fermentazioni e brioprocessi microbici

Biotecnologie anno 2018-2019

Appunti delle lezioni del prof. Porro

Alice Giussani

Introduzione

Economia circolare: produrre senza rifiuti. Sia la produzione di insulina che di bioetanolo passa da un bioreattore; se non funziona al suo interno, questo non viene messo in commercio. Animali e piante sono dei "bioreattori" non vantaggiosi perché non controllabili.

Gli organismi che sono maggiormente in grado di fissare la CO₂ per produrre materiale organico e liberare ossigeno sono le alghe. È molto più grave l'inquinamento degli oceani rispetto al deforestamento.

I polifosfati dei detersivi (effetto sbiancante) erano la causa della mucillaggine nel mare Adriatico; il problema si aveva verso aprile e maggio, ovvero quando crescevano le alghe che usavano i polifosfati come nutrimento. Oggi sono sostituiti dal citrato che viene prodotto in un bioreattore.

Il processo dei bioreattori viene gestito nel resto del mondo dagli ingegneri biochimici (non esiste questa figura in Italia); noi siamo la figura che più si avvicina.

Resa, produzione e produttività

• Produzione (g/L)
• Produttività → produzione per litro per ora
• Resa

Da ogni molecola di glucosio (180) si ottengono 2 molecole di etanolo (45), con una resa del 50% massima teorica.

Per produrre un farmaco, la resa è meno importante perché il valore aggiunto è estremamente elevato. Mediamente il 60-95% dei costi di processo è legato alla purificazione, soprattutto se si sta producendo un farmaco (meno se si sta producendo etanolo). L'ordine di grandezza della produzione è massimo g/L, se non mg/L. La produzione deve essere la più elevata possibile per bilanciare i costi di purificazione.

Il tempo di produzione del processo deve essere il minore possibile, mediamente 2-5 giorni.

Produzioni basate sulla generazione

• Glucosio → 1^° generazione
• Cellulosa → 2^° generazione
• Rifiuti → 3^° generazione
• CO₂ (in futuro)

Alla fine, niente sarà più un rifiuto. Il 20-40% dei tumori dipende dallo stile di vita, può essere dovuto a errori casuali oppure ereditario, ma queste ultime categorie sono irrisorie. È fondamentale la prevenzione.

Struttura del corso

1. Produzioni tradizionali: Aspetto tecnico → come funzionano i bioreattori
2. Produzioni avanzate con moo ricombinanti: Oggi vengono usati per la produzione di proteine eterologhe 3 tipi di cellule: E. Coli, S. cerevisiae, Cellule di mammifero

È importante sviluppare un processo il più semplice possibile poiché bisogna sia promuovere la produzione del prodotto di interesse che la sostenibilità e la crescita e sviluppo della cellula.

Promotori inducibili

Questi non sono sostenibili a livello industriale:

• Glucosio
• Lac
• Temperature sensibili

Si usano produttori costitutivi in una produzione industriale perché i promotori inducibili non sono sostenibili se non all'interno di un laboratorio.

È preferibile sostenere un processo aerobico piuttosto che uno anaerobico perché mantenere le condizioni di anaerobiosi è complicato. L'ossigeno costa ma risulta comunque più conveniente.

Caratteristiche dei microrganismi - cell factory

• Non patogeno
• Esigenze nutrizionali semplici (autotrofo): Azoto, Carbonio, Ossigeno, Idrogeno
• Condizioni di crescita semplici

La temperatura deve essere alta perché tutti i processi sono esoergonici ed è più facile mantenerla costante a valori alti. La crescita di biomassa fa aumentare la temperatura quindi va sempre controllata.

• Velocità di crescita elevata perché se necessario si può abbassare la velocità di crescita viceversa è impossibile
• Resistenza, adattamento ai cambiamenti chimico-fisici (moo robusto): Temperatura, pH, Condizioni nutrizionali di crescita, Elevata resa, produzione e produttività

Un processo robusto è un processo che non cambia in termini di resa, produzione e produttività.

È più difficile sviluppare un processo con un basso valore aggiunto (es. etanolo), rispetto alla produzione ad esempio di un farmaco che invece ha un elevato valore aggiunto perché bisogna curare ogni centesimo.

