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Fecondazione e Embriogenesi, Embriologia

Appunti di Embriologia per l’esame del professor Dupont. Gli argomenti trattati sono i seguenti: la fecondazione, l'embriogenesi, la reazione acrosomiale, la zona pellucida e suo riconoscimento, il meccanismo con cui gli spermatozoi legano e riconoscono la zona pellucida.

Esame di Embriologia docente Prof. S. Dupont

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ESTRATTO DOCUMENTO

Zona pellucida e suo riconoscimento

È una struttura abbastanza semplice, perché è formata principalmente

da tre proteine: ZP1, ZP2, ZP3.

ZP2 e ZP3 formano delle specie di filamenti, mentre ZP1 forma dei

ponti trasversali tra di essi, creando una rete complessa. Queste proteine

sono altamente glicosilate.

Il meccanismo con cui gli spermatozoi legano e riconoscono la zona pellucida, non è ancora

perfettamente conosciuto. Sembra che quello che viene riconosciuto della zona pellucida non sia

un antigene preciso, non c’è un recettore che riconosce un’unica proteina. Si sa che ZP3 è molto

importante per questo legame, ma non ne è l’unica responsabile. Quello che si pensa è che lo

spermatozoo riconosca una struttura tridimensionale data dalle proteine della zona pellucida e

dalle loro catene glucidiche. È un riconoscimento complesso. La miglior indicazione a supporto di

tale ipotesi è il fatto che, una volta avvenuta la fecondazione, una delle prime cose che fa l’oocita

è rilasciare le proteasi nella zona pellucida, in modo che nessun’altro spermatozoo possa

fecondare l’oocita. Una di queste proteasi è l’ovastacina che taglia ZP2 in due pezzi, inibendo il

riconoscimento degli spermatozooi rispetto alla zona pellucida, anche se i componenti sono

praticamente tutti ancora lì. Non è il semplice taglio di ZP2 a inibire, ma una struttura di tutte le

proteine insieme.

Questo riconoscimento ha una funzione fondamentale per indurre la reazione acrosomiale. Infatti

se si presenta uno spermatozoo di un mammifero a un oocita di un’altra specie, avranno tutti delle

proteine ZP1, 2, 3 ma il riconoscimento non avviene; quindi lo spermatozoo non potrà mai

fondersi con la membrana.

La zona pellucida ha un ruolo nel blocco della polismermia. Una volta che è avvenuta la

fecondazione vera e propria, ovvero quando il nucleo dello spermatozoo è entrato nel citoplasma

dell’oocita, quest’ultimo mette in atto delle difese, per bloccare l’entrata di altri nuclei, cambiando

la natura della zona pellucida in modo che non sia più attraversabile da parte degli spermatozoi.

Essa ha anche una funzione prima che avvenga la fecondazione, e anche una volta avvenuta

nell’ampolla della tuba uterina, prima che avvenga l’impianto, che è prevenire che la struttura

embrionale, che si svilupperà dallo zigote, scelga di impiantarsi nell’epitelio della tuba uterina,

piuttosto che nell’endometrio uterino. Una delle prime cose che fa l’embrione è sviluppare un

tessuto molto particolare, il tropoblasto, necessario per l’annidamento nell’endometrio. Tale

tessuto è molto efficiente. Se l'embrione in via di sviluppo si libera della zona pellucida prima di

arrivare nell’utero, si anniderà nella tuba uterina, cosa molto pericolosa perché la gravidanza

extrauterina comincia a scatenare una serie di reazioni nella tuba uterina, causando perdite ingenti

di sangue, nel tessuto sbagliato. Infatti è l’utero l’organo deputato a coordinarsi con l’embrione

rispondendo in maniera controllata. Quindi l’embrione dovrà liberarsi della zona pellucida prima

di andare incontro all’impianto.

