento avviene a livello dei pori nucleari ed è sempre attraverso

questi che la proteina entra nel nucleo.

Visto che queste proteine devono mantenere la capacità di rientrare nel nucleo dopo la mitosi o la

meiosi, in questo caso la sequenza di ingresso non è eliminata. 83

REGOLAZIONE DELL’ESPRESSIONE GENICA IN

BATTERI E BATTERIOFAGI

I batteri ed i batteriofagi vivono spesso in condizioni instabili, per cui hanno dovuto sviluppare un

sistema di accensione e spegnimento dei geni a seconda delle necessità. I batteriofagi in particolare

devono regolare il proprio metabolismo in funzione della cellula che infettano, per cui è importante

saper giostrare i geni per intraprendere la via litica o lisogena.

I geni la cui attività è controllata dalle necessità momentanee della cellula sono detti geni regolati,

mentre sono geni costitutivi quelli il cui normale funzionamento è essenziale per la vita della

cellula.

I geni regolati di un batterio vengono attivati dall’arrivo di una nuova sostanza chimica o

ambientale (induttore), che stimola il gene bersaglio (inducibile) a sintetizzare enzimi specifici ed

altre proteine regolatrici. Gli induttori fanno parte di una classe di molecole dette effettori,

coinvolte nel controllo dell’espressione di molti geni.

Gli induttori provocano indirettamente l’attivazione di un sito di controllo, posto in genere a valle

del promotore del gene inducibile, in seguito alla quale l’RNA polimerasi si lega al sito di controllo

ed inizia la trascrizione (il sito di controllo non codifica per nessun prodotto).

R ’ E.

EGOLAZIONE DEI GENI PER L UTILIZZO DEL LATTOSIO IN COLI

E.coli può crescere in un terreno minimo che contenga sali (per la presenza di azoto) e glucosio (per

il carbonio). Il metabolismo di quest’ultimo dà alla cellula l’energia necessaria per svolgere tutte le

sue funzioni, per cui gli enzimi che partecipano a questa via metabolica sono costitutivi.

Se invece del glucosio viene fornito lattosio (un disaccaride formato da glucosio e galattosio),

vengono attivati dei geni regolati che producono:

β-galattosidasi: ha la duplice funzione di scindere il lattosio nei suoi monosaccaridi oppure

 di trasformare il lattosio in allolattosio, importante nella regolazione dell’espressione dei

geni per l’utilizzo del lattosio.

Lattosio permeasi: necessaria per il trasporto del lattosio.

 Transacetilasi: funzione poco chiara.

Questo meccanismo per cui un solo induttore porta all’attivazione di più geni è chiamato induzione

coordinata. Quando il lattosio viene a mancare, gli mRNA che portano l’informazione per la

produzione di queste tre proteine vengono degradati e subito il meccanismo si interrompe.

D IMOSTRAZIONE SPERIMENTALE DELLA REGOLAZIONE DEI GENI LAC

La nostra conoscenza sui meccanismi di regolazione dei geni che controllano il metabolismo del

glucosio e l’espressione dei geni lac (geni per la scissione del lattosio), è dovuta agli studi di Jacob

e Monod. β-galattosidasi

Attraverso lo studio di mutanti indotti, si scoprì che la era codificata al gene lacZ, la

lattosio permeasi dal gene lacY e la transacetilasi da lacA, elencati nell’ordine in cui si trovano sul

DNA. Jacob e Monod scoprirono che i tre geni venivano prodotti esattamente in quest’ordine e

dunque non erano indipendenti.

Essi osservarono che le mutazioni missenso (in cui un amminoacido della catena è sostituito)

portavano, ovviamente, ad un’alterazione del prodotto corrispondente al gene, ma non influivano

sull’espressione degli altri due. Invece, nelle mutazioni nonsenso (che modificano la tripletta in

modo che codifichi per uno stop) gli altri non venivano più letti.

Questo fenomeno fu chiamato polarità. 84

Per comprende il meccanismo della polarità, bisogna introdurre che i tre geni vengono trascritti in

un’unica molecola di mRNA, chiamato mRNA policistronico (tutti gli mRNA formati da più geni

trascritti insieme vengono chiamati in tale modo, non solo questo), strutturato in questo modo: 5’-

+ + +

lacZ -lacY -lacA -3’.

