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Genetica Molecolare dello sviluppo

Appunti scritti al PC, schemi presenti ( digitali o a mano) basati su appunti personali del publisher presi alle lezioni della prof. Cavaliere dell’università degli Studi di Bologna - Unibo, facoltà di Scienze matematiche fisiche e naturali. Scarica il file in formato PDF!

Esame di Genetica molecolare dello sviluppo docente Prof. V. Cavaliere

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dorsale del girino, e si pongo non nella regione ventrale cambiano il loro destino. Oppure se si apostata una

regione della blastula, le cellule sono in credo di compensare autoregolandosi. Esempio nei è quello dei

gemelli.

• Sinciziale: molto diffusa negli insetti, ha luogo all'interno di un territorio unico caratterizzato da morfogeni

che da istruzione ai nuclei delle varie cellule in base alla loro poszione dando origine a una specifica

porzione. Quindi al contrario della precedente, l'influenza è data dal citoplasma e non dalle cellule

circostanti.

Organismo Modello e i suoi scopi:

• primo esempio storico è il Pisum Sativum

• Permette di studiare delle caratteristiche che noi consideriamo universali

• S. Cervisiae: organismo modello per i primi studi sugli eucarioti, in particolare per la regolazione del ciclo

cellulare. Consente di fare studio di genetica glassi a ma anche di genetica inversa, grazie all'elevata

frequenza di ricombinazione omologa.

• C. Elegans: usato per gli studi di RNAi, è composto da un numero fisso di cellule ( 959 e 302 neuroni )

• X. Laevis:

• Zebrafish

• Mis Musculus

• Arabidopsis Thaliana

• Drosophyla: ha una lunga storia di ricerche genetiche, si presta all'analisi di molti meccanismi biologici. In

particolare nei meccanismi di segnalazione cellulare. E' un ottimo sistema modello per lo studio di malattie

umane, questo perchè moltissimi geni associati a patologie umane, ha un omologo in Drosophyla.

Addirittura è stato usato negli studi della dipendenza d'alcol.

Cy( Curly ) è un esempio di mutazione di Drosopyla, groucho ( presenta sugli occhi delle setole addizionali ).

• la Drosophyla ha 3 stadi larvali, poi c'è lo stadio di pre-pupa, pupa ( a 25° dura 4-5 giorni ) e poi diviene

adulto che prima di raggiungere la maturità sessuale devono aspettare 3/4 ore.

• Ci sono evidenti differenze fenotipiche , la Drosophyla F è più grande, ma solo il M ha l'organo compilatore

e delle setole sulle zampe coinvolte nel rituale dell'accoppiamento.

• Nei maschi è completamente assente la ricombinazione omologa, questo è un aspetto molto rilevante.

Qualsiasi assortimento dei geni viene mantenuto come tale. Ha 4 cromosomi, con un cromosoma sessuale,

due cromosomi metàcentrici è un primo cromosoma piccolo eterocromatico. Il genoma è circa di 180 Mb,

120 eucromatina, 80 eucromatina. Ci sono dei polimorfismi nelle regioni eterocromatiche del cromosoma Y.

Il cromosoma Y è quasi del tutto eterocromatico. Ci sono dei cromosomi che sono politenici ( cromosomi

giganti ).

Drosophyla:

• cromosomi politenici: nella regione delle ghiandole salivari.

• I cromosomi politenici sono visibili anche a basso ingrandimento, è possibile distinguere eterocromatiche

( poco intensa ) rispetto a quelle eucromatiche ( che si colorano molto più debolmente ). QUesto ci darà un

brandeggio molto specifico e riproducibile sui cromosomi , che ci darà una mappa citologica sui cromosomi;

consente di identificare uniquovamente i diversi cromosomi. Tutte le braccia dei politeni, sono uniti nel

cromocentro, che è una regione eterocromatica. Questi vengono isolati tramite lisci delle ghiandole salivari (

squash ).

• Questi si formano perchè avvengono molte divisioni del DNA ma senza divisioni! QUindi abbiamo un

cromosoma composto da moltissimi filamenti che restano appaiati, si avrà un contenuto di DNA di 1024C.

Questi cromosomi sono trascrizionalmente attivi, questi cromosomi organizzati in questo modo le cellule

hanno un elevata attività metabolica durante la crescita, forniscono quindi un vantaggio essenzialmente

metabolico e quindi questo brandeggio è riproducibile per ciascun cromosoma. Questo brandeggio è

utilissima alla fine di localizzare la localizzazione del genoma in specifici geni Uno degli approcci per

identificare posizioni specifici di regione del DNA è stato quello di osservare cromosomi politenici , al fine

di stabilire l'estensione di delezioni. Per poter mappare delle delezioni e quindi comprendere i geni coinvolti

nella delezione, si fa un analisi dei cromosomi politecnico eterozigote ( uno wt e uno che porta una

delezione ) . Quindi quando un omologo porta una delezione è uno è wt, si forma un loop, dovuto al

mismatch di appaiamento tra cromosomi omologhi. L'altro utilizzo molto importante è rappresentato da

un'analisi che è stata utilizzato il fenomeno della pseudo-dominanza. Se abbiamo un individuo che è

eterozigote .Cioè se ho un organismo che ha un allele wt C deleto e un allele mutato recessivo c, allora avrò

un fenotipo ABcD che è pseudo dominante ( perchè se C grande non fosse stato deleto, avrei avuto ABCD e

quindi wt ) . Se si verifica la pseudominamza, allora sono riuscito a identificare l'intervallo citologico in cui

quel gene è localizzato. Anche sui cromosomi politenici è possibile fare un'ibridazione in situ e tecniche di

immunostaining ( ci dice se là proteine è in grado di legarsi al DNA e dove, e anche se due proteine sono in

grado di legarsi alla stessa regione co-immunostaining )

• Essendo la Drosophyla un moscerino piuttosto grande, è possibile seguire molte delle caratteristiche

morfologiche ( complesse ) della Drosophyla e che sono associate a specifici genotipi. Ci permette di seguire

la mutazione da una generazione a un'altra e consente di seguire gli eterozigoti da omozigoti e permette di

capire quale individui portano più mutazioni .

Forward Genetics

La mutazione resta un evento casuale, la cui incidenza è molto bassa, è difficile predire dove e quando la

mutazione si verificherà. La mutagenesi invece aumenta il tasso con cui una mutazione si possa verificare. Se

sottoponiamo un animale a un mutageni l la mutazione può colpire la linea somatica o quella germinale ( che

possono essere ereditate ).

Mutazione condizionale: l'effetto del fenotipo, si verifica solo in determinate condizione, che sono definite

condizioni restrittive. In altre occasioni, dette permissive, non si osserva alcun fenotipo.

Ad esempio la mutazione può essere temperatura sensibile.

Possiamo usare mutageni : chimici, fisici e biologici.

Un mutageno noto è l' EMS (ethyl-methane-sulfonate), è un Agente alkilante che va ad aggiungere ruppi etilici

all'ospite o come quello della Guanina o all'azoto 7 della Guanina oppure l'ossigeno 4 della timina. QUello che

fa è induce mutazione puntiformi, ad esempio da coppia C:G a A:T. E' un mutageno molto casuale, questo

favorisce il suo utilizzo, perchè si vuole andare a fare una mutagenesi omogenea di tutto il genoma. Quindi ha

una bassa specificità di bersaglio. Inoltre, è che se anche sono in grado di indurre piccoli riarrangiamenti o

delezioni, quello che fanno maggiormente è fare delle mutazioni singole. L'inserzioni di singole mutazioni

( point mutations ) permette di avere una collezione di alleli (Mutati) diversi.

La probabilità di avere mutazioni in uno specifico genere dipende dalla sua dimensione.

La difficoltà principale è che : la

progenie che proviene dalla

mutagenesi deve essere sottoposta a

analisi, perchè un mosaico genetico

( è un organismo in cui il genotipo

rispetto a quello di un specifico gene,

sono presenti cellule con genotipi

diversi ) .

Esempio: prendiamo uno strand con

una G achilata, dopo la replicazione ,

questa sì appaia con una T ( invece

che con una C ) se non intervengono

meccanismi di riparo. Se non

avvengono meccanismi di riparo, si

avrò un doppio strand che ha un

mismatch è un secondo strand che

invece viene sottoposto a duplicazione

e si forma l'etica portande la point

mutations.

L'organismo può essere un mosaico quindi bisogna analizzare l'organismo che abbia una specifica mutazione

nella linea germinale.

Oltre all' EMS abbiamo:

• ENU: molto utilizzata nel topo , responsabile sola di transizioni ( A:T-G:C ) sia che trsversioni ( A:T- T:A )

• Agenti intercalanti, che creano delle delezioni o inserzioni

• 5-bromouracile: è analogo alla timina e si appaia con la G nella successiva replicazione ( T:A To G:C

transitions)

Radiazioni:

• Raggi X : induce la rottura del ds e mutazioni cromosomico oppure riarrangiamenti come le delezioni ,

duplicazioni o traslocazione

• UV: che erano i Dimeri di timina che possono essere riparati non correttamente.

Trattamento con EMS:

Si sottopongono i moscerini in un periodo di fame (starvation), poi si mette una soluzione contenute saccarosio

e EMS. Più EMS mettiamo, più achilazione abbiamo e più alta è la probabilità che abbia mutazioni e che

potrebbero essere anche su geni essenziali e quindi la mia progenie omozigote potrebbe morire prima che

nasca. Se invece uso una concentrazione bassa achilazione e quindi di mutazione, di cui poche saranno letali

quando messe in omozigote.

Prendo il moscerino, lo mutagenizzo ( che non so quale sia ) e quindi lo incrocio con uno che ha una mutazione

nota. A questo punto ottengo un eterozigote che ha il genoma con la mutazione nota e una diversa ( so che è

diversa perchè se faccio un test di complementazione non ho un recupero del wt e quindi le mutazioni

interessano geni diversi ! ) e quindi avrò trovato una nuova mutazione.

Quindi se cerchiamo una nuova mutazione, trattiamo con una concentrazione bassa, si fa in omozigosi e quindi

se ho una mutazione letale e faccio omozigosi non vedrò niente)

Se invece un allele diverso di uno stesso gene, usiamo delle concentrazioni più alte, si fa un test di

complementazione e quindi in eterozigosi ).