Good Manufacturing Process (GMP): Tutti gli elementi sono strettamente controllati. Se si lavora con patogeni si lavora sotto pressione in modo che niente esca.

Bioreattore

Il bioreattore permette di essere certi della riproducibilità (tutti i parametri sono controllati). Deve garantire 4 caratteristiche:

• Sterilità e sicurezza → vi deve essere solo il moo di interesse o il consorzio di moo
• Il terreno con nutrienti termolabili viene sterilizzato per filtrazione e non per autoclave
• Bisogna sterilizzare l'aria o il gas di interesse mediante un filtro a sua volta sterilizzato

Se il bioreattore è grande (>10L) non può essere inserito in autoclave, ma si autoclavano da soli generando vapore, viceversa se è piccolo viene inserito interamente in autoclave. Se si lavora con moo patogeni l'aria viene sterilizzata anche in uscita.

Trasferimento di calore

Sono di interesse i moo acidofili e termofili estremi per le industrie, soprattutto i produttori di acidi organici (vengono prodotti i sali che su grandi volumi è costoso convertire in acido). Ogni bioreattore ha una porzione aerea e una sommersa; l'aria viene insufflata sul fondo e fatta gorgogliare, verrà poi allontanata facendo diminuire il volume operativo poiché entra aria secca ed esce aria umida. Posso umidificare l'aria in entrata oppure deumidificare quella in uscita abbassando la temperatura per far condensare l'acqua ed evitare così la perdita di volume operativo.

Trasferimento di ossigeno

L'ossigeno è l'accettore finale degli elettroni, non è un nutriente qualunque. In mancanza di ossigeno la coltura entra in fase stazionaria, succede spesso nelle colture in beuta. La fonte di azoto principale è l'ammonio (NH₄⁺), le cellule usano NH₃ quindi vi è un protone che fa abbassare il pH. Un accumulo di composti tossici causa l'entrata nella fase stazionaria.

I moo possono usare solo l'ossigeno disciolto in acqua, quindi bisogna garantire il trasferimento di ossigeno dalla fase gassosa a quella liquida (in beuta è l'agitazione che garantisce ciò). In base al tipo di agitazione nelle beute si avranno dei risultati differenti poiché la diffusione dell'ossigeno è differente. Il bioreattore ci permette di misurare la % di ossigeno sciolto.

Quando tolgo dall'autoclave la sonda per l'ossigeno, setto questa rilevazione come 0, a mano a mano che i moo crescono la % disciolta scende. Se arriva a 0 non significa che siamo in anaerobiosi, ma che è stato consumato tutto l'ossigeno che sto introducendo e l'ossigeno diviene quindi limitante → bisogna aumentare la velocità di trasferimento.

Trasferimento di ossigeno - oxygen transfer rate (OTR)

Abbiamo bisogno di un sensore che misura la % di O₂ disciolto in acqua (da approfondire da soli). Qualunque sia il valore di resistenza iniziale va considerato come zero (prima di iniziare le condizioni operative). Una volta arrivati alle condizioni operative vi sarà disciolto dell'ossigeno e imprimiamo a questo valore il 100%.

A questo punto inoculiamo continuamente dell'ossigeno che passa dalla fase gassosa a quella liquida, ma i moo cominceranno a usare l’ossigeno e più velocemente crescono più ne useranno → la % di ossigeno disciolto diminuisce (la quantità è sempre la stessa ma diventa limitante). L'ossigeno è fondamentale per avere il giusto apporto energetico e la carenza di ossigeno è pericolosa per il processo, dobbiamo aumentare la velocità di trasferimento di ossigeno:

• Aumento agitazione perché le bolle devono essere il più piccolo possibile per aumentare il volume di scambio, la quantità di ossigeno è la stessa (non in valore assoluto) nella bolla grande e quella piccola
• Aumento il flusso di aria (WWM se il bioreattore è 1l si insuffla 1l al minuto), la concentrazione di ossigeno è la stessa aumento solo la velocità di ingresso → vantaggio temporaneo
• Si usa aria arricchita in ossigeno (>20,8% che è quella in aria)
• Facciamo uscire meno aria di quanta ne entra aumentando così la pressione

K (condizioni chimico-fisiche del processo), A (rapporto superficie/volume), Δ (c) (differenza di concentrazione tra la fase gassosa e la fase liquida).