Cascata della reazione acrosomiale

Ogniqualvolta esiste un segnale (zona pellucida e suo recettore), vuol dire che esso sta passando

dall’esterno all’interno della cellula e, in questo caso, esiste una cascata di reazioni chimiche che

2+

amplificano questo segnale e che coinvolgono l’entrata di Ca e la funzione di IP (fosfatidil

inositolo) bi e tris fosfato, ovvero i secondi messaggeri. I IP sono quelli che reclutando delle

proteine effettrici, come ad esempio una proteina chinasi che si localizza nella membrana in loro

presenza, la quale fa partire a sua volta una cascata che dà il via al processo di esocitosi

dell’acrosoma. L' acrosoma è un’enorme vescicola

endocitica molto specializzata e il suo

rilascio avviene con un normale processo di

esocitosi, tranne il fatto che la struttura non è

una piccola vescicola, ma copre più o meno

metà del nucleo.

Questo è lo schema che mostra come lo

spermatozoo, giunto in prossimità della zona

pellucida, faccia avvenire la fusione

localizzata tra MP e membrana

acrosomiale esterna, questo fa in modo che

il contenuto dell’acrosoma possa uscire per

semplice effusione. Quella interna è più

vicina al nucleo.

Dopo la reazione rimane la testa dello spermatozoo, fino a metà della testa c’è ancora MP

originale; la parte anteriore del nucleo a questo punto è rivestita dalla membrana interna

dell'acrosoma. Le due membrane hanno una composizione diversa, con proteine trans membrana

diverse. Anche se le membrane sono dei doppi strati in cui le proteine all’interno diffondono

liberamente, si frappongono altre strutture, come ciò che rimane della vescicola acrosomiale, che

rallentano la diffusione, facendo in modo che ci siano delle piccole differenze, importanti per

quello che avverrà subito dopo.

Ricapitolando: arriva lo spermatozoo che passa la corona radiata e contatta la zona pellucida, il

contatto attiva recettori della membrana dello spermatozoo, che, con secondi messaggeri,

stimolano il rilascio della vescicola acrosomiale. La reazione acrosomiale fa in modo che si

liberino nella zona pellucida tutte le proteasi che si erano accumulate all’interno della vescicola.

Queste tagliano il reticolo facendo spazio al movimento dello spermatozoo, spinto anche dal

flagello che aiuta la penetrazione nella zona pellucida e avvicinandosi alla superficie dell’oocita

che presenta dei microvilli.

I microvilli dell'oocita contattano la testa dello spermatozoo nel segmento equatoriale, laddove

c’era la vera membrana plasmatica esterna dello spermatozoo in un punto specifico, poiché ci

sono delle proteine che mediano questa interazione che non ci sono sulla membrana acrosomiale

interna. Esistono numerosi sistemi per far concentrare determinate proteine in punti specifici e non

in altri.

La fusione non è passiva, si ha una fusione attiva da parte dell'oocita, che una volta che ha sentito

lo spermatozoo, usa questa informazione per attuare un processo simile alla fagocitosi, modella il

proprio citoplasma grazie ad uno scheletro di actina, avvolgendo completamente la testa dello

spermatozoo inglobandolo. Non c'è una semplice fusione probabilmente perché, non solo il nucleo

deve entrare nel citoplasma dell’oocita, ma anche il centriolo alla base del nucleo, che ha la

funzione di organizzare i microtubuli del flagello, e una parte iniziale del flagello con qualche

mitocondrio paterno anche se la stragrande maggioranza è materna. Quello che rimane dello

spermatozoo nello zigote sono il nucleo e il centriolo.

Segnali IZUMO e recettori JUNO Il fatto che spermatozoo e oocita

interagiscano in maniera stereotipata e

precisa, con avvicinamento e specifici

eventi secondari, indica che ci sono dei

segnali e dei recettori in grado di sentirli.

Il segnale che portava lo spermatozoo è

IZUMO, una proteina transmembrana

recepita dalla proteina recettore JUNO

scoperta il 24/04/2014. Questa proteina è

fondamentale sull'oocita per il

riconoscimento e la fusione delle

membrane, sennò non c'è fecondazione.

