Effetti fecondazione sull'ovocita, Embriologia

Quello che si osserva è quanto vedete dal grafico: nella prima zona abbiamo le cellule germinali

primordiali e poi abbiamo le cellule embrionali. Le linee indicano quanta metilazione abbiamo nelle

nostre cellule.

Le cellule germinative, come vedete, hanno già un buon livello di metilazione perché si sono già

differenziate. Quando entrano nelle gonadi cominciano il loro differenziamento, subiscono una

demetilazione abbastanza estensiva e poi, sempre nelle gonadi, vengono rimetilate completamente.

Quindi le nostre cellule germinali (i nostri gameti maturi) hanno uno stato di metilazione,uno stato

epigenetico, tipico di una cellula molto differenziata, di una cellula che non potrà fare molte cose.

Perché dimetilo e rimetilo il DNA?

Perché, come vedremo tra un attimo, i gameti devono assicurarsi di avere una metilazione

particolare su alcuni geni. Subito dopo la fecondazione, ancora prima di arrivare alla prima

divisione mitotica, si assiste alla globale demetilazione dei geni.

Quindi estensivamente il genoma viene demetilato e questa demetilazione continua più o meno fino

allo stadio di morula, cioè fino a quando prende le decisioni di differenziarsi o in massa cellulare

interna o in trofoblasto.

Voi potete interpretare queste due linee. All’inizio rappresentano i genomi parentali, poi cancellano

tutte le marcature/ metilazioni del genoma in modo da rendere possibile la trascrizione,

virtualmente, di qualunque gene. Da un po’ prima della fecondazione, visto che cominciano a

prendere delle decisioni, ricominciano a metilare il genoma.

Ovviamente se vado a vedere la metilazione nel maschio e nella femmina, dopo la fecondazione,

avrò due linee diverse. I geni che cominciano a venire spenti nella massa cellulare interna o nel

trofoblasto sono diversi nello spermatozoo e nel gameto femminile.

La linea nera indica i geni imprintati di cui parleremo tra un attimo.

Vi ho detto che dobbiamo demetilare il genoma per poter riattivare tutti i programmi genetici propri

dell'embrione, e questo è visibile proprio nel gene Oct4.

Il gene Oct4 segue proprio questa regola: all'inizio, al momento della fecondazione il gene Oct4 è

metilato, cioè spento.

Una volta che avviene la fecondazione,che i pronuclei paterno e materno vengono formati, una delle

prime cose che viene fatta è demetilare il locus del gene Oct4, in modo che tale gene sia

trascrivibile.

Se infatti non riesco ad attivare il gene Oct4 non posso fare massa cellulare interna,è quindi

fondamentale che il suo promotore venga demetilato.

Qui sopra vedete che l'incompleta demetilazione del DNA è una delle cause più comuni

dell'insuccesso del degli eventi di clonaggio.

Gli oociti di mammifero contengono tutti gli enzimi necessari per togliere le metilazioni,quindi gli

enzimi demetilasi.

Se prendo un oocita, tolgo il genoma originale dell'oocita, poi prendo il nucleo di una cellula

differenziata qualunque ( pelle,intestino...) e lo inserisco all'interno dell'oocita, ad un tasso molto

basso avviene che il citoplasma dell'oocita riesce a demetilare il DNA della cellula differenziata,

questo è sufficiente a riattivare il programma genetico tipico dello zigote e quindi quell'oocita che

contiene un nucleo che non proviene da due gameti ma da un nucleo che fino al giorno prima era

una cellula terminalmente differenziata, riacquisisce la capacità di fare un intero embrione.

In questo consiste il clonaggio che è stato fatto con la pecora Dolly e si fa comunemente in

allevamento con i bovini.

Il clonaggio pero è molto inefficiente perché uno degli step fondamentali, che è la demetilazione del

genoma che abbiamo iniettato nell'oocita, molto spesso non è così efficiente perché le marcature

epigenetiche tipiche di una cellula differenziata non permettono l'accesso facile delle demetilasi.

Di conseguenza quest'azzeramento delle informazioni che poi permette di ripartire non può

avvenire.

Nel caso di Oct4 abbiamo quindi che la demetilazione del DNA nel pronucleo paterno e materno

rende possibile la trascrizione del gene Oct 4 più altri fattori di trascrizione,questo guida la prima

scelta differenziativa perché si stabilisce una differenza tra due tessuti,uno continua ad esprimere

Oct4 e l'altro non lo esprime più.

In risposta ad Oct4 si forma FGF4 che si occupa di mantenere la proliferazione del trofoblasto.

In questo modo abbiamo tutta una serie di meccanismi che assicurano che la prima scelta venga

fatta in maniera ordinata,coordinata ed infallibile.

Imprinting genomico

Per qualche ragione che ancora non capiamo, mentre è vero che la maggior parte dei geni vengono

demetilati, alcuni geni che erano metilati all'interno dello spermatozoo e dell'oocita invece

rimangono metilati durante le prime fasi dello sviluppo, questo si chiama imprinting.

Perché l'embrione si sviluppi correttamente, c'è bisogno che vengano espressi alcuni geni dal padre

e alcuni dalla madre.

I geni materni saranno spenti nello spermatozoo: sono metilati e quindi non possono venire trascritti

nel genoma paterno; i geni paterni invece sono spenti nel genoma materno. Questo assicura che lo

zigote sia effettivamente il risultato dell'unione di un gamete maschile e di uno femminile.