Vengono usati i maschi:

• lo sperma è più sensibile ai mutageni

• Non si ababssa la fertilità

• Possono accoppiarsi con più femmine

Accoppiamo un maschio trattato con femmina non trattata, supponiamo che sia stata indotta una mutazione

letale non recessiva. Quindi otterremo 50% mutato, 25% wt e 25% morto. Quelli che sono sopravvissuti

potrebbero avere lo stesso fenotipo ( essendo uno eterozigote per il gene mutato e l'altro malato ). Ho indotto

una mutazione letale recessiva, ma come la seguo di generazione in generazione. Si usano dei cromosomi

bilanciatori. Sono dei cromosomi che portano inversione multiple, quando incrocio un cromosoma bilanciatori

con quello wt avrò aneuploidia e letalità. Se invece , l'appaiamento avviene ( di questo cromosoma vi

lanciatore ) con la mutazione, quando si ha l'appaiamento in meiosi, si forma un inversion loop, e quando

avviene il crossing over si hanno diversi casi ( rivedi genetica Russell ):

• Non a cavallo del centromero: si forma un ponte di centrico è un frammento centrico ( questo viene perso ) ,

mentre i ponte durante la segregazione si rompe. Quindi quello che ottengo ho il cromosoma di partenza,

quello che porta l'inversione e due che non sono vitali.

• A cavallo del centromero: quello che si forma è un wt vitale m uno con delezione morto, uno con inversione

viale, è uno che porta una delezione o duplicazione vitale.

Quindi in questo modo, quello che si ha, è come se il crossing over non fosse mai avvenuto, i ricombinati non

sono vitali , e quindi quella mutazione io la potrò osservare generazione per generazione.

Cromosomi bilanciatori:

• porta multiple inversioni, che porta letalità quando si appaia con un cromosoma wt

• Contiene un marker che ne perette l'osservazione

• Contiene una mutazione letale recessiva che le gli mermette di evitare che gli omozigoti sopravvivano

( giustamente non mi interessa avere l omozigote per il cromosoma bilanciatore!!!) In questo modo avremo

unicamente solo la progenie eterozigote ( un cromosoma contenente l'inversione è un altro continente il

cromosoma bilanciatore )

I cromosomi bilanciatori sono disponibili per ogni cromosoma a parte il quarto i cromosomi per i bilanciatori

X nei maschi non portano mai il letale.

Abbiamo quello BAR che è per il primo, poi ne abbiamo uno per il secondo ( vedi slides ) e ne vede un per il

terzo STUBBLE oppure SR. Ci sono bilanciatori per il terzo che li portano entrambi Stubble e SR.

I bilanciatori sono essenziali per i test di complementazione, per individuare le differenti classi di progenie.

Test di complementazione: ci serve a dire se

sono mutazioni dello stesso gene o meno ( che

prendono parte allo stesso processo biologico ).

QUindi possiamo incrociare un eterozigote :

let1/bilanciatore + let2/bilanciatore.

Se non si ha complementazione , quindi non ci

sono individui morti allora sono sullo stesso

gene, se sono invece morti allora sono su due

geni diversi.

Come faccio a riconoscere l'individuo

omozigote oer il bilanciatore ( morto ) da quelli

che invece muoiono perchè complementan?

O metto una mutazione recessiva specifica sul

Bilanciatore oppure posso equipaggiare il

cromosoma bilanciatore anche un transgene

( un gene dimerico ) stabilmente inserito nella

genoma , posto sotto il controllo di un promotore

Forte e ubiquitario ( così che sia sempre espresso

Indipendenmonte dal periodo di sviluppo e dalla

Localizzazione cellulare.

Quindi :

Cy: curly wings, che ci permette di osservarlo

Mutazione recessiva letale: che elimina l'omozigote

Per il bilanciatore

Gene reporter,

Per essere un reporter ottimale deve essere una proteina esogena, cos da evitare un falso positivo.

I geni reporter possono essere usati come reporter trascrizionali e reporter Traduzionali.

Reporter trascrizionali: abbiamo una regione regolatrice che controllo l'espressione di un gene endogeno. Ora

quest ultima regione può essere sostituita con un la regione codificante di un gene reporter di nostra scelta.

Questo composto dimerico è introdotto nella cellule in coltura attraverso trasfezione oppure inserito nelle

cellule germinali per ottenere organismi transgenici.

Attraverso delezioni , una dopo l'altra, si va

identificare la regione regolativa minima per

poter esprimere nel modo più efficiente

possibile il gene reporter di interesse. Schema reporter trascrizionale

Si possono avere reporter

Traduzionali, è un costrutto sempre

dimerico, in cui il nostro gene di

interesse ( come l'immagine di

sopra ) si può costruitre un costrutto

in cui il gene reporter viene posta in

cella che sarà o l'estremità carbossil

o amino terminale della proteina

che varerà poi ottenuta. Così da

avere una proteina marcata con

gene reporter!

naturalmente quello che si ottiene,

anche se marcato, deve comunque

mantenere la funzione della

proteina originale, se c'è

un'alterazione della proteina

originaria rispetto a quella fusa con

gene reporter.

Come si fa a capirlo? Bisogna

metterla in un organismo in cui la Reporter Traduzionale

proteina originaria non c'è più e

quindi ci mettiamo la nostra

proteina-transgenica. Ora se tutto va come deve andare, allora significa che la proteina funziona.

Il gene reporter deve:

• essere esogeno all'organismo

• Deve essere abbastanza stabile per garantirne l'analisi e l'uso nei saggi

• Se però è troppo stabile questo ne causerebbe una persistenza maggiore rispetto a quello che si

verificherebbe per la proteina originale, rendendo così il test meno fedele

CAT reporter assassino

• è il gene reporter più vecchio

• È un gene batterico

• Non si trova begli eucarioti per cui non crea interferenze

Come viene usato:

• si trasformano le cellule e poi vengono listate

• Le proteine estratte sono mixati con con un analogo del cloroanfenicolo che è modificato per dare un segnale

fluorescente/radiattivo

• Si aggiunge anche Acetil CoA

( qui evidentemente abbiamo CAt sotto il controllo di gene di interesse, e quando viene espresso, anche CAt

viene espresso e reagisce con l'analogia del cloroanfenicolo così da quantificarne l'espressione )

La quantità di acetilazione osservata è direttamente proporzionale alla quantità di proteina prodotto sotto il

controllo del promotore in analisi, quindi è una misura diretta della forza di quel promotore.

LacZ

• si usa questa proteina reporter, che può essere usata in tutti gli organismi viventi, è un reporter ampiamente

utilizzato. QUello che succede è che questo saggio richiede necessariamente il fissaggio dei tessuti, e quindi

non possiamo dare delle osservazioni in vivo. Inoltre bisogna tener conto che la beta-galattosidasi è un

emivita piuttosto lunga . Nelle piante viene usata una beta-brumoidasi? In sostanza quando il nostro gene di

interesse viene espresso, cristo che controlla anche LacZ, viene espressa la beta-galattosidasi e si ha una

colorazione Blu.

Cromosomi Bilanciatori:

• esempio secondo cromosoma: Bilanciatori espresso in un ceppo transgenico, che è un costrutto in cui le

sequenze del gene LacZ sono sotto il controllo di un promotore ubiquitinario ( come quello dell' Actina ). In

Questo modo è possibile distinguere gli organismi che portano il cromosoma bilanciatore in omozigosi o

eterozigosi. Questo viene fatto durante lo sviluppo, perchè Nell'adulto possiamo distinguere tra ala liscia

( omozigote ) e ala riccia ( eterozigote ). Durante lo sviluppo possiamo basarci sull'intensità della

colorazione:

◦ Blu intenso: omozigote per il bilanciatore

◦ Blu sbiadito: eterozigote per il bilanciatore

◦ Bianco: porta la mutazione in omozigosi

La GFP permette l'osservazione di fluorescenza in vivo. LA prima GFP isolata era molto termolabile, e quindi

in seguito a mutagenesi sono state ottenute diverse varianti della GFP, in vari colori e con diversi gradi di

stabilità.

Emociti sono considerati delle cellule simile ai macrofagi , in Drosophyla , impegnati nella fagocitosi, difesa

immunitaria e nella sintesi delle componenti delle membrane basali. Una delle caratteristiche che essi hanno è

quella di fagocitare organismi che invadono i tessuti, ad esempio i batteri.

Queste proteine reporter vengono usate allo stesso modo di CAT e LacZ, quindi abbiamo il cromosoma

bilanciatore che ha una GFP sotto il controllo di un promotore ubiquitinario è inoltre , trattandosi di GFP, il

tutto verrà fatto in vivo, non ci sarà fissazione. La fluorescenza, ora, può essere usata per automatizzare la

raccolta di embrioni. Si usa un embryo-sorter. Uno dei promotori usati con GFP è il FKG34, che è espresso

ovunque , dallo sviluppo fin al periodo adulto.

Un altro reporter da usare è la luciferasi, ha un'emivita molto viebe e l'emissione di luce dura alcuni minuti.

Viene usato per lo studio della funzionalità dei promotori che sono sottoposti a periodi di attività molto brevi.

( come i geni coinvolti nel ciclo circadiani ). Quello che si ha è che la luciferasi va a ossidare la luciferina in

presenza di ATP e O2 e quindi si ha emissione di luce. È un monomero che non richiede nessuna modifica

post-traduzionale e che non necessita di " maturazione " ma è subito in grado di funzionare. Viene usato nelle

linee cellulari ma anche in organismi interi. Naturalmente si deve fornire substrato , ossia luciferina,

nebulizzando lo oppure fornendolo nel terreno di crescita.

L'ultimissimo transgene che viene presentato, è quello in cui si deve fare è equipaggiare il transgene con un

prodotto che determina la morte ma solo quando viene attivato da un promotore inducibile, come quello della

Heat Schock protein , che possono essere indotti da schock termico.

In Drosophyla abbiamo che Reaper, Hid e Grim attivano le morte cellulare andando a bloccare la proteina anti

apoptotica DIapI. QUindi andando a over esprimere uno dei 3, è possibile indurre la morte apoptotica. QUindi

quello che si fa è il gene di fusione in cui si mette una Heat shock proteine che controlla ad esempio hip e

avremo che dopo l'incrocio, alzando la temperatura, sopravvivono solo i mutanti omozigoti.

La funzionalità del transgene è influenzato anche dall'effetto di posizione ( può funzionare di meno se si trova

in una regione eterocromatica, e può funzionare a temperatura inferiore rispetto a quella che ci aspetta se si

trova in una regione molto eucromatina ).

Poi per distinguere il morto per apoptosi da quello, eventualmente morto , a causa di una mutazione omozigote

che abbiamo indotto possiamo usare un gene reporter per distinguerli ( questo solo nel caso in cui la morte

sopraggiunge tutta nello stesso stadio, se nascono tutti morti allora è necessario poterli distinguere. Ma se

quelli col bilanciatore muoiono allo stadio di pupa, e quelli con la doppia mutazione allo stadio adulto allora è

facile riconoscere. QUesto esperimento è più uno strumento accessorio, ossia io prima verifico attraverso uno

degli esperimenti visti prima, dove è la mutazione e quando si verifica. Poi uso questo per raccogliere solo ed

esclusivamente i mutanti omozigoti ( perchè potrebbero sopravvivere anche quelli eterozigoti e io non lo saprei

))

Conseguenze molecolari delle mutazioni:

In che modo le mutazioni alterano l'attività del gene (trascrizione):

• silente : la mutazione porta alla produzione di un amminoacido con le stesse caratteristiche di quello che

avrebbe dovuto codificare( avviene sul terzo amminoacido )

• Nossenso : porta allo stop

• Missenso:

◦ Conservative: si forma lo stesso amminoacido

◦ Non conservativo: si origina un amminocacido diverso

effetti sulla traduzione:

• inserzione e delezione : portano a uno shit della cornice di lettura, quindi viene prodotta una proteina invece

che un'altra.

