Riassunto esame Fisiologia del Sistema Nervoso, prof. Cambria, libro consigliato Principi di Neuroscienze, Kandel

Canali ionici

I messaggi nervosi dipendono da rapide variazioni della DDP ai capi delle membrane. Le variazioni della DDP dipendono dalla presenza di canali ionici. I canali ionici sono strutture che rivestono grande importanza nella genesi di messaggi nervosi.

Proprietà dei canali ionici

• Lasciano passare gli ioni → conduzione
• Velocità elevate: flussi molto ampi di corrente
• Riconoscono e selezionano le diverse specie ioniche → selettività
• Si aprono e si chiudono in risposta a segnali specifici (di natura elettrica, meccanica o chimica) → regolabilità
• Quest’ultima proprietà è valida solo per i canali regolabili: esistono 2 grandi classi di canali, quelli passivi e quelli regolabili
• I canali passivi non sono regolabili e restano sempre aperti: sono importanti nella genesi del potenziale di riposo
• I canali regolabili si dividono in 3 classi in base allo stimolo che ne determina lo stato:
  • Voltaggio-dipendenti
  • Dipendenti da ligandi
  • Dipendenti da forze meccaniche

I canali ionici sono proteine che attraversano la membrana della cellula da parte a parte. Gli ioni sono idrofili (quindi non possono attraversare per diffusione il doppio strato lipidico idrofobico) e attraggono con forza le molecole d’acqua: l’acqua è un dipolo; con l’O attrae i cationi e con gli H attrae gli anioni.

• Serve energia per vincere le forze di attrazione tra acqua e ioni
• Il Na⁺ ha dimensioni minori del K⁺, quindi la sua carica è maggiormente localizzata: possiede allora un campo elettrico più efficace ed esercita un’attrazione maggiore sulle molecole d’acqua
• Na⁺ in soluzione è più grande di K⁺ in soluzione (quindi in forma idrata)
• Na⁺ in soluzione è rallentato: la sua mobilità è minore → più piccolo è lo ione (più grande è la sua forma idrata) tanto minore è la sua mobilità

Gli ioni possono attraversare la membrana solo in corrispondenza di canali che risultano selettivi. Teoria dei poro-canali: nei canali esisterebbe una stretta via, il filtro di selettività, nel quale gli ioni formerebbero interazioni elettrostatiche con residui di aminoacidi polari presenti sulle pareti del canale.

• Lo ione deve perdere l’acqua di idratazione, quindi ha bisogno di energia; l’energia necessaria è garantita solo se lo ione riesce a instaurare tutte le interazioni possibili con il filtro di selettività, e ciò è possibile solo se lo ione possiede le dimensioni adeguate.
• Canali K⁺: Na⁺ è escluso per il suo diametro, troppo grande per entrare
• Canali Na⁺: K⁺ è escluso perché le sue dimensioni ioniche non permettono la contemporanea interazione con tutti gli aminoacidi polari del filtro, e quindi non riceve sufficiente energia per la deidratazione → la selettività dipende da interazioni chimiche specifiche e dalle dimensioni del filtro molecolare

Studio dei canali ionici

Oggi è possibile studiare i canali ionici con metodi funzionali. Esperimenti hanno permesso di vedere come alcuni canali si comportano come semplici resistenze: la corrente unitaria, infatti, varia linearmente con il potenziale di membrana. L’intensità della corrente di un singolo canale poteva quindi essere calcolata con la legge di Ohm: i = V/R; tuttavia è meglio parlare di conduttanza (γ = 1/R) → i = γ * V.

La tecnica utilizzata per registrare il flusso di corrente di singoli canali ionici è il patch-clamp: un microelettrodo riempito di ACh (che apre i canali delle cellule muscolari) è poggiato sulla membrana postsinaptica (muscolare); il microelettrodo è così piccolo che aderisce a solo un canale.

Caratteristiche comuni dei canali ionici

I canali ionici di tutte le cellule hanno parecchie caratteristiche in comune. I flussi ionici che attraversano i canali sono passivi. Il flusso di ioni che scorre nei canali non richiede spesa di energia metabolica; anche la direzione e l’equilibrio finale del flusso non dipendono dai canali ma dalle forze elettrostatiche e di diffusione presenti ai capi della membrana. Ciò che dipende dai canali è la selezione dei tipi di ioni a cui è permesso il transito. Le proprietà cinetiche dei flussi sono ben descritte dalla conduttanza dei canali.