Più bassa è la temperatura più ossigeno posso trasferire al terreno, ma non si abbassa mai la temperatura del processo.

Sensori per il trasferimento di ossigeno

• % ossigeno disciolto
• Portata d'aria in entrata e uscita
• Pressione aria in entrata e in uscita
• Velocità agitazione (se guardo l'agitazione so il consumo di ossigeno)
• Concentrazione tra l'ossigeno in entrata (20,8%) e l’uscita (<20,8%)
• Concentrazione tra la CO₂ in entrata (0,04%) e in uscita (>0,04%)

Sensori bioreattore

• Temperatura
• pH (tende sempre a scendere)
• Schiuma
• Sonda volume operativo
• Sonda prodotto
• Sonda reagente (glucosio)
• Concentrazione cellule
• Tutti i metaboliti possibili → se la concentrazione è elevata la resa del processo è bassa

Quoziente respiratorio (RQ)

La CO₂ viene prodotta nel mitocondrio da piruvato dalla piruvato deidrogenasi. Nel ciclo di Krebs viene prodotta CO₂. Se tutto il glucosio che è la fonte di carbonio e di energia viene consumato, la prima risorsa che viene consumata è l'energia. Se conosco il quoziente respiratorio conosco molto sul metabolismo della cellula.

Più gas immettiamo nei terreni più schiuma si può formare e non è la cosa migliore per il processo anche perché non è garante di omogeneità → si aggiungono antischiuma che abbassano la tensione superficiale. Vi sono dei sensori formati da due elettrodi distanti che, se vi è schiuma, chiudono il circuito e il computer capta il segnale che indica la presenza di schiuma.

Sonda glucosio

Biosensore costituito da un enzima (glucosio-ossidasi) che è un prodotto secondario della produzione di acido citrico. È un enzima secreto che genera gluconolattone ed acqua ossigenata da glucosio. L’acqua ossigenata interferisce con il passaggio tra i due elettrodi e, se conosco la corrente che passa tra i due elettrodi, so quanta acqua ossigenata è stata prodotta e di conseguenza quanto glucosio.

Se so quanto glucosio è stato consumato e quante cellule vi sono, so il consumo per cellula. Questo biosensore non può essere usato in un bioreattore perché il sensore deve essere sterilizzato e si perderebbe la struttura terziaria e secondaria dell'enzima e quindi la sua funzionalità. Non esiste quindi un sensore, va fatto un prelievo.

Trasferimento di calore

La temperatura deve essere costante e tipica della temperatura di esercizio di ogni moo. Esistono vari metodi per mantenere la temperatura costante:

• Finger con acqua che scorre + camicia esterna per riscaldare
• Camicia termica con due strati tra i quali passa acqua
• Serpentina interna al bioreattore che scorre sulla parete in cui passa acqua refrigerata o calda se devo sterilizzare. È presente soprattutto nei bioreattori di grandi dimensioni.

Se l’impianto di controllo della temperatura non è disegnato bene, non si riesce a mantenere la temperatura.

Omogeneità

La concentrazione in ogni punto del bioreattore deve essere identica per garantire la riproducibilità degli esperimenti. L'omogeneità viene garantita grazie all'agitazione che serve non solo a spezzare le bolle, come abbiamo visto in precedenza.

Esistono diversi tipi di agitazione su cui si basano diverse tecnologie reattoristiche:

• Agitazione meccanica → stirred tank: Se sono piccoli, i motori sono posti in fondo e possono essere formati anche da dei magneti. In quelli di dimensioni maggiori, i motori sono posti in alto; le pale sono collegate all'albero motore e sono poste sul fondo a distanze ben definite. È inevitabile formare un vortice, quindi sono presenti delle palette anti-vortice (4) e a spezzare il vortice concorrono anche i sensori e le stazioni di prelievo. La maggior parte delle fermentazioni sono sviluppate in stirred tank perché è il più facile da disegnare e sono i più flessibili, sono molto costosi.
• Pneumatica → air lift: Vi è una sola fermentazione industriale che usa questo bioreattore, ovvero la produzione di acido citrico con Aspergillus niger (fungo filamentoso che non può essere usato in uno stirred tank perché danneggerebbe il micelio). È un bioreattore molto semplice, ma poco flessibile e costa poco mantenerlo in funzione. Nessuno li costruisce. È un cilindro chiuso, all'interno vi è un altro cilindro aperto sia dall'alto che dal basso immerso nel volume operativo; viene insufflata aria sul fondo del cilindro piccolo, le bolle devono essere già piccolissime perché non verranno ulteriormente spezzate (A è fisso), entrano nel cilindro interno abbassando il peso specifico del terreno che sale e scende dal cilindro dove incontra un terreno con peso specifico diverso. L'agitazione dipende dalla quantità di aria che si inserisce. Una volta che è stato costruito non è modificabile.
• Idrodinamica → bubble column: Non ha applicazioni industriali vere e proprie, vengono usati per i trattamenti dei fanghi. È formato da un cilindro senza motore; si preleva parte del terreno, lo si ossigena e viene reimmesso nel bioreattore. Questo garantisce omogeneità e la presenza di ossigeno disciolto. Sono difficili da gestire dal punto di vista della riproducibilità.

Bioreattori e scale-up

Il bioreattore più grosso ha un volume operativo di un milione e mezzo di litri ed è un air lift per la produzione di acido citrico. Esistono bioreattori molto piccoli usa e getta di 50 µL (tipo pozzetti per saggi ELISA), vengono usati per lo screening. Il passo successivo è la beuta; appena possibile bisogna uscire dalla beuta ed usare i bioreattori dove si opera un ulteriore screening.

Successivamente si passa nel bioreattore da 10 L; finito il bioreattore da 10 L si passa allo scale-up, ovvero l'aumento delle dimensioni. La maggior parte dei processi in questa fase muore perché non riesce ad ottenere la stessa resa, produzione e produttività su vasta scala; si ottiene molto meno in più tempo. Il processo deve essere il più veloce possibile.

Non esiste un processo definito per lo scale-up, ma si operano vari tentativi:

• Il primo tentativo è la similarità geometrica, mantenendo le proporzioni tra i bioreattori e la crescita in beuta del quantitativo di terreno operativo. Il tutto deve essere graduale.
• Il secondo tentativo è garantire lo stesso quantitativo di energia elettrica per quantità di volume.
• Il terzo metodo fa sì che ci sia la stessa quantità di OTR (trasferimento di ossigeno) per unità di volume.

Lo scale-up non garantisce la stessa produzione e produttività ed il downstream costa più di tutto il processo. La purificazione è troppo costosa; queste sono le ragioni per cui una produzione fallisce.

Tecniche di crescita

Le tecniche di crescita sono:

• Batch
• Continuo
• Feed-batch

Batch

Una fase di mortalità è generalmente rara; le cellule non tendono a lisare per i moo, è più frequente nelle cellule di animale. Le cellule entrano in stazionaria per carenza di ossigeno; le condizioni non sono più ottimali perché mancano i micro-elementi.

I terreni molto ricchi sono i terreni contenenti i peptoni (idrolizzati di proteine) ed estratto di lievito; i terreni definiti presentano tutti i nutrienti in condizioni precise. Nei terreni ricchi le cellule crescono molto velocemente, ma come ricercatore preferisco lavorare con un terreno definito che posso controllare conoscendone la composizione. La fonte di carbonio ed energia è in eccesso.

Il pH spesso scende perché producono acidi organici e perché le cellule usano NH₃ da NH₄ con la perdita di un protone.

Fase esponenziale

Nella fase esponenziale le cellule crescono esponenzialmente:

• In ascissa il tempo
• In ordinata il numero di cellule o la densità ottica (es. raddoppia ogni ora)
• Interpolazione dei punti e verifica del coefficiente di correlazione che deve essere 1
• Identificare la funzione che contiene la velocità di crescita specifica che non è il tempo di duplicazione (es. 60 min)

Calcolo il numero di generazioni per ora:

• Tempo di duplicazione, velocità di crescita specifica (ore al minuto)
• Numero di generazioni all'ora, numero di generazioni y = 20e^0,0116x
• R² = 1

Scala logaritmica ordinata → retta, l'angolo è la velocità di crescita specifica:

• Numero di cellule = • 2ⁿ
• n = numero di generazioni
• tempo di generazione = (log(cells(t) - log(cells(0)) / log(2)