Genetica medica

Genetica

Struttura e funzione del DNA e dell'RNA

• Replicazione del DNA
• Trascrizione dell’RNA
• Traduzione delle proteine

Codice genetico e varianti del DNA

Principi dell'ereditarietà mendeliana classica

(leggi di Mendel); modelli di ereditarietà mendeliana autosomica dominante e recessiva, X-linked dominante e recessiva (esempi di alberi genealogici)

Malattie con ereditarietà mendeliana a maggior frequenza

• Atrofia muscolare spinale (SMA)
• Fibrosi cistica
• Acondroplasia

Mutazioni dinamiche e sindrome X fragile

Analisi degli acidi nucleici

Struttura e funzione dei cromosomi

Principali anomalie dei cromosomi (di numero e di struttura)

Principali sindromi da anomalie dei cromosomi

Con riferimento anche ad alcune sindromi con anomalie dei denti peculiari.

Tumori ereditari a maggior frequenza nella popolazione

(tumore ereditario della mammella/ovaio) o tumori con anomalie maxillo-facciali e dei denti (AAP e sindrome di Gorlin).

Capitolo 1 - Struttura e funzione del genoma umano

Acidi nucleici e informazione genetica

Nel DNA è scritta tutta la nostra informazione genetica (esclusi alcuni virus a RNA) e complessivamente l’informazione si chiama genoma.

Genoma —> molto grande, 3 miliardi di nucleotidi organizzati in 23 coppie di cromosomi, 22 autosomi + X e Y. XX per le femmine e XY per i maschi.

Genoma: completa informazione genetica di un individuo; formata da circa 3.000.000.000 di desossinucleotidi organizzati in 23 coppie di cromosomi + il DNA mit.

Struttura degli acidi nucleici

L’unità base del DNA e dell’RNA è il nucleotide. Nucleotide: uno zucchero (DNA—> desossiribosio, è un pentoso) al quale è legato una base azotata che è legato al gruppo fosforico.

Basi azotate: Adenina, Timina, Citosina e Guanina. A+T, C+G

Come è legato il fosfato? Legato al 5’ dello zucchero precedente e al 3’ dello zucchero successivo.

A e G sono purine, T e C sono pirimidine

Desossiribosio: Possiede una struttura pentosa, differisce dal ribosio per l'assenza di un atomo di ossigeno in posizione 2', rappresentando un deossizucchero.

Struttura del DNA è una struttura elicoidale destrorsa

• Scheletro esterno: zucchero e gruppo fosfato
• Basi azotate: verso il centro
• La doppia elica ha un andamento dal 5’ al 3’ per un’elica, l’altra va nel senso inverso dal 3’ al 5’. Filamenti antiparalleli e complementari
• L’unità base del DNA si chiama paia di basi, per ogni gradino le basi azotate sono due: una di un’elica una dell’altra
• La lunghezza del DNA si misura in paia di basi (Bp). Se un frammento di DNA misura 1000 o 1000000 bp, si parlerà di una chilobase (kb) o di una megabase (Mb)
• Legame tra paia di basi: sempre adenina+timina, citosina+guanina
• Ogni 10 base pair l’elica —> giro senso orario
• Legami idrogeno tra le basi (debole), tra A e T 2, tra C e G 3.
• Distanza tra le coppie di basi 3,4 A
• Diametro elica 2nm

Missmatch: errato appaiamento (es. t+g), se succede va corretto. Se si sa l’andamento di un’elica, si sa l’andamento dell’altra.

RNA: zucchero ribosio, pentoso

• Singola elica
• Basi azotate: Adenina, Citosina, Guanina e Uracile (al posto della timina)

3 miliardi di nucleotidi nelle cellule —> DNA estremamente compatto

Se fosse lineare —> 1 metro

Compattamento —> Nucleosoma: l’unità base della cromatina —> insieme DNA e proteine associate —> nucleosoma ha carica +, il DNA ha carica -- DNA + istoni (ottamero di proteine basiche), sono 8 —> 2H2A, 2 H2B, 2H3 e 2H4

Introno agli istoni —> DNA fa 2 giri, trattenuto dalla carica positiva e da un istone (H1, lega DNA interposto) —> consuma 146 bp

Distanza tra 2 nucleosomi = 200 bp —> 146 bp intorno al nucleosoma e 50 bp DNA interposto

6 nucleosomi si susseguono in forma elicoidale e formano la bra cromatinica = 2/3 cm di genoma

Cromosomi —> DNA + proteine intorno alle quali sono avvolti, pochi micrometri

Cromatina —> non è tutta uguale —> stato di avvolgimento del DNA

Eterocromatina —> trascrizionalmente inattiva, altamente condensata

Eucromatina —> trascrizionalmente attiva, meno condensata durante l’interfase per la trascrizione del DNA e la sintesi del nuovo lamento di DNA

