File completo Microbiologia Clinica

Lezione n°1: Microbiologia clinica

Data: 20-10-2016

A cura di: Maria Grazia Santangelo

Argomento: introduzione alla microbiologia clinica

Introduzione alla microbiologia medica

La medicina di laboratorio, al di là dei singoli insegnamenti di microbiologia medica come microbiologia clinica, biochimica clinica e immunologia clinica, che ruolo ha?

C’è una condizione in cui si prescinde dalla medicina di laboratorio? La risposta è: NO. Che poi le analisi siano ematologiche, emato-cliniche, biochimiche, immunologiche, microbiologiche, è da determinare, ma non possiamo assolutamente fare a meno della medicina di laboratorio.

Pur essendo tre insegnamenti diversi sulla carta, è chiaro che studiamo un organismo, del quale preleverò una piccolissima parte. Parte da cui otterrò degli indici che mi daranno ragione del fatto che vi sia una condizione che interessa determinate strutture, siano esse immunitarie, microbiologiche o che altro. Con questo si vuole dire che, pur essendo tre materie differenti, operano insieme.

Ematologia

Dal punto di vista ematologico, quali sono i parametri che dimostrano la presenza di un'infezione in atto?

Nota revisionatore: Il campo delle possibili risposte alla domanda è troppo vasto per poter capire cosa effettivamente volesse da noi quella megera: probabilmente ci si riferisce alla presenza di batteri in coltura, ma altrettanto probabilmente ci si riferisce ad alterato metabolismo, presenza di IG, conta leucocitaria, aumento degli eosinofili nel caso di parassitosi e potrei continuare per molto.

Materiale patologico

Per l’immunologia clinica e la biochimica clinica il materiale patologico che si deve utilizzare è il sangue. Nel campo della microbiologia clinica, invece, il sangue è uno dei tanti materiali patologici che devono essere prelevati con un’attenzione particolare in relazione a quello che è il processo infettivo, e questo concetto non è tanto immediato come può sembrare dalla semplice enunciazione.

Analisi microbiologica

Cosa significa analisi microbiologica? Che scopo ha la diagnosi microbiologica e in particolare batteriologica? Ha lo scopo di identificare l’agente patogeno responsabile di una malattia infettiva al fine di suggerire un appropriato trattamento terapeutico.

Diagnostica diretta e indiretta

Come si identifica un microrganismo? A questo punto tutta la microbiologia clinica la possiamo riassumere in due possibilità: si può fare una diagnostica microbiologica diretta oppure una diagnostica microbiologica indiretta.

Quando diretta e quando indiretta? Se io cerco di realizzare l’isolamento dell’agente patogeno o di parte di esso si parla di diagnostica diretta. La diagnostica indiretta si ha quando la diagnosi tende a rilevare la risposta immunitaria dell’ospite a quell’agente infettivo.

Qual è la differenza? Nella diagnostica indiretta cerco gli anticorpi nel plasma, in modo particolare nel siero.

Trattamento del sangue

Come si deve trattare il sangue del prelievo? Il sangue si tratta con i coagulanti, o meglio si fa sierare togliendo la parte corpuscolata e si elimina la parte di fibrina mediante dei coagulanti ottenendo così il siero, dove ricerco gli anticorpi.

Anticorpi

Cosa sono gli anticorpi? Di che tipo sono?

• IgD: riconosce antigene non di natura microbica
• IgE: riconosce antigene non di natura microbica
• IgA: immunità neonatale e delle mucose
• IgG: responsabili della memoria immunologica
• IgE: presenti nei processi di ipersensibilità
• IgM: immunoglobuline precoci

Quindi tra queste immunoglobuline si ricercano le IgG e le IgM. In relazione al titolo, alla quantità, al dosaggio e alla differenza che si ha di queste due entità si ha la possibilità di poter fare una diagnosi microbiologica indiretta.

Diagnosi microbiologica indiretta

Qual è in microbiologia un caso dove si fa la diagnosi in base a questo tipo di reazione? Risposte: epatite, treponema pallidum (perché non si può coltivare, e si cerca quindi la cardiolipina), mononucleosi (ma non è tanto specifica per questo). La ricerca degli anticorpi nel siero si chiama indagine sierologica, quindi dire ricerca sierologica o ricerca anticorpale è la stessa cosa.

Diagnosi sierologica in batteriologia e protozoologia

In batteriologia in quali casi si fa diagnosi sierologica? E in protozoologia quando si fa? Risposta: agenti TORCH (toxoplasma, herpes, citomegalovirus, rosolia).