Ovviamente, nell’mRNA policistronico si trova anche una sequenza che funge da promotore, posta

a monnte dei tre geni. Una mutazione del promotore provoca un’alterazione di tutte e tre i geni, per

cui anche in presenza di un induttore essi non vengono sintetizzati.

La trascrizione e la traduzione sono due fenomeni strettamente correlati nei procarioti che, vista la

loro vita frenetica, devono subito adoperarsi per sintetizzare il prodotto corrispondente al gene

trascritto. Quindi, non appena dal ribosoma esce la testa 5’ dell’mRNA, si crea un polisoma che

copre gran parte della sua lunghezza. Nei punti in cui si trovano codoni di stop per passare da un

prodotto all’altro, i ribosomi scivolano avanti e procedono nella traduzione.

L’effetto polare è dovuto all’interruzione prematura della traduzione di un gene dovuta ad una

mutazione nonsenso, con rilascio dei ribosomi che liberano un mRNA nudo, e di una proteina

incompleta. La presenza di un mRNA nudo ne determina il ripiegamento in strutture secondarie,

che impediscono all’RNA polimerasi di riattaccarsi ad esso e produrre le proteine mancanti.

Sempre Jacob e Monod, osservando dei mutanti per l’espressione dei geni lac, si accorsero della

presenza di alcune regioni del DNA che svolgevano specifiche funzioni nella regolazione

dell’espressione genica: l’operatore (lacO) e il repressore (lacI – pag. 504).

c

Mutazioni riguardanti l’operatore vennero chiamate lacO e portavano alla sintesi di alcuni enzimi

c

per il lattosio sia in sua presenza che in sua assenza. Visto però che lacO si trova in posizione

+ +

adiacente a lacZ , le mutazioni coinvolgono l’espressione di questo gene e non quella di lacY o

+

lacA .

Quindi lacO controlla quando attivare la traduzione dei geni adiacenti ad esso. Poiché il controllo

+

da parte di lacO ha un raggio così breve (è cis-agente), la presenza di lacO sull’altro cromosoma

c

non corregge gli errori di lacO : ognuno si occupa solo dei geni adiacenti: questo fenomeno è

chiamato cis-dominanza. Visto che ognuno dei due alleli determina la sintesi di una proteina

diversa, ma queste proteine non si influenzano, allora è chiaro che il prodotto non è diffusibile nella

cellula. +

Invece il gene lacI codifica per una proteina repressore che si diffonde nella cellula e si lega

+

all’operatore. Mentre nel caso precedente la presenza di lacO non impediva l’espressione del

c +

mutante lacO , nel caso del repressore viene espresso il gene selvatico lacI anche se sul

-

cromosoma omologo è presente lacI (il mutante): fenomeni di questo tipo si dicono di trans-

dominanza. Poiché un solo cromosoma fornisce la proteina repressore per tutta la cellula, allora il

prodotto deve essere diffusibile.

M ’ J M

ODELLO DELL OPERONE DI ACOB E ONOD PER LA REGOLAZIONE DEI GENI LAC

Un operone è costituito da un gruppo di geni la cui espressione è regolata da un sistema comune,

che passa sia attraverso l’interazione della proteina regolatrice con il sito operatore, sia attraverso il

promotore. Quindi l’insieme dei geni lac è un operone.

La sequenza di elementi nell’operone è promotore-operatore-lacZ-lacY-lacA. Il gene lacI si trova

subito prima del promotore, ed è fornito di un proprio promotore e terminatore (pag. 504). La

proteina lacI è codificata in modo costitutivo (cioè come parte essenziale del metabolismo

cellulare), ma la presenza dell’induttore (il lattosio) gli impedisce di legarsi all’operatore. Il

+

repressore prodotto da lacI funziona in forma di tetramero, per cui è necessario che il suo mRNA

sia tradotto per quattro volte.

