Genetica medica

Organizzazione del genoma umano

Il nostro genoma è organizzato in piccole unità chiamate cromosomi. I cromosomi non sono però costituiti solamente dal DNA, ma anche da alcune molecole basiche note come istoni. Nel cromosoma abbiamo vari tipi di istoni, l’H2, H3, H4, H5. Gli istoni sono il complesso proteico su cui il DNA si aggrappa.

Informazione genetica e epigenetica

• L’informazione genetica è quella scritta nelle basi azotate del DNA, ed è quindi quel tipo di informazione che non può essere cambiata. Se l’inf. genetica infatti venisse cambiata si parlerebbe di una vera e propria mutazione genica. Dall’info genetica nasce direttamente la proteina.
• L’informazione epigenetica ci dice come, quando e dove l’informazione genetica deve essere espressa. I fenomeni epigenetici pertanto non agiscono mutando le basi azotate del DNA ma apportano delle modifiche (come metilazione, acetilazione) reversibili che modulano l’espressione dell’informazione genetica. L’informazione epigenetica è reversibile anche perché deve cambiare in base ai vari momenti di vita della cellula, o in base ai tessuti in cui il gene deve essere espresso.

Conformazione della cromatina

Come fa la cellula a decidere se esprimere un gene o meno? Lo fa cambiando la conformazione della cromatina, eucromatina (ovvero cromatina trascrizionalmente attiva) e eterocromatina (cioè cromatina trascrizionalmente chiusa). Per passare dalla euc. alla eteroc. (e viceversa) possono essere apportate delle modifiche come la metilazione, la demetilazione, l’acetilazione e la deacetilazione.

Metilare/demetilare vuol dire aggiungere/eliminare gruppi metilici (–CH₃) alle code –NH₂ presenti negli istoni oppure dalle citosine delle isole CpG presenti a livello dei promotori genici. Operano degli enzimi appositi come metiltransferasi e demetilasi. Acetilare e de-acetilare vuol dire apportare/rimuovere dei gruppi acetilici sugli istoni. Anche in questo senso operano degli enzimi come istone acetil-transferasi e istone de-acetilasi.

• Metilazione + de-acetilazione → Cromatina condensata, chiusa. Questo perché la de-acetilazione comporta un aumento dell’affinità tra gli istoni e il DNA, quindi la formazione di una cromatina più chiusa. Questo perché la metilazione dei gruppi CpG delle isole CpG presenti a livello dei promotori istonici causa un non-riconoscimento dei fattori di trascrizione del gene.
• De-metilazione e acetilazione invece causa una cromatina aperta, trascrizionalmente attiva.

Organizzazione del genoma umano

DNA a sequenza unica, o anche detto DNA informativo.

1. DNA moderatamente ripetitivo.
2. DNA altamente ripetitivo.

Il DNA a sequenza unica è a singola copia, forma il 46% del nostro genoma ed è rappresentato da geni codificanti proteine. Alla fine del progetto Genoma Umano (primi anni 2000), sono stati contati 23.000 geni codificanti proteine. La densità dei geni è estremamente variabile tra i vari cromosomi. Ad esempio, il cromosoma 17 ha 4 volte in più di geni del cromosoma 18, nonostante sia di poco più lungo. O ad esempio il cromosoma 19 ha più geni del cromosoma 2, e come sappiamo il cromosoma 2 è uno dei più grandi del nostro cariogramma.

Il DNA moderatamente ripetitivo forma il 45% del nostro genoma. Il DNA moderatamente ripetitivo è formato da elementi trasponibili. Gli elementi trasponibili possono essere retro-elementi ovvero elementi che nascono da una retro-trascrizione dal loro RNA oppure possono essere trasposoni a DNA. I trasposoni a DNA hanno ancora la capacità di replicarsi e di inserirsi in nuove posizioni del genoma. Gli elementi trasponibili, con le mutazioni puntiformi, sono stati molto probabilmente gli elementi che hanno consentito l’evoluzione della specie.

Il DNA altamente ripetitivo è formato da centinaia di unità ripetute in tandem di lunghezza variabile. Questo tipo di DNA è noto come DNA satellite. Il DNA altamente ripetitivo forma i centromeri (DNA alfa satellite) e i peri-centromeri (ovvero le sequenze che si trovano immediatamente vicine ai centromeri, noto come DNA beta satellite). Inoltre, il DNA altamente ripetitivo forma i telomeri dei cromosomi (la cui sequenza ripetuta in tandem è "TTAGGG").