E che scopo hanno queste indagini obbligatorie ripetute mese per mese? C’è il monitoraggio di negatività nella donna che vuole una gravidanza. Quindi con la ricerca di IgG e IgM abbiamo determinati riscontri che ci bastano, e sono indagini sierologiche.

Indagine diretta

Ma in batteriologia dove le facciamo? Nel campo della batteriologia sono solo tre i casi in cui si fa indagine sierologica, perché per il resto è più appropriata una indagine diretta. E come si fa l’indagine diretta? Risposta: l’indagine diretta si fa con l’isolamento diretto del patogeno, che significa fare coltura del patogeno. Oppure se ho un tampone, lo semino su un terreno di coltura e avrò una risposta. In alternativa, ricerchiamo gli anticorpi con l’immunofluorescenza, immunoenzimatica. Nell’indagine diretta si cerca anche al microscopio nel caso di Chlamydia.

Esame microscopico

Quindi diagnosi diretta significa realizzare un isolamento. In quali casi basta la visione al microscopio? Risposta: Chlamydia, Neisseria.

In che caso si fa per Clamydia l'immunofluorescenza? E come? Chlamydia ha un ciclo dimorfo, poiché è un parassita endocellulare obbligato che vuol dire che dobbiamo cercarlo dentro le cellule. Quindi prendiamo queste cellule, le strisciamo su un supporto idoneo, le coloriamo con un colorante con anticorpo e fluoresceina e poi le si guarda col microscopio a fluorescenza. Così abbiamo visualizzato la presenza di Clamydia facendo ricerca diretta di un microrganismo. Questo anche nel caso di tubercolosi, Neisserie.

Tecniche di ricerca

In quali casi basta l’esame microscopico con le diverse tecniche? Risposte: protozoi (come si fa diagnosi di malaria? Si cercano plasmodi eritrocitari). Si cercano quindi direttamente i microrganismi. Per i virus, per capire se il paziente è positivo al virus, si possono ricercare nel caso, per esempio delle epatiti, sia gli anticorpi che gli antigeni.

Individuazione dell'antigene

Come si fa ad individuare l’antigene? Si utilizza l’anticorpo noto, e lo dosiamo. Si può andare a cercare anche l’effetto citopatogeno, che consiste sempre in una ricerca diretta perché si ricerca l’antigene o parte di esso.

Test rapido per gli streptococchi

Cosa è il test rapido per gli streptococchi? Oppure come si evidenzia lo Pneumocystis o il Cryptococcus nel liquor? Risposta: prelievo del liquor, evidenziando con inchiostro di china.

Encefalite da herpes

Come si fa a capire per esempio se c’è encefalite da herpes? Risposta: ricerca diretta di antigene nel liquor, mediante anticorpi. Quindi da un lato la diagnosi indiretta con ricerca di anticorpi indicatori di uno stato patologico attuale o pregresso. Dall’altra parte, analisi microbiologica diretta a ricercare antigene o parte di esso.

Sonde e TRS

In quale contesto mettiamo le sonde o la TRS? Che tipo di ricerca è l’indagine molecolare? Risposta: è un'indagine diretta. La diagnostica sierologica fa diagnostica microbiologica valutando la reazione immunitaria, la diagnostica diretta cerca il microbo o parte di esso. Il problema è che le tecniche sono quelle, quindi la diagnosi indiretta la faccio con un metodo immunologico. Il fatto che la reazione sia immunoenzimatica, radioimmunologica, di immunofluorescenza dipende dalla scelta del microbiologo. Ma il concetto è che io fisso l’anticorpo, che non conosco, nel siero con un antigene noto, sia qualitativamente che quantitativamente. Mentre nella diagnosi diretta io mi avvalgo di più sistemi e ho diversi modi per andare a sapere che tipo di microrganismo c’è in quel distretto. Il modo più semplice per la ricerca batteri è l'esame colturale, ma nel caso dei virus, in caso di necessità di rapidità, in caso di ricerche particolari, mi avvalgo di una diagnosi rapida. Questa diagnosi rapida si effettua con due modalità: con ricerca di antigene nel materiale patologico, ovvero con un metodo immunologico (cioè ricerco l'antigene che non conosco con anticorpi noti, sia in ambito qualitativo che quantitativo), oppure un'altra strada moderna è quella del metodo molecolare, cioè la ricerca di determinate sequenze nell’agente batterico. Quindi la diagnostica rapida fa pur sempre parte della diagnosi diretta. È da precisare che non è meglio il metodo molecolare, rispetto alla immunofluorescenza, è solo diverso il caso e bisogna conoscere bene la microbiologia per applicare l’uno o l'altro sistema.