Mutazioni condizionali:

Sono molto utili perchè il fenotipo conferito dalla mutazione si manifesta solo in condizioni restrittive.

Geni pleiotropici: sono geni che svolgono funzioni in molteplici tessuti in molteplici periodi di sviluppo. E

vista la loro ubiquità, le mutazioni condizionali ci permettono di studiarne le loro mutazioni in differenti

periodi dello sviluppo e in differente cellule ( magari il nostro gene mutato porta mortalità embrionale, ma se

così fosse , allora non potrei vedere se causa alterazioni ad esempio all'occhio, se mutato in periodo adulto.

COn le mutazioni condizionali io posso indurre la mutazione solo in periodo adulto e vedere che effetto ho li ).

Quindi io , se individuo un allele condizionale, posso fare degli esperimenti di shift di temperatura e vedere

cosa accade quando induco la temperatura in altri periodi dell'organismo. Questo esperimento viene detto di

Shift-Up.

Effetti delle mutazioni sulla funzione genica ( vedi su libro genetica )

Perdita di funzione

Alleli amorfi: quando il gene perde la sua funzione

Alleli ipomorfi: quando il gene diminuisce la sua funzione

Guadagno di funzione

Alleli ipermorfi: i geni funzionano di più

Alleli neomorfi: i geni hanno una nuova funzione

Alleli antimorfi: mutazione in cui un gene da un tratto perde una funzione e acquista la funzione nuova ( o

dominante negativa )

Come facciamo a distinguere le varie tipologie di mutazioni ? Attraverso dei test di dosaggio genico.

Mutazione amorfa:

• è una mutazione recessiva

• Elimina completamente la funzione del gene

• Indica direttamente lo stadio o il tessuto che per primo richiede quel prodotto genico

Esempio:

• omozigote wt che produce il prodotto

• eterozigote ne produce la metà del prodotto e non manifesta il fenotipo, quel prodotto genico è sufficiente

• Omozigote mut e si manifesterà un certo fenotipo in dipendenza dalla mutazione subita

Come facciamo a capire se il fenotipo ha una manca za del prodotto genico o a una sua diminuzione ? Quindi

se è amorfa o ipomorfa ? Facciamo

degli incrocio che ci portia organismi

che abbiano un allele mutato e l'altro

cromosoma manca di quel locus.

Quindi vediamo che se il fenotipo

osservato è uguale all'omozigote per

quella mutazione , allora la

mutazione deve essere amorfa. E si

può verificare che là mutazioni è

soppressa se si fa un over

espressione di quel gene ( magari

usando dei mutanti con duplicazione

di quel gene ).

Se invece abbiamo una mutazione

ipomorfa, se facciamo il test di

dosaggio genicoa.

• l'omozigote wt sta bene

• L'eterozigote ha meno prodotto

proteico

• L'omozigote mut ha una produzione di prodotto ancora minore ( non nulla ! )

• Facendo lo stesso test ossia usando un allele mutato e uno che ha una delezione per lo stesso locus, quello

che vediamo è che il suo fenotipo è ancora più grave rispetto all'omozigote per quella mutazione.

Mutazione ipermorfo: mutazione per il quale il gene viene espresso in quantità più elevate. E' una mutazione

dominante. Abbiamo:

• wt: in cui l'allele è espresso in quntità normali

• Eterozigote: in cui c'è una maggiore produzione del prodotto genico

• Omozigote mutazione: quantità di prodotto genico ancora maggiore

• facendo un test di dosaggio, in cui facciamo un allele mutato e un allele che invece è deficiente per quel

gene , avremo una quantità di prodotto paragonabile a quella dell'omozigote wt.

Se aggiungo copie di allele selvatico, avtò um peggioramento del fenotipo, mentre se lo metto con un allele

deificante avrò un miglioramento ( perchè se ne produce di meno ).

White: fa parte di una permeasi che permette il passaggio di troptofano e guanina che sono i precursori dei

colori

Mutazione neomorfo: mutazioni dominanti, che mostrano un prodotto genico nuovo. Nel test si vede che

l'eterozigote allele mutante+allele deficiente si ha una situazione uguale all'omozigote per quella mutazione. La

deficienza quindi non migliora il fenotipo, se aggiungono quanità maggiori di allele selvatico , non avrò

miglioramento. E' una mutazione che colpisce la regione regolativa di un gene che non dovrebbe essere

espresso ma vene espresso. C'è un elemento tras-agente che va a inibire l'elemento cos-agente inibitore di quel

gene che non dovrebbe essere espresso ma che ora verrà espresso. Es do quello in cui nella tesa, invece de,Lele

antenne, avrà le zampe.

Lavoro in cui si mostra come il comportamento di corteggiamento della Drosophyla sia molto alterato a causa

di over-espressione del gene white.

Usando uno promotore Heatshock over-esprimono il gene white e vedono un alterazione del corteggiamento.

COrteggiamento:

• fase di orientamento

• Fase di tapping: il maschio ha un organo olfattivo sul primo paio di zampe, con cui riconsoce i ferormone

per riconoscere la femmina e di che specie è.

• Vibrazione delle ali: quando c'è il riconoscimento della femmina, una delle due ali viene estese e si ha una

vibrazione che viene definito come un canto specie specifico. Se il canto piace, ha luogo l'accoppiamento.

La femmina è più grande del maschio, e il lato dorsale è chiaro e segmentato ( mentre nel maschio quella finale

è tutto fuso e scuro ). Il maschio ha l'organo copulatore nella porzione anale.

Si sottopongono i moscerini transgenici a uno shock al calore e si ha un'overespressione ubiquitaria del gene

white. E si assiste a un comportamento homo-like. Gli autori ritengono, che l'espressione ubiquitaria del gene

white, poichè white fa parte di un sistema di permeasi , ciò provochi ai neuroni che sintetizzano serotinana un

abbassamento di triptofano e guanina. Portando a questa alterazione del comportamento. In effetti se si elimina

il triptofano si manifesta un comportamento omosessuale correlabile a una diminuzione della serotonina.

Guadagno di funzione: mutazioni antimorfiche o mutazioni dominanti negative

E' una mutazione generalmente dominante, è una mutazione per effetto della quale il prodotto del gene mutato

antagonizza con il gene selvatico ( quindi la sua espressione blocca quella di un altro ).

Abbiamo situazione:

• wt: il gene viene espresso

• Eterozigote: il gene mutato produce un prodotto che blocca il prodotto del gene wt

• Omozigote mutato

• Se si aumenta le dosi del gene selvatico, sui ha un miglioramento del fenotipo

• Molte mutazioni antimorfiche dipendono dalla presenza dell'allele wt per il fenotipo mutante

Abbiamo due cromosomi, ognuno con l'allele wt, entrambi i prodotti si uniscono a formare dei Dimeri attivi.

Allo stesso modo, se abbiamo un cromosoma con l'allele mutato è uno con il wt. QUando il wt è prodotto,

questo si lega al mutato e forma un dimero inattivato. QUindi basta aumentare la quantità di wt per avere

maggiore dimero attivo.

Esempio di mutazione dominante negativa, in cui quando si uniscono l'allele wt è quello mutato, si forma una

proteina che manca del dominio chinasi o di trans attivazione.

Tutte queste classe di mutazioni possono essere fatte attraverso mutagenesi ( produzione di transgeni ):

• aumento del numero di copie di wt o mutanti di quasi qualsiasi cosa

• Complementare mutazioni loss of fuctions

• Generare condizioni ipermorfo che per avere un over espressione del gene di interessa

• Generare una mutazione dominante negative e opterei un organismo transgenico che

Mutazione antimorfa in cui oltre ad avere l'allele possiamo avere un transgene che codifica per la proteina

dominante negativa e avere lo stesso effetto. QUi usiamo un transgene in cui abbiamo i due alleli wt + quello

DN. Mentre prima aveva un eterozigote wt+mutante DN.

Mutazioni del tipo perdita di funzione:

Sono generalmente recessive, ma possono esser dominante quando colpiscono un allele aploinsufficiente

( ossia un locus per effetto del quale, la funzione del tipo selvatico è assicurato dalla presenza di entrambi gli

alleli. Se uno dei due alleli non c'è, non si riesce ad assicurare la produzione di prodotto wt ). Quindi vediamo

che in questo caso l'eterozigote che ha allele wt+ mutato, avrà un'insufficiente produzione di prodotto genico e

quindi si ha un fenotipo che è mutato). QUindi facendo il test si vede che in ordine di gravità:

• eterozigote

• Omozigote

• Eterozigote con deficienza

• Omozigote con deficienza

Tilling (Targeting-Induced Local Lesions In genomes)

questa è una metodica molto utile perchè inizia come un sondaggio di genetica classica e poi attraverso

metodiche di biologia molecolare si giunge a geni di interesse. Si mutageniizza prima il genoma, poi osiamo

andare ad analizzare solo il genoma di nostro di interesse.

In queste metodiche di utilizza ( EMS o ENU ) per generare delle mutazioni puntiformi, poi si fa una PCR per

amplificare solo il gene interesse. Una volta fatto, si fa una manipolazione per porter identificare là mutazioni

puntiforme ( Cel-1). E' una endonucleasi che riesce a

riconoscere un singolo mismatch ed è in grado di tagliare

il legame all'interno di un singolo filamento ( al 3' del

disappaiamento). E quindi taglia il sono lago filamento e

poi dopo si fa una elettroforesi che ci consente di

identificare la mutazione nel nostro gene di interesse. Si

usa un maschio proveniente da un ceppo isogonico, non ci

interessa isolare eventuali polimorfismi che sono presenti

naturalmente. Quindi si parte da un ceppo isogonico, per

tutto il genoma o almeno per il cromosoma in cui è

localizzato il gene che ci interessa osservare. Questo si

ottiene attraverso successive generazioni di incrocio. Al

fine di avere un omozigosi per quasi tutti gli alleli

( potrebbe aversi omozigosi per mutazioni dannose:

svantaggio ). Quindi il maschio sottoposto a mutagenesi viene incrociato con una femmina avente il

bilanciatore. Nella F2 andiamo a incrociare fratello e sorella. Questo crea uno stock stock che si manterrà tale

( perchè quando si trovano insieme bilanciatore A e A l'omozigote muore). QUindi posso mantenere solo

eterozigoti o omozigoti per la mutazione.