• La conduttanza viene determinata misurando la corrente che passa per il canale aperto in risposta a una determinata forza motrice elettrochimica
• La forza motrice elettrochimica è determinata da 2 fattori:
  • La differenza di potenziale elettrochimico ai capi della membrana
  • Il gradiente di concentrazione dello ione
• In base alla relazione i/V (relazione tra il flusso di corrente per un canale e il voltaggio applicato), esistono 2 tipi di canali:
  • Canali ohmici, che si comportano come semplici resistenze (il flusso varia linearmente con il voltaggio) → conduttanza costante
  • Canali rettificanti, che tendono a condurre maggiormente gli ioni in una direzione piuttosto che nella direzione opposta → conduttanza variabile
• La velocità degli ioni (la corrente) dipende dalla concentrazione degli ioni
• La corrente aumenta linearmente con la concentrazione fino a un valore massimo: saturazione (si ha saturazione quando la concentrazione degli ioni è tale che tutti i siti polari presenti sulla parete dei canali sono legati agli ioni)
• Se per far passare uno ione è necessario un legame transitorio tra lo ione stesso e gli aminoacidi polari del poro, allora, come per gli enzimi, si può quantificare la Km (costante di dissociazione, caratteristica delle cinetiche di saturazione); la Km è molto elevata: il legame è molto blando, quindi si forma e si risolve molto rapidamente. Questo permette di raggiungere velocità elevatissime di conduzione ionica, necessarie per determinare rapide variazioni del potenziale di membrana.

Apertura e chiusura dei canali

L'apertura e la chiusura dei canali comporta una serie di modificazioni della loro conformazione. Tutti i canali posseggono 2 o più conformazioni stabili: almeno uno stato aperto e uno o 2 stati di chiusura (in realtà i canali passivi, a riposo, sono sempre aperti); i canali nei quali si può avere questa transizione sono detti ad accesso variabile.

• Le variazioni d’accesso di un canale comportano modificazioni diffuse di tutta la sua struttura
• Nello stato aperto aumenta la velocità di conduzione degli ioni per via del lume più largo e perché sono più esposti nel poro gli aminoacidi polari

I meccanismi di regolazione dell’apertura sono principalmente 3:

• Canali regolati da ligandi
  • Ligandi con effetto diretto sul canale (recettori ionotropi)
  • Ligandi extracellulari: neurotrasmettitori
  • Ligandi intracellulari: Ca²⁺ e nucleotidi
  • Ligandi con effetto indiretto sul canale (recettori metabotropici → attivano cascata di secondi messaggeri e fosforilazioni)
• Canali regolati da variazione del potenziale di membrana
• Canali regolati da deformazioni meccaniche della membrana

I canali ad accesso variabile presentano 3 stati funzionali diversi:

• Chiuso ma attivabile: riposo
• Aperto: attivo
• Chiuso e non attivabile: refrattario

Il passaggio dallo stato chiuso a quello aperto richiede energia:

• Nei canali voltaggio-dipendenti, l’energia è fornita dal movimento del sensore di voltaggio del canale proteico dovuto a una variazione del campo elettrico della membrana
• Nei canali regolati da neurotrasmettitori, l’energia è fornita dal legame del NT al sito recettoriale
• Nei canali ad attivazione meccanica, l’energia è fornita da stiramento o tensione della membrana o del citoscheletro

La velocità di transizione aperto-chiuso dipende dal segnale regolatore; la transizione è praticamente istantanea (variazione a gradino con carattere di tutto-o-nulla della corrente), la durata dello stato aperto o chiuso è variabile (in media però sono pochi millisecondi).

Stato di refrattarietà

• Canali dipendenti dai ligandi: il processo è detto di desensitizzazione, e avviene quando i canali vengono esposti a lungo all’azione del ligando
• Canali voltaggio-dipendenti: il processo è detto di inattivazione ed è dovuto a un cambio di conformazione intrinseca che avverrebbe sotto il controllo di una subunità o di una zona del canale diversa da quella che determina la loro attivazione, oppure a legame con Ca²⁺ o ancora per fosforilazione

Il canale può legarsi a sostanze che ne favoriscono la chiusura o l’apertura:

• Inibizione reversibile (competitiva o non competitiva) o irreversibile

Struttura dei canali ionici

La struttura dei canali ionici può venir desunta da ricerche di tipo biofisico, biochimico e di biologia molecolare. Tutti i canali ionici comprendono un componente glicoproteico di base, costituito da una proteina integrale di membrana; al centro è presente un poro idrofilo costituito da diverse subunità della proteina; alcuni canali possiedono subunità ausiliarie citoplasmatiche che ne modificano le proprietà funzionali.

