Fecondazione e Embriogenesi, Embriologia

Fecondazione

Abbiamo parlato finora di cosa avviene all'oocita una volta che ha lasciato l'ovaio e di cosa avviene al gamete maschile, ovvero allo spermatozoo, nelle vie genitali femminili e di come questo giunge nelle vicinanze dell'oocita. Avevamo indicato almeno tre sostanze, ANP (atrial natriuretic peptide), progesterone e RANTES, presenti in strutture diverse: il liquor follicolare per quanto riguarda ANP, e invece le cellule del cumulo ooforo, che rimangono con l'oocita insieme alla corona radiata, che producono invece altre sostanze e le rilasciano nella tuba uterina aiutando la chemiotassi degli spermatozoi verso l'oocita.

L'immagine dà un'idea di cosa vuol dire corona raggiata: l'oocita è al centro e tutte le cellule attorno sono state rilasciate dall'ovario e dal follicolo insieme all'oocita. Ovviamente il numero di cellule che compongono la corona raggiata è variabile, perché è più o meno casuale quante rimarranno associate all'oocita e quante rimarranno nel follicolo. Vi ricordo che l'oocita non ha ancora terminato la seconda divisione meiotica ed è ancora ricoperto dalla zona pellucida.

Ad un certo punto, finalmente, gli spermatozoi giungono in prossimità dell'oocita e prendono contatto con esso. La prima barriera è composta dalle cellule della corona raggiata e dalla matrice extracellulare, che tiene insieme queste cellule, che è in gran parte composta da acido ialuronico. Perciò gli spermatozoi sono dotati di ialuronidasi, già presenti nella MP dello spermatozoo ancora prima che avvenga la reazione acrosomiale, che ne aiutano il passaggio all'interno della corona raggiata. Lo spermatozoo è arrivato in prossimità dell'oocita e deve arrivare alla membrana dell'oocita stesso; c'è ancora una struttura molto importante, che è la zona pellucida, che separa lo spermatozoo dall'oocita.

Zona pellucida e suo riconoscimento

Una volta che lo spermatozoo penetra la corona radiata, contatta la prima struttura propria dell'oocita, che è la zona pellucida. Viene in contatto quindi con proteine filamentose che creano una rete intricata. Il contatto con la zona pellucida avviene tramite un sistema di riconoscimento. Lo spermatozoo possiede delle proteine trasmembrana che sono dei recettori, in grado di legare le proteine della zona pellucida scatenando la prima reazione attiva dello spermatozoo, che è la reazione acrosomiale.

Tutto quello che era all'interno dell'acrosoma, che è stato immagazzinato lì durante la spermiogenesi (fase di maturazione dello spermatozoo nei tubuli seminiferi), viene istantaneamente rilasciato laddove lo spermatozoo ha riconosciuto la zona pellucida. Questo permette la penetrazione dello spermatozoo all'interno della zona pellucida, grazie alle numerose proteasi acrosomiali che tagliano questa rete intricata, facendosi strada verso la membrana.

Quando giungono in prossimità della MP deve avvenire un secondo riconoscimento perché le membrane si fondano. Non basta passare la zona pellucida perché lo spermatozoo si fonda con l'oocita, anche quando le due membrane cellulari sono a stretto contatto, sono necessarie delle interazioni recettore-ligando per assicurarsi dell'identità reciproca e quindi permettere la fusione delle membrane.

Questo schema mostra le stesse fasi e mette in evidenza come lo spermatozoo, una volta che ha superato la zona pellucida, raggiunga l'oolemma, la membrana dell'oocita, ma non si pianti con la porzione anteriore, ma è in posizione tangenziale a questa. Ciò è importante per permettere l'entrata, insieme al pronucleo, di un'altra struttura che è fondamentale e che è portata dallo spermatozoo.

È una struttura abbastanza semplice, perché è formata principalmente da tre proteine: ZP1, ZP2, ZP3. ZP2 e ZP3 formano delle specie di filamenti, mentre ZP1 forma dei ponti trasversali tra di essi, creando una rete complessa. Queste proteine sono altamente glicosilate.