In assenza dell’induttore, quando il prodotto di lacI si lega all’operatore, l’RNA polimerasi si può

legare al promotore ma non può iniziare la trascrizione: dal punto di vista della proteina lacI si parla

di controllo di tipo negativo, perché la sua presenza impedisce la trascrizione. 85

Se E.coli viene fatto crescere in presenza di lattosio e non di glucosio, parte del lattosio viene

β-galattosidasi

convertito dalla in allolattosio, che induce a sua volta la sintesi degli enzimi lac:

l’allolattosio, legandosi al repressore, ne determina un cambiamento allosterico (cambiamento di

forma), in modo che questo perda affinità con l’operatore e se ne distacchi.

c

In presenza di mutanti lacO , la codifica dei geni dell’operone lac è costitutiva, ossia avviene in

maniera continuata. Questo perché la mutazione porta all’impossibilità per il repressore di

riconoscere l’operatore. Così, se ci si trova oltretutto in presenza di un induttore, la produzione di

questi enzimi è davvero esagerata. -

Gli stessi effetti si hanno nel caso di una mutazione su lacI , perché viene modificato il sito del

repressore che non riconosce l’operatore. S

Si può verificare anche una mutazione lacI , per cui il repressore si lega all’operatore anche in

presenza di un induttore e la trascrizione dell’operone non può mai avvenire.

L’ E.

OPERONE TRIPTOFANO IN COLI

Quando manca un amminoacido, devono essere espressi i geni che codificano per gli enzimi in

grado di produrlo attraverso le vie metaboliche. Al contrario di quanto accade per i geni lac, in

presenza del lattosio, la sequenza di geni per la produzione di un amminoacido è repressa quando

questo è presente e viene indicata come operone reprimibile.

Uno degli operoni reprimibili più studiati è quello del triptofano di E.coli.

L’operone triptofano è costituito da cinque geni strutturali (E-A – pag. 514). A monte dell’insieme

dei geni si trovano, strettamente vicini fra loro, il promotore prima e l’operatore poi. Subito dopo si

trova una regione leader che comprende il gene trpL, e l’attenuatore (vedi avanti).

R ’

EGOLAZIONE DELL OPERONE TRIPTOFANO

La regione trpR, localizzata ancora prima dell’operatore, è il gene regolatore dell’operone. Il suo

controllo di tipo negativo consiste nella produzione di una proteina apopressore, che si lega

all’operatore solo dopo aver legato triptofano (in questo modo esso rappresenta una molecola

effettore, come l’allolattosio per l’operone lac). Questo legame impedisce la trascrizione degli

enzimi per il triptofano.

Quando il triptofano è assente o presente in scarsa quantità, i geni per la sua biosintesi sono espressi

al massimo livello o ad un livello normale rispettivamente, perché la proteina apopressore non può

legarsi all’operatore. La regolazione di quanto il triptofano debba essere prodotto è possibile grazie

ad un sistema di controllo che si basa sulla trascrizione di frammenti lunghi (che includono tutti i

geni dell’operone) e frammenti corti, che terminano la propria trascrizione all’altezza di un sito

attenuatore: tanto più triptofano è presente, quanti meno frammenti lunghi ci saranno, e viceversa

per quelli corti.

Come funziona questa regolazione?

Nella regione leader vi sono quattro sequenze complementari a due a due che possono formare

strutture secondarie per appaiamento di basi e fornire diversi segnali:

Sequenza 1+ sequenza 2 = segnale di pausa

 2+3 = segnale di antiterminazione, che permette di proseguire la trascrizione saltando le

 sequenze di stop fra un gene e l’altro.

3+4 = segnale di terminazione della trascrizione (simile ai segnali di terminazione della

 trascrizione rho indipendenti), che la bloccano in presenza degli stop fra i geni.

Aspetto cruciale nel meccanismo di regolazione del triptofano è che nei procarioti trascrizione e

traduzione sono strettamente associati. Infatti, la traduzione dell’mRNA leader avviene mentre

l’RNA polimerasi opera la trascrizione del resto dell’operone: la sincronia è possibile grazie

86

all’appaiamento temporaneo delle regioni 1 e 2, che mettono in pausa l’RNA polimerasi e

permettono ai ribosomi di assemblarsi sull’mRNA.