Mutazioni di queste due proteine causano sterilità. JUNO è fondamentale anche nelle fasi

successive, subito dopo la fecondazione, e fa in modo che non ci sia la fecondazione da parte di un

altro spermatozoo. Questo perché l’oocita può venire a contatto con 10-20 spermatozoi diversi,

che arriveranno alla zona pellucida nello stesso momento, iniziando a degradarla e quindi

potrebbe essere che 2 o più spermatozoi fondano la loro membrana con l’oocita, fatto che non

deve avvenire perché se ci fossero tre nuclei nell’embrione esso non potrebbe svilupparsi e far

mitosi correttamente. Quindi subito dopo la fecondazione, una delle numerose cose che

avvengono è che lo zigote si libera del recettore JUNO intrappolandolo in vescicole che vengono

eliminate all’esterno. In questo modo, non c'è più recettore disponibile, quindi anche se ci fosse

uno spermatozoo che è riuscito ad arrivare molto vicino alla membrana , quasi in contemporanea

con l’altro, non viene captato poiché è eliminato il recettore stesso.

Proteina CD9 Un altro macchinario che è

coinvolto nel riconoscimento e

nella fusione delle membrane

spermatozoo-oocita è la

proteina CD9, che è della

famiglia delle tetraspanine,

proteine a cui piace stare

insieme ad altre tetraspanine

ed anche ad alcune integrine,

quindi aggregano grosse

strutture di membrana, la cui

funzione si pensa sia piú

effettrice piuttosto che di

riconoscimento.

IZUMO e JUNO hanno invece una funzione ligando-recettore, di riconoscimento. Una volta che

le due proteine si sono riconosciute il recettore JUNO sicuramente farà qualcosa all'interno

dell'oocita scatenando una risposta. La proteina CD9, le integrine e le altre tetraspanine, invece,

sembrano avere più una funzione di macchinario che promuove la fusione delle membrane

cellulari molto vicine, tipo SNARE del traffico vescicolare che forniscono l'energia necessaria

perché due membrane vicine si fondano. Il lavoro delle proteine CD9 assieme alle altre è

equivalente a questo. CD9 insieme a JUNO e a IZUMO sono fondamentali per la fertilità

femminile; mutazioni di CD9 portano a infertilità femminile, dato che questa proteina è espressa

dall'oocita.

Effetti della fecondazione sull'oocita, processi a valle della fecondazione

Tutti gli eventi che seguono la fecondazione avvengono in ordine:

1. Primo evento, il più rapido, è il blocco della polispermia, che avviene in due modi:

blocco rapido della polismermia, che avviene in frazioni di secondo, e reazione corticale,

cioé il blocco lento della polismermia, che impiega un po' più di tempo per avvenire.

Entrambi sono descritti sia per mammiferi che per l'uomo. Si conoscono le basi del blocco

lento, ma non i meccanismi alla base del blocco rapido.

2. Completamento della seconda divisione meiotica da parte dell'oocita, altrimenti il

bilancio dei cromosomi (23 paterni+23 materni) per creare una cellula diploide non torna.

L'oocita quando viene ovulato lo fa assieme al suo primo corpo polare, il risultato della

prima divisione meiotica che viene completata subito prima dell'ovulazione in risposta agli

stessi segnali, LH e FSH, che inducono l'ovulazione. Quando arriva lo spermatozoo

compare il secondo corpo polare, che viene poi eliminato. A questo punto abbiamo un

corredo genetico corretto per continuare lo sviluppo dello zigote. Abbiamo una cellula, i

due pronuclei, un corredo genetico diploide che permette di iniziare l'embriogenesi.

Embriogenesi

3. Attivazione metabolica dell'embrione. Mentre oocita e spermatozoo erano strutture

terminalmente differenziate e altamente specializzate a svolgere un'unica funzione nel

corso della loro vita (tanto che nel caso degli spermatozoi devono addirittura venire

nascosti per non essere riconosciuti dal sistema immunitario che prima non li aveva mai

visti), tali strutture specializzate adesso devono riprogrammarsi completamente partendo

da zero, per ricostruire interamente il corpo del feto e gli annessi fetali, cioè i tessuti extra-

embrionali (placenta). Molto precocemente si riattiva nello zigote il metabolismo proprio

necessario alle rapide divisioni cellulari mitotiche successive, e anche la trascrizione dei

geni propri in modo da prepararsi per le fasi successive dello sviluppo.

