Genetica medica e biologia applicata - Appunti

SINDROME DI WOLF-HIRSCHHORN

Anomalia di struttura in cui manca un pezzo del braccio corto del cromosoma 4.

Caratteristiche fenotipiche: disabilità intellettiva, dismorfismi facciali, ritardo di crescita pre e post natale, ritardo nello sviluppo delle tappe psicomotorie, fronte molto alta, ipertelorismo, radice del naso allargata, orecchie displastiche o ad impianto basso.

Incidenza: rara 1/50000.

Analisi del cariotipo. È stata evidenziata con MICRODELEZIONI 36. La sindrome da microdelezione è causata dalla delezione di una piccolissima regione genomica al di sotto delle 5 megabasi. In genere le microdelezioni si chiamano anche criptiche delezioni perché sono nascoste, non si vedono con il cariotipo standard ma hanno bisogno di tecniche di citogenetica molecolare.

SINDROME DI WILLIAMS

La regione deleta è sul braccio lungo del cromosoma 7.

Dismorfismi principali: naso ha la punta bulbosa, bocca larga, guance piene, denti e mento piccoli, statura bassa, stenosi.

periferica delle arterie polmonari, stenosi aortica sopravalvolare,strabismo, occhi blu e pattern stellato dell'iride, radice del naso infossata, predisposizione alle carie perché lo smalto è debole, ritardo mentale con numerosi tratti autistici. Da piccoli molto timidi poi socievoli e chiacchieroni. Hanno una buona predisposizione ad imparare le lingue straniere e la musica, ed alcuni mostrano capacità musicali e ritmiche assolutamente eccezionali.

SINDROME DI PRADER-WILLI E SINDOME DI ANGELMAN: regione deleta sul braccio lungo del cromosoma 15.

SINDROME DI DIGEORGE: la regione deleta è sul braccio lungo del cromosoma 22.

TECNICHE DI CITOGENETICA MOLECOLARE

Ibridazione in situ fluorescente (FISH): si basa sulla capacità del DNA di denaturarsi e rinaturarsi conseguenze specifiche. Non viene estratto direttamente il DNA del paziente ma serve un vetrino con sopra i cromosomi. (L'ibridazione avviene con il DNA che è contenuto nei

cromosomi maprelievo di sangue periferico in eparinanon viene estratto direttamente). Si fa un e sipreparano i cromosomi del paziente.

Esempio: sindrome di Prader-Willi.paziente in cui si sospetta una C’è un cromosoma 15normale e uno in cui è deleta una regione. I vetrini contengono i cromosomi e bisogna capirese i due 15 sono normali o se un cromosoma 15 presenza un pezzo deleto. Per capirlo bisognaordinare un kit che permette di rendere fluorescente la regione genomica se è avvenuto illegame. due segnali-

• Se si osservano allora la sequenza ha trovato sequenze complementari sunonentrambi i cromosomi 15 (la bambina ha quella delezione);
• Se si vede solo un segnale fluorescente allora la sequenza utilizzata ha trovato la sequenzadeleto).complementare solo su un cromosoma (sull’altro quel pezzo èdenaturare

Si fa la doppia elica del DNA che è presente nei cromosomi della bambina (simette il vetrino in una soluzione a 70 gradi che fa separare le

eliche); si mettono gocce dioligonucleotidi complementari sul vetrino con le eliche separate, si copre il tutto, si mette ilrinaturazione;vetrino con le gocce coperte in una condizione di umidità che favorisce la lasequenza sul vetrino si muove e cerca la sequenza complementare. Al microscopio poi sicercano segnali su entrambi i 15 o solo su uno.

sindrome di DiGeorgeAnche nella si può usare questa tecnica perché ci sono caratteristichefenotipiche specifiche e conosco il cromosoma da controllare (in questo caso delezione sulcromosoma 22).

sindrome di WilliamsAnche nella da microdelezione sul braccio lungo del cromosoma 7 si puòelastinausare la FISH. Qui viene deleto il gene dell’ (come sindrome di Marfan), problemi alivello delle arterie e del cuore (le pareti delle arterie si espandono ma non riescono a tornarealla forma originale). I pazienti hanno una sola copia del gene dell’elastina perciò hanno dellefibre elastiche meno funzionanti e

Spesso hanno problemi cardiaci (soprattuto stenosisopravalvolare dell'aorta). Tutte le sindromi da microdelezione sono disordini genomici (le microdelezioni sono low copy repeat, fiancheggiate da regioni con piccole sequenze ripetute, che hanno un'altissima omologia di sequenza; sono loro a causare la microdelezione; la regione deleta è sempre la stessa per tutti i pazienti).