Quello che si fa ora è incrociare un maschio con cromosoma mutageniizzato e bilanciatore viene incrociato

con una femmina isogenica . Così da avere un individuo con un cromosoma mutageniizzato e uno isogenica.

Così da essere sicuro che i polimorfismi sono indotti dalla MIA mutagenizzazione e non perchè c erano

polimorfismi sul bilanciatore ( per esempi ). Ora devo identificare le mutazioni di interesse. Quello che faccia è

: estrazione di DNA, e avrò due differenti molecole di DNA e avrò avuto da una transizione per cui da una

coppia G-C ( isogenica )ho una transizione A-T ( mutageniizzato ) .

A questo punto faccio una PCR con primer specifici. A

questo punto devo creare il mismatch , per poter sfruttare

la CEL-1. QUindi sottopongo il DNA a un ciclo di

denaturazione, rinaturazione , in questo modo avrò la

rinaturazione delle molecole di DNA e quindi quello che

succede è che in questa provetta avrò due molecole

diverse che differiscono per singole paia di basi. QUindi

si possono formare 4 differenti molecole: Quella mutante,

quella di tipo selvatica, oppure 2 eteroduplex con i

disappaiamenti ( che sono più corti perchè è un mismatch

)

A questo punto faccio una digestione con Cel1 e posso

fare una SDS-Page e ho 4 molecolare. Ma come le posso

distinguere? Faccio una PCR che usa Primer con un fluoroforo che marca al 5' e 3'. Naturalmente colori

diversi. Facendo una SDS e misurando poi la fluorescenza, quello che vedo è che potrò riconoscere il genoma

che porta una singola mutazione nel gene di interesse.

Si utilizza una nested PCR reaction:

• si usa una prima PCR con primers ( outer ) esterni alla mia regione di interesse e ottengono una primo

applicone

• Faccio una seconda PCR con primer ( inner ) un più vicini alla regione di mio interesse con sequenze

universali che si ritrovano dei plasmidi.

• Il secondo pali con e viene applicato una terza volta con primers universali coniugati con fluorofori.

Quindi:

• incrocio

• Si isola il DNA

• Nested PCR

• Si causa la formazione di Mismatch

• Digestione con Cel1

• Si carica tutto su SDS, dove se si vedono due bande più leggere, scorrispondo alle due mutazioni ottenute

• Altri step ( vedi Slides sbobinture )

Nel lavoro sono studiati i geni Sarà, Alp23B e Arf6.

Gel Sara4, e si vedono due mutazioni diverse ( su quello analizzato a 700 nm ( primo fluoroforo ) e in quello a

800 nm ( corrisponde al secondo fluoroforo ).

Elementi trasponibili:

Hanno pari importanza nello studio della funzione genica, assieme agli esperimenti di mutagenesi. Questi

approcci hanno fornito degli strumenti molto potenti per comprendere le fasi dello sviluppo in Drosophyla.

Un elemento trasponibile è essenzialmente un segmento di DNA in grado di escindersi dalla localizzazione

genomica per andare a integrarsi in un'altra. Ci sono quelli che si muovono mediante intermedio a DNA e

quelli mediante intermedio di RNA. Quello a intermedio a DNA che codifica esso stesso per una funzione

enzimatica per escidersi. Possono anche richiedere ,però , una DNA polimerasi o girarsi .

I retro Trasposoni invece, fanno che il DNA possa replicare altre copie di RNA.

Sono state scoperti da Barbara McClintock, essi sono in grado di escindersi da una località genomica e inserirsi

in posizione più o meno casuali, sono dei mutageni inserzionati. Da un altro canto, quello che può avvenire, ed

è quello che può essere sfruttato. Oltre alla trasposizione normale, può dare anche dei riarrangiamenti genomici

nelle regioni dalle quali si escisso: come elezioni, inversioni ( escissione imprecisa, invece di lasciare la

regione invariata come la maggior parte delle volte ). Trasposoni vicini possono anche ricombinare. Gli

elementi trasponibili possono essere trasmessi alla progenie, se le mutazioni che inducono sono vantaggiose

Circa 100 anni fa, a causa di un flusso genetico orizzontale ( acari ), vi è stato l'invasione di elementi P nei

ceppi di Drosophyla presenti nell'ambiente. Si è accorti di questi, perchè i ceppi di Drosophyla in laboratorio

sono tenuti in isolamento, e quindi immuni a questa invasione di elementi P. Quando si sono fatti degli incroci

tra progenie ambientale e progenie di laboratorio si aveva la disgenenesi degli ibridi ( maschi dall'ambiente e

femmine di laboratorio ) si manifestava una progenie F1 con una sindrome D tratti genetici corbellati :

sterelità, elevata frequenza di ricombinazione, ricombinazione in Drosophyla che normalmente non avviene,

insorgenza di mutazioni e riarrangiamenti cromosomico. Si è compreso che la progenie F1 ottenuta, si ha il

movimento incontrollato di questi elementi P, perchè non c'è nessun repressore che ne controlli il movimento.

Si è identificato alla fine questo elemento P.

Organizzazione dell'elemento P:

• ha due caratteristiche : ha un elemento cis agente ( rappresentato dalle ali delle'lemento P, che sono necessari

all'escissione ) e sono caratterizzati dalla presenza di ripetizioni invertiti, di 31 pb Che fiancheggiano i siti di

Binding della trasposasi. Il 5' ala ha anche il promotore dell'elemento P. All'interno, c'è una ripetizione

subterminali di 11 pb al 5' e 3' . Rappresenta il sito di Binding per la trasposasi. La trasposasi viene espressa

solo nella linea germinale, questo grazie a un evento di splicing tessuto specifico. Nella linea germinale c'è

un repressore, che serve a regolare la bobilità dell'elemento P. Abbiamo poi 4 esoni, 0 s 3. Separati da 3

introni. Quello che separata l'esone 2 e 3 viene eliminato solo nella linea germinale, in quella somatica non

viene eliminato. Nella linea somatica quindi avviene solo l'espressione della proteina repressice ( 66kd ).

invece della linea germinale, c'è lo splicing tra 2 e 3 e così ha luogo la sintesi della trasposasi. Che è lunga

87 kd. Si è evidenziato, con studi successivi, la presenza di elementi P incompleti e si è studiato la loro

capacità di muoversi. Quelli incompleti più utili. Portano delezioni per le regioni della trasposasi, quindi

questi elementi P erano non autonomi. Se però nel genoma era presente anche un elemento P completo,

questi potevano tornare a muoversi. QUindi se le ali ci sono, basta che ci sia la trasposasi ( funzione trans )

per potersi muovere. L'elemento P quando si inserisce, crea una duplicazione diretta della sequenza in cui si

è inserito. L'elemento P si muove secondo un meccanismo di tipo taglia e cuci, non è un meccanimso di tipo

replicativa ( vedi russel genetica ). Ora sappiamo che ci vogliono almeno 138 pb , mentre al 5' per avere il

movimento. La trasposasi fa un taglio , ai due lati, facendo in modo di fare delle unità sporgenti. L'elemento

P si excide, e a questo punto il sito da cui si escide subisce una riparazione. QUello che succede è che la

rottura del doppio filamento permette l'attivazione dei sistemi di riparo. Nel caso in cui si ha l'excissione,

interviene una esonucleasi che elimina le unità sporgenti e allarga l'intervallo. Ha luogo il riparo mediante

sistemi di riparazione omologa. Ora se sull'altro filamento c'è un elemento P, questo elemento P viene

ricopiato e si riparte da capo. Però se il P non si è escisso del tutto, si potrebbe avere una mutazione in

seguito alla riparazione una situazione diversa dal wt. In condizione di eterozigosi invece ( un cromosoma

non ha elemento P ), in questo caso se tutto va bene si ha ripristino della sequenza selvatica ( escissione

precisa ). Se durante la riparazione , c'è un'interruzione, potrebbe esserci una delezione nelle sequenze che

fiancheggiavano la regione di escissione. Oppure successivamente all'escissione, avviene una riparazione

mediante NHEJ, non homologus ending joining, e resta così una sorta di impronta dell'elemento P ( restano

alcuni appaiamenti di basi dell'elemento P che si escisso . Quindi si induce questa escissione imprecisa per

potere avere la delezione di sequenze fiancheggianti. Questo gap può essere riparato , anche uno stampo

inserito in un'altra regione del genoma.

In effetti potremmo ottenere un sistema binario fatto da trasposasi e l'elemento fiancheggiante. Possiamo

pensare così di ottenere, separando cis e trans, per mettere appunto un sistema che ci faccia muore l'elemento P

in maniera controllata nel genoma per avere delle mutazioni stabili. Potremmo anche, conoscendo questi due

elementi, fare un sistema per trasferire al genoma un segmento di nostro interesse. Dando origine fosì a

elementi transgenici.

Quindi si fa un costrutto in cui ho due ali che finacheggiano un elemento di DNA che voglio trasferire al

genoma e ci serve anche un marcatore, poi serve anche un Plasmide che codifichi per la trasposasi ( plasmide

helper ). Quindi facendo entrare dentro una cellula questi due plasmidi, l'attività trasposasica fa muovere il

plasmide nel genoma? Ovviamente ci interessa una trasposizione che interessi la linea germinale, perchè voglio

poter analizzare la porogenie. Hanno fatto questo esperimento in fasi molto precoci di Drosophyla, quando le

linee germinali ancora non si sono formate. Gli sperimentatori hanno usato prima un elemento P integrale , per

poi provarne uno che aveva solo le ali e e le sequenze di interesse. Non è possibile fare una mutagenesi sito

specifica con questo sistema.

Il primo lavoro era dimostrare quali fossero gli elementi trans e quelli cis necessari.

Subito dopo la fecondazione, il nucleo dello zigote va incontro a divisione nucleari, che non sono

accompagnate da divisioni citoplasmatiche. QUindi dopo 13 divisioni nucleari si ha un sincizio ( vedi libro ).

Le prime 7 divisioni sono sincrone, e portano a un'organizzazione di nuclei nella regione centrale

dell'embrione. La linea germinale viene determinata molto precocemente nello sviluppo. Dall'8 alla 10, i nuclei

si cominciano a spostare verso la periferia e 8 nuclei migrano della regione posteriore dell'embrione, lì dove

sono posti dei determinati che porteranno all'acquisizione dei nuclei polari che sono i precursori della linea

germinale. I nuclei polari sono anche i primi ad andare incontro a cellularizzazione mentre gli altri sono ancora

sinciziali. Dopo il nono ciclo, il blastoderma sinciziali va in conto a 4 divisioni e al 14 ciclo si forma il

blastoderma cellulare ( non c'è più l sincizio , con tutte le cellule col proprio nucleo posti alla periferia ).