Geni ortologhi, paraloghi e cluster genici

Geni ortologhi sono dei geni molto simili riscontrabili in genomi di specie differenti, che producono proteine molto simili tra di loro. Tali proteine hanno un 60-80% di omologia. Es: geni HOX.

Geni paraloghi sono geni omologhi, che codificano per proteine simili tra di loro e che sono presenti nello stesso organismo, derivati dalla duplicazione di un unico gene. Questo meccanismo è avvenuto nel passato evolutivo. ES: geni delle catene globiniche.

Cluster genici sono delle sequenze geniche molto simili tra loro, che codificano per una medesima proteina o per proteine molto simili. I cluster genici hanno la seguente particolarità: i geni sono disposti linearmente lungo il cromosoma, pertanto sono molto vicini tra di loro. Un esempio è il cluster genico delle globine: i geni sono raggruppati linearmente e a seconda del periodo di vita dell’individuo si accende il 1°, il 2°, il 3° gene e così via…

Pseudogeni e famiglie geniche

Pseudogeni sono dei geni “finti”, ovvero sono dei geni da cui non può nascere alcuna proteina funzionalmente attiva. Gli pseudogeni si distinguono in due tipi:

• Pseudogeni maturi → sono praticamente uguali al gene vero tranne che per il fatto che mancano degli introni. Questi geni nascono in seguito ad un processo noto come retro-trascrizione del mRNA della copia funzionale del gene ancestrale. Senza gli introni il gene non può funzionare.
• Pseudogeni immaturi → anche questi sono dei geni non funzionali poiché hanno accumulato nella loro sequenza genica una serie di mutazioni tali da non consentirne più il funzionamento.

Famiglie geniche sono formate da geni simili, codificanti proteine simili. Sono differenti dai cluster genici, in quanto questi ultimi sono vicini spazialmente, mentre i geni delle famiglie geniche sono distanti nel genoma, ad esempio su cromosomi diversi.

Genoma mitocondriale

Il DNA mitocondriale è detto mt DNA ed è formato da 37 geni che codificano per proteine propriamente mitocondriali. È un DNA circolare, formate da due emi-eliche non uguali tra loro, chiamate: catena leggera e catena pesante. Le due emi-eliche sono entrambe codificanti. I geni mitocondriali non hanno introni e hanno un codice di triplette differente rispetto a quello nucleare, considerato universale.

N.B. : i 37 geni derivanti dal genoma mitocondriale codificano sì per delle proteine, ma tali proteine non bastano al mitocondrio per soddisfare i propri “bisogni”. Pertanto c’è un’interazione tra il genoma nucleare e il mitocondrio, in quanto dal genoma nucleare nascono una serie di proteine che si dirigeranno verso di esso. Il genoma mitocondriale è suscettibile di mutazioni, ed è piuttosto facile che questo accumuli una serie di mutazioni che potrebbero portare ad una patologia.

Nel momento in cui tutte le particelle del DNA mitocondriale nella cellula sono le medesime, allora si parla di condizioni di omoplasmia, se invece le molecole di mt-Dna nella cellula sono differenti tra loro allora si parla di eteroplasmia. L’omoplasmia è molto poco frequente. L’eredità mitocondriale è matrilineare. Quindi le malattie mitocondriali vengono trasmesse dalla madre ai figli.

Ma che cosa è l’effetto Collo di Bottiglia - Bottle Neck? Ipotizziamo che una madre ha il 20% di mitocondri mutati. Questi verranno, nell’atto della fecondazione, trasmessi ai figli, ma non tutti. Pertanto il numero di mitocondri mutati diminuirà di generazione in generazione ed è probabile che in tal modo la malattia scomparirà.

Per manifestarsi una malattia mitocondriale esiste un carico mutazionale minimo, ovvero al di sotto di quella soglia minima di mitocondri mutati non abbiamo la malattia, cioè la malattia non si manifesta. Al di sopra della soglia la malattia comincia a manifestarsi, mano a mano in modo più grave con l’aumentare del numero dei mitocondri mutati.

Differenza tra gene eucariotico e gene procariotico

La sostanziale differenza sta nel fatto che i geni procariotici sono organizzati in operoni, ovvero in sequenze geniche da cui nascono proteine funzionalmente correlate, ovvero originano proteine implicate tutte nel medesimo metabolismo. Invece, negli eucarioti originano delle proteine singole ovvero delle proteine che nascono da singoli geni a seconda dei diversi tessuti.

