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Effetti fecondazione sull'ovocita, Embriologia

Appunti di Embriologia per l’esame del professor Dupont. Gli argomenti trattati sono i seguenti: gli effetti della fecondazione sull'ovocita,la prima scelta differenziativa: massa cellulare interna o trofoblasto?; la massa cellulare interna, la staminalità e potenziale differenziativo.

Esame di Embriologia docente Prof. S. Dupont

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Sicuramente questo metodo di generare asimmetria è molto rapido e dallo stadio di 8 cellule (cioè

da morula che ha fatto compattazione) allo stadio di 16/32 cellule (quindi più o meno due divisioni

che durano un po' più di due giorni), si arriva ad una struttura: la blastocisti.

Nella blastocisti individuiamo già i primi due tessuti embrionali in cui le due popolazioni cellulari

hanno destini completamente diversi e irreversibili, cioè presentano incapacità di ritornare indietro.

Nella blastocisti si identificano la massa cellulare interna e il trofoblasto, che sta in questo

rettangolo rosa che indica i tessuti extraembrionali.

• Il trofoblasto formerà il citotrofoblasto e poi il sinciziotrofoblasto e quindi giocherà un ruolo

molto importante nel formare la placenta, prendendo rapporto con l'utero.

• La massa cellulare interna invece formerà l'epiblasto, che è il tessuto embrionale da cui

originano gli altri tessuti che formeranno il corpo del feto propriamente detto: ectoderma,

mesoderma ed endoderma.

La massa cellulare interna e il trofoblasto stesso contribuiscono a formare anche parte dei tessuti

extraembrionali a diverse fasi dello sviluppo.

Nella blastocisti questi due tessuti, come in qualunque altro stadio dello sviluppo, comunicano tra

loro in modo che lo sviluppo avvenga in

maniera coordinata.

Uno dei modi con cui lo sviluppo della massa

cellulare interna si assicura che il trofoblasto

proliferi è quello di produrre un fattore di

crescita: Fgf4, che è il fattore di crescita dei

fibroblasti. Fgf4 è una proteina secreta che

viene trascritta in risposta a TTYUGT.

Questa proteina viene quindi prodotta dalle

cellule della massa cellulare interna, viene

secreta all'esterno e trova il suo recettore sulle

cellule del trofoblasto che rispondo a Fgf4 proliferando.

Staminalità e potenziale differenziativo

Non potremo parlare di staminalità e di pluripotenza se prima non parlassimo di come si controlla

l'espressione genica.

[Questo lo farete estensivamente l'anno prossimo in biologia molecolare, qui accenniamo solo

alcuni elementi giusto perché capiate una cosa fondamentale.]

Esistono due modi fondamentali per regolare la trascrizione di un gene:

1. Uno è avere un fattore di trascrizione, Oct4, che si siede sul promotore, ovvero sulla regione di

DNA che precede la regione codificante di quel gene, recluta la polimerasi che è l'enzima che

produce l'RNA messaggero. È necessario che ci sia questo fattore di trascrizione.

2. la trascrizione del gene può partire o no a seconda dello stato in cui si trova la cromatina di quel

gene. La cromatina può essere in uno stato che permette la trascrizione o in uno stato che non la

permette. Quindi può essere che sia presente il gene ed il fattore di trascrizione ma, in locus, la

parte di RNA che contiene quel gene può non essere accessibile, in maniera più o meno stabile.

Da questo si parla di controllo epigenetico di espressione genica.

Per controllo epigenetico si intende che l'espressione di un certo gene può essere proibita o

permessa, e questo stato di trascrizione o non trascrizione è ereditabile attraverso la mitosi, quindi

se faccio un ciclo di mitosi le cellule figlie ereditano la possibilità di trascrivere o no quel gene.

Vi faccio un esempio: Le nostre cellule hanno appena scelto se diventare massa cellulare interna ed

esprimere Oct4 o diventare trofoblasto ed esprimere Cdx2.

Se ho scelto di esprimere Oct4 non voglio più esprimere Cdx2 ed una delle prime cose che farò è

cambiare la cromatina del gene di Cdx2 in modo che, anche se ci fossero dei segnali in grado di

attivare quel gene, non potrebbero farlo perché da quel momento le cellule della massa cellulare

interna e tutte quelle che da questa derivano hanno chiuso il locus per Cdx2.

Il modo principale in cui avviene una delle modificazioni

che assicurano questo silenziamento/regolazione di geni,

ereditabile attraverso la replicazione del DNA, è la

metilazione delle citosine.