Quindi come viene fatto? Si usa un microscopio a luce rovesciata con micromanippolatore e poi un sistema che

serve a iniettare i trasposoni miscelati assieme. Iniezione nell'ordine di picolitri. QUindi l'iniziezione avviene

nella porzione posteriore, lì dove sono i nuclei polari. Attraverso l'uso di ipoclorito di sodio si può eliminare il

guscio dell'embrione e si allineano sul vetrino così da avere il polo posteriore da un lato. L'infezione va fatta

prima che le cellule polari si formino. Quindi prima della inezione vengono leggermente disidratati, altrimenti l

immissione di un volume, anche se piccolo, può portare dei problemi. Quando l'ago è ritratto si può avere la

perdita di citoplasma che causa la morte di alcuni embrioni.

L'iniezione è in rapporto 4/3:1. Il vettore deve contenere anche un marcatore, così da poter selezionare quelli

col plasmide dentro. Un marcatore usato è quello del tipo selvatico white, quindi questo evento la dobbiamo

fare in un ceppo white- ( che normalmente darebbe una progenie bianca ). Quindi se otteniamo inserzione,

potremo riconoscere il trasformante è perchè ha l'occhio rosso. La trasposasi promuove l'excissione e

promuove la successiva integrazione genomica ( che noi non possiamo prevedere ). Questo evento di

escissione e inserzione, può avvenire nei nuclei dei precursori delle cellule germinali, ma anche in quello dei

nuclei somatici, Per cui si fa compiere lo sviluppo a questi embrioni . Gli organismi che adulti che abbiamo è

una chimera, non sappiamo se l'elemento P sia inserito in linea germinale o somatica o entrambi. Quello che

può succedere è che dalla schiusa possono nascere dei moscerini com l'occhio rosso , ma non è certo che

l'elemento si sia inserito nella linea germinale, potrebbe averlo fatto anche in quella somatica. Come isoliamo?

Incrociando ogni singolo moscerino con il ceppo di partenza white, si fa un reincrocio. Se si manifesta il rosso,

allora abbiamo identificato il trasformante, però potrebbero avere tutti un'inserzione in posizioni diverse. Poi

prendiamo ognuno di questi è né facciamo delle linee , isolando così ciascun mutando inserzionale.

Poi bisogna fare un lavoro per comprendere quanti elementi P ci sono e dove sono localizzati ( ad esempio una

ibridazione in sito sui cromosomi politenici , oppure un southern Blot ). TRa i marcatori potremmo usare o

quelli per lo screening visuale ( colore occhi: white,Rosy e rough, oppure per il corpo: giallo ), ognuno di

questi per il back cross necessita poi della corrispondente linea mutante.

Proteine fluorescenti: magari che si possono esprimere nell'occhio come 3xP3(promotore)-EGFP

Oppure meccanismi di selezione degli elementi trasformati:

• HS-neo(heatshock): codifica per una neomicina phospotransferasi ( può inattivare la neomicina il G418 che

è un antibiotico eucariotico). I trasformanti sono sottoposti a trattamenti heatshock ( per esprimere il gene )

su terreno con G418

• HS-opd: stesso , reistenza a paraxon

• AdH: enzima coinvolto nel catabolismo dell'etanolo. Richiede il corrispondente ceppo mutante

TRansgne molto utilizzato è il : mini-white : è essenzialmente fatto dalle sequenze codificanti del gene white.

Ma non viene espresso agli stessi livelli del gene white. Assicura l'espressione ma a livelli non molto elevati.

Perchè è utile? Conferisce un colore giallo chiaro, a secondo del numero copie, presenti nel genoma,e a

seconda della localizzazione posso osservare una gradazione diversa dell'occhio. Per esempio se è molto rosso

l'occhio, ci sono più copie dell'elemento P inserito, se invece è molto chiaro c'è solo un elemento P oppure è

localizzato in una regione sfavorevole. Quindi è molto sensibile all'effetto di posizione.

Come è possibile , attraverso lo stesso sistema, ottenere mutagenesi. I due ricercatori coinvolti sono Cooley e

Spradling, che hanno messo appunto un sistema per fare mutagenesi inserzionale.

Quindi usano un vettore con le due ali e al centro l'elemento P ( che è detto mutatore e manca della trasposasi )

e poi mettono un vettore contenente l'elemento P con una sola ala al 5' ( quindi non può muoversi ) ma

codificai a per la trasposasi ( è chiamato Jumpstarter ). Una volta indotta la mutazione, vogliamo che quella

mutazione sia stabile per poter studiare il gene ( sequenziarlo, identificarlo ): possiamo farlo attraverso la

segregazione in modo che ci sia l'elemento P mutatore ma che non vi sia il Jumpstarter ( così che la mutazione

permanga inalterata, se ci fosse il JUmp continuerei a indurre mutazioni incontrollate ).

COme si procede?

QUindi incrociamo l'individuo white- , che ha

l'elemento P mutatore per white + ( quindi ha

occhi rossi ) con un individuo che ha l'elemento

P Jumpstarter, questo è individuabile grazie a un

marcatore dominante.

Nella F1, selezioneremo potererà entrambi gli

elementi. Si utilizzano i maschi, questo perchè

la trasposizione dell'elemento P avviene con

maggiore efficienza. E questi maschi sono

eterozigoti per l'elemento P mutatore ( non c'è

bisogno di bilanciatore perchè la

ricombinazione non avviene ) e sull'altro

cromosoma ce'è la trasposasi, QUindi prendo i

maschi, con occhi rossi ( e quindi White+ ) e

che abbiano il marker dominante ( segno che ci

sia il Jumpstarter ). A questo punto prendo il Sb ( stubble ), Marker dominante per le ali del torace

maschio e lo incrocio con più femmine TM6, Tb è il bilanciatore

possibili. Le incrocio con femmine con occhio

bianco e che abbiano il bilanciatore. Nella progenie F2 voglio solo individui che abbiano l'occhio rosso, che

non abbiano il marker ( senza Jumpstarter ) e con il bilanciatore ( questo mi serve a stabilizzare la mutazione,

così che se si ha ricombinazione, l'omozigote per i Bilanciatori muore e quindi avrò solo la mutazione o

omozigote o eterozigote, ma in ogni caso l'avrò ).

Quando prendiamo individui maschi, con l'occhio rosso nella progenie F2, poichè la X è portata dalla femmina

( omozigote white- ), siamo sicuri che c'è stata una nuova inserzione dell'elemento P white+ su uno dei 4

cromosomi. Invece se andiamo a prendere un rosso femmina, non sappiamo se c'è una inserzione sull'X ( nel

caso si sia ereditato l'X white + dal padre ) o su un altro cromosoma.

Possiamo avere dei maschi white- con l'elemento P

sul secondo cromosoma e con un bilanciatore ( Cy )

e lo incrociamo con una femmina white-, elemento

Jumper con marcatore. Poi incrociamo la F1 con un

omozigote per white meno e di questo prenderemo

solo quelli con occhi rossi, prenderemo quelli senza

Jumpstarter ( senza Sb ) e quello senza Cy ( così da

essere sicuri che ci siano stati nuovi eventi di

inserzione ).

Questa strategia ci permette di eliminare gli

individui in cui l'elemento P non si sia mosso.

La mutagenesi chimica permette di alterare la

funzione di un gene da molti punti di vista. Però poi

è complicato , nel genoma, andare a identificare la

specifica al'terazione di uno specifico gene. Quando

usiamo un elemento P, possiamo immaginare che vada a inserirsi dentro introne, determinando uno trascritto in

completo, o un trascritto che ha uno stop codon anomalo, oppure può inserirsi nel promotore, o nel 5'. Ci

aspettiamo che quell'eleemtno P sia in grado di inserirsi fu quello nel genoma, ma quello che ha dimostrato

Spradling dice che non è così. Ha caratterizzato i siti di inserzione dell'elemento P in un gene ipotetico.

Analizza 56 eventi inserzione differenti dell'elemento P. Quindi l'elemento P non è un mutageno casuale,

eprchè va a inserirsi preferibilmente nella regione 5', L'eleemento P può creare delle mutazioni ipomorfe, in

seguito all'identificazione della caratteristica di questa caratteristica , si è sviluppata l'idea dell' Enhancer

Trapping. Se si considera che gli elementi P tendono a integrarsi al 5', se io faccio un elemento P con ali al 5' e

3' con un promotore minimo e un reporter , in modo che l'espressione del gene reporter, che è minima o

assente, se cade sotto elementi genomic regolatrici verrà espresso di più!In un colpo solo dovrei avere una

mutazione ipomorfe del gene di interesse. Vedo in quali tessuti il gene è espresso.

• ottengo mutazione ipomorfo

• So dove espresso quel gene

• Mi consente di clonare rapidamente il gene

Struttura dell' enhancer trapper

• ali al 5'-3'

• Gene reporter LacZ , la beta galattosidasi prodotta ha un segnale di localizzazione nucleare

• Come segnale ha usato il primo è il secondo esone che codifica per la trasposasi ( quest ' ultima viene

espressa nel nucleo e quindi se ci si fonde la galattosidasi con questa, è ovvio che vada nel nucleo )

• L'ala al 5' contiene il promotore dell'elemento P, e viene sfruttato come promotore devole per LacZ

• Poi c'è una poly-A tail dell'Hsp90

• Come marker è stato scelto Rosy

All'interno della larva ci sono dei " sacchetti di cellule " detti dischi marginali, sono varie coppie, che al loro

interno contengono delle cellule che hanno acquisito un destino e si sviluppano nel momento in cui avviene la

metamorfosi.

Disco : otto anctienna, ali, zampe, altere, bocca e genitali.

Una volta ottenuta l'inserzione di EZ e aver ottenuto il profilo di espressione. Bisogna clonare il gene ( quello

per cui l'enhancer da espressione ) fiancheggiante. Quindi vicino alla coda di poli A è presente un sito di taglio

XBaI che taglia una solo volta all'interno dell'elemento P è una resistenza alla canomicina

• Quindi si estrae il DNA

• si digerisce con XbaI

• Si circolarizzano i frammenti in presenza di DNA ligasi ( in condizioni estremamente diluite, è più facile che

i frammenti si richiudano su se stessi piuttosto che si appaino con altri frammenti tagliati sempre allo stesso

modo

• possiamo trasformare le cellule e selezionare per

kanamicina E si fa PCR

• Se il frammento che si ottiene è troppo piccolo, si

fa una Iverse PCR. Si fa la digestione di PCR, si

circolarizza con Ligasi e si fa una reazione di

PCR in cui si usano degli oligo usando primer che

si appaiano alle due ali e che contengono al loro

interno la sequenza di interesse

Una variante è l'elemento P(LacW)

Qui la differenza è che il marker è white+,presenza l'ampicillina e un'origine di replicazione

Enhancer Trap:

• ottengo mutazione ipomorfo

• So dove espresso quel gene

• Mi consente di clonare rapidamente il gene

Vantaggi:

• elemento P viene integrato al 5', vicino a una regione regolatoria

• Può alterare l'espressione del gene

• Permette l'isola ione di mutanti espressi in particolare archi di tempo e spazio

Svantaggi:

• la distruzione del gene non è frequente

• Vedi sbobine

Gene Trap or protein Trao

Lo scopo è quello di selezionare eventi nei quali l'elemento P si vada a inserire nelle regioni introni che, è la

successiva traduzione della proteina che si ottiene contiene una proteina di fusione con l'elemento OP.

