Genetica Molecolare dello sviluppo

Forward Genetics: come ha un luogo un processo, andandolo ad alterare attraverso mutazione. Eseguendo una

mutagenesi è possibile identificare il gene o i geni mutati e stabilire in che relazione sono tra di loro e la loro

funzione nella formazione del tessuto di interesse.

Reverse Genetics: attraverso il clonaggio è possibile inserire una mutazione in un cDNA, eseguire una

mutagenesi pianificato dallo sperimentatore ( invece di creare un organismo mutate e poi di serve verificare

quali sono i geni mutati ). E' possibile ottenere organismi trasgenica. Si parte dal gene per arrivare al processo

biologico. Si fa il contrario del forward genetics.

Con il termine sviluppo si intendono tutti quei meccanismi second cui da uno zigote si forma un organismo

pluricellulare.

Una delle domande principali della Genetica dello Sviluppo: una cellula differenziata ha un genoma che ha

perso l'informazione per " fare " altri tipi di cellule oppure il genoma è ancora lì ma è attivo solo quello per fare

un determinato tipo di cellula?

I primi studi sono quelli di:

• T. Boveri: studia il riccio di mare , abbiamo le prime due divisioni che avvengono su piano ortogonale e il

terzo è perpendicolare formano otto blastomeri. Analizzan la polispermia che , a causa della fusione di due

nuclei provenienti da due spermatozoi con quelli di un ovocita , si creano delle aberrazioni che portano alla

formazione di quattro fusi mitotici e alla conseguente formazione di cellule aneuploidi. Bovari induce la

polispermia e separa i quattro blastomeri attraverso un filo sottile e osserva lo sviluppo di ciascun

blastomero. Quello che vede è che ciascun blastomero si sviluppa ciascuno in modo diverso. Quindi ogni

blastomero aveva un contenuto informazionale diverso.

• Spermann: eseguendo una costruzione, separa la blastula in modo tale che il nucleo dello zigote si trovasse

solo da un lato: così si aveva un embrione con 16 cellule. Allentando quella costrizione faceva migrare un

nucleo dall'altra parte e vedeva che entrambi davano origine a due funzionanti. Dimostra che fino a 16

cellule è in grado di avere la stessa potenzialità che aveva lo zigote.

• Wilson & Stevens : dimostrano l'importanza del cromosoma, correlando la caratteristica fisica a una

composizione del genoma.

Una cellula differenziata ha le stesse potenzialità dello zigote da cui proviene, quindi il suo nucleo dovrebbe

essere in grado di generare ogni altro tipo di cellula differenziata ( se messo in una cellula ancora

indifferenziata ). Cioè dovrebbe contenere tutte le informazioni necessarie.

Come fanno a dimostrarlo ? I primi esprimenti risalgono agli anni 50.

• pungono con un ago l'ovocita della rana, quando lo fanno , il fuso degli ovociti bloccati in meiosi cambia

posizione per riarrangiamento ( si sposta verso il basso dell'ovcita ) e così è facile da rimuovere. Inoltre la

puntura gli permette di attivare gli ovociti. Dopodichè dissolvono tessuti delle cellule differenziare w ne

perdono il nucleo e ne trapiantano uno nuovo di spermatocita e uno nuovo di ovocita. E ottengono zigoti che

si sviluppano in girini. All'inizo usano solo il nucleo di un blastomero. Questo però non sono pienamente

differenziati. Per cui rifanno esperimenti con cellule via via più differenziate ( cellule di blastula tardiva,

cellula precoce e tardiva di gastrula, coda di girino ). E si è visto che le Man mano che queste cellule erano

più sviluppate, si aveva via via una diminuzione delle cellule differenziate. Questa conclusione si è rivelata

incorretta.

Gurdon: cambia il sistema modello usando lo Xenopus che raggiunge prima la fertilità sessuale, l'ovogenesi

può essere facilmente indotta in qualsiasi momento. Un problema di Xenopus è che ha un involucro esterno.

Usa , per enucleare, i raggi UN per distruggere il nucleo e anche per eliminare l'involucro. Inoltre usa

marcatori genetici per dimostrare che l'individuo è derivato da un trapianto nucleare.

L'utilizzo di un marcatore genetico consente di , seguendo la manifestazione fenotipica del marcatore , dire che

l'individuo è derivato da trapianto nucleare. Si usa continuamente per gli organismi transgenici. Usa una

marcatura ( 1-m ) che è un marcatore per la delezione dei geni ribosomiali 18s e 28s; caratterizzati da un

nucleolo invece che due (wt). Si usa il donatore ( il mutato-1 nucleolo ) ottenuto da una nerula I'm un ovocita

( nucleolo ) wt. Dovrei così osservare un organismo con un solo nucleolo, e così è. L'altro marcatore eclatante,

era usare un nucleolo donatore da un organismo di xenopus Albino ). E si vede che tutta la progenie era albina.