Dogma centrale della genetica

1 gene = proteina —> per ottenere ciò passaggi intermedi

• Replicazione —> DNA cellule figlie uguale al DNA originale, copia identica del DNA
• Trascrizione —> da DNA al RNA
• Traduzione —> dal RNA alla proteina
• Retrotrascrizione —> sintesi del DNA a partire dal RNA

Replicazione del DNA

Caratteristiche: semiconservativa e semidiscontinua

• Doppia elica —> 2 doppie eliche
• Semiconservativa —> un frammento è conservato, l’altro è nuovo
• 5’—>3’ filamento veloce
• 3’—>5’ filamento lento
• Inizia in punti specifici —> origini di replicazione
• Srotolare le due eliche —> una funge da stampo per la nuova catena
• Elicasi —> separa i due lamenti (enzima)

Topoesomerasi —> mantiene struttura rilassata

2 filamenti vecchi su cui devono essere sintetizzati due filamenti nuovi

Per sintetizzare il nuovo filamento di DNA:

• Nucleotidi
• Primer —> piccolo inizio della replicazione
• DNA polimerasi (regola la replicazione) unisce i nucleotidi —> correzione di bozze, se necessario rimuove il nucleotide che non ha correttamente allineato. Funziona bene quando lavora in direzione 5’- 3’, non in direzione 3’- 5’.

Semidiscontinua: Una elica viene sintetizzata tutta di seguito

Elica 3’ - 5’ —> sintetizzata in frammenti tra 100 e 1000, frammenti di Okazaki, filamenti uniti dalla ligasi

Replicazione circa 8 ore

Sintesi del DNA nel nucleo, sintesi RNA nel nucleo, sintesi delle proteine avviene nel citoplasma

Trascrizione e maturazione RNA

DNA e RNA sono molto simili

Trasferimento dall’informazione dal DNA al RNA

Per sintetizzare RNA bisogna prendere un singolo frammento di elica e combinare le basi azotate.

m-RNA passa l’informazione alla proteina.

Il DNA non passa sempre l’informazione al RNA, ad esempio ci sono geni che vengono utilizzati solo durante lo sviluppo embrionale, oppure quando c’è uno stimolo ormonale.

Come avviene la trascrizione? RNA polimerasi sintetizza RNA sullo stampo di DNA che costituisce unità di trascrizione.

• Fattore di trascrizione si lega al promotore, arriva l’RNA polimerasi attacca i nucleotidi successivi e forma il filamenti di RNA fino a quando la polimerasi non incontra una sequenza di arresto.
• RNA polimerasi si lega al sito di inizio della trascrizione richiamata dai fattori di trascrizione.
• I fattori e il promotore che sta a monte dell’inizio della trascrizione indicano alla polimerasi dove posizionarsi sulla doppia elica di DNA, separandola (attività elicasica), per formare la bolla di trascrizione.
• La cromatina deve essere accessibile, eucromatina, trascrizionalmente attiva
• La RNA polimerasi usa come stampo il lamento antisenso
• Sintetizza RNA in direzione 5’-3’
• Sintesi continua fino a quando la polimerasi incontro sequenza di arresto
• Si forma catena di RNA
• Bolla di trascrizione si chiude e DNA torna alla conformazione normale

RNA neosintetizzato = un lamento di DNA, T sostituita con U.

La trascrizione non comincia sempre per tutti i geni. È regolata dalla RNA-polimerasi. Non si attacca a tutti i frammenti di DNA, si attacca dove serve. —> guidata dai fattori di trascrizione, che si legano alle porzioni del gene che regolano la trascrizione, i promotori (subito prima del gene).

Gene —> una porzione che viene trascritta e una porzione che lo precede. Il promotore è nella porzione che lo precede —> non deve essere trascritto, serve solo per l’attacco dei fattori di trascrizione

RNA-polimerasi tre tipi, perché non esistono solo RNA che servono per formare proteine:

• RNA senza produrre proteine —> RNA che fanno parte di ribosomi e RNA transfer e RNA non codificanti (funzione regolatoria) e RNA che fanno parte del complesso dello splicing.
• QUINDI non sempre un gene= una proteina. Esistono geni che portano al passaggio di informazioni al RNA che poi non codifica per nessuna proteina.

Tipi di RNA polimerasi:

• RNA polimerasi I trascrive i geni degli RNA ribosomiale 18 S, 5.8, S e 28 S
• RNA polimerasi II trascrive i geni che codificano proteine sintetizzando mRNA
• RNA polimerasi III trascrive i geni di tutti RNA transfer, RNA ribosomiale 5S.

