fermentazioni e brioprocessi microbici

NADH

 O2



Abbiamo fatto 2 ipotesi sul perché produce etanolo:

Catena degli elettroni

 NADH



Come facciamo a dimostrare che la catena di trasporto degli elettroni è limitante e quindi deve scaricare gli

elettroni in un altro modo. Se per qualche motivo qualcosa è limitante questo potrebbe causare un

rallentamento e quindi una produzione di etanolo.

Formuliamo varie ipotesi:

1. Eliminiamo alcol deidrogenasi (3) non verrà più prodotto etanolo e quindi dovrebbe aumentare il

NADH nel citoplasma, produrrà glicerolo --> le alcol deidrogenasi sono almeno 7 e senza il ceppo non

cresce quindi non si può testare

2. Possiamo aumentare l'efficienza della catena di trasporto degli elettroni, vengono trasportati più

elettroni.

Se conoscessi le componenti della catena potrei over-esprimerli

 Aumentare il numero dei mitocondri.



Se a limitare è al catena di trasporto degli elettroni e aumentiamo l'efficienza il CDR dovrebbe spostarsi

verso destra, se la peggioriamo dovrebbe spostarsi verso sinistra.

Se viene accumulato NADH nel citoplasma questo non si può accumulare e quindi va a fare etanolo, se

disrompo l'alcol deidrogenasi va a produrre glicerolo.

Per aumentare l'efficienza possiamo aumentare il numero dei mitocondri, oggi non lo sappiamo fare

oppure devo cercare di limitare, un'altra opzione è di aumentare il NADH nel citoplasma.

Il NADH citoplasmatico in Cerevisiae non presenta dei trasportatori per il mitocondrio quindi non può né

entrare né uscire.

Shuttle di riduzione (ossido e riduco un composto ad esempio malato)

 37

Vi sono le NADH deidrogenasi che portano gli elettroni dal NADH e li trasferiscono sulla catena di

 trasporto degli elettroni (NDe1 ,NDe2)

Disrompo NDe1, il critical dilution rate dovrebbe abbassarsi, ma nella realtà non succede niente.

Se disrompo NDe2 non succede niente.

Se disrompo entrambe il CDR si abbassa. Quindi potrebbero fare etanolo per il fatto che le NDe vengono

saturate, il NADH non si può accumulare nel citoplasma e quindi iniziano a produrre etanolo.

Quindi producono etanolo in condizioni aerobiche per lo stesso motivo per cui fanno etanolo in condizioni

anaerobiche.

Il glicerolo viene prodotto verso la fine del grafico quando non ce la fa più.

l'etanolo viene prodotto prima che raggiunga la massima capacità respiratoria quando introduco glucosio

(vedi esperimento precedente), quindi il plateau di ossigeno è un effetto non una causa.

Ma questo non va d'accordo con la saturazione di NDe.

La produzione di etanolo risulta istantanea.

Le NADH deidrogenasi vengono saturate immediatamente.

Il numero di mitocondri è direttamente correlata alla

velocità di crescita, quando introduciamo glucosio la

quantità di mitocondri diventa immediatamente limitante

perché la cellula non ha prodotto nuovi mitocondri, mentre

un aumento graduale permette alla cellula di produrre

mitocondri.

Voglio spostare il CDR usando un altro metodo

Per spostarlo a destra devo introdurre una reazione che consuma NADH citoplasmatico (mai stato

 fatto)

Aumentare il NADH citoplasmatico --> il CDR si sposta verso sinistra.



Per aumentare il NADH citoplasmatico devo giocare con il bilancio redox

l'acido formico (HCOOH) è una fonte di energia ma non una fonte di carbonio per azione della formico

deidrogenasi

HCOOH + NAD+ --> CO2 + NADH

Introduco insieme al glucosio l'acido formico.

Dovrei vedere un incremento di qCO2 , ma il quoziente respiratorio dovrebbe rimanere uguale



Il NADH andrà sulle NADH deidrogenassi, se queste sono il fattore limitante dato che ho aumentato il

NADH il CDR si deve spostare a sinistra, se aumento molto l'acido formico l'etanolo si produce anche a

dilution rate molto bassi.

Prima di vedere etanolo a parità di atomi di carbonio per l'acido formico dovrei avere più energia e quindi

essendo la crescita limitata dall'energia dovrei vedere più biomassa fino al CDR.

In realtà non succede niente non si ha un aumento di biomassa.

Sulle cellule vi è un trasportatore per l'acido formico che consuma energia.

Voglio sapere anche perché nonostante ci sia più CO2 il quoziente respiratorio rimane uguale perché i due

elettroni vengono trasferiti sull'ossigeno (aumenta l'ossigeno)

Voglio sapere quanto ATP viene prodotto per coppia di elettroni consumata (P/O ratio).

Se con l'acido formico ho più energia ma non fa più biomassa vuol dire che l'energia viene usata per il

trasporto dell'acido formico. Se so quanto costa trasportare l'acido formico so quanta ATP tiro fuori dai due

elettroni dell'acido formico.

Questi dati di consumo di energia del trasportatore sono diversi per ogni ceppo.

38

Adesso devo determinare quanto costa il trasporto.

Si clona il trasportatore in membrane di coli, rompi coli e si formano delle vescicole, si fa lo stesso

esperimento in vitro, marco il substrato e vedi quanto substrato viene portato dentro e puoi determinare

l'energia.

Mediamente ottengo 1ATP per coppia di elettroni trasportati e il trasportatore consuma 1 ATP.

Rimangono 3 quesiti da chiarire:

Voglio disrompere PDC e PDH contemporaneamente

Voglio disrompere la trioso fosfato isomerasi

Perché l'acetil coenzima A può entrare, ma non uscire?