Il meccanismo con cui gli spermatozoi legano e riconoscono la zona pellucida, non è ancora perfettamente conosciuto. Sembra che quello che viene riconosciuto della zona pellucida non sia un antigene preciso, non c'è un recettore che riconosce un'unica proteina. Si sa che ZP3 è molto importante per questo legame, ma non ne è l'unica responsabile. Quello che si pensa è che lo spermatozoo riconosca una struttura tridimensionale data dalle proteine della zona pellucida e dalle loro catene glucidiche. È un riconoscimento complesso.

La miglior indicazione a supporto di tale ipotesi è il fatto che, una volta avvenuta la fecondazione, una delle prime cose che fa l'oocita è rilasciare le proteasi nella zona pellucida, in modo che nessun altro spermatozoo possa fecondare l'oocita. Una di queste proteasi è l'ovastacina che taglia ZP2 in due pezzi, inibendo il riconoscimento degli spermatozoi rispetto alla zona pellucida, anche se i componenti sono praticamente tutti ancora lì. Non è il semplice taglio di ZP2 a inibire, ma una struttura di tutte le proteine insieme.

Questo riconoscimento ha una funzione fondamentale per indurre la reazione acrosomiale. Infatti, se si presenta uno spermatozoo di un mammifero a un oocita di un'altra specie, avranno tutti delle proteine ZP1, 2, 3, ma il riconoscimento non avviene; quindi lo spermatozoo non potrà mai fondersi con la membrana. La zona pellucida ha un ruolo nel blocco della polismermia. Una volta che è avvenuta la fecondazione vera e propria, ovvero quando il nucleo dello spermatozoo è entrato nel citoplasma dell'oocita, quest'ultimo mette in atto delle difese, per bloccare l'entrata di altri nuclei, cambiando la natura della zona pellucida in modo che non sia più attraversabile da parte degli spermatozoi.

Essa ha anche una funzione prima che avvenga la fecondazione, e anche una volta avvenuta nell'ampolla della tuba uterina, prima che avvenga l'impianto, che è prevenire che la struttura embrionale, che si svilupperà dallo zigote, scelga di impiantarsi nell'epitelio della tuba uterina, piuttosto che nell'endometrio uterino. Una delle prime cose che fa l'embrione è sviluppare un tessuto molto particolare, il tropoblasto, necessario per l'annidamento nell'endometrio. Tale tessuto è molto efficiente. Se l'embrione in via di sviluppo si libera della zona pellucida prima di arrivare nell'utero, si anniderà nella tuba uterina, cosa molto pericolosa perché la gravidanza extrauterina comincia a scatenare una serie di reazioni nella tuba uterina, causando perdite ingenti di sangue, nel tessuto sbagliato. Infatti è l'utero l'organo deputato a coordinarsi con l'embrione rispondendo in maniera controllata. Quindi l'embrione dovrà liberarsi della zona pellucida prima di andare incontro all'impianto.

Cascata della reazione acrosomiale

Ogniqualvolta esiste un segnale (zona pellucida e suo recettore), vuol dire che esso sta passando dall'esterno all'interno della cellula e, in questo caso, esiste una cascata di reazioni chimiche che amplificano questo segnale e che coinvolgono l'entrata di Ca²⁺ e la funzione di IP (fosfatidilinositolo) bi e tris fosfato, ovvero i secondi messaggeri. I IP sono quelli che reclutando delle proteine effettrici, come ad esempio una proteina chinasi che si localizza nella membrana in loro presenza, la quale fa partire a sua volta una cascata che dà il via al processo di esocitosi dell'acrosoma. L'acrosoma è un'enorme vescicola endocitica molto specializzata e il suo rilascio avviene con un normale processo di esocitosi, tranne il fatto che la struttura non è una piccola vescicola, ma copre più o meno metà del nucleo.

Questo è lo schema che mostra come lo spermatozoo, giunto in prossimità della zona pellucida, faccia avvenire la fusione localizzata tra MP e membrana acrosomiale esterna, questo fa in modo che il contenuto dell'acrosoma possa uscire per semplice effusione. Quella interna è più vicina al nucleo.

Dopo la reazione rimane la testa dello spermatozoo, fino a metà della testa c'è ancora MP originale; la parte anteriore del nucleo a questo punto è rivestita dalla membrana interna dell'acrosoma. Le due membrane hanno una composizione diversa, con proteine trans membrana diverse. Anche se le membrane sono dei doppi strati in cui le proteine all'interno diffondono liberamente, si frappongono altre strutture, come ciò che rimane della vescicola acrosomiale, che rallentano la diffusione, facendo in modo che ci siano delle piccole differenze, importanti per quello che avverrà subito dopo.

