Genetica molecolare umana

INVOLUCRO NUCLEARE

Due membrane concentriche tra di esse spazio perinucleare

⇾

La membrana esterna si continua con il reticolo endoplasmatico

Presenza di pori nucleari e lamina nucleare

Attraverso i pori avviene il passaggio di ioni e piccole molecole trasporto selettivo, complesso del poro

⇾

ampio scambio con il citoplasma (passaggio di proteine, mRNA)

Il nucleo ha una serie di organelli, i nuclear bodies

non hanno membrane e si formano e sciolgono a seconda della necessità

• Lamina nucleare

Rete di proteine insolubili adesa al versante nucleoplasmatico

lamina A, B, C

famiglia di piccole proteine 60-70 kd conservate evolutivamente

Sono attivamente coinvolte nella disgregazione della membrana nucleare durante la divisione cellulare (con fosforilazione), sono

coinvolte nella stabilità strutturale, organizzazione della cromatina ed espressione genica

Mutazioni di questi geni sono correlati a diverse patologie umane (laminopatie) sindrome di Hutchinson-Gilford

⇾

Rara, incidenza 1:8.000.000

forma di progeria, invecchiamento precoce

La maggior parte dei casi sono causati da una mutazione de novo troncante il gene della lamina A

determina una maggiore fragilità nucleare agli stress meccanici, nonché di scorretti rapporti con l’eterocromatina periferica e con il

posizionamento dei pori nucleari Sub-organizzazione a domini

1- Nucleolo

2- Corpi di Cajal

3- Granuli intercromatinici o speckles

Le lamine fanno da ancora per proteine

regolatrici e le concentrano in determinate parti del nucleo contribuendo all’organizzazione interna del nucleo

⇾

Questi corpi non avendo membrana non sono fissi, ma si creano e dissolvono

Modello di formazione dei nuclear bodies - stocastico

- ordinato

- seeding (forma mista)

• Nucleolo

Nel nucleolo avviene:

- la trascrizione dell’rRNA

- maturazione rRNA da un unico trascritto che viene escisso e modificato (editato) in alcuni specifici nucleotidi da snoRPNs

(small nuclear ribonucleoproteins)

- assemblaggio rRNA e proteine per dare le due subunità ribosomiali

Non è un organulo, ma una regione particolarmente densa di materiale genetico e proteico (particolarmente evidente in microscopia)

• Corpi di Cajal

Corpi di RNA e proteine

siti dove snRNA e snoRNA subiscono modificazioni e sono assemblati completamente a proteine

Avviene l’origine degli spliceosomi

Sono associati con l’assemblaggio e il reclutamento della telomerasi per mezzo di una sequenza comune sia agli RNA dei corpi di Cajal

che a TERC (componente RNA della telomerasi)

• Granuli intercromatinici o speckles

Se si indirizzano anticorpi fluorescenti verso fattori proteici coinvolti nello splicing del pre-mRNA si nota una distribuzione non

uniforme, ma concentrata in 20-50 domini irregolari detti speckles o granuli intercromatinici che si pensa siano depositi dinamici che

forniscono i fattori di splicing già finiti e pronti per l’uso necessari a siti di trascrizione vicini

Quindi il nucleo ha al suo interno comparti spaziali estremamente organizzati

che forniscono un “servizio” che ottimizza e rende più efficiente e rapida, ai cambiamenti transienti, l’espressione genica

L’interno del nucleo conterrebbe questi aggregati proteici detti transcription factory

I compartimenti spaziali avrebbero una disposizione:

- non casuale ma dipendente dal set di proteine nucleari

- dinamica: può variare in rapporto agli stimoli cellulari, allo stato di sviluppo, alla condizione fisiologica/patologica (esempio:

traslocazioni che spesso sono responsabili di cambiamenti posizionali che alterano l’organizzazione)

ARCHITETTURA DEL NUCLEO INTERFASICO

Come è organizzata tridimensionalmente la sequenza lineare del DNA umano?

Durante l’interfase, quando non possiamo vedere i cromosomi nella loro struttura, questi sono organizzati in un modo preciso o

casuale?

Ci può essere un effetto di posizione o codice (insieme di regole) nell’organizzazione topografica del materiale genetico che possa

incidere sulla sua espressione?

Nel nucleo interfasico esiste un sistema molto controllato che consente espressione di più geni in maniera non casuale, ma controllata

topologia nucleare

Rabl e Boveri teorizzano che i singoli cromosomi mantengono la propria identità nel nucleo durante il ciclo cellulare

i cromosomi hanno una loro posizione definita nel nucleo chromosome territories

⇾

la posizione non è casuale, a seconda della posizione possono essere attivi o meno attivi

Dimostrazione con esperimento di Cremer e Cremer

irraggiamento del nucleo di cellule nella stessa fase del ciclo cellulare con laser fisso, se:

- i cromosomi sono organizzati in modo casuale, a seconda della cellula danneggio cromosoma diversi se colpisco sempre lo stesso

territorio

- se sono organizzati in una maniera specifica e definita, danneggio sempre gli stessi cromosomi in ogni cellula

Ogni cromosoma durante il ciclo cellulare mantiene la sua individualità occupando un volume limitato nello spazio (territorio

cromosomico) utilizzando sonde cromosoma-specifiche è possibile evidenziare i territori cromosomici che appaiono come domini

⇾

quasi sferici di 2 µm di diametro

I territori cromosomici occupano posizioni probabilistiche e non assolute nel nucleo

l’architettura genomica deve essere interpretata alla luce della sua natura dinamica (cioè la mobilità cromatinica