Perché l’acetil CoA può entrare, ma non uscire?

Oggi rispondiamo a 3 domande

1) Cosa succede se disrompo TPI

2) “ ” PDC e PDH

3) Se disrompo PDC in Cerevisiae il ceppo non cresce, ma se lo disrompo in un Saccaromices lactis

questo ceppo cresce perché?

Per rispondere alla terza domanda:

Vi possono essere 2 motivi per cui il ceppo cresce in terreno defined:

A) L’acetil CoA esce dal mitocondrio

B) Sintetizza Acetil CoA da qualche parte nel citoplasma

Potrebbe essere una o l’altra o entrambe

Ipotesi:

1) Disrompo PDH e PDC, se il ceppo non cresce è corretta la risposta A necessariamente l’acetil CoA



deve essere portato fuori dal mitocondrio per la sopravvivenza. Se cresce vi è la produzione di

Acetil CoA da qualche parte nel citoplasma

Il ceppo non cresce quindi in questo ceppo l’acetil CoA può usvire dal mitocondrio, cosa che in Cerevisiae

non è possibile.

Questo ceppo Delta PDC e delta PDH cresce su etanolo?

L’etanolo è in grado di diffondere, viene prodotto acetil CoA che entra nel mitocondrio e il ceppo cresce

Disrompo la trioso fosfato isomerasi il ceppo cresce?

Bloccando TPI non si blocca la glicolisi, arrivo fino alla formazione di DAP che può andare a glicerolo e viene

prodotto anche G3P che può andare a piruvato e continuare il ciclo.

Ma nella realtà il ceppo non cresce e non capisco perché : la G3P essendo in condizioni aerobiche può

continuare il ciclo.

Avendo solo 1 G3P (invece di 2) non recuperiamo le ATP investite nella prima fase della glicolisi, eppure il

piruvato dovrebbe entrare nel mitocondrio e produrre energia.

Se mi trovassi in condizioni anaerobiche il ceppo non potrebbe crescere (manca ATP).

In tutti gli organismi la via dei pentoso fosfati deve sempre essere presente.

Posso assumere che il ceppo non cresca perché l’energia necessaria ad innescare il sistema non è

sufficiente e quindi non sono in grado di produrre energia.

Come posso fare a dimostrarlo?

Fornisco un altra fonte di carbonio in modo da aggirare l’ostacolo

- Etanolo

- Acetato

- Etanolo + glucosio

- Piruvato 39

- Citrato

- Acidi grassi

- Acido formico e glucosio

Nessun intermedio dopo G3P può entrare nella cellula con l’eccezione del piruvato che è l’unico a non

avere un gruppo fosfato

Su nessuno di questi substrati cresce tranne che su acido formico e il composto glucosio + etanolo.

Un ipotesi potrebbe essere che non cresce perché necessita di energia per innescare la reazione.

Su acido formico cresce per un po’ e poi smette di crescere questo accade perché l’acido formico è una

fonte di energia, ma non di carbonio, grazie all’energia fornita riesce a ciclare essendo presente il glucosio.

Cresce molto lentamente per alcune generazioni.

Questo fatto mi da informazioni sul fatto che il ceppo non cresce senza un impulso di energia, ma non so

perché smette di crescere

Perché non cresce sulle altre fonti di carbonio ed energia?

Se la trioso fosfato isomerasi non solo servisse per la ragione della glicolisi ma fosse necessaria anche in un

altra reazione fondamentale della cellula. Il ceppo senza questa non potrebbe crescere, ma non è questo il

vero motivo.

Potrebbe essere un problema energetico (i trasportatori necessitano di energia)

Tuttavia l’etanolo diffonde nel citoplasma e nel mitocondrio e non è limitato da un trasporto.

Su glucosio +etanolo cresce perché le due fonti di carbonio si compensano non è un problema energetico.

Una cellula che c'è su etanolo produce acetil CoA.

Una parte del etanolo deve uscire dal mitocondrio ed entrare in gluconeogenesi, arriva a fosfoenol

piruvato, poi G3P e si risale a fruttosio - 6P e via dei pentoso fosfati.

Su solo etanolo non cresce perché non può andare in gluconeogenesi.

Su solo glucosio non cresce perché è a bilancio energetico zero.

Su substrato misto un po’ di glucosio andrà nella vita dei pentoso fosfati.

CELLULE ED ENZIMI IMMOBILIZZATI

gli enzimi immobiliari hanno lo scopo di favorire una bioconversione recuperando l’enzima.

I sistemi in continuo sono usati per le bioconversione in continuo a seconda dell’attività specifica

dell’enzima scegliamo la velocità di inserimento del substrato.

Immobilizzare un enzima implica fermarlo in un supporto con le seguenti caratteristiche :

- Insolubile

- Sulla superficie

- Grande area superficiale

- Cataliticamente inerte

- Facilmente recuperabile /rigenerabile

- Può essere organico o inorganico.

Preferisco un supporto inorganico che non sarà mai substrato dell’enzima.

Ci sono 4 metodi di immobilizzazione:

1) Assorbimento :mediante associazione con legami ionici, idrogeno, wan der vaals. Il legame è molto

debole quindi piccole alterazioni staccano l’enzima.

È molto semplice (pro) 40

2) legami covalenti: legami forti, ma devo evitare legami con il sito attivo dell’enzima. Una strategia

prevede di aggiungere una tail all’enzima in modo che questa sua il sito si legame

3) intrappolamento e incapsulamento: quando il gel non è polimerizzato si inserisce l’enzima che rimane

incastrato nelle maglie dell’enzima

Il substrato deve poter entrare e il prodotto uscire quindi la diffusione