La sequenza primaria dei canali (studi su batteriorodopsina) contiene sequenze con aa idrofili e sequenze di circa 15-20 aa idrofobici, che rappresentano le α-eliche transmembrana.

Geni dei canali ionici

I geni che codificano i canali ionici possono venir raggruppati in famiglie. Le diverse famiglie di geni si sono evolute da un unico gene ancestrale; ecco le principali:

• Canali regolati da ligandi (ACh, GABA, glicina)
  • 5 subunità, ciascuna con 4 eliche; differiscono per specificità di ligando e selettività di ione
• I canali attivati dal glutammato fanno parte di una famiglia diversa
• Giunzioni comunicanti (sinapsi elettriche)
  • 12 subunità identiche, ciascuna con 4 domini transmembrana
• Canali voltaggio-dipendenti
  • 4 sequenze ripetute di una struttura di base con 6 domini transmembrana; l’ansa tra S5 e S6 è la regione P, che si approfondì per un tratto nella membrana e forma il filtro di selettività
  • I canali V-D per Ca²⁺ e Na⁺ possiedono esattamente questa struttura
  • I canali per K⁺ sono simili a questa struttura; ne esistono 3 famiglie:
    • Canali K⁺ con 4 subunità separate (invece che 4 sequenze ripetute); ogni subunità rappresenta una struttura di base
    • Canali K⁺ a rettificazione entrante, attivati da iperpolarizzazione, con 4 subunità formate da 2 domini transmembrana (S5 e S6) connessi da regione P
    • Canali K⁺ della conduttanza a riposo, con subunità formate da una sequenza di 2 domini ciascuno uguale a una subunità dei canali a rettificazione entrante

Struttura di un canale selettivo per K⁺

La struttura di un canale selettivo per K⁺ è stata chiarita da analisi cristallografiche ai raggi X. Canale batterico K⁺, presente anche nei mammiferi, con topologia di membrana semplice.

• 4 subunità identiche disposte simmetricamente intorno a un poro centrale
• Ogni subunità è costituita da 2 tratti α-elica transmembrana, connessi da un’ansa (regione P) che forma il filtro di selettività
• Nel dettaglio, il tratto di catena extracellulare che connette le 2 eliche è formato da:
  • Una catena di aminoacidi che circonda lo sbocco esterno del canale (torretta)
  • La regione P:
    • Un’α-elica corta (elica del poro) che si approfonda nella membrana a formare la parete del poro
    • Una catena che forma l’ansa che riveste il filtro di selettività
• Aminoacidi acidi sono situati agli sbocchi interno e esterno del poro, per attrarre i cationi
• L’interno del poro è rivestito da aminoacidi idrofobici, per garantire un’elevata velocità di passaggio degli ioni all’interno
• Il filtro di selettività è molto stretto, ed è il tratto che limita la velocità di transito
• Lo ione deve attraversare il filtro in forma deidrata, per essere poi reidratato subito dopo il filtro, in una camera larga contenente acqua; verso questa camera punta il dipolo formato dall’elica del poro con la sua estremità C elettronegativa
• Sul filtro di selettività sono presenti 3 gruppi carbonilici di una glicina, una tirosina e un’altra glicina per ogni subunità; questi 12 gruppi (3 anelli da 4 gruppi, uno per subunità) creano un ambiente fortemente polare per i K⁺; le catene laterali di questi aminoacidi determinano una certa larghezza del poro, che deve essere tale da permettere ottimali interazioni tra K⁺ e i gruppi carbonilici, al fine di fornire allo ione idrato energia sufficiente per la sua deidratazione
• Na⁺ è troppo piccolo per interagire con tutti e 4 gli ossigeni dei gruppi carbonilici di ogni anello: non riceve abbastanza energia per deidratarsi
• Il canale è occupato da 3 K⁺: la loro mutua repulsione impedisce legami duraturi con gli ossigeni dei gruppi carbonilici e garantisce una conduttanza elevata → canali ionici: selettività elevata e elevata velocità di transito

Potenziale di membrana

È possibile distinguere i canali ionici presenti nelle membrane in 2 tipi:

• Passivi: sempre aperti e non influenzati da fattori estrinseci; il loro ruolo è quello di mantenere costante il potenziale di riposo
• Attivi: generalmente chiusi quando la membrana è in condizioni di riposo. La loro probabilità d’apertura è regolata dal voltaggio, dall’associazione con un ligando o dalla deformazione meccanica della membrana

Potenziale di membrana a riposo

Il potenziale di membrana si stabilisce come conseguenza della separazione di cariche elettriche di segno opposto ai capi della membrana plasmatica.