Quindi se io prendo un elemento P che porta un gene reporter, e basta , senza sequenza di inizio traduzione, ma

con sito accettore e donatore di splicing. Se si inserisce in una regione intronica e se avviene lo splicing ,

questo reporter può essere tradotto nella proteina e sarà fusa con la proteina che vi era vicina.

Lo svantaggio: la presenza delle sequenze

P, potrebbero mutare la funzione della proteina

Però possiamo analizzare in vivo l'espressione

Della nostra proteina. Solitamente quello che si

Ottiene è che la proteina ha la C e la N terminale

Separata dal gene reporter.

L'elemento P ( esone trasponibile ) deve inserirsi nel corretto orientamento. Sono stati usati tre elementi

differenti, che hanno differenti moduli di lettura della GFP ( per far sì che si abbia sempre l'espressione di

GFP ). Abbiamo l'elemento trasponibile P classico poi con ali e siti di splicing e la GFP. Sono usate tre diverse

GFP con tre diversi moduli di lettura.

Incrociano quindi il ceppo con l'elemento P con la femmina col JUmp-starter s, poi le F1 sono incrociate con

femmine white- e poi sono selezionate le F2 che abbiano l'espressione di GFP.

Vantaggi:

• analisi in vivo

• È sotto l'espressione di meccanismi endogeni e quindi riflettono la fisiologia del organismo

Svantaggi:

• sono eventi rari

• L'inserzione deve avvenire nell'interno

• L'inserzione deve avvenire nel giusto modulo di lettura

• L'inserzione deve avvenire nel gesto orientamento

• La proteina è chimerica, la funzionalità potrebbe essere alterata

Abbiamo detto che l'inserzione dell'elemento P, molto spesso, più che una mutazione nulla introduce una

mutazione ipomorfe. Bisogna vedere come si fa ad aumentare la frequenza di un'azione nulle.

Insulatori: lezione 18 Aprile

• sono delle regioni del DNA che legano specifiche componenti trans e grazie alla loro funzione sono i grado

di definire il dominio di attivazione genica. L'insulatore permette di definire il dove 'l'enhancer piuttosto che

che un altro. Quindi si potrebbe ingegnerizzate un elemento P per portare anche un insultatore per portare

una mutazione con completa perdita di funzione.

Che insultare si è utilizzato? Uno che deriva da un particolare elemento trasponibile detto Gipsy, che è un

classico retrotrasposone con due sequenze fiancheggianti LTR, che è in grado di alterare gemi anche a molto

lontani ( 80 che fai? a valle e a monte ) dalla sua regione. L'effetto dell'elemento Gipsy viene ottenuto anche

soltanto inserendo l'insulatore che lo comprende . Gipsy quindi contiene un insultatore detto Su(Hw). Mod è

una sequenza che aumenta l'effetto bloccante di Su(HW) , noi però non la forniamo perchè già naturalemente

presente nei tessuti f di interesse. Chiedi prof/sbobine.

Quindi abbiamo un elemento P con le ali, che continente il gene mini-white+ e yellow+ e questi elementi sono

dotati di due insultatori Su(Hw) e questi i simulatori circondando il gene mini white ( sensibile all'effetto di

posizione ).

Quando si trasferisce alla linea germinale questo elemento P e poi lo si mobilizza , si inserisce nella regione 5'

dei geni e grazie alle sequenze insulatrici riesce a inserire delle mutazioni completa perdita di funzione.

Facendo uno screening si vede che c'è un aumento di mutazione del tipo completa perdita di funzione, questa

proteina Su(Hw) essendo ubiquitinaria, è espressa in ogni luogo. Si è visto delle inserzioni anche delle

inserzioni in regioni eterocromatiche.

Approcci di Genetica inversa usando gli elementi P:

• si crea un mutante attraverso l'uso di elementi P che vengono stabilmente integrati nel gomma della

Drosophyla

• Questo approccio ci permette di fare uno studio molto fine della funzione genica

Uno dei pacchetti di controllo che si utilizza, per poter esprimere le cellule dove e quando si vuole, si uti,issano

i promotori delle proteine HSP70 e dotato di un 3'-UTR anch esso può essere HSP70. Una volta ottenuto il

costrutto si esegue la trasformazione della linea germinale e si fanno delle linee transgeniche in cui si fa in

modo di avere stabilmente quell'elemento P di interesse. Poi si procede al'analisi del fenotipo. Essenzialmente i

promotori HSP sono ubiquitari e rispondono molto bene ad alte temperature e quindi lo shock termico provoca

un attivazione della trascrizione molto molto efficace. È' un espressione inducibile, quindi sappiamo quando lo

vogliamo over esprimere ( durante lo stato larvale, embrionale ecc ). L'latro vantaggio è che io posso modulare

l'attività di questo promotore, quindi in base alla temperatura posso avere un livello di induzione variabile e

quindi avere espressione a elevatissimi livelli ( 30° ), medi oppure molto basse ( 18° ). ANche se a temperature

basse potrei avere lo svantaggio di avere comunque un'espressione superiore a quella voluta. Il trattamento al

calore può indurre la trascrizione del mio gene, ma anche degli altri geni endogeni sotto il controllo di HSP .

QUindi potrei avere delle fenocopie, ossia un fenotipo dovuto all'attivazione di altri geni a causa del calore,

piuttosto che del gene che sto studiando.

Esempio di plasmide ( pCaSpR-hs ):

• ala al 5'

• Mini white

• HSP70

• Sito di clonaggio multiplo

• 3' dell'HSP70

• Sequenze dell'ala 3'

Possiamo avere un'altra strategia che si basa su altri promotori , che siano stati già caratterizzati, specifiche

sequenze relative che controllano l'espressione negli Stati vitali o nei tessuti di nostro interesse. Il problema è

che esiste una limitata disponibilità di promotori già noti. Qui vediamo un pCasper vector ( senza hs- Heat

shock ). IUl vantaggio di questa tecnica è che uso un promotore specifico per quel tessuto e per quella fase

temporale, lo svantaggio è che non sono moltissimi i promotori caratterizzati completamente. L'altro

svantaggio è che magari l'espressione ad alti livelli o di forme mutate, può determinare letalità e quindi non si

può ottenere la linea transgenica ( quindi poi si usano altre strategie ).

Alcuni promotori sono:

• actina 5 C: è ubiquitario

• Tubulina : ubiquitinario

• ELAV: è un promotore molto usato perchè si esprime nei neuroni in periodo embrionale

• GMT: promotore che funziona nel disco dell'occhio

Il clone plasmidico di partenza abbiamo detto che è come quello vista prima senza hs. Ha la stessa

organizzazione, però dopo l'ala c'è la sequenza pUC8 che ci permette di ottenere grandi quantità del nostro

plasmide.

In un primo approccio facciamo l'espressione ubiquitinaria, poi proviamo un processo più specifico per vedere

in che tempo e spazio e viene espresso il gene e che è effetti ha. Abbiamo D detto inoltre che si potrebbe avere

letalità, e quindi non si può avere la linea transgenica. Ci sono delle tecniche che permette di avere

un'espressione controllata dei vari transgeni.

Il sistema N entrato per primo viene chiamato GAL4/UAS. Si bassa su questo attivatore trascrizionale, GAL4

si lega alle sequenze UAS, e il repressore che GAL80. GAL4 è coinvolto nel catabolismo del galattosio e alla

fine si ha la formazione di glucosio-1-fosfato. QUando là cellula di lievita è mantenuta in assenza di galattosio,

questi geni sono bloccati. Perchè? Gal4 è presente nella cellula, ma Bloccata nelle sue funzioni dalla proteina

repressice GAL80 e ne impredisce la funzione di attivatori trascrzionale. In presenza di galattosio, questo entra

nella cellula e in parallelo si ha la sintesi da parte di GAL3, un induttore che fa staccare la GAL80 e favorisce

l'espressione di GAL4. Questo è molto potent, perché è stato molto studiato permettendo di dimostrare che il

suo dominio di legame al DNA e il suo dominio di attivazione sono due unità separate, che grazie a un dominio

di dimerizzazione possono legarsi e fare un complesso completato. C0è ovviamente anche un dominio di

legame per GAL80. In assenza di galattosio, la GAL4 dimerizzazione ed è legata da GAL80, che si stacca se

c'è glucosio. Il dimero si lega alle sequenze UAS ( upstream activating sequences) ed è caratterizzata da 17 pb,

3 a destra e 3 a sinistra sono caratterizzati da sequenze ripetute che circondano 11 sequenze uniche con i

domini di legame per le dita di zinco da parte di GAL4.

C'è una variante in cui GAL4 è fuso al dominio di attivazione del VP16, che è uno degli attivatori più potenti

in natura.

Se nella cellula abbiamo l'espressione di GAL4 e abbiamo un transgene in cui il nostro gene è posto sotto il

controllo del gene UAS, saremo in grado di esprimere questo gene sotto il profilo i espressione di GAL4. Ci

permette di avere un unico transgene in cui il gene è sotto il controllo UAS e lo mettiamo assieme a proteine

GAL4 che sono espressi sotto differenti regioni regolativa.

In Drosopyla questo approccio è stato descritto da Brand e Perrimon, in cui è possibile dirigere l'espressione

dei geni. Si utilizzano due organismi transgeni:

• uno che porta un driver GAL4: GAL4 è sotto il controllo di uno specifico elemento regolativa ( hsp90, un

promotore noto , ma visto che in Drosophyla non ci sono sequenze UAS, GAL4 da solo non attività niente )

• Una linea responder che porta il gene di interesse sotto il controllo delle sequenze UAS, queste linee sono

stabili perchè il gene di interesse non può essere espresso , quindi anche in questo caso non danno nessun

problema.

A questo punto incrociamo le due linee, a questo punto nella progenie F1, nei tessuti e nelle fasi in cui viene

espresso GAL4 verrà espresso il nostro gene. QUindi è GAL4 che conferisce la specificità dell'espressione, o

meglio il promotore sotto cu è posto. In questo modo è difficile che io ottenga un organismo letale, perchè

finché non li metto insieme non esprimo il gene wt o mutato che sia , e quindi posso ottenere tutta la prole che

voglio finchè non li incrocio.

Ma come lo controllo GAL4? Posso porre GAL4 sotto un promotore noto e quindi fatto esprimere nel

momento che mi interessa e dove voglio. Anche qui GAL4 naturalmente ha le Ali ecc con mini-white come

marker fenotipo.