Achei lui ha usato come nuclei donatori, cellule che via via erano più differenziate, e si vede che mano mano

che le cellule si differenziavano, i nuclei delle cellule donatrici.

Gurdon nel' 66 dimostra che ha usato come cellule donatrici, cellule differenziate:

• intestino ( del girino che si nutre ) : perchè se il girino si nutre, le cellule dell'intestino sono differenziate e

vede che riusciva nel suo esperimento e l' 1% dava individui adulti

• In questi risultati, in parallelo, otteneva anche degli " embrioni parziali" dovuti a degenerazione, ma una

parte di essi si sviluppa a. Fa dei trapianti seriali: usa l'embrione parziale e fa un secondo trapianto ( in un

ovocita enucleato ,ottenendo degli embrioni completi e un individuo morto. L'ipotesi è che manca sincronia

tra prima divisione e seconda divisione dello zigote, una cellula quindi sarà una viva e l'altra morta.

Il differenziamento, dunque, non comporta una perdita di informazione genica. Ma si trova in una forma

silente, se metto nell'ambiente giusto, il genoma può essere riprogrammato.

Le critiche:

• rispetto allo stadio: visto che lo stadio del girino adulto, le cellule della linea germinale devono ancora

migrare verso le gonadi. Quindi avrebbe potuto prelevare quelle ( quindi ancora parzialmente indifferenziate

• L'altro riguarda le cellule dell'intestino: potevano ancora essere non del tutto differenziate, perchè in quelle

cellule, a quello stadio, c'è ancora del vitello

In successi lavori ha usato cellule proveniente da adulti in cui otteneva girini ma non andava oltre. Ha abusato i

cheratina citi delle membrana Inter-epitelilale, polmone e cuore.

Campbell ha ottenuto delle pecore adulte, usando nuclei da una linea cellulare embrionale. Poi hanno utilizzato

cellule embrionali ( 9 days), cellule di feto ( 26 days ), ghiandole mammarie adulte ( 6 anni ). Quindi era

possibile ottenere un nucleo donatore che porta va a un adulto formato.

Usano due razze diverse di pecora. Viene indotta l'enucleazione e enoclueato tramite aspirazione, poi veniva

preso il nucleo è messo in coltura e poi inserito nell'evocita enoclueato, viene attivato l'uovo attraverso stimoli

elettrici che permettono la destabilizzazione della membrana e le cellule si fondono insieme e quando l'ovocita

diventa blastula viene reimpiantato nella pecora ( madre surrogata ). Una di essa ha dato l'origine delle pecora

dolly , con caratterista della razza donatrice del nucleo.

Si è usato :

• epitelio mammario : 1 offspring ( Dolly )

• Fibroblasti fetali: 1 muore e 1 vive con fenotipo della razza donatrice

• Embrioni : 4 offspring, 2 nate con Cesario.

Hanno usato l'analisi degli SNP mediante micro satelliti per eseguire la genotipizzazione. Il genotipo deve

essere uguale al donatore e diverso dall'accettore. L'analisi dimostra ciò .

La riuscita del clonaggio dipende dalla specie e dalla tecnica usata. E' possibile fare una correlazione tra

successo gli clonaggio quando quello che riceve non è uno zigote enucleato ma un ovocita. Visto che il nucleo

viene riprogrammati, essi viene riprogrammato in maniera più efficient quando è un obocita piuttosto che uno

zigote. Per quanto riguarda la cellula donatrice, la percentuale di successo dipende dallo stato delle cellule

donatrici, la percentuale di successo dipende dallo stato delle cellule donatrici, è maggiore quando le cellule

sono in fase G0, G1 o M. Questo sarebbe dovuto al fatto che deve avvenire una riprogrammazione del nucleo,

quindi la modificazione Epigenetica avrebbero in modo migliore negli stadi di quiescienza ( riorganizzazione

della cromatina). Mentre in fase M o G1 la cromatina potrebbe essere più facilmente accessibile per la

riprogrammazione.

Non tutte le stesse caratteristiche possono essere clonate. Per esempio l'inattivazione del cromosoma X, per cui

tutte le caratteristiche associate a esse sono casuali e non clonabili.

Sindrome di clonaggio:

Possiamo avere elevati tassi di mortalità prenatale, gestazione prolungata, variazioni di peso alla nascita

( maggiore rispetto alla media). Potremmo avere fenotipi patologici: quale elevata mortalità. Obesità, sistema

immunitario compromesso , riduzione della durata di vita.