DNA di un gene è fatto da:

• Porzione trascritta e non tradotta (serve al RNA per uscire dal nucleo)
• Porzione trascritta e codificante —> esoni: contengono l'informazione necessaria per codificare la proteina
• Porzioni di DNA interposte, trascritte ma non tradotte —> introni, tra due esoni

I trascritti primari devono subire altre modificazioni prima di andare nel citoplasma —> maturazione degli mRNA

• Estremità 5’ del RNA —> CAP —> proteggere quando esce dal nucleo verso citoplasma (attacco esonucleasi)
• Estremità 7’ —> metilata guanosina monofosfato
• Splicing (spliceosoma: promuove e controlla, snRNP) : eliminazione degli introni, li deve riconoscere. Introni —> GT—AG, taglio al 5’ (sito donatore) e al 3’ (sito accettore). Gli esoni si uniscono.
• Estremità 3’ —> aggiunta coda poli A (stabilizza e facilita il trasporto), AATAA specifica la fine della trascrizione
• 15-30 nucleotidi prima RNA scisso dall’endonucleasi
• Aggiunta al RNA 200 amp adenosina monofosfato
• mRNA codificanti gli istoni non hanno coda poli A.

Altri RNA: rRNA RNA ribosomiali, tRNA RNA transfer, snRNA piccoli RNA nucleari, scRNA citoplasmatici

Come fanno due cellule che hanno lo stesso corredo genetico ad essere diverse tra di loro? Dipende da quali geni sono attivi.

Come fanno a lavorare geni diversi in cellule diverse? Devono essere regolati dalle conformazioni della cromatina, dalla presenza dei fattori di trascrizione.

RNA vengono trascritti solo alcuni geni —> devono esserci fattori di trascrizione che si legano ai promotori e si legano alle RNA polimerasi —> cromatina accessibile

Fattori di trascrizione riconoscono i promotori, si attaccano, la RNA polimerasi parte e copia tutto e crea un RNA immaturo: esoni, introni, estremità 5’ trascritta e non tradotta, estremità 3’ trascritta e non tradotta (—> proteggono l’RNA)

Gene: lettere maiuscole esoni, lettere minuscole introni. (Non sempre)

Sintesi delle proteine e codice genetico

mRNA nucleo —> citoplasma, sintesi delle proteine

mRNA si lega ai ribosomi

Ribosomi —> 2 subunità (complessi ribonucleoproteici RNA)

• Subunità grande 60S —> 50 proteine + rRNA 28 S, 5.8S e 5s
• Subunità piccola 40S —> 30 proteine e rRNA 18S (S= Svedberg —> velocità di sedimentazione dopo essere stati centrifugati, in relazione alla massa)

Sequenza amminoacidica —> sequenza nucleotidica mRNA

Codice genetico universale —> identifica 3 triplette = 3 nucleotidi = 1 codone (unità codificanti)

La sequenza aminoacidica della proteina nascente è determinata dalla sequenza dell’RNA (a gruppi di 3 nucleotidi-codone)

tRNA —> porta amminoacidi sparsi nel citoplasma nel punto in cui il ribosoma li lega nella sintesi proteica

Struttura a trifoglio

Estremità 3’ —> un amminoacido

Estremità 5’—> anticodone, tripletta di basi

Attraverso questo anticodone —> riconoscimento del codone del mRNA

Così è possibile inserire uno specifico amminoacido nella catena polipeptidica in accrescimento.

Riconoscimento del codone del mRNA —> le sue 3 basi azotate sono complementari a quelle dell’anticodone

Es. tRNA 3’-AAG-5’ —> mRNA 5’-UUC-3’

mRNA inizia sempre con AUG: all’interno della sequenza di Kozak, è una corta sequenza interna dell'mRNA (5’GCCPuCCAUGG) riconosciuta dal complesso di pre-inizio della traduzione —> metionina (M si può ripetere nelle sequenza)

Amminoacido successivo si lega con legame peptidico (gruppo carbossilico 1º amm, gruppo amminico 2º amm, formazione catalizzata dal ribozima (prod. sub. Grande).

Incorporati amminoacidi fino al codone di stop (UUA, UAG, UGA)

64 codoni possibili —> 61 x 20 amminoacidi, 3 codoni di stop

Codice genetico degenerato —> codoni diversi (più codoni) —> stesso amminoacido

Dal tRNA riconosciuti tutti i codoni perché anticodone si appaia con le prime 2 basi, la terza può essere diversa

RICORDA: ATG metionina, codoni di stop: TAA, TAG, TGA

Proteine

Sono composte da uno o più polipeptidi. L’elemento base dei polipeptidi sono gli amminoacidi.