Dal punto di vista genetico quindi, nonostante i geni siano gli stessi, la possibilità di esprimerli non

è la stessa e ci vogliono sia quelli della madre sia quelli del padre per assicurare uno sviluppo

corretto.

In un embrione normale che contiene un pronucleo paterno e uno materno lo sviluppo può

 avvenire in maniera normale e bilanciata.

• Se io invece faccio un esperimento in cui forzo lo sviluppo (questo si fa sul topo e mai

sull'uomo ovviamente) di un embrione in cui ho inserito un secondo pronucleo femminile, dal

punto di visto genetico quell'embrione è a posto perché contiene 46 cromosomi. Per qualche

ragione, però, il corpo dell'embrione comincia a svilupparsi ma la placenta non cresce

abbastanza quindi i geni paterni che porta lo zigote paterno e che esprime solo il genoma

paterno sono fondamentali per favorire la crescita dei tessuti extraembrionali della placenta.

• Viceversa se forzo la formazione di un embrione che ha due pronuclei paterni, si ottengono dei

tessuti extraembrionali che iniziano correttamente lo sviluppo ma i tessuti embrionali non

crescono correttamente,lo sviluppo viene ritardato e ad un certo punto si arresta e non

progredisce più correttamente.

Ci sono quindi alcuni geni espressi unicamente dal genoma materno, fondamentali per assicurare la

crescita dei tessuti embrionali e poi fetali. In questo modo ci assicuriamo che lo zigote cominci, si

annidi e porti avanti lo sviluppo di un nuovo feto unicamente quando questo è il risultato di una

riproduzione sessuata.

Alcuni di questi geni imprintati sono ad esempio il recettore per UINHGJI2 e h19 e quindi esistono

differenti potenziali dei genomi materno e paterno: la sequenza del genoma è la stessa, ma siccome

nei due genomi alcuni geni sono differentemente metilati, ho bisogno di entrambi i genomi perché

almeno una copia di quel gene venga trascritta e quindi lo sviluppo possa progredire.

Quando si parla di tessuti

embrionali, una volta che avviene la

prima scelta non si torna più indietro

e dunque ogni volta che compio una

scelta in senso differenziativo

diminuisco il mio potenziale

differenziativo.

Per cui se immaginate il processo

che porta dal nostro zigote alla

blastocisti e poi al feto:

- lo zigote è totipotente e può fare

qualunque tessuto,

- la blastocisti contiene due tessuti

di cui uno è più o meno

monopotente (perché fa solo il

trofoblasto) e l'altro, la massa

cellulare interna, è pluripotente

(perché può ancora fare tantissimi tessuti diversi).

- Durante la crescita esistono delle cellule oligopotenti all'interno del nostro corpo, cioè

dell'adulto, che mantengono un certo potenziale differenziativo.

I precursori del sistema ematopoietico ad esempio sono cellule in grado di differenziarsi in tante

cellule diverse. [Attenzione che in alcuni casi si possono trovar in alcuni libri che le cellule

staminali del sistema ematopoietico sono totipotenti, perché sono state uno dei primi sistemi di

cellule staminali scoperti e studiati e all'epoca erano cellule con enorme plasticità differenziativa.

Erano le uniche cellule conosciute all'epoca che potevano fare più cose, per cui, comparate alle

altre erano sicuramente le migliori quindi totipotenti.]

- Poi abbiamo scoperto molte altre cellule staminali nell'adulto, come quelle dell'epitelio

dell'intestino e di quello dello stomaco. Praticamente ogni tessuto ha delle cellule staminali,

anche il fegato.

La rigenerazione del fegato può venire infatti prevalentemente per mitosi degli epatociti stessi

differenziati ma se il danno persiste e quindi diventa cronico,esiste un compartimento staminale

anche nel fegato, che può venire attivato per favorire la crescita dell'organo.

Queste cellule staminali ovviamente hanno un potenziale differenziativo ridotto perché potranno

fare alcune cose e non altre.

Via via durante lo sviluppo, più le cellule si differenziano e più perdono possibilità di scelta.

Da queste strutture noi possiamo derivare delle cellule per usarle ad esempio in laboratorio, e questo

è quello che è stato fatto.

Ad esempio dalla massa cellulare interna della blastocisti è possibile derivare delle cellule che

crescono in laboratorio e che si chiamano cellule embrionali staminali.

Esse sono delle cellule che, anche se coltiviamo al di fuori della struttura originale (la blastocisti),

mantengono la capacità della pluripotenza. Se quindi prendo una di queste cellule e la metto nella

blastocisti, questa riprende tutto il programma di differenziamento e contribuisce a formare il corpo

del feto.

Ci chiediamo quali siano i fattori che

insegnano ad una cellula ad essere

pluripotente.

Se voi immaginate lo zigote come una

pallina (quella viola in figura) che

inizialmente si trova in alto ad una serie di

valli, quando comincia a rotolare, ogni

volta che arriva ad una biforcazione può fare una scelta, ovviamente le palline rotolano sempre

verso il basso e non possono tornare indietro spontaneamente (possiamo farlo solo in laboratorio).

Dunque ogni volta che la cellula staminale compie una scelta e prende una valle, lo fa

irreversibilmente e questo assicura che alla fine otteniamo una cellula differenziata.

Questa idea delle scelte differenziative viene ricapitolata molto da vicino dallo stato epigenetico

delle cellule.

La cellula dello zigote che è totipotente ha un DNA globalmente demetilato e man