Bisogna ricordare che, mentre per la maggior parte dei geni l'allele paterno o materno non

fa nessuna differenza, nel senso che vengono espressi entrambi, esistono delle piccole

eccezioni che si chiamano GENI IMPRINTATI. Essi hanno l'imprinting o materno o

paterno; quindi anche se l'allele paterno è presente, non verrà espresso. Viceversa ci sono

geni in cui anche se l'allele materno è presente, questo non verrà trascritto. Questo è un

modo per assicurarsi che lo zigote sia il risultato di una riproduzione sessuata e non un

evento di partenogenesi: cioè ad esempio una fase II della meiosi che per qualche motivo

non è andata a buon fine, per qualche ragione l'oocita si è attivato e sembrerebbe avere un

corredo cromosomico esatto anche se non lo è, quindi lo sviluppo potrebbe iniziare, cosa

che non dovrebbe accadere.

4. Si ha in parallelo la decondensazione dei cromosomi dello spermatozoo, in modo da

rendere la cromatina accessibile alla trascrizione, dato che il nucleo dello spermatozoo era

stato compattato in maniera particolare da proteine istoniche proprie dello spermatozoo e

anche dalle protammine, ulteriori proteine specifiche che si trovano solo nello

spermatozoo con ruolo di condensare il nucleo maschile. Questo pronucleo va

rimaneggiato per fare la prima mitosi. Il rimaneggiamento consiste nella rimozione della

cromatina dello spermatozoo che viene sostituita da una nuova cromatina che deriva dalle

scorte di proteine materne. Tali proteine ricromatinizzano il genoma paterno. Solo a questo

stadio, quando il nucleo dello spermatozoo è stato decondensato, si può parlare di

pronucleo paterno, quindi solo dopo che è stato rimaneggiato dal citoplasma dell'oocita in

modo che la sua cromatina sia gestibile.

5. Quando i cromosomi iniziano a trascrivere avremo la definizione del sesso genetico: il

gamete femminile contribuirà sempre con cromosoma X, nel caso dello spermatozoo potrà

contribuire con X definendo il sesso femminile e con Y definendo quello maschile. Questo

è il primo momento in cui si esprimono i geni, o da X o da Y che identificano il sesso di

zigote e feto.

6. Cancellazione delle modificazioni epigenetiche della cromatina: durante l'ovogenesi e

la spermatogenesi, nel lungo cammino che porta prima alle cellule germinali, poi a quelle

terminalmente differenziate, molti geni sono stati silenziati in maniera epigenetica, i geni

ci sono ma il macchinario di trascrizione non può accedervi; è come se ci fosse una grande

biblioteca in cui c'è tutto il sapere di cui abbiamo bisogno, ma una stanza è chiusa a chiave

e noi non possiamo entrarci, questo va bene per spermatozoo e oocita, perché sono cellule

molto differenziate che devono fare una solo cosa, ma non va bene per lo zigote che deve

invece disporre di tutte le informazioni necessarie per fare tutto. Una delle prime cose che

bisogna fare quando pronucleo materno e paterno si incontrano, è cancellare quasi tutte le

modificazioni epigenetiche, nell'analogia della biblioteca bisogna aprire tutte le porte, in

modo da avere a disposizione tutte le informazioni possibili perché lo zigote possa

eseguire tutti i differenziamenti necessari per creare i tessuti del feto e extra-embrionali.

Tutti questi effetti avvengono

in maniera ordinata, esiste un

meccanismo di regolazione

che assicura che una cosa

avvenga prima e le altre dopo.

Questi effetti sono più o meno

quelli che avvengono in tutti

gli organismi; c'è una tabella

che utilizzeremo come filo

conduttore, sull'umano non è

ancora stata fatta, che è basata

sugli studi su riccio di mare

usato come animale modello,

poi confrontato con l'uomo.