Eteroplamia: ci sono due DNA ( nucleare e mitocondriale ).

Come può accadere che da uno zigote si formi un organismo pluricellulare?

Negli anni '60 è stato espressa la terziaria dell'espressione genica differenziale:

• ciascuna cellula GA lo stesso genoma ( tranne i linfociti B e T )

• I geni non espressi più, mantengono la capacità di essere espressi, ma non la usano

• Una piccola percentuale del genoma è espressa in ogni tipo di cellula

Ibridazione in situ: con Dixogineina ( GIN: è uno steroide che si lega a UTP per poterlo marcare ), ci permette

di comprendere i territori spaziali in cui un gene è espresso.

Possiamo fare entrare questa sonda nel tessuto; per far appaiare RNA o formare ibridi DNA-RNA. Dopo il

riconoscimento si formano un DS che contiene GIN e vengono legati da anticorpi coniugati a perossidasi o

fosfatasi alcalina.

Possiamo usare marcature diverse, usando anche apteni fluorescenti, usiamo un anticorpo secondario

servendosi di un ferro cromo.

Si può usare là GIN per localizzare anche i cromosomi e vedere su di essi, uno specifico gene.

Immunostaining: possiamo vedere la localizzazione di proteine, dobbiamo avere un anticorpo diretto contro la

proteina di interesse e non una sonda, riconosciuta poi da un anticoporpo secondario coniugato ad un enzima o

ferrocromo. Oppure un anticorpo primario già marcato.

Differenziamento:

Commitment: la cellula ha acquisito il destino, anche se esteriormente non si differenzia, ma è stata pre-

ordinata.

C'è un momento della specificazione: che è una fase reversibile ( dipende dall'ambiente).

Determinazione: E' irreversibile.

Dopodiché c'è il Commitment.

E' specificata se viene privata del suo contesto e posto in un ambiente neutri, si può sviluppare come se fosse

nella sua cellula di provenienza. Ma se messa in un ambiente diverso, può cambiare destino.

E' determinata se messa in un nuovo ambiente non cambia.

La specificazione può essere:

• autonoma: ogni cellula si sviluppa anche separata dall'altra, non sono in grado di autoregolarsi. Ad esempio

le cellule dei trofoblasti. Prelevando un particolare blastomero questo predice gli stessi tipi di cellule che

avrebbero prodotto se avessero ancora fatto parte dell'embrione

• Conduzione regolativa: una cellula può seguirle quindi viene specificata multipli destini differenziativi. E' in

grado di modulare il proprio destino. Per esempio enoclueazione. Se si prelevano delle cellule della regione

dorsale del girino, e si pongo non nella regione ventrale cambiano il loro destino. Oppure se si apostata una

regione della blastula, le cellule sono in credo di compensare autoregolandosi. Esempio nei è quello dei

gemelli.

• Sinciziale: molto diffusa negli insetti, ha luogo all'interno di un territorio unico caratterizzato da morfogeni

che da istruzione ai nuclei delle varie cellule in base alla loro poszione dando origine a una specifica

porzione. Quindi al contrario della precedente, l'influenza è data dal citoplasma e non dalle cellule

circostanti.

Organismo Modello e i suoi scopi:

• primo esempio storico è il Pisum Sativum

• Permette di studiare delle caratteristiche che noi consideriamo universali

• S. Cervisiae: organismo modello per i primi studi sugli eucarioti, in particolare per la regolazione del ciclo

cellulare. Consente di fare studio di genetica glassi a ma anche di genetica inversa, grazie all'elevata

frequenza di ricombinazione omologa.

• C. Elegans: usato per gli studi di RNAi, è composto da un numero fisso di cellule ( 959 e 302 neuroni )

• X. Laevis:

• Zebrafish

• Mis Musculus

• Arabidopsis Thaliana

• Drosophyla: ha una lunga storia di ricerche genetiche, si presta all'analisi di molti meccanismi biologici. In

particolare nei meccanismi di segnalazione cellulare. E' un ottimo sistema modello per lo studio di malattie

umane, questo perchè moltissimi geni associati a patologie umane, ha un omologo in Drosophyla.

Addirittura è stato usato negli studi della dipendenza d'alcol.

Cy( Curly ) è un esempio di mutazione di Drosopyla, groucho ( presenta sugli occhi delle setole addizionali ).

• la Drosophyla ha 3 stadi larvali, poi c'è lo stadio di pre-pupa, pupa ( a 25° dura 4-5 giorni ) e poi diviene

adulto che prima di raggiungere la maturità sessuale devono aspettare 3/4 ore.