Vantaggi e svantaggi dei due metodi di diagnostica

Quale è il vantaggio del metodo molecolare? La specificità, l'accuratezza, il tempo.

E lo svantaggio? Il costo, ma in particolare si deve avere già un sospetto su un particolare patogeno, poiché il ventaglio di possibilità diagnostiche con la sonda a DNA è estremamente ampio e soprattutto molto specifico. Vediamo se c’è quel preciso microrganismo o meno, in che quantità. Quindi serve il quesito diagnostico ben preciso. Più è specifico il test, più deve essere specifica la richiesta. Nel caso dovessimo fare un’indagine da un materiale patologico il gold standard è la coltura. Quindi devo avere una sequenza ben precisa. La ricerca di una sequenza ben specifica è particolarmente impegnativa, quindi il costo è anche alto. Anche il metodo immunologico è molto preciso, perché solo su quell’antigene vado a cercare i miei anticorpi, non su tutto.

Chi fa diagnosi?

Il medico. Cosa si aspetta dal microbiologo? Una conferma o una smentita a un sospetto diagnostico.

Ricerca di immagini da internet

Figura 1: Piastra di coltura

Figura 2: Pozzetti

Pozzetti dove viene fatta PCR, ma con questo stesso supporto vado a realizzare la ricerca anche degli agenti TORCH, quindi la ricerca sierologica, vado a realizzare la ricerca dell’antigene, vado a realizzare la ricerca dei frammenti di Dna. Cambia il concetto, se cerco l’anticorpo, utilizzo l'antigene noto, se cerco l’antigene, utilizzo l’anticorpo noto. Se devo fare delle indagini per ricerca di un frammento di Dna devo evidenziarlo con delle sostanze che mi permettano di vedere questa omologia. Quindi le reazioni sono le stesse, cambia il tipo di concetto che mi guida nella diagnosi. Il materiale è questo, questi famosi pozzetti che servono per visualizzare. Si inserisce il prelievo in diluizioni scalari, si inseriscono gli anticorpi o gli antigeni (a seconda di come si identificano), si insemina con queste pipette multiple e si ha una risposta. Si possono notare diverse risposte, come l’agglutinazione, in base al materiale che è stato aggiunto. Quindi questi pozzetti devono essere adeguatamente trattati, seminati, messi a incubare e poi la risposta si ottiene dopo un po’ di tempo.

Figura 3: Pozzetti per coltura di Enterobatteri

Diverso è il caso di questi pozzetti che servono all’identificazione (si chiamano comunque pozzetti perché sono delle piccole cavità in cui va qualcosa), e servono per studiare gli enterobatteri. Ed è una ricerca diretta. Quindi ci sono diversi tipi di pozzetti. Possiamo usare anche piastre a pozzetti per essere adeguati all’utilizzo di particolari macchinari. Quello che è importante è che ci sono pozzetti di diverso tipo: conici, piatti, cilindrici quindi diversi per le diverse esigenze, ma quello che bisogna ricordarsi è che sia le reazioni sierologiche, sia quelle per la ricerca dell’antigene le facciamo tutte sui pozzetti con le stesse identiche tecniche, ma cambia il significato. Qua per esempio c’è un pozzetto piatto. (la professoressa consiglia di guardare le immagini su internet)

Scelta del campione patologico

Quello che è importante dire è: su quale principio si basa la diagnostica microbiologica? In base a quello che abbiamo detto, per una corretta diagnosi eziologica fatta dal medico, bisogna per prima cosa individuare l’organo o gli organi interessati, formulare un’ipotesi, scegliere il materiale patologico che si deve prelevare. Esempio: che vuol dire individuare l’organo? Mettiamo il caso che un paziente in ambulatorio si presenti con tosse. La tosse può avere mille origini, ed escludendo quelle infettive, il clinico deve per prima cosa crearsi un’idea, nonostante le diverse cause di una tosse, grazie all’anamnesi (da quanto tempo si ha la tosse, dove è stato, se è stato in viaggio, se ha tumori). Dopo di ché esclude alcune cause. Poi deve andare alla diagnostica per immagini o alla diagnostica di laboratorio e deve indirizzare entrambi gli operatori, microbiologo e radiologo, per esempio. Il medico grazie alle analisi ematologiche ed ematocliniche capisce che c’è un infezione in atto. Quindi procede domandandosi quale sia l’agente che causa l’infezione. Può fare il prelievo dell'espettorato, e nel caso della tubercolosi, per esempio, va bene, perché a differenza degli altri microorganismi (streptococco agalactiae, streptococco pneumoniae, stafilococco, klebsiella pneumoniae, legionella anche se questa si acquisisce diversamente, pneumocystis, micosi, virus) questi sono acido-alcol resistenti e quindi a questo punto è giustificabile una biopsia con sonda diagnostica o la coltura. Ma questo espettorato passa dalle alte vie aeree quali bocca e naso, molto colonizzate, quindi, se noi avessimo dovuto cercare lo Streptococco pneumoniae, non avremmo avuto conferma dall’isolamento di questo perché è facile che si trovi anche nelle altre sezioni delle vie aeree, nonostante resti comunque causa di polmonite, e quindi di infezione polmonare.