Una delle prime cose che avviene è la depolarizzazione

dell'oolema, quando avviene la fusione tra oocita e

spermatozoo si ha un cambio di carica della membrana

dell'oocita, dovuto ad un aumento di permeabilità di Na+,

indispensabile per il blocco rapido della polispermia.

Questo è il grafico in cui c'è il potenziale di membrana

misurato sull'oocita, quando lo sperma contatta e attraversa

la zona pellucida si fondono le membrane e in pochi

secondi (10-20s), si ah una depolarizzazione completa

molto rapida. Non si sa perché essa impedisca la fusione di

nuovi spermatozoi. Poco dopo si osserva l'attivazione

dell'enzima fosfolipasi che converte acidi

grassi presenti in membrana producendo

fosfatidil-inositoli(scala temporale 1-2

minuti) e questo a valle causa un aumento

citoplasmatico “a picco” del calcio, uno dei

migliori e più efficienti secondi messaggeri

delle nostre cellule. Ci sono dei picchi di

calcio oscillanti, il calcio citoplasmatico è

rilasciato dall'esterno ma soprattutto dalla

cisterne intracellulari di ER, una delle

riserve più ingenti di ioni calcio. Questi

picchi di calcio funzionano come una

specie di orologio, più picchi ci sono, più

tempo è passato dalla fecondazione.

Chi induce inizialmente questi picchi di Calcio è la fosfolipasi C nell'isoforma Z, presente nel

citoplasma dello spermatozoo, che entra nel citoplasma dell'oocita agendo sulle sue membrane, e

attiva una cascata di segnali che coordina il rilascio di calcio sia da ER che dal'esterno.

Lo spermatozoo porta tre cose: il GENOMA, CENTRIOLO e FOSFOLIPASI C.

La fofolipasi C è fondamentale per fare iniziare

questi spike di calcio, quindi se si prendesse un

oocita umano e si iniettasse solo la fosfolipasi C,

anche se l'oocita non ha mai visto uno spermatozoo,

un IZUMO, la membrana dello spermatozoo, basta

la fosfolipasi C per iniziare questi spike di calcio.

Quest'immagine mostra che lo spike inizia

localmente dov'è avvenuta la fecondazione, poi si

crea una specie di onda di calcio che si espande a

tutta la membrana (prima depolarizzazione a cui

segue il calcio) e poi continueremo con queste

oscillazioni ritmiche, fino a quando i pronuclei saranno formati, ovvero quando il nucleo dello

spermatozoo è stato decondensato, sono state eliminate tutte le proteine della cromatina paterna,

sono stati immessi gli istoni dall'oocita ed è stata riformata la membrana nucleare attorno al

genoma paterno. A questo statdio si ha il pronucleo materno e cessano gli spike di calcio. Dopo

qualche ora l' inizio della mitosi li fa ripartire, con la rottura della membrana nucleare.

La fosfolipasi C è un enzima strano perché possiede un fortissimo segnale di localizzazione

nucleare (NLS; ricordate che le proteine possono stare o al mitocondrio o in alcuni distretti perché

hanno segnali che li indirizzano di qua e di là). Questo è un esempio in cui un NLS è

fondamentale: finché non c’è un nucleo, la fosfolipasi C è nel citoplasma. Ma appena noi

ricreiamo il pronucleo maschile e ovviamente anche quello femminile (perché è terminata la

meiosi II) e si riformano le membrane nucleari, a quel punto si riformano anche i pori nucleari.

Tutta la fosfolipasi C viene pompata all’interno del nucleo e là non riesce più ad agire perché non

accede più ai suoi substrati che sarebbero sulle vescicole e sulla membrana plasmatica. Quindi il

fatto di aver ricreato la membrana attorno al pronucleo ferma gli spike di calcio.

Poi riparte la mitosi, si distrugge il nucleo, la fosfolipasi C esce nel citoplasma e di nuovo gli

spike ripartono.