Amminoacidi: Determina la natura chimica dell’aa

La maggior parte degli amminoacidi ha un solo gruppo amminico ed un solo carbossile perciò sono chiamati amminoacidi neutri (polari e non polari); quelli che hanno un carbossile in più vengono detti amminoacidi acidi (carica neg) mentre quelli con un gruppo amminico in più sono amminoacidi basici (carica pos).

Struttura ed espressione dei geni

Gene = sequenza di DNA potenzialmente trascrivibile in un RNA funzionalmente attivo.

Quale RNA?

• mRNA (trasporta informazioni per la sintesi delle proteine)

Genoma umano 23 mila geni codificanti proteine, MA esistono anche RNA non codificanti (ncRNA). Funzione? Regolazione della cromatina, trascrizione genica codificanti.

Altri RNA funzionalmente attivi (non codificanti):

• rRNA (funzione strutturale)
• tRNA (funzione catalitica)

Promotore: Regione a monte, precede sito inizio trascrizione. Dal promotore si conta con -1, precede sito inizio trascrizione che ha numerazione +1.

Brevi sequenze legate dai fattori di trascrizione che reclutano RNA polimerasi II nel sito adeguato a iniziare la trascrizione, grazie al mediatore complex (complesso proteico di 30 prot) —> serve per la sintesi dell’RNA e trascrizione.

• Geni ad elevato livello di trascrizione es istoni e B-globina —> elementi del promotore con TATA box, TATAAA a circa -25 bp dal sito inizio trascrizione (-80 bp dal sito inizio trascrizione)
• Geni house keeping (necessari funzionamento generale cellula) —> nel promotore CAAT box

Altre sequenze specifiche riconosciute dai fattori di trascrizione:

• Fattori di trascrizione tessuto-specifici (che conoscono i promotori) —> gene a trascrizione tessuto specifica o ectopica = trascrizione a livelli molto bassi in tutte le cellule
• Elementi risposta nel promoter o regione 5’
• Enhancer —> intensificatore: aumentare i livelli basali della trascrizione, si trovano a distanza variabile, talvolta a valle del sito di inizio della trascrizione = interno regione trascritta

Regolazione della trascrizione:

• Ci devono essere i fattori di trascrizione (ubiquitari, tessuto specifici, legati ad altri fattori), che interagiscono con sequenza del promotore del gene e sequenze enhancer e consentono l’assemblaggio del complesso di trascrizione (inclusa RNA polim. II)
• Conformazione della cromatina —> fibra solenoide da 30 nm, con DNA del promotore libero da istoni

L'espressione di molti geni è controllata da un ormone, da un fattore di crescita o da una molecola di segnale intracellulare (es. cAMP) i quali legandosi a recettori specifici determinano l'attivazione o l'inattivazione di determinati fattori di trascrizione.

Fattori attivati interagiscono con ER (elementi risposta) del promotore inducono l'espressione del gene corrispondente.

In genere: CROMATINA trascrizionalmente attiva = alto livello di acetilazione istoni H3 e H4 a livello dei residui di lisina delle code N-terminali. Tali code protrudono dal nucleosoma e normalmente legano il DNA grazie alla carica positiva dei residui di lisina e arginina; l’acetilazione dei gruppi amminici della lisina neutralizza tale carica e diminuisce quindi l’affinità degli istoni H3 e H4 per il DNA, facilitandone il distacco.

Modificazioni epigenetiche —> modificazioni della cromatina

Istoni associati cromatina inattiva —> tutti deacetilati

• Acetilazione
• Deacetilazione

Processi mediati dalle HAT Acetiltransferasi e HDAC istonedeacitilasi

Metiltransferasi (HMT):

• In posizione 4 istone H3 () —> cromatina attiva
• Metilazione lisina H3-K4
• In posizione 9 istone H3 () —> cromatina inattiva = compatta
• Metilazione lisina H3-K9

DNA Metiltransferasi (DNMT)

Metilazione delle citosine (più studiata) nelle regioni non trascritte e dei promotori dei geni trascrizionalmente attivi. = aggiunta gruppo metile in posizione 5’ dell’anello pirimidinico della citosina, solo se seguita da guanina —> dinucleotide CG, indicato come CpG. CpG frequenti nella regione 5’, nel promotore = (50% dei geni le isole CpG hanno). —> citosine metilate riconosciute da MDB (Methyl DNA binding protein), che richiamano le HDAC (proteine) che compattano la cromatina, deacetilano gli istoni, favorendo trascrizione del gene.

Struttura esoni-introni

Esistono:

• Esistono esoni —> sequenze codificanti
• Introni —> sequenze non codificanti