In un certo momento della vita cellulare, il DNA viene

metilato e durante la replicazione del DNA, cioè durante

la fase S questa metilazione viene copiata sul filamento

neoformato.

Ed è questo il meccanismo che assicura che le cellule

figlie ereditino la metilazione e quindi eventualmente la

regolazione di quel gene.

Se andiamo a vedere lo stato di metilazione del nostro

genoma, si può capire quanto una cellula sia in grado di

accedere a tutti i geni che sono scritti nel nostro genoma e

quanto invece questo non è possibile.

In maniera molto semplicistica possiamo immaginare che

più una cellula è differenziata più il suo genoma sarà metilato.

Immaginate infatti l'oogonio che deve fare l'oocita, per fare questo ha bisogno unicamente dei geni

per fare l'oocita. Non avrà quindi bisogno dei geni per fare il cheratinocita, l'osteoclasto o le cellule

del sangue e allora tutti questi programmi genici alternativi possono esser silenziati e le regioni

geniche saranno metilate.

Questo si trova proprio perché le sequenze CpG che sono delle sequenze ripetute che sono metilate,

nei mammiferi molto spesso si trovano proprio nelle regioni dei promotori dei geni, proprio ad

indicare che c'è stata una selezione per avere delle specie di interruttori all'interno dei promotori e

poter quindi decidere se spegnere per sempre un gene o lasciarlo acceso.

La modifica della metilazione del DNA nello sviluppo pre-impianto

Vi ho appena detto che l'oogonio fa solo l'oocita e che lo spermatogonio fa solo lo spermatozoo,

quindi si tratta di cellule monopotenti che possono fare una sola cosa e nient'altro. Però queste

cellule altamente specializzate e differenziate, una volta messe insieme, possono invece far tutto,

perché lo zigote è in grado di fare tessuti extraembrionali, tessuti embrionali e formare il feto

completo.

Come è possibile allora che le cellule che avevamo prima non potevano praticamente accedere a

nessun programma genetico per fare differenziamento e lo zigote invece è in grado eventualmente

di accedere a qualunque programma genetico per fare tutti i tessuti possibili?

Nelle gonadi Embrione

Quello che si osserva è quanto vedete dal grafico: nella prima zona abbiamo le cellule germinali

primordiali e poi abbiamo le cellule embrionali. Le linee indicano quanta metilazione abbiamo nelle

nostre cellule.

Le cellule germinative, come vedete, hanno già un buon livello di metilazione perché si sono già

differenziate. Quando entrano nelle gonadi cominciano il loro differenziamento, subiscono una

demetilazione abbastanza estensiva e poi, sempre nelle gonadi, vengono rimetilate completamente.

Quindi le nostre cellule germinali (i nostri gameti maturi) hanno uno stato di metilazione,uno stato

epigenetico, tipico di una cellula molto differenziata, di una cellula che non potrà fare molte cose.

Perché dimetilo e rimetilo il DNA?

Perché, come vedremo tra un attimo, i gameti devono assicurarsi di avere una metilazione

particolare su alcuni geni. Subito dopo la fecondazione, ancora prima di arrivare alla prima

divisione mitotica, si assiste alla globale demetilazione dei geni.

Quindi estensivamente il genoma viene demetilato e questa demetilazione continua più o meno fino

allo stadio di morula, cioè fino a quando prende le decisioni di differenziarsi o in massa cellulare

interna o in trofoblasto.

Voi potete interpretare queste due linee. All’inizio rappresentano i genomi parentali, poi cancellano

tutte le marcature/ metilazioni del genoma in modo da rendere possibile la trascrizione,

virtualmente, di qualunque gene. Da un po’ prima della fecondazione, visto che cominciano a

prendere delle decisioni, ricominciano a metilare il genoma.

Ovviamente se vado a vedere la metilazione nel maschio e nella femmina, dopo la fecondazione,

avrò due linee diverse. I geni che cominciano a venire spenti nella massa cellulare interna o nel

trofoblasto sono diversi nello spermatozoo e nel gameto femminile.

La linea nera indica i geni imprintati di cui parleremo tra un attimo.

Vi ho detto che dobbiamo demetilare il genoma per poter riattivare tutti i programmi genetici propri

dell'embrione, e questo è visibile proprio nel gene Oct4.

Il gene Oct4 segue proprio questa regola: all'inizio, al momento della fecondazione il gene Oct4 è

metilato, cioè spento.