Ecco perché non è semplice cercare gli organi interessati e scegliere il materiale patologico. Il materiale patologico nel caso della ricerca dell’agente eziologico delle polmoniti deve essere un materiale che non si contamini con altri patogeni che fanno parte del normale ambiente microbiotico delle vie aeree superiori. Questo si fa in determinati casi, e consiste nel lavaggio bronco alveolare da cui si può ricercare il microorganismo specifico, se si vuole fare diagnostica microbiologica. Abbiamo parlato di sangue come siero, ma se devo cercare il plasmodio della malaria o la brucella utilizzo il sangue come campione clinico prelevandolo e considerandolo come prelievo che non va trattato con anticoagulanti (e quindi messo in differenti provette). Quindi essendo un materiale patologico “non convenzionale”, deve essere trattato come tale poiché deve essere sottoposto a un altro tipo di diagnostica microbiologica.

Lezione n.2, 27/10/2016

Argomento: Tamponi e infezioni

A cura di: Valeria Scarpato

Il ruolo della microbiologia clinica

La scorsa lezione abbiamo definito il ruolo della Microbiologia Clinica nell’ambito della medicina di laboratorio; parlando abbondantemente di quelle che sono le analisi sierologiche, di ricerca di anticorpi e quello che sono le indagini microbiologiche dirette all’isolamento nel microrganismo degli antigeni o di parti di essi. Tutti i casi, quindi, della microbiologia di azione sierologica o ricerca degli antigeni o parti di essi.

Prelievo microbiologico

Un passo fondamentale per le indagini microbiologiche è la raccolta e la preparazione del campione. La preparazione del materiale patologico non è così automatica come sembra. Iniziamo oggi a parlare del prelievo microbiologico e di come effettuarlo. Per ogni prelievo e ogni indagine ci sono delle adeguate linee guida che però non possono prescindere da alcune fasi importanti:

• Il campione viene raccolto da un medico e mandato al laboratorio. Quindi, raccogliere il campione prima del trattamento antibiotico, mai effettuare un prelievo se si è in terapia antimicrobica perché i dati vengono falsati. Se proprio è necessario, sospendere per due o tre giorni la terapia per consentire il prelievo.
• Scegliere il campione più rappresentativo del processo infettivo. Esempio: Se c’è un’infezione cutanea qual è il materiale più rappresentativo? Se è presente pus, ho un processo infettivo a carico della pelle. Il campione deve essere prelevato in quel punto preciso, nel momento opportuno e in quantità sufficiente.
• Evitare la contaminazione durante il prelievo.
• Utilizzare contenitori sterili idonei e appropriati terreni di trasporto.
• Etichettare i campioni per definire anamnesi, condizioni e ricerca dei patogeni che si vogliono ottenere.
• Formulare un sospetto di diagnosi.
• Inviare immediatamente il campione prelevato al laboratorio.

Valutazione del campione

Il microbiologo, una volta ricevuto il campione, deve valutare intanto se il materiale è sufficiente, poiché se il materiale è insufficiente vi possono essere dei falsi negativi. Successivamente valuta se il contenitore e il terreno di trasporto sono adeguati, in base alla richiesta fatta dal medico, il terreno di trasporto può essere di vari tipi: per miceti, per GRAM+, per GRAM- e per virus, si possono inoltre avere dei risultati falsi positivi o negativi se si ha una contaminazione. Viene valutata anche la conservazione di questo prelievo poiché il microbo potrebbe essere perso. Infine viene controllata la corrispondenza del campione con il nome del paziente, cosa ovvia, ma da tenere sempre a mente, in quanto capita molte volte che le analisi vengano scambiate.

Analisi qualitativa

Il microbiologo valuta da punto di vista QUALITATIVO il campione che poi viene visualizzato in base agli aspetti macroscopici, che sono:

• Odore
• Presenza di pus