La posizione dei ribosomi è essenziale per permettere la regolazione nell’appaiamento delle

sequenze (pag. 516): se le cellule si trovano in carenza di triptofano, mancano i tRNA

corrispondenti ed il ribosoma si blocca in corrispondenza del codone per il triptofano, che si trova

nella regione 1. Quindi 1 e 2 non possono appaiarsi ed avviene il legame fra 2 e 3, che permette di

proseguire la sintesi per gli enzimi che sintetizzeranno il triptofano.

Se invece c’è abbastanza triptofano, il ribosoma prosegue fino a coprire la regione 2: questa non

può appaiarsi con la 3, che invece forma un legame 3-4, in modo che l’RNA polimerasi blocchi la

trascrizione.

Un altro livello di regolazione per la produzione del triptofano consiste sta nella degradazione del

trascritto policistronico di mRNA.

Queste molecole hanno vista relativamente breve, per cui quando si blocca la traduzione e si

dissociano i complessi proteici coinvolti, l’mRNA viene degradato.

Tutti questi sistemi di controllo sono a lungo termine. Per rispondere a cambiamenti breve termine,

come quando mi prendo una pasticca di triptofano, la cellula attua una retroinibizione, cioè manda

il triptofano ad inibire uno dei primi enzimi della via biosintetica in modo da provocarne un

cambiamento allosterico e bloccare la sintesi.

R EGOLAZIONE GENICA NEI BATTERIOFAGI

Poiché i batteriofagi vivono parassitando altri organismi, non hanno bisogno di molti geni regolatori

delle vie biosintetiche. Più che altro regolano l’espressione dei geni per la riproduzione ed in

particolare quelli volti a far intraprendere il ciclo litico o quello lisogeno.

λ,

In particolare, ci occupiamo del fago un fago temperato, con un cromosoma lineare che

circolarizza all’interno dell’ospite.

I principali geni che operano nella scelta fra i due cicli sono cI (il repressore del ciclo litico) e cro:

la prevalenza del prodotto di cI induce un ciclo lisogeno, mentre se predomina la proteina Cro il

ciclo è litico.

E ( )

VENTI DELLA TRASCRIZIONE PRECOCE PRIMA DI OGNI SCELTA

Prima che venga data al fago la possibilità di esprimere i geni cI, cominciano ad essere sintetizzate

le molecole per il ciclo litico. La trascrizione dei geni interessati parte dai promotori P e P : visto

L R

che si trovano su due eliche diverse, uno verrà trascritto verso destra (P ) e l’altro verso sinistra

R

(P ).

L

Partendo da P , il primo gene trascritto è cro, per la scelta del ciclo litico; viceversa, a partire da P

R L

viene trascritto N, un antiterminatore della trascrizione, che permette alla RNA polimerasi di

procedere oltre N. Uno dei geni successivi trascritto è cII, che attiva il gene cI (repressore del ciclo

litico), O e P (per il ciclo litico) e Q (attiva i geni necessari per il ciclo litico, funzionando da

antiterminatore). La proteina prodotta da Q e quella da cII, quindi, sono in competizione: Q

funziona solo quando la trascrizione da P continua abbastanza a lungo da permetterle di

R

accumularsi.

L A SCELTA DEL CICLO LISOGENO

La scelta del ciclo lisogeno richiede i prodotti dei geni cII e cIII (che si trova dopo N ed il cui

ruolo è solo quello di stabilizzare cII). 87

La proteina cII attiva la trascrizione del gene cI, il cui prodotto è una proteina repressore del ciclo

litico. Il repressore funziona legandosi ai promotori P e P (quindi è bloccata ogni trascrizione), in

L R

modo che non possano essere trascritti i geni N e cro (e quindi anche O, P e Q).

L’operazione ha successo se il repressore è stato prodotto in concentrazione abbastanza alta da

vincere sui promotori P e P .

L R

L A SCELTA DEL CICLO LITICO

Se non è stata prodotta una quantità abbastanza elevata di repressore, si attiva (fra gli altri) il gene

O, il cui prodotto stimola la traduzione del gene cro. La proteina Cro riduce la sintesi di RNA da P L

e P : come conseguenza si riduce anche la produzione della proteina cII e dunque del repressore del

R

ciclo litico cI.