Un altro metodo per controllare, posso usare l'enhancer trapper. Abbiamo detto che con l'enhancer Trap , grazie

all'inserimento dell'elemento PZ, potevo andare a vedere dove c'era l'enhancer. Ci sono degli enhancer Trap in

cui invece di LACZ c'era GAL4, quindi ho un enorme disponibilità di profilo di espressione secondo cui far

esprimere un elemento responder da me selezionato.

Il vettore è pGAWB:

• ala 5'

• Promotore debole della trasposasi sotto cui si esprime gal4 ( qui non c'è bisogno della sequenza per il

nucleo, visto che ci va da solo)

• Terminatori dell'hsp70

• Gene white+

Quindi se si ha la vicinanza a un enhancer genomico, questo espirmierà GAL4 che a sua volta andrà a far

attivare il gene nell'elemento Responder con un espressione che varierà a seconda di quanto è forte la sequenza

enhancer che fa esprimere GAL4 e quindi ho un sacco di profili di espressione diverse! Elimino anche il

problema della temperatura e delle sue interferenze.

Come ottenere un elemento responder:

• pUAS:

◦ 3'P

◦ Sito di di restrizione

◦ UAS sito

◦ TATA box hsp70

◦ Sito di clonaggio multiplo

◦ Terminatore SV40

◦ BamH1

◦ White+

◦ 5'P

Si è visto però che funziona solo nella linea somatica piuttosto che linea germinale

Rorth ha realizzato un vettore pUASP che è in grado di esprimersi anche nella linea germinale.

Abbiamo :

• ala 5'

• Marcatore white+

• Siti di legame per le proteine GAGA, servono a contrastare l'effetto di poszione , le sequenze GAGA sono

localizzate vicino alle sequenze promotrici di molto ifenomeni e si pensa che il GAGA TF possa alterare la

struttura della cromatina favorendo la trascrizione ( ecco perchè contrata l'effetto di poszione )

• Ci sono promotori minimi della trasposasi , siti dell'inizio della trascrizione, sequenze che funziona nono

bene nella linea germinale.

• Sito di clonaggio multiplo

• SIto terminatori FS1K10

Quindi si incrocia un organismo GAL4 driver è un UAS responder che messi insieme danno una progenie F1

con entrambi gli elementi.

Usando poi l'enhancer trapper come strategia possiamo avere centinaia di linee driver gal4, usando pattern

spaziali e temporali di espressione, scelti dallo sperimentatore. Ovviamente l'uso di questo sistema binario , ci

permette di seguire lo sviluppo di specifiche cellule. Possiamo avere un gene letale , che però è inattivo finché

non ci metto il driver. Posso fare così esperimenti di " ablazione delle cellule " durante lo sviluppo. C'è un

incrocio tra UAS responder e GAL line. Gli individui che hanno entrambi gli elementi, posso analizzare il

diverso profilo di espressione a seconda della linea gal4 che si utilizza ( sotto quale promotore è controllato

gal4 ). Si può usare un UAS-GFP o un UAS-LacZ.

SI può mettere GAL4, anche qui, sotto un promotore che sia influenzato dalla temperatura., in modo da

regolare l'espressione da minima a quella massima possibile. Se il gene determina letalità a una determinata

fase della temperatura, basta abbassare la temperatura e non si avrà letalità in quella fase. L'altro approccio che

si può fare è il sistema Target che si avvale del repressore GAL80 che è in grado di reprimere GAL4. Lo sito

utilizza per poter controllare l'attività della proteina GAL4. Come faccio però a controllare GAL80, ne uso una

temperatura sensibile. Si parla di TARGET system , sistema in cui rispetto all'UAS entra un componente pià ,

ossia GAL80ts ( temperature sensitive ), sotto il controllo della tubulina a ( ubiquitaria ) a 18 gradi funziona

benissimo, quando esegue uno shift di temperatura , a 32 C°, avremo che GAL4 si sblocca e può funzionare da

attivatori.

Quindi abbiamo un sistema TERNARIO e non binario. QUindi abbiamo GAL4 sotto il controllo di un

promotore ( ugello che voliamo ) nello stesso genoma abbiamo il costrutto della GAL80ts.

Sistema ternario:

• espressione spaziale ( dipende dal profilo dell'enhancer Trapping )

• Espressione temporale ( a seconda della temperatura )

• Quantitativo: anche qui possiamo avere una espressione nulla, totale o media di GAL80. ANche qui è

possibile modulare.

Lezione 20 aprile

Sistema ormone inducibile: gene Switch

Sistema che si basa su un attivato re trascrizionale chimerico ,

• dominio di lega,e al DNA di GALF4

• dominio di legame a un Ligandoli del progesterone umano

• Dominio di attivazione trascrizionale p65, non altera la fisiologia di chi lo esprime

È' possibile attrae la p65

attraverso la

somministrazione del

Ligando ( RU486 )

atiprogestina lega il recettore

per il Ligando è attiva la

molecola gene Switch

Gene Switch promuoverà la

trascrizione

( vedi registrazione )

P Switch 1: è come

l'enhancer Trap, ma codifica

per la Gene Switch invece

che Gal4

P Swtich1: è presente anche

i segnale di localizzazione

nucleare

COme possiamo vedere qui

c'è un doppio controllo

temporale :

• tutto il costrutto da GAL4 a p65 è espresso in dipendenza dall'enhnacer vicino a cui lo inseriamo ( come il

GAL4/UAS

• Poi il costrutto , che contiene l'attivatore per UAS ( ossia p65 , che per legarsi ha necessità di GAL4 ) si

attiverà solo se metro RU486

Gene Switch

Facciamo esprimere Gene Switch secondo un preciso profilo spazio temporale , un altro livello di controllo è

dato da quando e quanto RU486 iniettiamo ottenendo diversi livelli espressione. Nello steso contesto è

presente il transgene con uAS+gene. QUesto è attivato quando Gene Switch produce il suo prodotto che può

attivare UAS. QUi è necessario riottenere una collezione nuova, rispetto all'uso di GAL4. Si è dimostrato che

questo sistema è molto efficace . Hanno usato due differenti linee: una che produce una proteina apoptotica

( UAS-hid responder), l'latro responder e sarà UAS ricina ( che determina la morte cellulare ). Hanno usato

questo costrutto per mirare al disco marginale che è sede della morfogenesi dll'occhio.

Il costrutto è GMR ( glass multimer reporter, sono sequenze riconosciute da un TF riconosciute dalle elle

dell'occhio detto Glass ) + Gene Switch. QUindi incrociano GMR+ Gene Switch con UAS-ricina o UAS-hid e

creano delle larve allo stadio L3 e le mettono insieme a RU486 e non ( controllo ) e le lasciano per un'ora. Poi

le mettono in un contenitore per farle crescere e poi vanno ad analizzare l'individuo adulto.

Uso di transgeni che codificano per segmenti ripetuti invertiti, che si usano per silenziare l'espressione di un

gene unico, l'uso di questa strategia è stata fatta eprch' l'inference può essere mediata anche da molecole di

RNA che abbiano una forma a forcina ( stem-loop ). In Drosophyla si vede che questo tipo di molecola riesce a

innescare il silenziamento genico. Si fa un costrutto engrailed-lacZ, quindi si avrà l'espressione di LacZ solo se

è espresso engrailed. Quello che lo sperimentatore fa in cui le sequenze UAS controllano il gene di interesse

c'è sono ripetute e in maniera invertita ( separate da uno spacer per evitare l'instabilità ) e lo si incrocia con un

GAL-4 driver e quindi la progenie F1 si ottiene l'espressione di questa molecola a RNA a forcina ( perchè nel

responder c'è un gene ripetuto e invertito ! )

Alcuni autori hanno dimostrato che se le due sequenze ripetute invertite,sono separate da un introne,

l'interferenza avviene in modo molto più efficiente. Attraverso due step sito ha:

• le due ali, sequenze UAS, hsp70 tatabox, un introne ( che separa i freni di interesse ) , il terminatori, e poi

anche un promotore seguito da EGFP. Insieme viene espresso il costrutto stem-loop e EGFP. Questo ci

permette osservare , l'individuo in cui avviene il silenziamento. Dove sta la fluorescenza, è lì che agisce il

dsRNA

L'addome è quasi completamente occupato da una coppia di ali.

Ovario: ricorda un carciofo, fatto tra 14-16 ovariolo. La camera ovarica di forma all'inizio dell'ovogenesi e va a

incontro a un processo di sviluppo, dove allo stadio 14 porta alla formazione di un uovo maturo che è dotato di

tutto il corretto corredo per essere fecondato e dare inizio allo sviluppo. L'ovariolo è un filo di perle lungo cui

sono impilate le diverse camere ovariche a stadio via via crescente. La camera ovarica fuoriesce dalla parte

detta germinario che va incontro a un processo di accrescimento nella zona detta vitellario, nello stato 14,

l'uovo passo in un ovidotto laterale, ovidotto comune e incontrerà la spermateca è il ricettacolo seminale e in

questo passaggio è fecondato.

Il germinario contiene le cellule staminali di

linea germinale e somatica ( tutti e due i

tipi ).

Per quanto riguarda le prime, ci sono due

cellule della linea germinale che si dividono

in maniera asimmetrica dando luogo a una

cellula staminale e a un cistoblasto. Quest

ultimo fa 4 divisioni asimmetrica formando

16 cellule collegate con un ponte , alla fine

solo 4 sono contenute da un ponte circolare

canale ad anello ( tutte e quattro sono

collegate ) e una di queste diventerà

ovocita , le altre 15 sono cellule nutrici.

La cisti di 16 cellule è incapsulata tra le

cellule che fanno parte della linea somatica (

abbiamo detto che sono presente anche. Le

stem cells della linea somatica ). QUindi nel

germanio abbiamo uno studio in cui c'è il cistoblasto, la regione due dove stanno le 16 cellule, e lo stadio 2b in

cui le cellule iniziano a essere circo andate dalla linea somatica. Poi abbiamo lo studio 3 in cui sono

completamente circondate. E poi si ha la camera ovarica, che Man mano si all'una e si accresce, in

contemporanea con l'ovocita ( che conterrà solo l'ovocita allo stadio 14 , le cellule nutrici saranno eliminate per

via apoptotica così anche come quelle follicolari). Quelle follicolari inizialemnte sono intorno all'oro cita

( come monostrato ) e poi migrano posteriormente. L'ovocita cresce grazie al fatto che ci siano cellule nutrici,

attraverso canali ad anello, poi tramite endocitosi prende anche le sostanze rilasciate dal vitello. Il trasporto

Si divide in :

• transporto lento, si osserva una sorta di rimescolamento ( stadio 9, l'ovocita occupa metà della camera

ovarica )

• Trasporto attico allo stadio 11, le cellule nutrici si svuotano nell'ovocita

Per quanto riguarda le cellule somatiche , corrispondono alle cellule follicolari!

