Genetica Molecolare dello sviluppo

P Jumpstarter, questo è individuabile grazie a un

marcatore dominante.

Nella F1, selezioneremo potererà entrambi gli

elementi. Si utilizzano i maschi, questo perchè

la trasposizione dell'elemento P avviene con

maggiore efficienza. E questi maschi sono

eterozigoti per l'elemento P mutatore ( non c'è

bisogno di bilanciatore perchè la

ricombinazione non avviene ) e sull'altro

cromosoma ce'è la trasposasi, QUindi prendo i

maschi, con occhi rossi ( e quindi White+ ) e

che abbiano il marker dominante ( segno che ci

sia il Jumpstarter ). A questo punto prendo il Sb ( stubble ), Marker dominante per le ali del torace

maschio e lo incrocio con più femmine TM6, Tb è il bilanciatore

possibili. Le incrocio con femmine con occhio

bianco e che abbiano il bilanciatore. Nella progenie F2 voglio solo individui che abbiano l'occhio rosso, che

non abbiano il marker ( senza Jumpstarter ) e con il bilanciatore ( questo mi serve a stabilizzare la mutazione,

così che se si ha ricombinazione, l'omozigote per i Bilanciatori muore e quindi avrò solo la mutazione o

omozigote o eterozigote, ma in ogni caso l'avrò ).

Quando prendiamo individui maschi, con l'occhio rosso nella progenie F2, poichè la X è portata dalla femmina

( omozigote white- ), siamo sicuri che c'è stata una nuova inserzione dell'elemento P white+ su uno dei 4

cromosomi. Invece se andiamo a prendere un rosso femmina, non sappiamo se c'è una inserzione sull'X ( nel

caso si sia ereditato l'X white + dal padre ) o su un altro cromosoma.

Possiamo avere dei maschi white- con l'elemento P

sul secondo cromosoma e con un bilanciatore ( Cy )

e lo incrociamo con una femmina white-, elemento

Jumper con marcatore. Poi incrociamo la F1 con un

omozigote per white meno e di questo prenderemo

solo quelli con occhi rossi, prenderemo quelli senza

Jumpstarter ( senza Sb ) e quello senza Cy ( così da

essere sicuri che ci siano stati nuovi eventi di

inserzione ).

Questa strategia ci permette di eliminare gli

individui in cui l'elemento P non si sia mosso.

La mutagenesi chimica permette di alterare la

funzione di un gene da molti punti di vista. Però poi

è complicato , nel genoma, andare a identificare la

specifica al'terazione di uno specifico gene. Quando

usiamo un elemento P, possiamo immaginare che vada a inserirsi dentro introne, determinando uno trascritto in

completo, o un trascritto che ha uno stop codon anomalo, oppure può inserirsi nel promotore, o nel 5'. Ci

aspettiamo che quell'eleemtno P sia in grado di inserirsi fu quello nel genoma, ma quello che ha dimostrato

Spradling dice che non è così. Ha caratterizzato i siti di inserzione dell'elemento P in un gene ipotetico.

Analizza 56 eventi inserzione differenti dell'elemento P. Quindi l'elemento P non è un mutageno casuale,

eprchè va a inserirsi preferibilmente nella regione 5', L'eleemento P può creare delle mutazioni ipomorfe, in

seguito all'identificazione della caratteristica di questa caratteristica , si è sviluppata l'idea dell' Enhancer

Trapping. Se si considera che gli elementi P tendono a integrarsi al 5', se io faccio un elemento P con ali al 5' e

3' con un promotore minimo e un reporter , in modo che l'espressione del gene reporter, che è minima o

assente, se cade sotto elementi genomic regolatrici verrà espresso di più!In un colpo solo dovrei avere una

mutazione ipomorfe del gene di interesse. Vedo in quali tessuti il gene è espresso.

• ottengo mutazione ipomorfo

• So dove espresso quel gene

• Mi consente di clonare rapidamente il gene

Struttura dell' enhancer trapper

• ali al 5'-3'

• Gene reporter LacZ , la beta galattosidasi prodotta ha un segnale di localizzazione nucleare

• Come segnale ha usato il primo è il secondo esone che codifica per la trasposasi ( quest ' ultima viene

espressa nel nucleo e quindi se ci si fonde la galattosidasi con questa, è ovvio che vada nel nucleo )

• L'ala al 5' contiene il promotore dell'elemento P, e viene sfruttato come promotore devole per LacZ

• Poi c'è una poly-A tail dell'Hsp90

• Come marker è stato scelto Rosy

All'interno della larva ci sono dei " sacchetti di cellule " detti dischi marginali, sono varie coppie, che al loro

interno contengono delle cellule che hanno acquisito un destino e si sviluppano nel momento in cui avviene la

metamorfosi.

Disco : otto anctienna, ali, zampe, altere, bocca e genitali.

