Genetica medica

BCL-ABR, funzione nuova

L'esempio è quindi una mutazione che genera un prodotto proteico che funziona in eterozigosi e per di più con funzione aumentata.

Antimorfo: l'allele è causato da una mutazione che porta a un prodotto genico antagonistico. È il risultato di una mutazione che colpisce un gene il cui prodotto proteico funziona in cooperazione con altre proteine. Particolari mutazioni rendono la proteina mutata di disturbo a tutte le altre essendo queste ultime completamente normali. Un esempio è quello in cui più geni contribuiscono alla formazione delle proteine, ciascuno producendo una parte delle catene di base: una mutazione in un solo allele produce un effetto negativo complessivo. E si ha manifestazione in eterozigosi del fenotipo malato.

Come stabiliamo se una mutazione è o meno patogenetica? Ci sono delle linee guida. Intanto, delezioni del gene, mutazioni nonsenso e frameshift sicuramente distruggono la funzione del gene.

gene e quindi non possono essere polimorfismi, sono sicuramente mutazioni patogenetiche. Uguale anche le mutazioni dei siti di splicing che hanno come effetto o la rimozione di un dominio proteico oppure lo scivolamento frameshift se si parla di codoni non in frame. Per le mutazioni missenso è più complicato. Potrebbe essere una mutazioni con effetto genetico, come nell'acondroplasia, oppure potrebbero essere polimorfismi, e dobbiamo valutare quale parte della proteina è interessata. Altra considerazione riguarda l'amminoacido che viene coinvolto. Si fa studi in silico per valutare quanto è conservato quell'amminoacido nella specie. Più l'aa è conservato nella proteina, più è probabile che sia importante e una mutazione che determina un suo cambiamento importante è verosimile che abbia un impatto patogenetico più che polimorfico. Un'altra mutazione missenso patogenetica è se la mutazione è non conservativa.

sicuramente o quasi se la mutazione è insorta de novo.

Le mutazioni sinonime invece sono polimorfiche o patogenetiche ? In questo caso per tanto tempo sono state ritenute mutazioni non patogenetiche (intuitivamente si dice, se la mutazione non cambia la proteina allora la progeria Hutchison-Gilford mutazione non sarà patogenetica), ma non è cosi. Possiamo pensare alla che70 genera una forma di estremo invecchiamento precoce, bassa statura, calvizie, assenza di tessuto adiposo e rischio di arteriosclerosi e infarto. In questo caso è stata descritta una nuova mutazione in eterozigosi nel gene lamin A cromosoma 1, della che mappa sul braccio lungo del cromosoma. È una mutazione de novo e di tipo sinonima. La variante nt non fa variare l'aa nella proteina, ma introduce un sito criptico di splicing, e l'effetto è che fa perdere 50 aa alla proteina.

Identificazione di una mutazione puntiforme in un campione biologico (lez.8 e 9 - 13/11 e 20/11)

Iniziamo oggi

DNA o RNA. La lisi sicuramente è un compromesso, deve essere abbastanza aggressiva da un lato, ma anche delicata in modo tale che si mantenga l'integrità degli acidi nucleici. La meccanica, chimica enzimatica, lisi possono essere per frammentazione o dipende poi dalle fasi successive.

De-protetinizzazione, cioè dobbiamo togliere le proteine contaminanti l'acido nucleico.

Precipitazione dell'acido nucleico, così da rendere DNA/RNA il più puro possibile.

Andiamo a vedere le estrazioni di RNA e DNA:

Estrazione del DNA

Iniziamo dall'estrazione del DNA in cui secondo le linee guide dell'istituto superiore di sanità deve essere un processo di purificazione secondo metodi standardizzati riportati in letteratura e convalidati in laboratorio se possibile con metodi automatizzati. Devono essere disponibili metodi idonei per la conservazione del DNA per la protezione dell'integrità del materiale cosi che rimanga

Il DNA perfettamente intatto in tutta la sua lunghezza è estremamente difficile se non impossibile da ottenere, tuttavia normalmente è sufficiente che durante la purificazione il DNA si mantenga in frammenti di 50-100 kb per poter effettuare qualsiasi analisi successiva. La prima fase è quella delle DNasi, quella che vede sia la lisi di membrane, ma anche l'inibizione attraverso l'azione chelante per bloccare queste DNasi, seguita poi effettivamente dalla rimozione delle proteine per liberare il DNA in soluzione. Questa rimozione può essere meccanica, chimica o enzimatica come abbiamo detto prima.

Dopodiché abbiamo la fase di precipitazione e di estrazione. Vedendo un breve cenno storico dell'evoluzione delle tecniche di estrazione, in base alle metodiche possiamo farla con estrazione fenolo/cloroformio, salting out, estrazione con Chelex o con il kit di estrazione a membrana di silice.

Possiamo partire dal 1950 circa per arrivare a oggi. Per tanti anni le tecniche che si usavano avevano come base l'estrazione con fenolo/cloroformio, successivamente venne introdotto il salting out. Verso la fine del '900 con lo sviluppo di sistemi automatizzati prodotti da aziende furono introdotte tecniche con uso prevalentemente di membrane di silice che hanno permesso la notevole standardizzazione di queste tecniche. Oggi dove è possibile e se è possibile si usano estrattori automatici per lo più fenolo/cloroformio. L'estrazione con fenolo/cloroformio viene fatta con una provetta che ha due fasi, una fase fenolica e una fase acquosa, e l'interfaccia è rappresentata dalle proteine. Dopo lisi cellulare questa estrazione permetteva di isolare le proteine per far precipitare il DNA e per far si che rimanesse nella fase acquosa, ovvero nella fase inferiore della provetta. Questa tecnica venne a lungo usata, permetteva di ottenere grandi

Quantità di DNA, malunghezza tossici. Il grosso problema era la temporale, e poi il fenolo e cloroformio erano salting out.

Il metodo è la tecnica che ha sostituito l'estrazione in fenolo cloroformio tra le tecniche manuali.

Proteinasi K. Viene fatta ovviamente la lisi cellulare, poi si esegue la digestione proteica con le con lo scopo di estrarre DNA e degradare tutte le proteine contaminanti che vengono poi allontanate dalla soluzione mediante la precipitazione con sali. Il principio su cui ci basiamo è che le proteine stanno in soluzione dipendendo dalle loro caratteristiche fisico-chimiche, temperatura e dal pH, oltre che anche però dalla concentrazione di sali e quindi forza ionica della soluzione. Stando a basse concentrazioni di sali, e aumentandola gradualmente, la solubilità della proteina aumenta in modo altrettanto graduale (salting per poi arrivare a concentrazioni alte di sali in cui la solubilità inizia bruscamente a diminuire.