Corrispondono a un epitelio cellulare, all'interno del quale, differenti meccanismi

Di segnalazione determina l'espressione di specifici geni e l'acquisizione di specifici destini

Nel germinario proliferano e circondano la cisti di cellule, durante l'ovogenesi vanno a lo

Localizzarsi intimo all'ovoita. Queste cellule sono in grado dio compiere delle sèecifiche mi

Grazioni,accoppiate all'acquisizione di uno specifico destino organizzativo. Le cellule

follicolari

Sono un modello anche per lo studio della metastatizzazione. Le cellule follicolari, quando

Circondano tutto , sono dette bordercells ( solo che quelle

Che migrano all'interno ) , allo stadio 9, alcune

Di queste cellule si distaccano e intrapre

Ndono una migrazione attraverso le cellule nutrici fino a raggiungere la parte posteriore

Dell'ovocita. i. Insieme a queste cellule che passano all'interno, anche le altre cellule follicolari si spostano in

contemporanea verso la zona posteriore ( fino allo stadio 10 ) ( come immagine sopra ). E poche follicolari

circondano le nutrici. Producono le proteine del vitello, e inoltre elaborano tutte le componenti che vanno a

costituire il guscio dell'uovo di Drosophila, questo guscio è molto complesso. Serve a consentire lo sviluppo

dell'embrione in un ambiente esterno, deve assicurare l'entrata dello spermatozoo, ha bisogno di ossigeno

( grazie a due appendici sul lato dorsale, con due steli è una parte terminali che consentono lo scambio di

ossigeno).

Ci sono 4 strati ( vedi registrazione )

La regione anteriore, è fatta da un corion sottile (opercolo ) )( che consente l'uscita della larva ).

Lezione 21

Ci sono delle cellule follicolari che circondano l'ovocita , che sono delle sotto popolazioni. Una parte dorsale

mediana che formerà l'opercolo, poi quelle dorsali bilaterali che formano le Appendici dorsali del corion,

E le cellule del follicolo ventrale che contribuiscono alla formazione del guscio.

La camera ovarica in sviluppo, già permette di far comprendere una sorta di polarità. In quanto l'ovocità è

sempre posto posteriormente. Poi invece dopo lo stadio 6, si posterà verso il lato dorsale.. Allo stesso modo

anche il guscio mostra una certa polarità.

Nell'utero c'è una spermateca e un ricettacolo, quando l'uovo allo stadio 14 passa di la, viene fecondato.

spermateca e un ricettacolo Rendono possibile la fertilizzazione di molte centinaia di uova, questi spermi

possono essere conservata in queste strutture fino a due settimana. Nella Spermateca ci sono delle cellule SSCs

( cellule secretorie delle spermateca ) che ci sono delle sostanze nutritive che riescono a mantenere vitali questi

spermi. Subito dopo l'accoppiamento aumenta la frequenza con cui la femmina rilascia le uova e c'è un minor

propensione della femmina a un successivo accoppiamento.

Abbiamo detto che il micropilo sull'uomo permette l'entrata dello spermatazoo. Quindi la membrana dello

spermatozoo si rompe ( PMBD ) e siccessiva attivazione dello spermatozoo ( con rimodellamento della

cromatina. L'attivazione dell'uovo e la fertilizzazione avvengono insieme.

Quando lo stadio 14 attraversa l'ovidotto, la meiosi finisce, avviene la fusione dei pro nuclei maschili e

femminili. Il processo di segmentazione di drosofila è caratterizzato dal fatto che i primi cicli di divisione

( 10 ) sono solo nucleari senza citodieresi e si ha un blastoderma sinciziale ( questo perchè non ci sono le fasi

G ). Le cellule subiscono un preciso profilo di migrazione. Inizialmente i nuclei si trovano nel primo terzo

dell'emperione, al quarto ciclo c'è un'espansione assiale, nell'ottavo c'è la migrazione verso il cortex. Nel nono

ciclo c'è la migrazione dei nuclei che daranno origine alle cellule polari ( sono anche le prime che acquistano

la membrana , nEl decimo ciclo) . FIno al ciclo 14 ci sono altre divisione, nell'intera se del ciclo 14 i forma il

blastoderma cellulare che è costituito da 6000 cellulare. Ciascun nucleo è circondato da una "isola

citoplasmatica" e si parlerà di energidi ( nucleo + isola citoplasmatica ).

Nel processo di celllularizzazin c'è un aumento notevole dellla grandezza

dei nuclei, si ha una lunghezza di 14 micrometri. Nell'embrione

sinciaziale, ciascun nucleo è circondato da Actina corticale e sopra la

membrana plasmatica dell'embrione. Questo complesso si approfonda

verso il centro dell'embrione, e si formano dei solchi ( con

contemporanea allungamento dell'embrione ), e l'actina si sposta da

corticale a basale

Il processo di cellularizzazione dipende fortemente dai microtubuli ,

infatti se se ne inibisce la polimerizzazione con Nacodazole , non ha

luogo tutto il processo di approfondammento dell'actina.

L'embrione di Drosophyla ha una metameria che sono apprezzabili dopo

10hr che daranno luogo alla testa , torace, e addome.( 8 segmenti ) rivedi

su libro Zanichelli.

Cuticola dotata di particolari strutture che consentono di riconoscere ciascun segmento, si può riconoscere la

testa dalla porzione terminale,e siamo in grado di riconoscere i segmenti toracici ( 3 )da quelli addominali ( 8)

Nell'adulto:

• t1 : porta il primo paio di zampe

• T2: porta il secondo paio di zampe e le ali

• T3: porta altere e terzo paia di zampa

Già nell'embrione a livello di blastoderma cellulare, è possibile attraverso tecniche genetiche, è possibile

stabilire una mappa con i vari destini cellulari. Così da poter vedere quali regioni avrebbero dato luogo alla

testa ecc. Dall'anteriore al posteriore. QUindi il patterning della Avrebbe a che fare con l'asse

anteroposteriore. quindi era importante sapere quali geni erano importanti per la segmentazione.

Due ricercatori: hanno investigato lo sviluppo dell'uovo di drosofila appena fecondato , un alto invece ha fatto

dei lavori riguardanti l'eredità di ciascun segmenti. Parla di geni omeotici: ossia geni altamente conservati.

Lavoro di Volhard e Wieshaus: studiano i geni che controllano le prime fasi dello sviluppo, quindi il patterning

dell'embrione segmentato. Si sono posti come obiettivo di cercare tutti i geni zigotici che sono capo volti nella

segmentazione. Fanno un saggio per saturazione, mediante mutagenesi chimica. Quindi estensiva mutagenesi e

analisi delle mutazione.

Un qualunque genere necessario per lo sviluppo embrionale, se mutato mi darà un'alterazione della

segmentazione che io posso osservare nella cuticola larvale. L'acron identifica la testa, mentre il telson

identifica la porzione posteriore. Si sono posti come obiettivo, quello di indentificare il maggior numero di

geni coinvolti nel patterning.

Controllo genetico dello sviluppo nei metazoi: avviene nelle fasi iniziali dello sviluppo, da quando si passa dal

controllo dello sviluppo da parte della madre a quello dello zigote. Una volte che l'uovo ha terminato lo

sviluppo è in quiescienza ( fermo in metafase ). Poi va in fase di attivazione ( indipendente dalla

ferilizzazione ): aumento del calcio, attivazione di segnali a cascati, riprende la meiosi, rimodellamento del pro

nucleo maschile , riarrangiamenti del citoscheletro. Parte così l'embriogenesi: rapide divisioni cellulari e

divisioni mitotiche. Queste fasi iniziali sono sotto il controllo del genoma materno, questo perhè jell'ovocito

sono conservati prodotti materni ( macromolecole , metaboliti, proteine , messaggeri ) Nelle primissime fasi

dello sviluppo avviene grazie ai prodotti materni. Ci sono fenomeni di modificazione post-trasczionali e meno

trascrizionali. Il genoma dello zigote è ancora inattivo, dopo delle divisioni mitotiche , si ha la transizione da

materno a zigote:

• gli mRNA materni vengono destinati a essere eliminati: da proteine materne stesse

• Attivazione del Genoma zigotici avviene in due successive ondate: attivazione più debole e attivazione più

forte.

◦ Vengono prodotti attivatori trascrizionali che aumentano la trascrizione dello ignote

◦ Proteine e miRNA aumentano l'efficienza della degradazione dell'mRNA

A seconda della specie, la transizione avviene in momenti diversi dello sviluppo. In Drosophyla, all'ottavo

ciclo inizia l'attivazione più debole, al 14 ciclo ( rivedi questa attivazione su libro Zanichelli ) avviene l'ondata

principale.

Quindi l'obiettivo era identificare i geni coinvolti nel patterning. QUando vado a mutagenizzare e a identificare

eventuali al'terazione del processo di sviluppo: posso avere mutazioni a effetto materno , mutazioni zigotici.

Abbiamo visto che ci sono geni che vengono immagazzinati nell'uovo ( materni ) quindi se mutati si ha effetto

materno, perchè non dipende dal genotipo dello zigote ma da quello della madre.

La femmina durante l'ovogenesi inserisce il gene A nell'uovo dopodicheè lo incrocio con il maschio e si acrà un

normale sviluppo. Se invece incrocio la madre con mutazione di quel gene, il gene non verrà inserito, e dopo

l'accoppiamento quello zigote mancherà di quel gene. Avrà un genotipo A/a. Nonostante sia eterozigote e

quindi fenotipo wt, poichè la madre era omozigote recessiva, allora osserverò comunque un effetto da fenotipo

"recessivo". E non sopravvive quindi Nè a/A nè a/a.

Per essere sicuri che la mutazione sia ad effetto materno incrocio maschio a/a con madre A/am ossrverò che sia

a/a che A/a è vitale! Questo perchè la madre di partenza era eterozigote e quindi fenotipo wt e quindi anche a/a

che avrebbe un fenotipo mutato, risulta vitale. CONTROLLO MATERNO.

Invece dopo lo shift, si ha che il fenotipo dell'opera zigote dipoenderà dal suo genotipo. Quindi in questo caso

incrociando due eterozigoti, mi porterà ad avere un a/a morto ( anche se la madre era eterozigote, perchè qui

non siamo sotto controllo materno ma dello zigote ), mentre l'eterozigote o l'omozigote wt sarà vivo.


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56

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PUBBLICATO

9 mesi fa


DETTAGLI
Corso di laurea: Corso di laurea magistrale in biologia molecolare e cellulare
SSD:
Università: Bologna - Unibo
A.A.: 2018-2019

I contenuti di questa pagina costituiscono rielaborazioni personali del Publisher antoniocarusillo93 di informazioni apprese con la frequenza delle lezioni di Genetica molecolare dello sviluppo e studio autonomo di eventuali libri di riferimento in preparazione dell'esame finale o della tesi. Non devono intendersi come materiale ufficiale dell'università Bologna - Unibo o del prof Cavaliere Valeria.

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