Ricapitolando: arriva lo spermatozoo che passa la corona radiata e contatta la zona pellucida, il contatto attiva recettori della membrana dello spermatozoo, che, con secondi messaggeri, stimolano il rilascio della vescicola acrosomiale. La reazione acrosomiale fa in modo che si liberino nella zona pellucida tutte le proteasi che si erano accumulate all'interno della vescicola. Queste tagliano il reticolo facendo spazio al movimento dello spermatozoo, spinto anche dal flagello che aiuta la penetrazione nella zona pellucida e avvicinandosi alla superficie dell'oocita che presenta dei microvilli.

Fusione tra spermatozoo e oocita

I microvilli dell'oocita contattano la testa dello spermatozoo nel segmento equatoriale, laddove c'era la vera membrana plasmatica esterna dello spermatozoo in un punto specifico, poiché ci sono delle proteine che mediano questa interazione che non ci sono sulla membrana acrosomiale interna. Esistono numerosi sistemi per far concentrare determinate proteine in punti specifici e non in altri.

La fusione non è passiva, si ha una fusione attiva da parte dell'oocita, che una volta che ha sentito lo spermatozoo, usa questa informazione per attuare un processo simile alla fagocitosi, modella il proprio citoplasma grazie ad uno scheletro di actina, avvolgendo completamente la testa dello spermatozoo inglobandolo. Non c'è una semplice fusione probabilmente perché, non solo il nucleo deve entrare nel citoplasma dell'oocita, ma anche il centriolo alla base del nucleo, che ha la funzione di organizzare i microtubuli del flagello, e una parte iniziale del flagello con qualche mitocondrio paterno anche se la stragrande maggioranza è materna. Quello che rimane dello spermatozoo nello zigote sono il nucleo e il centriolo.

Segnali IZUMO e recettori JUNO

Il fatto che spermatozoo e oocita interagiscano in maniera stereotipata e precisa, con avvicinamento e specifici eventi secondari, indica che ci sono dei segnali e dei recettori in grado di sentirli. Il segnale che portava lo spermatozoo è IZUMO, una proteina transmembrana recepita dalla proteina recettore JUNO scoperta il 24/04/2014. Questa proteina è fondamentale sull'oocita per il riconoscimento e la fusione delle membrane, sennò non c'è fecondazione. Mutazioni di queste due proteine causano sterilità.

JUNO è fondamentale anche nelle fasi successive, subito dopo la fecondazione, e fa in modo che non ci sia la fecondazione da parte di un altro spermatozoo. Questo perché l'oocita può venire a contatto con 10-20 spermatozoi diversi, che arriveranno alla zona pellucida nello stesso momento, iniziando a degradarla e quindi potrebbe essere che 2 o più spermatozoi fondano la loro membrana con l'oocita, fatto che non deve avvenire perché se ci fossero tre nuclei nell'embrione esso non potrebbe svilupparsi e fare mitosi correttamente. Quindi subito dopo la fecondazione, una delle numerose cose che avvengono è che lo zigote si libera del recettore JUNO intrappolandolo in vescicole che vengono eliminate all'esterno. In questo modo, non c'è più recettore disponibile, quindi anche se ci fosse uno spermatozoo che è riuscito ad arrivare molto vicino alla membrana, quasi in contemporanea con l'altro, non viene captato poiché è eliminato il recettore stesso.

Proteina CD9

Un altro macchinario che è coinvolto nel riconoscimento e nella fusione delle membrane spermatozoo-oocita è la proteina CD9, che è della famiglia delle tetraspanine, proteine a cui piace stare insieme ad altre tetraspanine ed anche ad alcune integrine, quindi aggregano grosse strutture di membrana, la cui funzione si pensa sia più effettrice piuttosto che di riconoscimento. IZUMO e JUNO hanno invece una funzione ligando-recettore, di riconoscimento. Una volta che le due proteine si sono riconosciute il recettore JUNO sicuramente farà qualcosa all'interno dell'oocita scatenando una risposta. La proteina CD9, le integrine e le altre tetraspanine, invece, sembrano avere più una funzione di macchinario che promuove la fusione delle membrane cellulari molto vicine, tipo SNARE del traffico.