Abbiamo quindi una specie di orologio che ci dice “non ho ancora finito di fare i pronuclei”

oppure “i pronuclei sono a posto”. A questo punto dobbiamo aspettare, ci vuole un po’ di tempo

prima che la mitosi possa cominciare: bisogna che si formi il fuso mitotico, bisogna raddoppiare il

centriolo (non ne basta uno per fare un fuso mitotico), far partire tutti i segnali che scatenano la

prima mitosi. Passate circa 14 ore, riparte la mitosi, ripartono gli spike.

Siamo in gioco, abbiamo ricominciato. Zigote, siamo in partenza!

Ovviamente, all’oscillazione di calcio

corrispondono oscillazioni di tutti gli effettori

a valle del calcio. E un effettore che è

fondamentale per coordinare quello che

avviene, è la chinasi calcio-dipendente di

tipo II (CaMKII).

Vediamo gli spike di calcio in blu, gli spike

rossi invece sono l’attività della CaMKII che

risponde al calcio; quando il calcio cessa,

cessa anche l'attività di questa chinasi. Quindi

abbiamo un network basato proprio su queste

chinasi che in qualche modo coordinano

quello che avviene nella cellula.

Perché vi dicevo che questi spike funzionano come un orologio? Perché sperimentalmente noi

possiamo agire su questi picchi: possiamo fargliene fare alcuni e poi fermarli.

E facendo questo abbiamo visto che ci sono alcuni eventi, come per esempio l’esocitosi dei

granuli corticali e il blocco della polispermia, che rispondono a pochi picchi di calcio (1, 2 o 3 al

massimo).

Ne bastano molto pochi per attivare il rilascio dei granuli corticali e l’esocitosi del loro contenuto.

Ci vorranno più picchi invece, ad esempio, perché riprenda la meiosi e questa è la ragione per cui

la meiosi segue il rilascio dei granuli corticali.

Ci vorranno ancora più picchi, ad esempio, perché venga completata la formazione dei pronuclei.

Voi potete immaginare che la lista di eventi che seguono la fecondazione ha un ordine perché ogni

evento richiede che sia passato più tempo e il modo in cui la cellula conta questo tempo è

contando quanti picchi di calcio sono avvenuti e quante oscillazioni abbiamo avuto. È un ottimo

modo per sapere cosa è successo prima e cosa è successo dopo.

In risposta all'aumento di calcio una delle prime cose che

avviene è l’esocitosi dei granuli corticali.

Quand’è che i granuli corticali compaiono nell’oocita primario?

Già nel follicolo precoce cominciamo a vederne la comparsa,

nel follicolo primario multilaminare ci sono sicuramente. Sono

stati già prodotti dall'oocita in quello stadio e questo è il

momento in cui ci servono. In risposta ad uno spike di calcio, si

ha esocitosi del contenuto di questi granuli e l'effetto di questo

rilascio è quello di tagliare alcune proteine nella zona pellucida,

ad esempio ZP2, e quindi cambiare l'organizzazione

tridimensionale della zona pellucida in modo che se arrivasse in

quel momento un altro spermatozoo, non la riconoscerebbe.

Non avverrà neanche la reazione acrosomiale; non sarà più un

problema di “contatta la membrana - non contatta la

membrana”, ma sarà proprio tagliato fuori dalla zona pellucida.

Qui affianco viene fatto vedere sempre lo stesso processo: si

vede come l’endocitosi dei granuli corticali cambia la struttura

della zona pellucida nel processo che viene anche segnalato

come un indurimento della zona pellucida (non è che si

indurisce perché diventa più dura; si indurisce perché non lascia

più entrare nessuno).


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22

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6.96 MB

AUTORE

peppotta

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+1 anno fa


DETTAGLI
Esame: Embriologia
Corso di laurea: Corso di laurea magistrale in medicina e chirurgia 1 (ordinamento U.E. - 6 anni)
SSD:
Università: Padova - Unipd
A.A.: 2015-2016

I contenuti di questa pagina costituiscono rielaborazioni personali del Publisher peppotta di informazioni apprese con la frequenza delle lezioni di Embriologia e studio autonomo di eventuali libri di riferimento in preparazione dell'esame finale o della tesi. Non devono intendersi come materiale ufficiale dell'università Padova - Unipd o del prof Dupont Sirio.

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