LOW COPY REPEATS: elementi genomici ripetuti di circa 200Kb in lunghezza con una forte omologia di sequenza. All'interno della regione 22q11.2 ci sono diversi set di LCRs.

gametogenesi Durante la il normale processo di ricombinazione omologa prevede l'appaiamento e la ricombinazione dei cromosomi omologhi paterni e materni. Poiché le LCRs hanno una forte omologia di sequenza, l'appaiamento inappropriato delle LCRs durante la ricombinazione (durante il crossing over alla prima divisione meiotica) dà origine a una delezione su un cromosoma ricombinante e a una

duplicazione sull'altro. Si otterrà un cromosoma con un piccolo pezzo in meno e un cromosoma con un piccolo pezzo in più. I pazienti che hanno il 15 microduplicato hanno un fenotipo più lieve. La delezione è sempre molto più grave di una duplicazione.

Array-CGH: Ibridazione Genomica Comparativa. Tecnica che permette di vedere riarrangiamenti criptici (delezioni o duplicazioni piccole) in tutto il genoma. Tecnica che viene anche definita cariotipo molecolare, cioè si può guardare cromosoma per cromosoma e vedere se ci sono piccole delezioni o duplicazioni in tutto il genoma. L'array è un vetrino/una piattaforma su cui la ditta ha messo dei pezzi genomici che sono rappresentativi di un genoma normale.

Si usa quando il fenotipo suggerisce una sindrome cromosomica, cioè quando si pensa ci possa essere una delezione, una duplicazione o un riarrangiamento più complesso.

Esempio: bambina con epilessia, ritardo mentale

non ben inquadrabile, tratti dismorfici che però non ricorda nessuna sindrome ma esistono caratteristiche fenotipiche precise, malformazione a carico di qualche organo che fanno pensare ci possa essere un piccolo riarrangiamento genomico (non si può fare FISH perché è una tecnica che permette di vedere solo una regione specifica).

Differenze: nella FISH si usa il vetrino su cui ci sono cromosomi del paziente (prelievo di sangue in eparina, preparare i cromosomi); nell'Array si parte dai cromosomi ma dal DNA (prelievo di sangue periferico in EDTA con un altro anticoagulante del paziente, si estrae DNA).

Tutti i nucleotidi della doppia elica del DNA sono nella stessa sequenza per il 99,9%. Pertanto esiste una sequenza genomica di riferimento su cui basarsi per l'analisi dei pazienti con sindromi (esempio nanismo).

Il genoma sano viene spezzato e i frammenti vengono messi sul vetrino. Si rende riconoscibile fluorocromo il DNA del paziente attraverso un (rosso).

Contemporaneamente si rende riconoscibile un DNA sano di controllo (dello stesso sesso) con un fluorocromo diverso (verde). Poi si mettono insieme i due DNA sul vetrino e si utilizzano delle condizioni che permettono l'ibridazione delle sequenze del paziente e del controllo con i frammenti che sono sopra il vetrino. I DNA rosso e verde si mettono in un fornetto e la mattina dopo si guarda se per ogni sequenza presente sul vetrino comprato si sono ibridati entrambi i DNA o solo uno.

- Se in un punto preciso del vetrino si sono attaccate sia la sequenza verde sia rossa si ottiene (normalità); un colore giallo.

- Se si osserva solo uno spot verde il paziente colorato di rosso è deleto (non ha quella delezione); sequenza, duplicazione.

- Se si vede solo uno spot rosso il paziente ha un pezzo in più (Lo scanner poi va a misurare l'intensità di fluorescenza di ogni singola frequenza e la restituisce in modo più visibile: è un cariotipo molecolare.

Perché bisogna analizzare grafico.cromosoma per cromosoma attraverso un I puntini neri del grafico indicano normalità (come spot gialli) e sono sempre sulla linea dello zero; una deviazione a destra rappresenta da spot rossi c'è una duplicazione del paziente (valore intorno a 0,5); se la deviazione è a sinistra gli spot verdi indicano una delezione del paziente. Con il grafico si possono anche correlare i geni con il fenotipo del paziente (valore intorno a -1). persone normali Quando è stata messa a punto questa tecnica, all'inizio sono state scrinate e si è visto che abbiamo delle regioni di DNA che sono variabili come numero di copie, sono varianti benigne. Ad esempio una regione di DNA a qualcuno può essere presente in una copia, ad un altro in 8 copie, un altro ancora può non averla. Il nostro DNA presenta la stessa disposizione di nucleotidi al 99,9% (G T A C A T G A), ogni tanto lo 0,1% ha un nucleotide in una posizione