Sebbene venga bloccata anche la trascrizione di P , si è accumulata talmente tanta proteina Q che

R

questa può funzionare ugualmente. 88

REGOLAZIONE DELL’ESPRESSIONE

GENICA DEGLI EUCARIOTI

Nei geni eucariotici nessuna struttura somiglia all’operone procariotico, per cui i meccanismi di

regolazione sono completamente differenti.

La regolazione a breve termine implica lo spegnimento o l’accensione di geni in risposta a

cambiamenti repentini dell’ambiente, mentre quella a lungo termine riguarda gli eventi di sviluppo

e differenziazione dell’organismo.

L ’

IVELLI DI CONTROLLO DELL ESPRESSIONE GENICA NEGLI EUCARIOTI

La regolazione dell’espressione genica degli eucarioti avviene a numerosi livelli di controllo (pag.

534): Controllo trascrizionale: dal DNA al trascritto primario di mRNA

 Controllo della maturazione: dal pre-mRNA all’mRNA maturo

 Controllo del trasporto: da dentro a fuori il nucleo

 Controllo della degradazione dell’mRNA

 Controllo della traduzione: dall’mRNA alle proteine

 Controllo della degradazione delle proteine

C ONTROLLO TRASCRIZIONALE

Il controllo trascrizionale regola la possibilità di trascrizione di un gene e la sua quantità.

I geni che codificano per le proteine contengono sia promotori (definiscono dove comincia la

trascrizione o se deve cominciare), sia enhancers (permettono la massima espressione del gene), sia

silencer (disattivano il gene).

Delle proteine regolatrici si legano a queste seqeunze e ne provocano l’attivazione (regolazione

positiva) o l’inattivazione (regolazione negativa).

La sequenza enhancer si trova parecchi nucleotidi più a monte del promotore. Una proteina

regolatrice si lega all’enhancer e determina la formazione di un’ansa sul DNA, in modo che la

proteina regolatrice legata all’enhancer venga a contatto con quella legata al promotore.

Visto che per un solo evento di regolazione possono essere presenti più proteine regolatrici, la scelta

fra la trascrizione o meno è data dal bilancio della presenza di proteine attivanti e disattivanti, sia

che queste leghino i promotori, sia che leghino gli enhancers.

Il numero di proteine regolatrici, in confronto a quello dei geni, è veramente scarso. Questo

significa che per regolare un solo gene in modo specifico più proteine devono combinarsi e formare

un complesso caratteristico per quel gene. Questo tipo di regolazione è detta regolazione genica di

tipo combinatorio.

Il controllo della trascrizione può avvenire anche a livello della posizione di svolgimento dei

cromosomi. Nei cromosomi, infatti, il DNA sottoposto a trascrizione è più svolto rispetto a quello

per il momento non trascritto. Digerendo i cromosomi con l’enzima DNasi I, un’endonucleasi in

grado di digerire solo il DNA svolto, è possibile bloccare la trascrizione.

Utilizzando sonde di specifici geni clonati e la tecnica del Southern blot, è stato possibile provare

scientificamente che i cromosomi si svolgono in piccole parti per permettere la trascrizione.

Innanzitutto bisogna estrarre la cromatina sia dal nucleo di una cellula che sta producendo la

proteina di cui vogliamo controllare la trascrizione, sia da quello di una cellula che non sta

producendo quella proteina.

I due campioni vengono trattati con DNasi I e poi con gli enzimi di restrizione adatti per il gene in

questione. I frammenti ottenuti vengono trattati con elettroforesi e fissati su filtro mediante

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Southern blot. I frammenti presenti su filtro vengono ibridati con una sonda radioattiva del gene

studiato, in modo da confrontare la dimensione di questi con quella dei frammenti del DNA digerito

con la DNasi I.

I frammenti di DNA della cellula con il gene in trascrizione risultavano più corti, cioè il gene stesso

era stato digerito dalla DNasi I, mentre i frammenti di DNA della cellula il cui gene non era in

trascrizione, erano della lunghezza aspettata.

Quindi, effettivamente il DNA del cromosoma si svolge durante la trascrizione.

Studi più dettagliati hanno dimostrato che esistono dei siti ipersensibili alla DNasi I, e sono i primi

ad essere tagliati dall’enzima.