Una volta che avviene la fecondazione,che i pronuclei paterno e materno vengono formati, una delle

prime cose che viene fatta è demetilare il locus del gene Oct4, in modo che tale gene sia

trascrivibile.

Se infatti non riesco ad attivare il gene Oct4 non posso fare massa cellulare interna,è quindi

fondamentale che il suo promotore venga demetilato.

Qui sopra vedete che l'incompleta demetilazione del DNA è una delle cause più comuni

dell'insuccesso del degli eventi di clonaggio.

Gli oociti di mammifero contengono tutti gli enzimi necessari per togliere le metilazioni,quindi gli

enzimi demetilasi.

Se prendo un oocita, tolgo il genoma originale dell'oocita, poi prendo il nucleo di una cellula

differenziata qualunque ( pelle,intestino...) e lo inserisco all'interno dell'oocita, ad un tasso molto

basso avviene che il citoplasma dell'oocita riesce a demetilare il DNA della cellula differenziata,

questo è sufficiente a riattivare il programma genetico tipico dello zigote e quindi quell'oocita che

contiene un nucleo che non proviene da due gameti ma da un nucleo che fino al giorno prima era

una cellula terminalmente differenziata, riacquisisce la capacità di fare un intero embrione.

In questo consiste il clonaggio che è stato fatto con la pecora Dolly e si fa comunemente in

allevamento con i bovini.

Il clonaggio pero è molto inefficiente perché uno degli step fondamentali, che è la demetilazione del

genoma che abbiamo iniettato nell'oocita, molto spesso non è così efficiente perché le marcature

epigenetiche tipiche di una cellula differenziata non permettono l'accesso facile delle demetilasi.

Di conseguenza quest'azzeramento delle informazioni che poi permette di ripartire non può

avvenire.

Nel caso di Oct4 abbiamo quindi che la demetilazione del DNA nel pronucleo paterno e materno

rende possibile la trascrizione del gene Oct 4 più altri fattori di trascrizione,questo guida la prima

scelta differenziativa perché si stabilisce una differenza tra due tessuti,uno continua ad esprimere

Oct4 e l'altro non lo esprime più.

In risposta ad Oct4 si forma FGF4 che si occupa di mantenere la proliferazione del trofoblasto.

In questo modo abbiamo tutta una serie di meccanismi che assicurano che la prima scelta venga

fatta in maniera ordinata,coordinata ed infallibile.

Imprinting genomico

Per qualche ragione che ancora non capiamo, mentre è vero che la maggior parte dei geni vengono

demetilati, alcuni geni che erano metilati all'interno dello spermatozoo e dell'oocita invece

rimangono metilati durante le prime fasi dello sviluppo, questo si chiama imprinting.

Perché l'embrione si sviluppi correttamente, c'è bisogno che vengano espressi alcuni geni dal padre

e alcuni dalla madre.

I geni materni saranno spenti nello spermatozoo: sono metilati e quindi non possono venire trascritti

nel genoma paterno; i geni paterni invece sono spenti nel genoma materno. Questo assicura che lo

zigote sia effettivamente il risultato dell'unione di un gamete maschile e di uno femminile.

Dal punto di vista genetico quindi, nonostante i geni siano gli stessi, la possibilità di esprimerli non

è la stessa e ci vogliono sia quelli della madre sia quelli del padre per assicurare uno sviluppo

corretto.

In un embrione normale che contiene un pronucleo paterno e uno materno lo sviluppo può

 avvenire in maniera normale e bilanciata.

• Se io invece faccio un esperimento in cui forzo lo sviluppo (questo si fa sul topo e mai

sull'uomo ovviamente) di un embrione in cui ho inserito un secondo pronucleo femminile, dal

punto di visto genetico quell'embrione è a posto perché contiene 46 cromosomi. Per qualche

ragione, però, il corpo dell'embrione comincia a svilupparsi ma la placenta non cresce

abbastanza quindi i geni paterni che porta lo zigote paterno e che esprime solo il genoma

paterno sono fondamentali per favorire la crescita dei tessuti extraembrionali della placenta.

• Viceversa se forzo la formazione di un embrione che ha due pronuclei paterni, si ottengono dei

tessuti extraembrionali che iniziano correttamente lo sviluppo ma i tessuti embrionali non

crescono correttamente,lo sviluppo viene ritardato e ad un certo punto si arresta e non

progredisce più correttamente.

Ci sono quindi alcuni geni espressi unicamente dal genoma materno, fondamentali per assicurare la

crescita dei tessuti embrionali e poi fetali. In questo modo ci assicuriamo che lo zigote cominci, si

annidi e porti avanti lo sviluppo di un nuovo feto unicamente quando questo è il risultato di una

riproduzione sessuata.

