Genetica molecolare

Paradosso di Sherman

Studio fatto grazie a maschi trasmettitori sani (T), individui con 60-70 ripetizioni che trasmettono alle figlie femmine le stesse ripetizioni, senza espandere e che hanno anche il 5-9% di probabilità di avere figli affetti.

La figlia avrà maggiore probabilità di avere figli affetti perché tenderà ad espandersi.

Le donne affette tendono a manifestare un fenotipo meno grave dei maschi (per inattivazione cromosoma X che inattiva parzialmente FMR-1 mutato).

FMR PROTEIN:

• Citoplasmatica, di molti tipi cellulari in particolare neuronale (ruolo nella maturazione delle sinapsi)
• È una RNA binding protein che interagisce con diversi mRNA e potrebbe agire come chaperone di questi dal nucleo all'apparato traduzionale (associato ai poliribosomi) → mutata non si associa più ai poliribosomi e impedisce le sinapsi

3. MALATTIE DOVUTE ALL'ESPANSIONE DI RIPETIZIONI NON CODIFICANTI CHE CONFERISCONO NUOVE

PROPRIETÀ ALL’RNA CORRISPONDENTE

Le madri di soggetti affetti riferiscono problemi dei propri padri (maschi trasmettitori) intorno ai 50-60 anni come frequenticadute e perdita di equilibrio, difficoltà nell’alimentarsi e perdita di memoria.

FRAXA

Maschi con esordio a 50-70 anni. Soggetti premutati. Tremore intenzionale (quando si vuole prendere un oggetto), atassia (camminata trascinata), neuropatia periferica, perdita progressiva delle capacità intellettuali, disordini del SNA, ansietà e disturbi emozionali, parkinsonismo.

Analizzando il cervello si è notata una atrofia corticale grave e tramite neuroimagin ipertesità della materia biancacerebellare e dei peduncoli cerebellari “segno MCP”.

Analisi post-morte evidenzia su tutti i cervelli analizzati inclusioni intranucleari ubiquitina-positive a livello sia dei neuroniche degli astrociti.

(Associated Tremor/Atassia)FXTAS

Donne madri di soggetti affetti da X fragile

e con menopausa precoce (prima dei 40 anni). Problemi emozionali e depressione.

→ 20-30% dei casi presentano premutazione del gene FMR-1.

↓(Pre Ovarian Failure)FXPOF

In questi soggetti si notano livelli di FMRP ridotti per espansioni elevate. aumenta in correlazione con l’aumento del numero di ripetizioni (soggetti premutati).

I livelli di mRNA per il gene FMR-1→

➊ 200+ ripetizioni metilazione, no mRNA e proteina, Sindrome X fragile→

➊ 55-200, premutazione livelli mRNA aumentano e lieve riduzione proteina, FXTAS, POF

FXTAS non è dovuta all’assenza di FMRP e alla presenza dell’espansione CGG (maschi full mutati non sviluppano causata dall’abnorme trascritto per FMR-1 apparentemente FXTAS) ma può essere espansione ripetizione CGG al 5’UTR e presenza di elevati livelli di mRNA per FMR-1→ funzione tossica “gain of function” dell’mRNA di FMR-1→

Es.: Topo transgenico con 100 CGG repeats presenta inclusioni

nucleari con mRNA del gene FMR-1.

Drosophila con 90 CGG presenta inclusioni.

MODELLO DI RNA GAIN OF FUNCTION PER FXTAS:

Le ripetizioni che formano le forcine fanno legare proteine con ribonucleoproteine, CpG binding protein… e queste chedovrebbero funzionare in altri pathway cellulari vengono sottratte. →La cellula tenta di andare in degradazione legando HSP, ubiquitina formazione inclusioni.

Le inclusioni possono anche essere alla base, nella cellula ovarica o granulosa, della riduzione del numero di oociti odell’oocita.disfunzione delle cellule della granulosa importanti per la produzione di sostanze per la maturazione

DISTROFIA MIOTONICA (DM1/2)

o Autosomica dominante ed espressività variabile

o Miotonia (rigidità muscolare) e progressivo indebolimento muscolare

o Forma più comune: distrofia muscolare ad esordio tardivo

o Associazione con alterazioni scheletriche cardiovascolari e oculari (cataratta) e diabete

o Associazione con ritardo mentale:Fenomeno

Come per la FXTAS, la patogenesi molecolare è legata in prima istanza ad un acquisto di funzione dell’RNA contenentel’espansione CTG.

