fecondazione: esempio echinodermi e mammiferi

Eventi della capacitazione

1. Modificazione della fluidità della membrana spermatica, nella composizione

lipidica, per permettere la fusione delle membrane dei due gameti.

2. Vengono persi dallo spermatozoo degli ioni potassio che rendono il potenziale

di membrana più negativo: la depolarizzazione permette la fusione delle

membrane. degli ioni potassio.

3. Rimozione di molecole di superficie: esistono molecole di superficie che

bloccano i recettori sulla testa dello spermatozoo. Viene rimosso il blocco

all’interazione con l’oocita per facilitare interazione trai gameti.

4. Fosforilazione proteica estesa: modificazioni post-traduzionali per regolare le

proteine per facilitare l’interazione ligando-recettore.

Anche l’ovulo attua dei meccanismi per favorire la fecondazione interna:

Chemiotassi, operata da fattori presenti nel fluido follicolare, che vengono secreti da

⇒ oociti in grado di essere fecondati (circa la meta’ in condizioni sperimentali).

Iperattivazione: operata da fattori solubili presenti nell’ovidotto, che agevolano la

⇒ traslocazione dello sperma lungo l’ovidotto.

Questi fattori si dispongono secondo gradiente di concentrazione lungo tutto l’apparato

riproduttivo femminile. Sono meccanismi di riconoscimento per garantire che lo spermatozoo

raggiunga oocita.

Livelli di controllo specie-specifica nei vertebrati

I vertebrati con fecondazione interna sono accompagnati da meccanismi di riconoscimento

anatomico;

* nelle specie con fecondazione esterna, si sono evoluzionate tecniche di

accoppiamento che evitano che una specie provi a fecondarne un’altra. Es una gallina

non è attratta dal corteggiamento del pavone.

Una volta che gli spermatozoi sono entrati nel tratto genitale femminile lo devono percorrere

e raggiungere l’oocita.

1. Forse anche nei mammiferi esistono molecole di chemioattrazione, come il peptide

RESACT del riccio di mare: non per necessità di riconoscimento tra specie, ma per attrarre

fisicamente gli spermatozoi all’oocita nel minor tempo possibile nel lungo tratto genitale

femminile. Non sono presenti meccanismi di controllo ligando-recettore;

2. Barriera d’interazione recettore♂-ligando♀: nei mammiferi, le proteine analoghe alla

bindina sono codificate dal gene ZP3 (zona pellucida) e il suo recettore sulla superficie

dello spermatozoo.

per identificare la proteina ZP3

àEsperimento

- Utilizzando la Tecnica del Northern blot: prima di tutto vengono estratti tutti gli mRNA di

ciascun tessuto sminuzzando l’embrione; gli mRNa vengono sottoposti a corsa di elettroforesi;

si localizzano con sonda molecolare specifica gli mRNA della proteina ZP3 per identificarne la

localizzazione: è situato sulla superficie della zona pellucida.

- Gli esperimenti di ibridazione in situ mostrano che l’mRNA del gene ZP3 è espresso in

maggioranza negli oociti, in particolare nei più maturi, pronti all’ovulazione. In questi il gene è

espresso di più perché necessita della proteina sulla zona pellucida in modo da permettere la

fecondazione da parte dello spermatozoo.

Il complesso ZP è di grandi dimensioni, costituito da 3 tipi di proteine:

ZP1. Forma ponti trasversali che tengono insieme le catene filamentose di ZP2 e ZP3.

ZP2 e ZP3 sono catene filamentose che si alternano, tenute insieme da ponti trasversali. Sulla

loro superficie sono presenti residui glucidici, applicati dal golgi durante le modificazione

post-traduzionali della proteina. Sono molto abbondanti su ZP3, la proteina più attiva del

complesso. per studiare il complesso ZP

àEsperimento

- saggio d’inibizione. Si eseguono tre esperimenti in cui mettono a contatto le singole proteine

del complesso con gli spermatozoi. Si tenta una fecondazione in vitro: gli spermatozoi

precedentemente trattati sono ora messi a contatto con l’oocita. La proteina responsabile

dell’interazione ligando-recettore saturerà i recettori degli spermatozoi, inibendo la loro

capacità di fecondare l’oocita.

Con ZP1 purificata — avviene la fecondazione, con un’efficienza di legame spermatozoo-

ovocita del 100%.

Con ZP2 la situazione è simile.

Con ZP3, al contatto degli spermatozoi con la zona pellucida la fecondazione viene inibita.

Con ZP3 senza residui glucidici, la capacità di saturare i recettori e di inibire gli spermatozoi è

parzialeài residui glucidici sono coinvolti nell’interazione recettore-ligando.

Quando lo spermatozoo raggiunge la superficie dell’oocita, in quest’ultimo si formano delle

protrusioni: i coni di fecondazione, che garantiscono l’inglobamento del nucleo spermatico. Ad

entrare nell’oocita sono il nucleo, il centriolo e raramente qualche mitocondrio, che si

diluiscono nei tanti mitocondri dell’oocita. Il contributo maschile alla fecondazione è solo

genetico. Il centriolo nell’embrione sarà per il 50% paterno e 50% materno.

Blocco della polispermia

Sulla superficie dell’oocita di riccio di mare ci sono milioni di spermatozoi.

C’è la possibilità che più di uno spermatozoo riesca a entrare per fecondare: si forma uno

zigote con contenuto genetico 3n e lo sviluppo sarà aberrante, perchè ci sono cromosomi e lo

zigote non sopravvive.