Alcuni di questi geni imprintati sono ad esempio il recettore per UINHGJI2 e h19 e quindi esistono

differenti potenziali dei genomi materno e paterno: la sequenza del genoma è la stessa, ma siccome

nei due genomi alcuni geni sono differentemente metilati, ho bisogno di entrambi i genomi perché

almeno una copia di quel gene venga trascritta e quindi lo sviluppo possa progredire.

Quando si parla di tessuti

embrionali, una volta che avviene la

prima scelta non si torna più indietro

e dunque ogni volta che compio una

scelta in senso differenziativo

diminuisco il mio potenziale

differenziativo.

Per cui se immaginate il processo

che porta dal nostro zigote alla

blastocisti e poi al feto:

- lo zigote è totipotente e può fare

qualunque tessuto,

- la blastocisti contiene due tessuti

di cui uno è più o meno

monopotente (perché fa solo il

trofoblasto) e l'altro, la massa

cellulare interna, è pluripotente

(perché può ancora fare tantissimi tessuti diversi).

- Durante la crescita esistono delle cellule oligopotenti all'interno del nostro corpo, cioè

dell'adulto, che mantengono un certo potenziale differenziativo.

I precursori del sistema ematopoietico ad esempio sono cellule in grado di differenziarsi in tante

cellule diverse. [Attenzione che in alcuni casi si possono trovar in alcuni libri che le cellule

staminali del sistema ematopoietico sono totipotenti, perché sono state uno dei primi sistemi di

cellule staminali scoperti e studiati e all'epoca erano cellule con enorme plasticità differenziativa.

Erano le uniche cellule conosciute all'epoca che potevano fare più cose, per cui, comparate alle

altre erano sicuramente le migliori quindi totipotenti.]

- Poi abbiamo scoperto molte altre cellule staminali nell'adulto, come quelle dell'epitelio

dell'intestino e di quello dello stomaco. Praticamente ogni tessuto ha delle cellule staminali,

anche il fegato.

La rigenerazione del fegato può venire infatti prevalentemente per mitosi degli epatociti stessi

differenziati ma se il danno persiste e quindi diventa cronico,esiste un compartimento staminale

anche nel fegato, che può venire attivato per favorire la crescita dell'organo.

Queste cellule staminali ovviamente hanno un potenziale differenziativo ridotto perché potranno

fare alcune cose e non altre.

Via via durante lo sviluppo, più le cellule si differenziano e più perdono possibilità di scelta.

Da queste strutture noi possiamo derivare delle cellule per usarle ad esempio in laboratorio, e questo

è quello che è stato fatto.

Ad esempio dalla massa cellulare interna della blastocisti è possibile derivare delle cellule che

crescono in laboratorio e che si chiamano cellule embrionali staminali.

Esse sono delle cellule che, anche se coltiviamo al di fuori della struttura originale (la blastocisti),

mantengono la capacità della pluripotenza. Se quindi prendo una di queste cellule e la metto nella

blastocisti, questa riprende tutto il programma di differenziamento e contribuisce a formare il corpo

del feto.

Ci chiediamo quali siano i fattori che

insegnano ad una cellula ad essere

pluripotente.

Se voi immaginate lo zigote come una

pallina (quella viola in figura) che

inizialmente si trova in alto ad una serie di

valli, quando comincia a rotolare, ogni

volta che arriva ad una biforcazione può fare una scelta, ovviamente le palline rotolano sempre

verso il basso e non possono tornare indietro spontaneamente (possiamo farlo solo in laboratorio).

Dunque ogni volta che la cellula staminale compie una scelta e prende una valle, lo fa

irreversibilmente e questo assicura che alla fine otteniamo una cellula differenziata.

Questa idea delle scelte differenziative viene ricapitolata molto da vicino dallo stato epigenetico

delle cellule.

La cellula dello zigote che è totipotente ha un DNA globalmente demetilato e man mano che si va

avanti nelle scelte differenziative questo DNA viene rimetilato. Dopo la rimetilazione, le cellule

non possono più andare in un altro programma di differenziamento.

Dal punto di vista dello stato epigenetico, una delle prime indicazioni che le cellule stanno iniziando

a differenziarsi è l'inattivazione del cromosoma X negli individui femminili in cui ci sono infatti due

cromosomi X. Dei due, uno soltanto viene trascritto e l'altro è inattivato per eterocromatinizzazione.