La separazione di cariche è rappresentata dalla presenza di un sottile strato di ioni, rispettivamente positivi e negativi, sulla superficie esterna e interna della membrana.

• A riposo, l’esterno è positivo e l’interno è negativo
• La separazione è mantenuta costante perché gli ioni non possono muoversi liberamente attraverso la membrana, e quindi dà origine a una DDP detta potenziale di membrana Vm,
• V = V_EST – V_INT
• Vr rappresenta il potenziale di riposo; dato che per convenzione V = 0, allora V_EST = V_R e generalmente varia tra -60 e -70 mV
• I segnali elettrici sono rapide variazioni di questo potenziale, dovute a flussi di corrente che compaiono in seguito all’apertura di canali

Per convenzione, la direzione del flusso della corrente è definita come la direzione netta delle cariche positive:

• I cationi si muovono seguendo la direzione della corrente, gli anioni nella direzione opposta
• Una riduzione della separazione di cariche (il potenziale diventa meno negativo) è detta depolarizzazione
• Un aumento della separazione di cariche (il potenziale diventa più negativo) è detta iperpolarizzazione

Le variazioni del potenziale che non determinano l’apertura di canali ad accesso variabile, ma che dipendono dai canali passivi, sono detti potenziali elettrotonici. Se la depolarizzazione supera un valore soglia, si aprono i canali voltaggio-dipendenti che innescano un potenziale d’azione di tutto-o-nulla.

Misura del potenziale di membrana

2 microelettrodi sono connessi a un oscilloscopio; un elettrodo è mantenuto fuori dalla cellula, l’altro viene inserito nella cellula; al momento della penetrazione, l’oscilloscopio registra un potenziale costante (potenziale di riposo).

È possibile far variare il potenziale di membrana mediante un secondo paio di elettrodi connessi a un generatore di corrente: iniettando cariche positive nella cellula, questa si depolarizza e il potenziale è meno negativo (dapprima si ha un potenziale elettrotonico la cui variazione è proporzionale all’entità dell’impulso di corrente, da un certo valore in poi si ha un potenziale d’azione); se invece si invertono gli elettrodi, con quello negativo all’interno, la membrana si iperpolarizza (iperpolarizzazione è puramente elettrotonica).

Potenziale di membrana a riposo determinato dai canali ionici passivi

Na⁺ e Cl^- sono in concentrazioni maggiori all’esterno, K⁺ e anioni organici (aminoacidi e proteine) sono più concentrati all’interno. Di seguito l’analisi dei potenziali di cellule permeabili a uno o a più ioni, tenendo in considerazione solo i canali passivi.

Canali ionici passivi delle cellule gliali

I canali ionici passivi delle cellule gliali sono selettivi soltanto per gli ioni K⁺. Le cellule gliali hanno un potenziale di riposo di -75 mV e presentano canali passivi permeabili quasi esclusivamente agli ioni K⁺.

• K⁺ è presente in elevate concentrazioni all’interno, quindi tenderà a diffondere fuori dalla cellula seguendo il proprio gradiente di concentrazione
• In seguito a questo movimento verso l’esterno, si avrà un eccesso di cariche positive all’esterno con l’interno negativo
• Questa separazione di cariche dà origine a una DDP (positiva all’esterno e negativa all’interno) che tende ad opporsi a un ulteriore efflusso di K⁺ → gli ioni vengono sollecitati da 2 forze con direzione opposta:
  • Una forza motrice chimica (gradiente di concentrazione) verso l’esterno
  • Una forza motrice elettrica (DDP sulle due facce della membrana) verso l’interno
• Ad un certo momento, il flusso di K⁺ verso l’esterno sarà uguale a quello verso l’interno. Il valore del potenziale al quale la forza motrice elettrica entrante eguaglia quella chimica uscente è detto potenziale di equilibrio del potassio, E_K
• In una cellula permeabile solo a K⁺, il potenziale di riposo (determinato dal solo flusso autolimitante di K⁺) è uguale al potenziale di equilibrio del potassio, cioè -75 mV (V_m = E_K)

Il potenziale di equilibrio si ricava dall’equazione di Nernst:

RT [X]_i e^{E = ln} = − = ricavata dal potenziale elettrochimico μ_X zF [X]_e i → RT/F a 25° = 25 mV; ln = 2,3 log 10; a 29° 2,3 RT/F = 60 mV

• Per K⁺, [K⁺]_i = 400 mentre [K⁺]_e = 20 → a 25° E_k+ vale proprio -75 mV