• Ci sono evidenti differenze fenotipiche , la Drosophyla F è più grande, ma solo il M ha l'organo compilatore

e delle setole sulle zampe coinvolte nel rituale dell'accoppiamento.

• Nei maschi è completamente assente la ricombinazione omologa, questo è un aspetto molto rilevante.

Qualsiasi assortimento dei geni viene mantenuto come tale. Ha 4 cromosomi, con un cromosoma sessuale,

due cromosomi metàcentrici è un primo cromosoma piccolo eterocromatico. Il genoma è circa di 180 Mb,

120 eucromatina, 80 eucromatina. Ci sono dei polimorfismi nelle regioni eterocromatiche del cromosoma Y.

Il cromosoma Y è quasi del tutto eterocromatico. Ci sono dei cromosomi che sono politenici ( cromosomi

giganti ).

Drosophyla:

• cromosomi politenici: nella regione delle ghiandole salivari.

• I cromosomi politenici sono visibili anche a basso ingrandimento, è possibile distinguere eterocromatiche

( poco intensa ) rispetto a quelle eucromatiche ( che si colorano molto più debolmente ). QUesto ci darà un

brandeggio molto specifico e riproducibile sui cromosomi , che ci darà una mappa citologica sui cromosomi;

consente di identificare uniquovamente i diversi cromosomi. Tutte le braccia dei politeni, sono uniti nel

cromocentro, che è una regione eterocromatica. Questi vengono isolati tramite lisci delle ghiandole salivari (

squash ).

• Questi si formano perchè avvengono molte divisioni del DNA ma senza divisioni! QUindi abbiamo un

cromosoma composto da moltissimi filamenti che restano appaiati, si avrà un contenuto di DNA di 1024C.

Questi cromosomi sono trascrizionalmente attivi, questi cromosomi organizzati in questo modo le cellule

hanno un elevata attività metabolica durante la crescita, forniscono quindi un vantaggio essenzialmente

metabolico e quindi questo brandeggio è riproducibile per ciascun cromosoma. Questo brandeggio è

utilissima alla fine di localizzare la localizzazione del genoma in specifici geni Uno degli approcci per

identificare posizioni specifici di regione del DNA è stato quello di osservare cromosomi politenici , al fine

di stabilire l'estensione di delezioni. Per poter mappare delle delezioni e quindi comprendere i geni coinvolti

nella delezione, si fa un analisi dei cromosomi politecnico eterozigote ( uno wt e uno che porta una

delezione ) . Quindi quando un omologo porta una delezione è uno è wt, si forma un loop, dovuto al

mismatch di appaiamento tra cromosomi omologhi. L'altro utilizzo molto importante è rappresentato da

un'analisi che è stata utilizzato il fenomeno della pseudo-dominanza. Se abbiamo un individuo che è

eterozigote .Cioè se ho un organismo che ha un allele wt C deleto e un allele mutato recessivo c, allora avrò

un fenotipo ABcD che è pseudo dominante ( perchè se C grande non fosse stato deleto, avrei avuto ABCD e

quindi wt ) . Se si verifica la pseudominamza, allora sono riuscito a identificare l'intervallo citologico in cui

quel gene è localizzato. Anche sui cromosomi politenici è possibile fare un'ibridazione in situ e tecniche di

immunostaining ( ci dice se là proteine è in grado di legarsi al DNA e dove, e anche se due proteine sono in

grado di legarsi alla stessa regione co-immunostaining )

• Essendo la Drosophyla un moscerino piuttosto grande, è possibile seguire molte delle caratteristiche

morfologiche ( complesse ) della Drosophyla e che sono associate a specifici genotipi. Ci permette di seguire

la mutazione da una generazione a un'altra e consente di seguire gli eterozigoti da omozigoti e permette di

capire quale individui portano più mutazioni .

Forward Genetics

La mutazione resta un evento casuale, la cui incidenza è molto bassa, è difficile predire dove e quando la

mutazione si verificherà. La mutagenesi invece aumenta il tasso con cui una mutazione si possa verificare. Se

sottoponiamo un animale a un mutageni l la mutazione può colpire la linea somatica o quella germinale ( che

possono essere ereditate ).

Mutazione condizionale: l'effetto del fenotipo, si verifica solo in determinate condizione, che sono definite

condizioni restrittive. In altre occasioni, dette permissive, non si osserva alcun fenotipo.

Ad esempio la mutazione può essere temperatura sensibile.

Possiamo usare mutageni : chimici, fisici e biologici.

Un mutageno noto è l' EMS (ethyl-methane-sulfonate), è un Agente alkilante che va ad aggiungere ruppi etilici

all'ospite o come quello della Guanina o all'azoto 7 della Guanina oppure l'ossigeno 4 della timina. QUello c