Un’altra differenza: il gene procariotico è colineare, ovvero dal gene nasce direttamente l’mRNA maturo, il quale viene subito tradotto in proteina. Nel gene eucariotico non abbiamo questa colinearità, ovvero dal gene nasce il pre-mRNA, da cui nasce l’mRNA maturo, da cui nasce la proteina. Il gene procariotico è colineare perché la cellula procariotica non è compartimentalizzata, la cellula eucariotica sì.

Anatomia e differenze dei due geni

Partiamo da lontano:

Enhancer e silencer

Presenti sia nel gene eucariotico che nel gene procariotico. Possono trovarsi prima del gene oppure dopo il gene. Sono sequenze che agiscono solamente in cis, ovvero agiscono solamente sulla medesima elica.

Promotore

Il promotore procariotico è formato da una sequenza a -35 pb e una a –10 pb nota come TATA BOX. Il promotore eucariotico è invece formato da una sequenza nota CG box a -100 pb, a -70 pb abbiamo la CAAT BOX e a -30 pb abbiamo la TATA box. Sono tutte sequenze utili per il riconoscimento della polimerasi. In prossimità della TATA BOX è più semplice cominciare la trascrizione del DNA, in quanto è più semplice aprire la doppia elica. Perché? Perché tra la Timina e l’Adenina ci sono solo due legami ad H.

Leader

La sequenza leader è la prima sequenza ad essere trascritta, ma non tradotta. Lo scopo della sequenza leader è quello di permettere l’appaiamento tra il ribosoma e il trascritto. Nel gene procariote, la sequenza leader è stata ampiamente studiata e ha preso il nome di sequenza di Shine-D’Algarno. Si tratta di una sequenza, ricca in purine, contenente sempre la sequenza AGGAGG, sita fra i 3 e i 10 nucleotidi a monte del codone di inizio della traduzione, la quale, per semplice appaiamento fra basi nucleotidiche complementari, riconosce una regione ricca in pirimidine al terminale 3' dell'rRNA 16S della subunità ribosomale minore (la 30S), contenente sempre la sequenza UCCUCC e detta sequenza anti-Shine-Dalgarno. Nell’eucariote, la sequenza leader funge da sito di capping dell’mRNA. Il cappuccio è formato da 5-metilguanosina e si lega con un particolare legame 5’-5’ al mRNA eucariotico.

Sequenza codificante

La sequenza codificante, sia nel gene eucariote che procariote, comincia con AUG, corrispondente alla formil-metionina. In questa regione, la differenza tra DNA eucariotico e DNA procariotico risiede nel fatto che il gene eucariote è formato da esoni e da introni, mentre quello procariotico no. Tra le sequenze esoniche e quelle introniche ci sono delle sequenze di riconoscimento dello splicing, note come sequenze donatrici e accettrici di splicing, che permettono il riconoscimento dello splicesoma sul gene. Inoltre, nell’introne è presente il punto di ramificazione (branch point) formata da una Adenina.

La sequenza di stop: nel procariote è molto grezza, ed è formata da alcune sequenze palindromiche che si appiano tra di loro. La polimerasi allora giunta in prossimità di queste sequenze, si imbatte nella forcina derivante dall’appaiamento di suddette sequenze e scivola via dal gene. In tal modo è terminata la trascrizione del gene. Nel gene eucariote abbiamo codoni di stop ripetuti (UGA, UAA, UAG), in prossimità dei quali la DNA POLIMERASI si ferma e scivola via dal gene.

Maturazione post-trascrizionale

Come abbiamo detto, una volta terminata la trascrizione del gene, deve avvenire la sua maturazione. Il gene eucariotico presenta delle sequenze introniche, miste a quelle esoniche. Queste vengono eliminate attraverso lo splicing, da complessi proteici noti come splicesomi (a loro volta formati da snRNA protein).

Ulteriore modifica è l’aggiunta del CAP, ovvero il cappuccio di 5-mG al primo nucleotide del mRNA, quindi nella regione 5’ dello stesso. Sempre in prossimità 5’, c’è l’aggiunta di due molecole di CH₃ ai primi due nucleotidi. A cosa servono? A far ripiegare il messaggero su se stesso.

Nella regione 3’ del mRNA abbiamo invece un’ulteriore modifica che consiste nell’aggiunta di una coda di 50-250 Adenine nel poli-A addition site da parte della POLI-A polimerasi. La coda di adenine ha una funzione stabilizzatrice. Un mRNA senza coda di Adenine è un messaggero altamente instabile, e pertanto non potrebbe uscire dal nucleo cellulare.