Si sono evoluzionate 2 meccanismi che assicurano, sempre con un margine di errore, che

l’oocita venga fecondato da un solo spermatozoo;

Blocco rapido variazione del potenziale di membrana a diverse concentrazioni di Na

àEsperimento: +.

L’oocita è immerso in un ambiente con grande disponibilità di ioni, come in acqua di mare

dove lo ione sodio è molto concentrato (490millimolare).

[Na ]=490 mM - il primo spermatozoo che tocca l’oocita attiva il blocco rapido della

+

polispermia: la membrana dell’oocita passa da un potenziale di -60 a +20, in modo da

impedire agli altri spermatozoi di interagire. Il 22% degli oociti fecondati sarà polismermico.

Si abbassa la probabilità di polispermia.

[Na ]=50 mM - iperpolarizzazione della membrana. La concentrazione è troppo bassa e il

+

100% oociti saranno polismermici.

È il primo blocco che l’oocita pone. La membrana depolarizzata a +20 è in una condizione

innaturale che pone l’oocita ad un rischio di esplosione osmotica: il Na si concentra

+

all’interno del citoplasma dell’oocita, aumenta la quantità di soluto nel citosoplasma, che

richiama solvente dall’esterno. Se così fosse entrerebbe tanta acqua da farlo esplodere.

Per questo motivo la depolarizzazione è conservata per circa 60 secondi. Dopo il primo

minuto, il potenziale è ripristinato a -60.

Il blocco della polispermia evita che in questo minuto entrino altri spermatozoi, ma non può

impedire l’ingresso nei momenti successivi. Segue un blocco lento.

Blocco lento

Sulla superficie dell’oocita, immediatamente sotto la membrana plasmatica, nella zona

corticale del citoplasma, sono distribuiti circa 10.000 granuli corticali: al loro interno

accumulano materiale in modo compatto a forma di spirale, per contenere molte sostanze.

Quando il primo spermatozoo entra in contatto con l’oocita comincia l’attivazione dei granuli

corticali: per attivarli ci vuole un minuto, per questo avviene il blocco rapido prima. I granuli

corticali liberano il loro contenuto al di fuori della membrana plasmatica e formano una

barriera fisica all’accesso degli spermatozoi: la membrana di fecondazione, posta tra

membrana vitellina e quella plasmatica (le allontana).

I granuli corticali contengono:

1. La proteina ialina: molto densa ma traslucida. Nella membrana di fecondazione si

deposita nella faccia a contatto con la m. plasmatica.

2. Proteasi: distruggono le proteine che connettono la m. vitellina e la plasmatica,

permettendo l’allontanamento. Inoltre distruggono i recettori della bindina in modo da

impedire l’attacco dell’oocita da parte di altri spermatozoi.

3. Mucopolisaccaridi: Riempiono lo spazio, sono molto densi, quindi creano gradiente

osmotico e attirano l’acqua. L’acqua aumenta di volume il nuovo spazio formatosi,

allontanando ulteriormente le MV e Mp.

4. Enzima perossidasi: fa si che avvengano legami trasversali sui residui tirosinici delle

proteine che si trovano nella parte esterna della membrana di fecondazione: la rinforzano.

Membrane dell’oocita (esternoàinterno):

mV - ambiente fluido con h2o marina e polisaccaridi - strato denso di proteina – mP

La membrana di fecondazione accompagnerà lo zigote per parte dello sviluppo.

⇒ Formazione della m. fecondazione: si propaga come un onda, perché l’esocitosi dei granuli

⇒ corticali è attivata come una reazione a catena.

I recettori della bindina non sono equamente distribuiti sulla superficie dell’oocita, ma ci

⇒ sono delle regioni in cui non sono addensati, quindi l’oocita induce l’attacco degli

spermarozoi solo in alcune regione.

Esocitosi dei granuli corticali

Una serie di segnalazioni e processi biochimici sulla superficie dell’oocita portano al rilascio di

calcio dal RE. L’esocitosi è attivata da ioni calcio intracellulare, che si trova accumulato nel RE

delle cellule. Quando il primo spermatozoo si lega alla bindina, un meccanismo di trasduzione

del segnale media il rilascio dello ione calcio dal RE nel punto d’ingresso.

per seguire il percorso dello ione calcio nella cellula:

àEsperimento

lo ione calcio è marcato con materiale fluorescente. Inizialmente viene rilasciato solo nel sito

di ingresso dello spermatozoo ma successivamente il segnale si propaga ad onda e man mano

viene rilasciato da tutte le cellule, permettendo così la secrezione dei granuli corticali su tutta

la superficie dell’oocita. Il rilascio di calcio intracellulare continua anche durante la fusione dei

due nuclei. Fecondazione negli anfibi

Negli anfibi la fecondazione avviene più o meno come in riccio di mare.

L’oocita è bloccato nello stadio di lipotene, il completamento avviene tra ovulazione e

fecondazione, durante l’atto sessuale.

La meiosi è bloccata perché MPF è inattivo. Durante l’ovulazione aumentano i livelli di

progesterone, che fosforilano la chinasa e attivano la proteina c-Mos.

In questo modo si attiva il complesso MPF sbloccando la meiosi I. Si produce il primo corpo

polare.

La meiosi procede fino alla metafase II, dove si blocca nuovamente: al momento della

fecondazione il flusso di calcio attiva la calmodulina, una proteina modulata dal calcio.

La calmodulina attiva due proteasi, che degradano la proteina CSF (fattore citostatico)

responsabile del blocco. Si riattiva la meiosi: alla fine si ottengono 3 corpuscoli polari e l’uovo

con tutto il citoplasma.