Affinché il DNA sia svolto, però, è necessario rimuovere le proteine istoniche, legate

indifferentemente lungo tutto il DNA in maniera abbastanza uniforme. Il controllo del legame è

consentito da sistemi di acetilazione e fosforilazione, che diminuiscono l’affinità dell’istone con il

DNA.

In particolare, la trascrizione è bloccata se gli istoni si trovano in corrispondenza dei TATA box.

Esperimenti hanno provato che, in una competizione fra gli istoni e le proteine regolatrici dei

promotori, sono i primi che si legano più velocemente alla sequenza TATA. Se però alle proteine

regolatrici dei promotori si uniscono quelle che legano gli enhancers, allora la trascrizione avviene.

Infatti, le proteine che si legano agli enhancers interagiscono con il nucleosoma presente in TATA

box disgregandolo. Allo stesso modo, l’acetilazione può diminuire il legame degli istoni al DNA

perché destabilizza il nucleosoma.

Dopo la trascrizione del DNA, una piccola parte di questo viene metilata per azione dell’enzima

DNA metilasi. Non è molto chiaro il motivo della metilazione, ma si pensa che rappresenti un tipo

m

di segnale. Una base metilata in particolare, la 5-metil-citosina (5 C) è stata studiata perché

correlata in molte occasioni con l’attività genica.

Esiste anche un rapporto inversamente proporzionale fra trascrizione e metilazione, anche se ogni

caso ha la sua particolarità e non è possibile estendere questa affermazione a tutti i sistemi.

m

Per la maggior parte dei casi (il 90%), la 5 C si trova all’interno della sequenza CCGG (pag. 539),

che fa parte dei siti di riconoscimento di alcuni enzimi di restrizione. Visto che gli enzimi di

restrizione non riescono a tagliare il DNA metilato, vengono usati per studiare la percentuale e la

posizione di questo.

C ’ RNA

ONTROLLO DELLA MATURAZIONE DELL M

Questo controllo regola la produzione di molecole di mRNA maturo a partire dal pre-mRNA, ed

avviene a due livelli: la scelta dei siti di poli(A) e la scelta dei siti di splicing.

Il sito di poli(A) è una sequenza del pre-mRNA che specifica la posizione in cui va aggiunta la coda

di poli(A). Un classico esempio di questo tipo riguarda la produzione di IgM (immunoglobulina M),

coinvolta nella risposta immunitaria dei linfociti B. IgM è formata da due catene pesanti (lungo

polipeptide) e due leggere (corto polipeptide - vedi più avanti).

µ

La trascrizione del gene per la catena pesante porta alla sintesi di un pre-mRNA che contiene due

diversi siti di poliadenilazione: se la cellula si trova in uno stadio precoce dello sviluppo, la catena

di poli(A) viene attaccata in modo da produrre la catena pesante più lunga. Se invece la cellula si

trova in uno stadio tardivo, la coda si attacca in modo che venga prodotta una catena pesante più

corta.

Lo splicing consiste nella rimozione degli introni dell’mRNA. Un esempio di questo tipo di

maturazione lo troviamo in Drosophila. La determinazione del sesso in Drosophila dipende dal

rapporto [cromosomi X : autosomi], per cui nella femmina abbiamo un rapporto 2X:2, e nei maschi

1X:2. 90


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blacksun

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DESCRIZIONE APPUNTO

Riassunto per l'esame di Genetica, basato su appunti personali e studio autonomo del libro Genetica, anno 2004, di Russell consigliato dalla docente Caterina Tanzarella. Fra gli argomenti: segregazione genetica, analisi genetica, mendel, mitosi, meiosi, ereditarietà, ricombinazione, mappatura, crossing over, coniugazione batterica, trasduzione, dna, rna, cromosomi, replicazione, trascrizione, e.coli, clonazione, mutazioni genetiche, alleli.


DETTAGLI
Esame: Genetica
Corso di laurea: Corso di laurea in scienze biologiche
SSD:
A.A.: 2005-2006

I contenuti di questa pagina costituiscono rielaborazioni personali del Publisher blacksun di informazioni apprese con la frequenza delle lezioni di Genetica e studio autonomo di eventuali libri di riferimento in preparazione dell'esame finale o della tesi. Non devono intendersi come materiale ufficiale dell'università Roma Tre - Uniroma3 o del prof Tanzarella Caterina.

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