L’mRNA che presenta espansione da origine ad una forcina.Si legano una serie di proteine come MBNL1 presente nei foci di RNA (che si vedono nelle cellule) che intrappola leCUGBP (binding protein la cui espressione è aumentata, up-regulation).

Sequestro MBNL1 e l’up-regolazione→ indotta di CUGBP1 (coinvolte nello splicing) porta alterazione dello splicing.

Si ha un’attivazione di splicing embrionali in tessuti adulti.→ →RNA gain of function causa come effetto secondario alterazione completa degli splicing.presenza nel 3’ UTR di grosse espansioni (2000+) potrebbe alterare la cromatina

Altro meccanismo possibile dato dallache riduce

L'espressione del gene SIX5 è coinvolta nell'insorgenza della cataratta.

DIAGNOSI: DIAGNOSTICA MOLECOLARE PER PICCOLE ESPANSIONI:

In caso di piccole espansioni si possono posizionare dei primer in testa nelle regioni uniche che non comprendono le ripetizioni ed effettuare una PCR.

TRIPLET REPEAT-PRIMED PCR PER GRANDI ESPANSIONI:

Si posiziona uno dei due primer, reverse, a cavallo delle CGG (una parte contiene CGG ripetuta). Il primer forward è normale, posizionato nella regione fiancheggiante le CGG. → Il reverse potrebbe appaiarsi in qualsiasi posizione della sequenza ripetuta si producono filamenti di varie dimensioni.

In molti laboratori si preferisce usare ancora il vecchio sistema, il (slide per ripasso procedimento):

SOUTHERN BLOT

Lo stato di full mutazione e di metilazione di FMR-1 nelle donne è difficile da trovare. Sonda: StB12.3

Si taglia il DNA genomico con l'enzima EcoRI. Si usa un enzima metilazionesensibile che taglia solo sequenze non

metilate. → → → Uomo normale 1 X normale 1 banda da Eag a ECoRI 5,2 Kb 2 bande (1 per l’X normale e 1 per l’inattiva metilata e non tagliata) → → o Donna normale 1 X inattivata e metilata → → o Maschio premutato aumenta ripetizione CGG aumenta peso da 2,8 Kb un X con premutazione e l’altra normale → → o Donna premutata + attivi o inattivi (tagliati o no da Eag) 4 bande → → o Maschio full mutato repeats CGG espansa, no taglio Eag perché metilato 5,2 Mb + numero ripetizioni espanse → o Donna mutata tre bande: 1 X con full mutazione; 1 X normale attivo; 1 X normale inattivo

Polimorfismi del DNA

LEZIONE 9

Il sequenziamento del genoma umano di molti individui ha portato all’individuazione di 3 milioni di paia di basi che variano tra gli individui su 3 miliardi di paia di basi che compongono il genoma. → VARIABILITA’ GENETICA Il 99.9% del DNA è conservato tra individui diversi. Solo gemelli identici

Possiedono lo stesso genoma. Una differenza dello 0.1% nella composizione del DNA è sufficiente per dar luogo alla variabilità della popolazione. "Esistenza di forme diverse". → Variazioni della sequenza del DNA presenti nella popolazione con POLIMORFISMO una frequenza >1% (quindi non sono mutazioni). Esistenza nella popolazione di due o più varianti (alleli, fenotipi varianti di sequenza varianti per la struttura cromosomica) con frequenze significative. Il termine generalmente si riferisce all'esistenza nella popolazione di due o più alternativi genotipi. Un locus è polimorfico se vi sono due o più alleli che vengono mantenuti nella popolazione ed in cui l'allele più raro ha una frequenza di almeno l'1%. → Aplotipo = la costituzione allelica di loci multipli in un cromosoma sufficientemente vicini da non permettere un nell'altro locus l'allele 2. evento di crossing over. Es.: individuo con alle