Una volta ottenuta l'inserzione di EZ e aver ottenuto il profilo di espressione. Bisogna clonare il gene ( quello

per cui l'enhancer da espressione ) fiancheggiante. Quindi vicino alla coda di poli A è presente un sito di taglio

XBaI che taglia una solo volta all'interno dell'elemento P è una resistenza alla canomicina

• Quindi si estrae il DNA

• si digerisce con XbaI

• Si circolarizzano i frammenti in presenza di DNA ligasi ( in condizioni estremamente diluite, è più facile che

i frammenti si richiudano su se stessi piuttosto che si appaino con altri frammenti tagliati sempre allo stesso

modo

• possiamo trasformare le cellule e selezionare per

kanamicina E si fa PCR

• Se il frammento che si ottiene è troppo piccolo, si

fa una Iverse PCR. Si fa la digestione di PCR, si

circolarizza con Ligasi e si fa una reazione di

PCR in cui si usano degli oligo usando primer che

si appaiano alle due ali e che contengono al loro

interno la sequenza di interesse

Una variante è l'elemento P(LacW)

Qui la differenza è che il marker è white+,presenza l'ampicillina e un'origine di replicazione

Enhancer Trap:

• ottengo mutazione ipomorfo

• So dove espresso quel gene

• Mi consente di clonare rapidamente il gene

Vantaggi:

• elemento P viene integrato al 5', vicino a una regione regolatoria

• Può alterare l'espressione del gene

• Permette l'isola ione di mutanti espressi in particolare archi di tempo e spazio

Svantaggi:

• la distruzione del gene non è frequente

• Vedi sbobine

Gene Trap or protein Trao

Lo scopo è quello di selezionare eventi nei quali l'elemento P si vada a inserire nelle regioni introni che, è la

successiva traduzione della proteina che si ottiene contiene una proteina di fusione con l'elemento OP.

Quindi se io prendo un elemento P che porta un gene reporter, e basta , senza sequenza di inizio traduzione, ma

con sito accettore e donatore di splicing. Se si inserisce in una regione intronica e se avviene lo splicing ,

questo reporter può essere tradotto nella proteina e sarà fusa con la proteina che vi era vicina.

Lo svantaggio: la presenza delle sequenze

P, potrebbero mutare la funzione della proteina

Però possiamo analizzare in vivo l'espressione

Della nostra proteina. Solitamente quello che si

Ottiene è che la proteina ha la C e la N terminale

Separata dal gene reporter.

L'elemento P ( esone trasponibile ) deve inserirsi nel corretto orientamento. Sono stati usati tre elementi

differenti, che hanno differenti moduli di lettura della GFP ( per far sì che si abbia sempre l'espressione di

GFP ). Abbiamo l'elemento trasponibile P classico poi con ali e siti di splicing e la GFP. Sono usate tre diverse

GFP con tre diversi moduli di lettura.

Incrociano quindi il ceppo con l'elemento P con la femmina col JUmp-starter s, poi le F1 sono incrociate con

femmine white- e poi sono selezionate le F2 che abbiano l'espressione di GFP.

Vantaggi:

• analisi in vivo

• È sotto l'espressione di meccanismi endogeni e quindi riflettono la fisiologia del organismo

Svantaggi:

• sono eventi rari

• L'inserzione deve avvenire nell'interno

• L'inserzione deve avvenire nel giusto modulo di lettura

• L'inserzione deve avvenire nel gesto orientamento

• La proteina è chimerica, la funzionalità potrebbe essere alterata

Abbiamo detto che l'inserzione dell'elemento P, molto spesso, più che una mutazione nulla introduce una

mutazione ipomorfe. Bisogna vedere come si fa ad aumentare la frequenza di un'azione nulle.

Insulatori: lezione 18 Aprile

• sono delle regioni del DNA che legano specifiche componenti trans e grazie alla loro funzione sono i grado

di definire il dominio di attivazione genica. L'insulatore permette di definire il dove 'l'enhancer piuttosto che

che un altro. Quindi si potrebbe ingegnerizzate un elemento P per portare anche un insultatore per portare

una mutazione con completa perdita di funzione.

Che insultare si è utilizzato? Uno che deriva da un particolare elemento trasponibile detto Gipsy, che è un

classico retrotrasposone con due sequenze fiancheggianti LTR, che è in grado di alterare gemi anche a molto

lontani ( 80 che fai? a valle e a monte ) dalla sua regione. L'effetto dell'elemento Gipsy viene ottenuto anche

soltanto inserendo l'insulatore che lo comprende . Gipsy quindi contiene un insultatore detto Su(Hw). Mod è

una sequenza che aumenta l'effetto bloccante di Su(HW) , noi però non la forniamo perchè già naturalemente

presente nei tessuti f di interesse. Chiedi prof/sbobine.

Quindi abbiamo un elemento P con le ali, che continente il gene mini-white+ e yellow+ e questi elementi sono

dotati di due insultatori Su(Hw) e questi i simulatori circondando il gene mini white ( sensibile all'effetto di

posizione ).

Quando si trasferisce alla linea germinale questo elemento P e poi lo si mobilizza , si inserisce nella regione 5'

dei geni e grazie alle sequenze insulatrici riesce a inserire delle mutazioni completa perdita di funzione.

Facendo uno screening si vede che c'è un aumento di mutazione del tipo completa perdita di funzione, questa

proteina Su(Hw) essendo ubiquitinaria, è espressa in ogni luogo. Si è visto delle inserzioni anche delle

inserzioni in regioni eterocromatiche.

Approcci di Genetica inversa usando gli elementi P:

• si crea un mutante attraverso l'uso di elementi P che vengono stabilmente integrati nel gomma della

Drosophyla

• Questo approccio ci permette di fare uno studio molto fine della funzione genica

Uno dei pacchetti di controllo che si utilizza, per poter esprimere le cellule dove e quando si vuole, si uti,issano

i promotori delle proteine HSP70 e dotato di un 3'-UTR anch esso può essere HSP70. Una volta ottenuto il

costrutto si esegue la trasformazione della linea germinale e si fanno delle linee transgeniche in cui si fa in

modo di avere stabilmente quell'el