L’esatta localizzazione spaziale di una porzione genomica potrebbe non essere importante quanto il tempo in cui rimane in quella

posizione

La posizione viene mantenuta nell’evoluzione, i cromosomi hanno una posizione diversa nel nucleo in base al loro contenuto in geni:

- ricchi di geni parte più interna del nucleo

⇾

- poveri di geni parte esterna del nucleo

⇾

Gene kissing

La cromatina si riposiziona all’interno del suo territorio e cambia stato di condensazione e di attività

Geni localizzati in domini diversi possono venire co-regolati mediante l’interazione tra anse di cromatina

La co-localizzazione spaziale-temporale di loci genici appartenenti a differenti cromosomi o siti lontani sullo stesso cromosoma,

rappresenta un esempio dell’organizzazione tridimensionale del genoma

I cromosomi tramite le anse riescono a muoversi pur essendo fissi, possono interagire con vari territori anche di altri geni

Analisi della conformazione cromosomica

- microscopia elettronica: laboriosa, difficile da applicare

- microscopia ottica: la risoluzione non è sufficiente per visualizzare il contatto tra due diversi loci

- DNA binding protein legate a GFP: solo alcune posizioni possono essere esaminate contemporaneamente

- FISH: richiede dei trattamenti che possono influire sull’organizzazione dei cromosomi

Utilizzo della Chromosome Conformation Capture

1- Formazione dei cross-linking

trattamento con formaldeide

⇾ formazione di cross-linking di regioni che si toccano fisicamente tramite i contati delle loro DNA

⇾ bound-protein (come enhancer e promotori)

2- Digestione con enzimi di restrizione

taglio del DNA con enzimi di restrizione o per sonicazione

il DNA che interagisce resta unito

3- Ligazione intramolecolare

unione degli estremi dei segmenti cross-linked

4- Reverse cross-linking

alte temperature e proteinasi K

⇾ pool risultante di 3C DNA

⇾

5- Quantificazione

qPCR con marker locus specifici (frequenze di ligazione)

Lati negativi:

- richiede una conoscenza a priori dei loci interagenti perché servono primer locus specifici

- alcuni dei risultati possono derivare da interazioni casuali di loci posti nelle vicinanze sullo stesso cromosoma

serve bioinformatica e replicazione degli esperimenti

ANALISI GENETICA E INTERPRETAZIONE DEGLI ALBERI GENEALOGICI

Problemi relativi all’interpretazione:

- allele recessivo molto frequente pseudodominanza

⇾

- penetranza

- espressività

- manifestazione tardiva della malattia

- mutazione de novo

- eterogeneità genetica

- fenocopie

- esclusione di paternità

Per allele recessivo

ALLELE RECESSIVO MOLTO FREQUENTE

∎

Quota di soggetti carrier è così elevata che anche dal matrimonio tra non consanguinei nasce un figlio omozigote

Allele recessivo molto frequente può dare l’idea di un’eredità dominante

ogni figlio malato ha un genitore malato

Gruppo 0 sanguigno

Per allele dominante

Malattie dominanti:

- espressività variabile

- penetranza ridotta

- insorgenza tardiva

- nuova mutazione

- mosaicismo

PENETRANZA

∎

Frequenza con cui un gene (dominante o recessivo) si manifesta nel fenotipo degli individui, ossia la percentuale di individui con un

dato genotipo che mostrano il fenotipo corrispondente

Dipende sia dal genotipo (interazione con altri geni) che dall’ambiente e può essere:

- completa, 100% tutti i portatori di un certo allele manifestano il fenotipo corrispondente

⇾

- incompleta, meno del 100%

Es: se un gene A ha una penetranza del 70%, vuol dire che nel 70% degli individui vi è il fenotipo A e nel 30% dei casi il fenotipo è a

In caso di difetti di penetranza, non avviene la manifestazione della malattia anche in presenza dell’alle mutato

colpisce di più le malattie dominanti rispetto alle recessive perché per avere il fenotipo recessivo serve una doppia mutazione

per la malattia dominante serve un solo allele mutato

Ectrodattilia, penetranza ridotta

ESPRESSIVITA’

∎

Grado di espressione fenotipica di un certo carattere in un individuo

L’espressione può essere ⇾ uniforme

⇾ variabile

Correlata a difetto di penetranza e in genere caratteristica delle forme dominanti.

Generalmente le condizioni recessive sono meno variabili di quelle dominanti probabilmente perché il fenotipo degli eterozigoti è legato

al bilanciamento di due alleli ed in questo modo l’influenza dell’ambiente è minore

A livello di popolazione un fenotipo presenta espressività variabile quando all’interno dell’insieme di soggetti sicuramente portatori il

fenotipo presenta gravità e/o complessità diversa. Anche all’interno della famiglia ci può essere espressività variabile

Non si applica per singole malattie, ma per forme sindromiche

colpiscono diversi organi

Pazienti possono manifestare tutti i sintomi della sindrome o solo alcuni

Esempi:

- Neurofibromatosi di tipo 1

Alcuni pazienti hanno solo un coinvolgimento cutaneo, altri hanno una sintomatologia molto più grave: multipli tumori benigni,

multiple macchie pigmentate (caffèlatte), duo o più noduli a livello dell’iride

Non posso fare previsioni interpretazione della malattia è molto complicata, posso calcolare la penetranza ma non l’

espressivit&ag