Funzioni degli introni

• Gli introni fungono da assorbimento delle mutazioni, quindi hanno una funzione di protezione.
• Avere degli introni vuol dire intrinsecamente avere la possibilità di splicing alternativo.
• Anche gli introni hanno un ruolo importante nella regolazione dell’espressione genica. Infatti, all’interno delle sequenze introniche abbiamo delle sequenze di riconoscimento per proteine tessuto specifico che permettono di modulare l’espressione del RNA in modo diversificato.

Regolazione dell’espressione genica a livello pre-trascrizionale

Abbiamo parlato dell’origine anticorpale, il quale meccanismo rientra nella regolazione dell’espressione genica a livello pre-trascrizionale. Altri meccanismi di regolazione genica pre-trascrizionale sono:

• Metilazione del DNA – quindi silenziamento genico.
• Eterocromatinizzazione del cromosoma X.
• Imprinting genomico.

Silenziamento genico

Come si fa a silenziare un gene? Rivediamo la sequenza di un gene: un gene è formato da un promotore, da una sequenza leader, da una sequenza codificante formata dalla successione di esoni e introni, da una sequenza stop e da un trailer. Ricordiamo ancora che la parte trascritta del gene va dalla sequenza leader alla regione di stop. A monte del promotore sono presenti delle sequenze nucleotidiche del tipo CpG, praticamente dei dimeri di Citosina e di Guanina ripetuti. Queste isole CpG rappresentano il substrato ideale per permettere la metilazione delle citosine; quindi, da citosina diventa 5-metil-citosina; Il fatto che a monte del gene ci sia una elevata quantità di 5-metil-citosine, comporta lo spegnimento del gene, cioè la sua trasformazione da eucromatina a eterocromatina.

L’enzima implicato nella metilazione della citosina si chiama DNMT, ovvero DNA metil transeferasi. Perché alle isole CpG metilate corrisponde uno spegnimento della cromatina?

• Il DNA metilato viene riconosciuto a fatica da fattori di trascrizione.
• Specifiche proteine riconoscono e si legano alle sequenze CpG metilate reclutando le acetilasi e le metil-transferasi istoniche, che a loro volta, causano il rimodellamento della cromatina (in questo caso verso una conformazione in cui i promotori non sono accessibili).

Eterocromatinizzazione del cromosoma X

Gli esseri umani sono degli organismi diploidi, ovvero ereditano le informazioni genetiche in doppia copia; Per poter funzionare bene, la maggior parte dei geni deve essere espresso in doppia copia; Infatti esistono delle malattie date dalla aploinsufficienza: uno dei due alleli non funziona e quindi abbiamo una carenza di proteina; Questo potrebbe portare ad effetti fenotipici patologici.

Una minima parte dei geni nel nostro genoma, però, per poter funzionare deve essere espresso in singola copia. Questo accade nell’espressione dei geni delle Ig umane (principio di esclusione allelica) o, appunto, nelle donne (cariotipo 46,XX) in cui uno dei due cromosomi sessuali deve essere inattivato. L’inattivazione del cromosoma X è un evento precoce, avviene a livello della blastocisti, ovvero quando l’embrione è formato ancora da una ventina di cellule. In questo momento avviene l’inattivazione casuale di uno dei due cromosomi X.

Sul cromosoma X, braccio q, esiste una regione nota come XIC, ovvero “X inactivation centre”, la quale possiede dei geni tra cui XIST e TSIX. Da entrambi le sequenze geniche nascono dei “ncRNA” ovvero dei non coding RNA. L’RNA derivante da xist è responsabile del processo di etero-cromatinizzazione del cromosoma X. L’RNA di tsix è un antisenso del RNA di xist. Il suo compito è quello di “nascondere” il DNA cromosomico da eterocromatinizzare al ncRNA di xist. Quindi il processo di eterocromatinizzazione è una “lotta” tra xist e tsix.

Nella maggior parte dei casi, il processo di eterocromatinizzazione del cromosoma X è casuale. Ma non è casuale quando:

• Una delle due X contiene dei geni letali, l’X eterocromatinizzata è proprio quella con i geni letali.
• C’è una X che ha subito una traslocazione con un autosoma. In questo caso la X ad essere etero-cromatinizzata non è quella traslocata.