Questa inattivazione è casuale, avviene più o meno nello stadio che segue la blastocisti quindi molto

presto durante lo sviluppo embrionale.

Nell'epiblasto alcune cellule inattiveranno il cromosoma X che viene dalla madre ed altre

inattiveranno quello che viene dal padre. Per quanto riguarda il cromosoma X, gli individui di sesso

femminile sono dei mosaici, perché alcune cellule esprimeranno il cromosoma X di un tipo e le

altre il cromosoma X di un altro tipo.

Se uno di questi due porta un gene che codifica per una malattia, solo alcune cellule del corpo

esprimeranno la malattia, le altre no.

La prova che le cellule della morula nei nostri embrioni di mammifero sono ancora

totipotenti viene da esperimenti in cui possiamo fondere due morule: le mettiamo

insieme e quindi le forziamo a stare insieme.

In alternativa possiamo addirittura togliere uno dei blastomeri della morula e

trasferirlo all'interno della cavità della blastocisti di un embrione ricevente.

Questo embrione poi verrà impiantato in utero, si svilupperà e otterremo una

chimera, cioè un topolino in cui parte delle cellule venivano dalla blastocisti

originale e altre cellule derivano invece dal blastomero che ho messo lì dentro.

Questo indica che la cellula che ho messo lì dentro era ancora in grado di fare

qualunque tessuto.

Per sapere quanto bene può fare qualunque tessuto, devo andare a vedere i tessuti che

derivano dalla cellula donatrice nel topolino stesso, ma soprattutto devo andare a

vedere i figli di quel topolino.

Questo topolino ha metà cellule nere e metà cellule bianche, dove le cellule nere

derivano dalla parte inserita forzatamente e contribuiscono anch’esse alla linea

germinale. Invece, i figli dei gameti prodotti saranno o tutti neri o tutti bianchi.

È quindi possibile prendere delle cellule allo stadio di morula e queste

contribuiranno alla linea germinale e quindi sono totipotenti dal punto di vista

sperimentale.

Se faccio lo stesso con una cellula nello stadio della blastocisti questo non vale.

- Se infatti prendo una cellula dalla massa cellulare interna, allora troverò un topolino che era

una chimera e questo farà figli neri.

- Se invece prendo una cellula del trofoblasto, magari parte della placenta di quel feto verrà

formata, ma il topo che nasce non porterà nessuna cellula derivante dalla cellula che ho

impiantato.

Ciò dimostra che le cellule della blastocisti hanno fatto una scelta differenziativa perdendo

potenziale differenziativo, soprattutto quelle del trofoblasto.

I parti gemellari

È possibile che un parto sia gemellare. I parti gemellari possono avere origine da eventi distinti.

A. Uno degli eventi che può avvenire è che da un'unica cellula uovo si formi una morula che,

invece di fare compattazione e creare un'unica struttura, crea due blastocisti.

Se creo due blastocisti, queste poi si annideranno nell'utero indipendentemente l’una dall’altra.

Assisteremo allo sviluppo di due placente, due corion (da cui gemelli bicorialici): si avranno

due feti che si sviluppano in maniera completamente indipendente.

Ovviamente un parto di gemelli bicorialici monozigoti (cioè che originano dallo stesso zigote)

è un evento piuttosto raro; la maggior parte di eventi di gemelli bicorialici sono embrioni che

derivano da due oociti diversi fecondati allo stesso momento. Per saperlo, occorre fare

un'indagine genetica. Se il genoma dei due gemelli è identico allora quelli sono monozigotici,

cioè derivano da una sola cellula uovo che prima di diventare blastocisti si è separata ed ha

creato due blastocisti.

Come ho detto prima, nella blastocisti esistono popolazioni cellulari diverse; in vitro possiamo

derivarle e separarle le une dalle altre.


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19

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10.51 MB

AUTORE

peppotta

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+1 anno fa


DETTAGLI
Esame: Embriologia
Corso di laurea: Corso di laurea magistrale in medicina e chirurgia 1 (ordinamento U.E. - 6 anni)
SSD:
Università: Padova - Unipd
A.A.: 2015-2016

I contenuti di questa pagina costituiscono rielaborazioni personali del Publisher peppotta di informazioni apprese con la frequenza delle lezioni di Embriologia e studio autonomo di eventuali libri di riferimento in preparazione dell'esame finale o della tesi. Non devono intendersi come materiale ufficiale dell'università Padova - Unipd o del prof Dupont Sirio.

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